МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ ВИЩИЙ ДЕРЖАВНИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД УКРАЇНИ «УКРАЇНСЬКА МЕДИЧНА СТОМАТОЛОГІЧНА АКАДЕМІЯ» ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ НОВИХ АНТИДЕПРЕСИВНИХ ЗАСОБІВ Методичні рекомендації Полтава-2014 Установа-розробник: Вищий державний навчальний заклад України “Українська медична стоматологічна академія”, м. Полтава Укладачі: д. мед. н., професор Бобирьов В.М. д. мед. н., професор Мамчур В.Й. к. мед. н., доцент Луценко Р.В. д. мед. н., професор Дев’яткіна Т.О. асистент Сидоренко А.Г. к. мед. н., асистент Хомяк О.В. (05322)71769 (0567)135553 (099)9348001 (066)2290868 (066)1958590 (095)0249535 Рецензент: член-кор. НАМН України, заслужений діяч науки і техніки України, д.мед.н., професор В.Й. Кресюн 2 ЗМІСТ ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ………………………………..... 4 1. ВСТУП………………………………………………………………… 5 2. ДЕПРЕСИВНІ РОЗЛАДИ ТА ЇХ ФАРМАКОКОРЕКЦІЯ……... 6 2.1. Депресія, як соціальна проблема…………………………......... 6 2.2. Етіопатогенез депресії………………………………………...... 7 2.3. Класифікація препаратів для лікування депресії…………….............. 12 2.4. Механізм дії антидепресантів……………….……………….............. 16 3. ЕТАПИ ДОСЛІДЖЕННЯ НОВИХ АНТИДЕПРЕСАНТІВ......... 4. МЕТОДИ ВИВЧЕННЯ СПЕЦИФІЧНОЇ 18 АКТИВНОСТІ ЗАСОБІВ, ЩО РЕКОМЕНДУЮТЬЯ ЯК АНТИДЕПРЕСАНТИ. 20 4.1. Поведінкові тести……………………………………………...... 20 4.1.1. Вплив на загальний стан і просторові поведінкові реакції тварин…...……………………………………….. 20 4.1.2. Тест Порсолта………………………………………......... 20 4.1.3. Тест із водяним колесом Nomura………………………. 21 4.1.4. Тест підвішування за хвіст ……………………………... 21 4.2. Нейрофармакологічні тести ……………………………………. 21 4.2.1. Дослідження ефектів потенційних антидепресантів на дію речовин, що мають гальмівний вплив на ЦНС …... 21 4.2.2. Дослідження ефектів потенційних антидепресантів на дію речовин, що мають активуючий вплив на ЦНС…... 25 4.3. Біохімічні методи досліджень….……………………………...... 29 4.3.1. Вплив на активність моноамінооксидази ……………... 29 4.3.2. Визначення активності моноамінооксидази в сироватці крові ………………………………………….. 29 4.3.3. Визначення вмісту катехоламінів, серотоніну та їх метаболітів у структурах головного мозку щурів ……. 4.4. Метод радіолігандного зв’язування з різними 30 типами рецепторів ……………………………………………………….. 32 5. ВИСНОВКИ…...…………………………….………………………… 32 ПЕРЕЛІК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ......….……………… 34 3 ПЕРЕЛІК СКОРОЧЕНЬ АКТГ – адренокортикотропний гормон ГАМК − гамма-аміномасляна кислота L-ДОФА − L-3,4-діоксифенілаланін ДОФОК – діоксифенілоцетова кислота; ЕДТА – етилендіамінтетраацетат ЕЕГ – електроенцефалографія КОМТ – катехол-о-метилтрансфераза КРФ – кортикотропін-рилізинг фактор МАО − моноаміноксидаза МОФеГ − 3-метокси-4-оксифенил-гліколь 5-НТ – серотонін 5-ОІОК − 5-оксиіндолоцетова кислота ЦНС – центральна нервова система 4 1. ВСТУП Протягом кількох останніх десятиліть проблема депресивних розладів набуває особливого значення. Депресія суттєво порушує фізичне, психічне та соціальне благополуччя населення і спричиняє підвищення ризику передчасної смерті. Це захворювання утруднює задоволення базових потреб людини і негативно впливає на її повсякденну життєву активність, призводячи до значного зниження якості життя. Депресія спричиняє низку порушень соціального функціонування, що є тяжчими за наслідки таких хронічних соматичних захворювань, як стенокардія, артрит, бронхіальна астма та діабет. Депресивні розлади слід вважати одним із найважливіших чинників соціально-економічних проблем, що виникають унаслідок порушення здоров’я. Однією з основних груп психотропних препаратів, що використовуються для лікування депресій ендогенного і екзогенного походження, є антидепресанти. Ця група лікарських засобів включає не тільки типові антидепресанти (трициклічні сполуки та інгібітори моноаміноксидази), але й препарати різної хімічної будови, які називаються “атиповими”. Пошук і дослідження потенційних антидепресивних засобів ґрунтується на фармакологічних властивостей типових антидепресантів, що проводиться на основі здатності цих сполук відновлювати нейротрансмісію, порушену при депресії. Доклінічне вивчення речовин, що можуть рекомендуватися в якості антидепресантів, повинне виявити: специфічну фармакологічну активність (антидепресивну), відсутність токсичних властивостей і позитивні відмінності нових сполук у порівнянні з класичними препаратами. Переваги потенційних антидепресантів оцінюють за наявністю якісних і/або кількісних відмінностей у фармакологічних ефектах і за особливостями механізму дії. Таким чином, невпинно зростає необхідність створення ефективних засобів для лікування депресій. Проведення доклінічних досліджень потенційних антидепресантів за допомогою правильно підібраних підходів та методичних прийомів дозволяє визначити стратегію цілеспрямованого пошуку засобів для лікування депресії. З огляду на вищенаведене пропонується методична розробка з експериментального вивчення нових антидепресивних засобів. 5 2. ДЕПРЕСИВНІ РОЗЛАДИ ТА ЇХ ФАРМАКОКОРЕКЦІЯ 2.1. Депресія, як соціальна проблема Проблема психічних захворювань є однією з найбільш актуальних для сучасної медицини. Розповсюдженість цієї патології в Європі складає близько 30% від загальної кількості захворювань [58, 79]. Протягом ХХ сторічча майже в усіх розвинутих країнах світу відмічалося невпинне зростання психічних розладів і, зокрема, депресивного характеру. На початку сторічча вони зустрічалися в популяції з частотою 0,2%, а в 90-тих роках – 4%. Близько чверті населення планети в різні періоди життя хворіли на психічні захворювання. У світі більше 120 млн. людей страждає на депресію [21, 24, 62]. Згідно із аналітичними показниками Всесвітньої організації охорони здоров’я до 2025-2030 рр. смертність від депресії вийде на 1-е місце в світі, випередивши серед інших причин серцевосудинні захворювання [61]. Великомасштабні епідеміологічні дослідження показали, що на “велику” і “біполярну” депресію, не враховуючи інші форми, хворіє до 8% дорослого населення Європейського Союзу [83]. Це означає, що більше 21 мільйону європейців працездатного віку страждають афективними розладами і тому складають групу з високим ризиком рецидиву або хроніфікації депресії [80]. Ризик виникнення депресії протягом життя зростає більш ніж у два рази. При цьому одужання або стійка ремісія виявляється лише в 33% пацієнтів, рецидиви спостерігаються у 55%, а у 12% хворих захворювання триває роками і навіть десятиріччями. Депресивні розлади в розвинених країнах є другою за значимістю причиною інвалідності [44, 45, 53, 82]. На сьогодні спостерігається подальша тенденція до зростання депресивних станів, особливо серед людей похилого віку, а саме – після 60 років. У літніх людей, які мають декілька соматичних захворювань, розповсюдженість депресії сягає близько 30% [47, 48]. Наприклад, поширеність цієї патології у хворих, що перенесли мозковий інсульт, становить 30-50% [39]. Одним із найбільш небезпечних проявів депресії є суїцидальні наміри та дії [38]. При цьому 15-18% хворих здійснюють спроби самогубства. Кожного дня близько 15 людей у віці від 15 до 24 років через цю недугу закінчують життя самогубством. Показник смертності від суїцидів у даний час дещо поступається показникам смертності при серцево-судинних та онкологічних захворюваннях. В Україні за останні десятиріччя спостерігається невпинна тенденція до збільшення захворюваності населення на депресивні розлади, зокрема в 1973 році кількість зареєстрованих випадків депресії становила 2,3%, а в 2000 році – 3,8% від загальної кількості населення [29]. На сьогодні близько 1,2 млн. людей в Україні страждають від психічних захворювань різного ступеня тяжкості, серед яких на депресію хворіє більше 50 тисяч 6 людей [30]. Проте можна вважати, що пацієнтів на цю недугу в декілька разів більше. Хворі на депресію, окрім пригніченого настрою, мають і соматичні скарги, що приводить їх до лікарів загальної практики [29, 30]. Недіагностована депресія − це неадекватна терапія, перехід захворювання в хронічну фазу та розвиток різноманітних ускладнень [39]. Близько 30-60 % хворих на депресивні розлади є резистентними до терапії антидепресантами. Після проведеної фармакотерапії майже 60-75% пацієнтів зберігають залишкові ознаки хвороби, а близько 10% таких пацієнтів взагалі не мають ніякого ефекту від лікування [35]. Антидепресанти, які представлені на фармацевтичному ринку не вирішують проблеми хворих на цю недугу. Це пов’язано з певними недоліками фармакотерапії, а саме з пізнім розвитком клінічного ефекту, що складає 2-4 тижні від початку лікування, наявністю небажаних наслідків, що проявляються на початку терапії, інколи саме з цим пов’язана відмова хворих від подальшого лікування [20,74]. Досить часто зустрічаються такі побічні реакції, як сексуальна дисфункція, порушення сну та коливання маси тіла, інколи навпаки можуть погіршуватися симптоми депресії [25, 26]. Найбільш важливою проблемою сучасної терапії антидепресантами вважається повільний розвиток ефекту від початку застосування препаратів і звикання, хоча мають значення і побічні реакції та недостатній ефект від лікування [19, 27, 28, 64, 74, 76]. Економічні затрати, пов’язані з депресивними розладами, настільки великі, що депресію вважають однією з найбільш “дорогих” хвороб [78]. Наприклад, у США витрати на лікування депресії складають у середньому 40 мільярдів доларів на рік, не враховуючи непрямі витрати, що включають зниження працездатності, потребу в догляді та інше. На сьогодні кожен другий новий препарат, що з’являється на світовому фармацевтичному ринку, використовується для лікування захворювань центральної нервової системи. Це свідчить про актуальність даної проблеми та необхідність пошуку нових психотропних засобів, зокрема антидепресантів. 2.2. Етіопатогенез депресії Пусковими факторами розвитку депресії є ендогенні (порушення мозкового кровообігу, ендокринні захворювання, генетична схильність) та екзогенні чинники (соматичні та інфекційні захворювання, отруєння, вживання алкоголю, наркотиків, фармакологічних препаратів, травми головного мозку та інше) [7, 14, 52, 81]. Морфофункціональними основами цієї патології є майже всі структури головного мозку: кора великих півкуль, лімбічно-ретикулярний комплекс, центральні відділи вегетативної нервової системи, гіпоталамо-гіпофізарна система, епіфіз. Основні механізми розвитку депресії пов’язані з дефіцитом серотонінергічної системи та складною дисрегуляцією норадренергічної системи [13, 75]. 7 Останні тісно взаємодіють з іншими нейромедіаторними системами, а саме: гліцинергічною, збуджуючих амінокислот, гістамінергічною, карболінів, дофамінергічною, холінергічною, глутаматергічною та ГАМКергічною. Однією з провідних ланок патогенезу депресії є розлади функції норадренергічної системи головного мозку [23]. Норадреналін є медіатором змішаної дії. Синтез провідного медіатора ЦНС відбувається таким чином: тирозин ТИРОЗИНГІДРОКСИЛАЗА діокси-L-фенілаланін (L-ДОФА) ДОФАДЕКАРБОКСИЛАЗА дофамін ДОФАМІН-β-ГІДРОКСИЛАЗА норадреналін МАО, КОМТ 3-метокси-4-оксифенілгліколь (МОФеГ). Він міститься в таламусі, гіпоталамусі, гіппокампі, гіпофізі, корі великих півкуль, мозочку та спинному мозку. Виділяють α1- і α2-адренорецептори, які розміщаються в нейронах та β1- і β2адренорецептори, які знаходяться в клітинах глії. Дія норадреналіну на електричну активність нейронів головного мозку відрізняється від такої класичних медіаторів, залежить від вихідного стану нервових клітин і характеризується пермісивністю. При депресії відмічається порушення синтезу і екскреції норадреналіну. Це підтверджується зниженням у сечі концентрації основного метаболіту норадреналіну – МОФеГ у хворих із маніакальнодепресивним синдромом у стадії депресії, та його підвищенням при гіпоманіакальному перебігу. Покращення стану пацієнтів з уперше виявленими депресивними розладами характеризується значним підвищенням вмісту МОФеГ у сечі, а в хворих із систематичними депресивними епізодами змін його рівнів не спостерігалося. При низькій концентрації в сечі МОФеГ позитивний лікувальний ефект виявлено від трициклічних антидепресантів, які блокують зворотне захоплення норадреналіну пресинаптичними закінченнями. Також у деяких хворих на депресію відмічено зниження чутливості постсинаптичних адренорецепторів та збільшення кількості пресинаптичних α2- і β2адренорецепторів. Такий дисбаланс призводить до зниження викиду норадреналіну в синаптичну щілину. У патогенезі депресії суттєву роль відіграє дофамінергічна система головного мозку [10]. Дофамін є нейромедіатором змішаної дії. Синтез та перетворення даного медіатора такий: тирозин ТИРОЗИНГІДРОКСИЛАЗА діокси-Lфенілаланін ДОФАДЕКАРБОКСИЛАЗА дофамін МАО, КОМТ 3-4-діоксифенілоцетова кислота (ДОФОК), гомованільна кислота. Дофамінергічна система складається з шести трактів: нігростриарний (чорна субстанція, стриатум, хвостате ядро, скорлупа); мезокортикальний (покришка мозку, таламус); мезолімбічний (покришка мозку, лімбічні структури); тубероінфундибулярний (гіпоталамус, гіпофіз); інтерогіпоталамічний (Zona incerts); діенцефалоспінальний (задній гіпоталамус) [54]. Шляхом клонування виявлено 5 генів, що кодують різні типи дофамінових рецепторів. D1- і D5-рецептори активують аденілатциклазу, а 8 D2 подібні рецептори (D2s, D2l, D3, D4) інгібують аденілатциклазу [50]. Однак зберігається умовний розподіл на основні D1- і D2-рецептори. Вони розташовані на постсинаптичній мембрані. D1-ауторецептори знаходяться на пресинаптичній мембрані та беруть участь у регуляції синтезу та виділення дофаміну. Можливим чинником, що обмежує дофамінергічну передачу при депресії, може слугувати активація пресинаптичних ауторецепторів з наступним обмеженням викиду медіатора у синаптичну щілину [3, 5]. У хворих на депресивні розлади, в клінічній картині яких домінує апатія та загальмованість, відмічено зменшення обміну дофаміну. При аналізі спинномозкової рідини в ній відмічався знижений рівень основного метаболіта дофаміна – гомованільної кислоти [46, 57,59]. Важливим фактом на користь дофамінергічної концепції депресії є наявність дофамінергічної дії в спектрі психотропної активності антидепресивних засобів. При цьому депресивні розлади зменшують препарати з переважним дофамінергічним компонентом, подібні до бупропіону та номіфензину, що здатні полівалентно модулювати нейромедіаторні процеси [3, 36, 49]. Порушення функції серотонінергічної системи головного мозку також спричиняє депресивні розлади [2, 73]. Серотонін (5-НТ) є медіатором змішаної дії, він регулює емоційні стани, циркадні ритми, реакції болю, голоду, сну, статеву поведінку, агресивність. Виділяють наступні етапи синтезу та перетворення 5-НТ: триптофан L-TРИПТОФАН-5ГІДРОКСИЛАЗА 5-НТ МАО 5-оксиіндолоцетова кислота (5-ОІУК). Нейромедіатор знаходиться в таких структурах головного мозку: кора, мигдалик, гіпоталамус, гіпокамп, мозочок, спинний мозок. На сьогодні виділено 14 підтипів серотонінових рецепторів, з яких 5-НТ1-, 5-НТ2-, 5-НТ3- і 5-НТ4рецептори найбільш досліджені. 5-НТ1-, 5-НТ2-рецептори складаються з семи трансмембранних доменів і з’єднані з G-білками, кожен з цих рецепторів включає декілька підтипів. 5-НТ3-рецептори являють собою рецептор-канал, подібний до α-субодиниці М-холінорецепторів. Установлено, що 5-НТ4-, 5-НТ5-, 5-НТ6- і 5-НТ7-рецептори сполучаються з G-білками, однак досліджені недостатньо. До 5-НТ1 – рецепторів належать п’ять підтипів: 5-НТ1А, 5-НТ1В, 5-НТ1D, 5-НТ1Е, 5-НТ1F, активація яких призводить до інгібування аденілатциклази та змін проникності калієвих і кальцієвих каналів. 5-НТ1А-рецептори беруть участь у регуляції емоцій, поведінки, тривожності та температури тіла. Збудження цих рецепторів призводить до відкривання калієвих каналів, гіперполяризації мембрани і гальмування нейронів. Згідно серотонінергічної теорії виникнення депресії 5-НТ відповідає за розвиток тимоаналептичного ефекту антидепресантів [3, 15, 39]. Підтверджують серотонінергічну гіпотезу розвитку депресії експериментальні, клінічні та клініко-морфологічні дані. 9 Руйнування ядра шва викликає зниження рівня 5-НТ у мозку і пригнічення впливу серотонінергічної системи. Це призводить до підвищення емоційної реактивності, порушення поведінки та збільшення вірогідності виникнення емоційно-стресових реакцій [71]. Провідну роль у механізмах розвитку стрес-індукованої депресії (модель “вивченої безпорадності” і “поведінкового відчаю”) відіграє дефіцит 5-НТ, особливо у фронтальній корі та септальній зоні мозку [66]. При депресії спостерігається дефіцит 5-НТ в тканинах мозку, що встановлено при дослідженні post morten осіб, які закінчили життя самогубством [38]. Також відмічено знижений вміст триптофану та 5ОІОК в плазмі крові. У хворих на депресію зменшується вміст серотоніну в депо та збільшується кількість пресинаптичних 5-НТ2 рецепторів, саме це призводить до зниження продукції серотоніну. Зокрема, антидепресивний ефект міансеріну розвивається за рахунок блокади 5-НТ2А рецепторів. Слід зазначити, що пацієнти з такими симптомами, як поганий настрій, апатія, відчуття туги, в більшій кількості вживають вуглеводну їжу, що призводить до гіперглікемії. При цьому виникає гіперінсулінемія, яка збільшує проникність гематоенцефалічного бар’єру для триптофану – попередника серотоніну. Синтез останнього збільшується в ЦНС, що може зменшувати симптоми депресії. Поряд з цим, існує точка зору, щодо надлишку функціональної активності серотонінергічної системи та гіперчутливості постсинаптичних 5-НТ-рецепторів при деяких депресивних станах. Це підтверджується ефективністю трициклічних антидепресантів і селективних інгібіторів зворотнього захоплення серотоніну, лікувальний ефект, яких пов’язаний зі зниженням рівня серотоніну [31, 32, 56]. У появі депресивних розладів певне значення мають порушення функції холінергічної системи. Ацетилхолін − стимулюючий медіатор. Він представлений в таких структурах головного мозку, як кора великих півкуль, стриатум, ретикулярна формація середнього мозку. Цей медіатор відповідає за процеси пам'яті, поведінку, емоції та активуючі психічні процеси. Ацетилхолін – функціональний антагоніст дофаміну. При багатьох психічних захворюваннях виявлені порушення обміну цього медіатора. На участь холінергічної системи мозку в патогенезі депресії вказує підвищення щільності мускаринових рецепторів у лімбічній системі мозку хворих на депресію і в осіб, які покінчили життя самогубством [42]. У механізмах розвитку депресії встановлена суттєва роль ГАМКергічної системи. Гамма-аміномасляна кислота (ГАМК) виконує роль головного гальмівного медіатора і в значній кількості знаходиться в корі великих півкуль, смугастому тілі, блідій кулі та чорній субстанції. Для дослідження цієї системи використовують блокатори ГАМК-рецепторів – бікукулин і пікротоксін. Виділяють два типи рецепторів: ГАМКАрецептори належать до іонотропних і являють собою хемочутливі хлорні канали, що відкриваються при дії ГАМК. ГАМКВ-рецептори – 10 мембранотропні, їх вплив опосередкований через G-білки, вони є мішенню для бензодіазепінів і барбітуратів. Система головного гальмівного медіатора тісно пов’язана з нейромедіаторами гліцином і дофаміном. ГАМК за допомогою медіатора гліцину пригнічує функцію спинного мозку, а через моноамін дофамін – спричиняє седативний, снодійний і анксіолітичний ефекти. На ГАМКергічну теорію розвитку депресії вказує слабкість гальмівної функції ГАМК, що супроводжується гіперзбудливістю емоціогенних лімбічних структур (мигдалик, гіпокамп та інші) [3, 16 - 18]. Дефіцит цього медіатора відмічається в лікворі і сироватці крові хворих з депресивними та тривожними розладами, який міцно корелює з тяжкістю симптоматики. Також в експерименті була показана антидепресивна активність блокаторів ГАМКВ-рецепторів [65]. Гліцинергічна система. Амінокислота гліцин – це основний гальмівний медіатор, який є в нейронах ствола мозку та спинного мозку. Дефіцит нейромедіатора відмічається при тривожних станах [72]. Головними збуджуючими медіаторними амінокислотами в ЦНС, які локалізуються в нейронах кори переднього мозку, мозочку, гіппокампу та спинному мозку є глютамат і аспарат. Глютамат є попередником ГАМК. NMDA-рецептори являються рецепторами збуджуючих амінокислот, їх блокада призводить до розвитку психічних захворювань. Зокрема, встановлена участь NMDA-рецепторів у патогенезі депресії, що підтверджується появою адаптивних змін у цьому рецепторному комплексі (підвищення афінності агоністів гліцинової ділянки) в щурів після проведення тесту примусового плавання [1, 23]. Також при нейрохімічних дослідженнях установлено, що в тканині головного мозку хворих на депресію людей виявляється ослаблення зв’язування ліганда гліцинового сайту NMDA-рецепторів L-689,560 у верхньоскроневій області [77]. Відомо, що глутаматергічний вплив на гальмівні інтернейрони опосередкований активацією NMDA-рецепторів. У щурів з депресивними розладами, що викликані соціальною ізоляцією, виявлялось зниження чутливості ГАМК-ергічних нейронів до дії ко-агоністів NMDA-рецепторів (гліцину і D-серину) та підвищення активності блокатора гліцинзв’язуючого сайту NMDA-рецепторів [41]. Певну роль у розвитку депресивних розладів відіграє система гіпоталамус-гіпофіз-кора надниркових залоз. Вона знаходиться під впливом норадреналіну та 5-НТ, а її гіпофункція призводить до порушення синтезу гормонів [17, 66]. Секреція глюкокортикоїдів відбувається під контролем адренокортикотропного гормону (АКТГ), який виділяється задньою долею гіпофізу. Виділення АКТГ регулює кортикотропін-релізинг фактор (КРФ) у гіпоталамусі. Регуляція секреції глюкокортикоїдних гормонів відбувається за принципом зворотного зв’язку, а їхній рівень за нормальних умов є стабільним. 11 При аналізі вмісту кортизолу у хворих установлений зв’язок між появою депресивного епізоду та порушеннями синтезу глюкокортикоїдів. При депресії зменшується чутливість до дексаметазонового тесту і відсутнє пригнічення оксикортикостерону. Також відмічається підвищений рівень КРФ у спиномозковій рідині, який нормалізується після проведеного лікування антидепресантами [66]. Причиною цього порушення є дефіцит біогенних амінів у мозку, які контролюють секрецію КРФ у гіпоталамусі. Дефіцит норадреналіну призводить до підвищення рівня глюкокортикоїдів, а дефіцит 5-НТ – до його зниження та порушення механізму зворотнього зв’язку. При депресії розвивається замкнуте коло: дефіцит норадреналіну та серотоніну в мозку призводить до підвищення секреції глюкокортикоїдів, а низький рівень глюкокортикоїдів викликає дефіцит моноамінів. Гістамінергічна система. Гістамін − гальмівний і основний медіатор гіпофіза. У хворих на депресію виникає надлишок цього нейромедіатора [34]. У ґенезі депресивних розладів самостійне місце займають порушення добових, сезонних та інших біологічних ритмів організму. За хронобіологічну регуляцію відповідає мелатонін. При депресії спостерігаються десинхронізм, що свідчить про зниження вмісту епіфізарного мелатоніну. Низький рівень мелатоніну в пацієнтів з депресією є ознакою зменшення рівня норадреналіну та серотоніну в головному мозку. Виділяють два біохімічних типи депресії: перший – з низьким рівнем дофаміну, другий – з низьким рівнем дофаміну та серотоніну. 2.3. Класифікація препаратів для лікування депресії Антидепресанти – це лікарські засоби, що використовуються для лікування депресії та субдепресії. Серед антидепресантів виділяють препарати, що мають у спектрі психофармакологічної активності стимулюючий компонент і призначаються для лікування депресій з явищами стійкого пригнічення, вони мають назву тимоеректики. Антидепресантні засоби з вираженим седативним компонентом мають назву тимолептики і призначаються при депресіях з явищами ажитації. У даний час використовуються різні класифікації антидепресантів [31, 32, 34, 39]. Класифікація антидепресантів за механізмом дії: 1. Інгібітори нейронального захоплення катехоламінів 1.1. Невибіркові інгібітори (трициклічні антидепресанти) амітриптилін (саротен), іміпрамін (меліпрамін), кломіпрамін (анафраніл), доксепін. 1.2. Селективні інгібітори зворотного захоплення серотоніну і норадреналіну (не трициклічні антидепресанти без побічних ефектів на серцево-судинну систему) – мілнаципрану 12 гідрохлорид (іксел), дулоксетин (сімбалта), венлафаксин (релаксин, венлаксор). 1.3. Селективні інгібітори зворотного нейронального захоплення серотоніну – флувоксамін (феварин), флуоксетин (портал, продеп, флуксен), пароксетин (паксил), сертралін (золофт), циталопрам (цитагексал). 1.4. Селективні інгібітори зворотного нейронального захоплення норадреналіну – мапротилін (дюдіміл), доксепін. 2. Інгібітори МАО 2.1. Невибіркові інгібітори МАО – ніаламід. 2.2. Вибіркові інгібітори МАО-А – пірліндол (піразидол). 3. Препарати інших груп 3.1. Блокатори центральних пресенаптичних α2-адренорецепторів і 5-НТ2-серотонінових рецепторів – міансерин (леривон). 3.2. Блокатори центральних пресенаптичних α2-адренорецепторів і постсинаптичних 5-НТ2- і 5-НТ3-серотонінових рецепторів – міртазапін (ремерон). 3.3. Стимулятори нейронального захоплення серотоніну (антидепресанти з анксиолітичними властивостями) – тіанептин (коаксил). 3.4. Стимулятори синтезу дофаміну – адеметіонін (гептрал). 3.5. Лікарські засоби, що попереджують порушення нейротрансмітерної передачі норадреналіну, серотоніну, інгібують МАО, КОМТ, модулюють секрецію інтерлейкіну-6 (препарати звіробою) – негрустин, гіперицин (геларіум гіперикум, деприм). Також існує класифікація антидепресантів в основі якої знаходиться хімічна структура препаратів (табл.1). Таблиця 1 Хімічна класифікація антидепресантів [34] № з/п 1 1. Групи антидепресантів Препарати 2 Трициклічні 3 Амітриптилін, азафен, дезіпрамін, іміпрамін, кломіпрамін, доксепін 2. Тетрациклічні Амоксапін, міансерін 3. Біциклічні Тразодон, нефазодон, тетралін, циталопрам міртазипін, мапротилін, 13 Продовж. табл. 1 1 4. 2 Моноциклічні 5. Інгібітори МАО: тетрацикліні біциклічні моноциклічні гідразинові 3 Флуоксетин, флувоксамін, венлафаксин, кловоксамин, ефедрин Піразидол, індопан, тетріндол, міансерин Сиднофен, кароксазон Брофорамін, моклобемід, толоксатон, Ніаламід, іпроніазид Проте ця класифікація не уніфікована, зокрема, виділенні в окремий клас інгібітори МАО, що за хімічною структурою є тетра-, бі- та моноциклічні речовини. Загальними властивостями всіх антидепресивних засобів є тимоаналептичний ефект. У одних препаратів ця дія поєднується зі стимулюючим ефектом, у інших – з седативним компонентом. Також виділяють “збалансовані антидепресанти”, в яких тимоаналептична дія у випадку тривожної і ажитованої депресії супроводжується седативним ефектом, а при депресії, що супроводжується загальмованістю – помірним активуючим компонентом. У клінічній систематиці Кильгольца-Мосолова [34] антидепресанти розділені на три групи: зі стимулюючим, седативним та збалансованим ефектами (табл.2). Таблиця 2 Клінічна систематика антидепресивних препаратів [34] № Групи антидепресантів з/п 1 2 1 Антидепресанти з седативною дією 2 Антидепресанти збалансованої дії Препарати 3 Фторацизин Доксепін (синекван) Амітриптилін (триптизол, лароксил, дамілен) Флувоксамин (феварин) Азафен (піпофезин) Тразадон (триттіко) Міансеиін (леривон) Амоксапін Тіанептин (коаксил) Мапротилін (людиоміл) 14 Продовж. табл. 2 1 2 Антидепресанти зі стимулюючою дією 3 3 Кломіпрамін (анафраніл) Міртазапин (ремерон) Сертралін (золофт) Пароксетин (паксил) Дибензепін Кароксазон Піразідол (пірліндол) Циталопрам (ципраміл) Флуоксетин (прозак, продеп) Іміпрамін (меліпрамін) Бупропіон (велбутрин) Моклобемід (аурорикс) Ніаламід (нуредал) Мілнаципран (Іксел) Сіднофен (фепроседнін) Фенелзін Іпроніазід Класифікація тимоаналептиків Смулевича А.Б. (2001р.) ґрунтується на наявності побічних ефектів [39, 40]. Вони умовно поділяються на антидепресанти першого та другого ряду. До першого ряду відносяться сучасні антидепресанти, які мають помірний тимоаналептичний ефект, у них відсутні тяжкі побічні реакції та є незначний спектр небажаних ефектів (табл. 3). До антидепресантів другого ряду належать препарати, що мають виражену психотропну активність, ефективні при лікуванні тяжких форм депресії, зокрема інгібітори МАО застосовуються в амбулаторних умовах, а трициклічні антидепресанти – в стаціонарі (табл. 3). Таблиця 3. Класифікація тимоаналептиків за Смулевичем А.Б. [39] № п/п 1 1. Групи Препарати антидепресантів 2 3 Антидепресанти Селективні інгібітори зворотного захоплення першого ряду серотоніну: флуоксетин, флувоксамін, піроксен. 15 Продовж. табл. 3 1 2 3 Селективні стимулятори зворотного захоплення серотоніну: тіанептин (коаксил). Зворотні інгібітори МАО-А: (піразидол), моклобемід (аурорикс). пірліндол Стимулятори норадренергічної і серотонінергічної передачі нервових імпульсів: міртазапін (ремерон). Селективні блокатори зворотнього захоплення норадреналіну: міансерін, томоксетін, атомоксетін, ребоксетін. Інгібітори зворотного захоплення серотоніну і норадреналіну: венлафаксін, мілнаципран, дулоксетін. 2. Антидепресанти другого ряду Інгібітори МАО: ніаламід, іпроніазид. Трициклічні антидепресанти: амітриптилін, іміпрамін, кломіпрамін, доксепін. Інгібітори зворотного захоплення моно амінів: мапротилін (людиоміл). 2.4. Механізм дії антидепресантів На сьогодні підтверджено чотири основних механізми терапевтичної дії антидепресантів, а саме [31, 32, 70, 72]: 1. Інгібування зворотного захоплення моно амінів. 2. Інгібування МАО. 3. Блокада постсинаптичних і пресинаптичних моноамінергічних рецепторів. 4. Стимуляція постсинаптичних моноамінергічних рецепторів. Інгібування зворотного захоплення моноамінів є характерним для трициклічних і гетероциклічних антидепресантів. Медіатор із синаптичної щілини, який не зв’язаний із постсинаптичними рецепторами, за допомогою білків-переносчиків надходить до пресинаптичної терміналі. Це запобігає гіперстимуляції рецепторів постсинаптичної мембрани. 16 Зворотне захоплення моноамінів забезпечується “іміпраміновими” рецепторами. У хворих на депресію їх щільність та кількість знижена. Інгібування зворотного захоплення моноамінів призводить до підвищення вмісту вільних нейромедіаторів у синаптичній щілині і збільшує тривалість та інтенсивність їх збуджуючої дії на постсинаптичну мембрану. Інгібітори зворотного захоплення моноамінів не впливають на транспорт дофаміну, на відміну від таких психостимуляторів, як кокаїн, метилфенідат і амфетамінів. Однак зазначені антидепресанти можуть опосередковано полегшувати дофамінергічну передачу шляхом підвищення концентрації норадреналіну в дофамінергічних закінченнях кори головного мозку та десенситизації D2-ауторецепторів переднього мозку, що підвищує настрій і зменшує загальмованість [54]. Інгібітори МАО. Велика кількість моноамінів у синаптичній щілині руйнується ферментом МАО. Існує два основні типи МАО: МАО-А – діє переважно на серотонін (її вибірково інгібує клоргилін) і МАО-В, яка впливає на фенілетиламін (вибірково інгібується селегілином). Обидва типи ферментів знайдені в печінці і головному мозку в більшості видів тварин. Інгібування МАО призводить до підвищення концентрації моноамінів у синаптичній щілині. Інгібітори МАО-А виявляють більшу ефективність порівняно із інгібіторами МАО-В [31]. Вибіркові зворотні інгібітори МАО-А (брофаромін і моклобемід) характеризуються короткою дією і, в порівнянні з невибірковими, незворотніми інгібіторами МАО, значно менше посилюють гіпертензивну дію тираміну та інших симпатоміметиків. Максимальне зниження активності МАО спостерігається вже через декілька днів після початку прийому інгібіторів цього ферменту, однак антидепресивний ефект, як і в більшості інших антидепресантів розвивається лише через кілька тижнів. Причини цього не з’ясовані. Можливо, для достатнього терапевтичного ефекту потрібний розвиток вторинних компенсаторних процесів, зокрема зниження щільності α- і ß-адренорецепторів в ЦНС. Оскільки всі інгібітори МАО (за винятком моклобеміда) діють незворотно, для відновлення запасів ферменту і повернення метаболізму амінів до початкового рівня, після відміни препарату, потрібно до 2 тижнів. Слід зазначити, що найкращий ефект досягається при щоденному прийомі препаратів. Вважається, що антидепресивна дія інгібіторів МАО пов'язана із підвищенням концентрації медіаторів-моноамінів у синапсах ЦНС і симпатичної нервової системи. Блокада постсинаптичних і пресинаптичних моноамінергічних рецепторів [60] характерна майже для всіх антидепресантів, та найбільше для тимоаналептиків нового покоління (тразадон, міртазіпін, нефазодон). Механізм їхньої дії заключається в наступному: антидепресант є агоністом/антагоністом, частково блокує постсинаптичні рецептори і стимулює викид медіатора в синаптичну щілину. При блокаді 17 пресинаптичних ауторецепторів концентрація медіатора в синаптичній щілині збільшується за механізмом зворотнього зв’язку. Антидепресивний та анксіолітичний ефекти тимоаналептиків пов’язані з дією на 5-НТ2- і 5-НТ3-рецептори в гіпокампі. Наступним механізмом дії антидепресантів є стимуляція постсинаптичних моноамінергічних рецепторів. Унаслідок патологічного процесу рецептор постсинаптичної мембрани може бути заблокований метаболітом, що призводить до надмірного накопичення медіатора і зниження активності рецептора. У хворих на депресію відмічено зниження чутливості постсинаптичних адренорецепторів, при цьому антидепресанти виступають агоністами постсинаптичних рецепторів. Якщо є недостатня кількість ліганда, наприклад 5-НТ, антидепрсанти зв’язуються з постсинаптичними рецепторами та нормалізують їх чутливість. До таких тимоаналептиків відносяться міртазіпін, вілоксазін, венлафаксін, бупропіон. Їхній антидепресивний і аксіолітичний ефекти пов’язані із стимуляцією постсинаптичних α-адренорецепторів і 5-НТ1-рецепторів. Крім моноамінових механізмів терапевтичної дії антидепресантів є і немоноамінові механізми. У деяких антидепресантів тимоаналептичний ефект пов’язаний зі збільшенням викиду норадреналіну з депо в пресинаптичну мембрану (цефедрин), блокадою глюкокортикоїдних рецепторів (тіанептин), збільшенням синтезу 5-НТ (гептрал), збільшенням концентрації ГАМК (піразидол). Селективні інгібітори зворотного захоплення серотоніну, трициклічні антидепресанти, інгібітори МАО та інші препарати підвищують концентрацію медіаторів у синаптичній щілині. В результаті їхній вплив на постсинаптичну мембрану збільшується, що покращує передачу нервового імпульсу та призводить до відновлення фону настрою у хворих на депресію. 3. ЕТАПИ ДОСЛІДЖЕННЯ НОВИХ АНТИДЕПРЕСАНТІВ Етапи дослідження потенційних антидепресивних засобів включають скринінг та наступне поглиблене вивчення [6, 33, 37]. На стадії скринінкових досліджень необхідно відокремити засоби, що виявляють антидепресивну дію, та можуть мати практичний інтерес, від препаратів, що такого впливу не мають, та визначити ефективну дозу. Метою другої стадії дослідження є поглиблений аналіз та остаточний відбір речовин, перспективних для подальшого вивчення та уточнення ефективної дози. Для скринінгових досліджень доцільним є використання доз кратних ЛД50 (1/10, 1/20, 1/40 і т.д. від ЛД50). Прийнятним є емпіричний метод, що дозволяє знайти інтервал ефективних доз. Дослідження починають з низьких доз і поступово їх збільшують у кратну кількість разів [11]. 18 Критеріями вибору референс-препарату при вивченні перспективного антидепресанта є подібність фармакологічної активності, механізму дії, походження (синтетичний або природний). Шлях введення речовини залежить від лікарської форми останнього, що буде рекомендована для клінічного застосування. Біодоступність препарату та вираженість фармакологічного ефекту залежить від лікарської форми та шляху введення, необхідно, щоб і референс-препарат використовувався аналогічно. Схема дослідження та режим введення препаратів. Експерименти необхідно проводити на статевозрілих щурах та мишах чоловічої статі. Кожен дослід з визначенням ефективності потенційних антидепресантів передбачає наявність 6 – 12 тварин у групах: 1. Контрольна група – інтактні тварини, які утримуються в стандартних умовах віварію, як і всі інші групи тварин, але на них не моделюється вплив несприятливого чинника, і вони не отримують розчинник чи досліджувану речовину; 2. Контрольна патологія – група тварин, на яких моделюється вплив несприятливого чинника без наступного лікування, з уведенням розчинника чи дистильованої води в еквівалентному об’ємі до досліджуваної сполуки та маси тіла тварин; 3. Дослідна група тварин з модельованим впливом несприятливого чинника, що одержує досліджувану речовину; 4. Дослідна група тварин з модельованою патологією, що одержує препарат порівняння; 5. дослідна група тварин, що не піддається впливу несприятливого чинника та одержує потенційний антидепресант. Досліджувані сполуки зазвичай використовуються в таких режимах введення: - профілактичний – до відтворення аверсивного стимулу; - лікувально-профілактичний – тваринам вводиться засіб за сім-три дні до, та протягом усього періоду дії несприятливого чинника; - лікувальний – тваринам вводиться засіб на фоні модельованої патології. При оцінці впливу несприятливого фактора визначають вірогідні відхилення в порівнянні з показниками інтактних тварин (р<0,05). Критеріями ефективності потенційних антидепресивних засобів та препаратів-порівняння є вірогідні позитивні зміни досліджуваних показників по відношенню до групи з контрольною патологією. Переваги нових речовин над референс-препаратами необхідно вважати при вірогідних відмінностях порівнюваних показників. Експериментальні дані обробляють методами варіаційної статистики із застосовуванням критерію t, χ-квадрат, коефіцієнтів кореляції, коефіцієнтів лінійної регресії та дисперсійного аналізу [9]. 19 4. МЕТОДИ ВИВЧЕННЯ СПЕЦИФІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ЗАСОБІВ, ЩО РЕКОМЕНДУЮТЬЯ ЯК АНТИДЕПРЕСАНТИ Усі методи можна поділити на наступні групи: 4.1. Поведінкові тести. 4.2. Нейрофармакологічні тести. 4.3. Біохімічні методи досліджень. 4.4. Метод радіолігандного зв’язування з різними типами рецепторів. 4.1. Поведінкові тести 4.1.1. Вплив на загальний стан і просторові поведінкові реакції тварин Стан тварин оцінюють після введення їм досліджуваних сполук і відмічають збереження чи зміну локомоції, феномен Штраубе (наявність чи відсутність), положення лап (ходіння на кінчиках лап, розповзання кінцівок, підстрибування, бокове положення), зміни температури тіла, частоти дихання, рефлекторну збудливість, наявність тремору, судом та інше. Загальні зміни поведінки тварин дають змогу оцінити вираженість активуючих або седативних властивостей в досліджуваних речовин [6]. 4.1.2. Тест Порсолта [67-69] Поведінковий “тест відчаю”, або вимушеного плавання отримав широке застосування при аналізі антидепресивної активності речовин. Препарат-порівняння та досліджувані сполуки вводять за 30-60 хвилин до початку експерименту. Для тестування, щурів опускають у білий пластиковий циліндр висотою 60 см. і діаметром 50 см., який на дві третини заповнений водою (температура 20-24 С0), щоб тварина не могла торкатися дна задніми лапами. В основі тесту лежить спостереження за тваринами. Тривалість тесту – 6 хвилин, протягом яких реєструється поведінка тварин у воді. Щури вимушені плавати, якщо можливість вибратися з води відсутня. Після початкового періоду активних спроб, зазвичай їхня активність різко зменшується [67-69]. Досліджують наступні показники: латентний період першого “зависання” (іммобільність більше 5 сек.), загальний час (сек.) іммобільності (тварина пасивно плаває у воді зі злегка припіднятою головою, всі чотири кінцівки нерухомі, ураховується кількість стрибків з води – спроба уникнути аверсивного впливу). При цьому стадію “зависання” інтерпретують як прояв “відчаю”, латентність та загальна тривалість якого може бути чутливою до дії введених сполук. Під впливом потенційних антидепресантів латентний період і кількість стрибків з води збільшується, а загальний час іммобільності зменшується. 20 4.1.3. Тест із водяним колесом Nomura [43] Тест має широке застосування при дослідженні препаратів, які рекомендуються в якості антидепресантів, на поведінкові реакції тварин. Препарат-порівняння та досліджувані сполуки вводять за 30-60 хвилин до початку дослідження. При тестуванні щурів опускають у ємкість довжиною 20 см., шириною 8 см. та висотою 18 см., заповненою водою (температура 24 С0) на 9 см., з водяним колесом у центрі. Водяне колесо у вигляді валу діаметром 3 см. і довжиною 6 см., на ньому розміщені шість лопаток шириною 0,5 см. Колесо рухається при навантаженні на нього більше 5 г. Тривалість тесту 15 хв., протягом яких реєструється поведінка тварин. В основі тесту лежить спостереження за тваринами, які енергійно плавають та намагаються вибратись з води. Тварина знаходить водяне колесо та забирається на нього, і крутить його вагою свого тіла. Згодом різко зменшується активність до мінімуму, яка необхідна, щоб триматися за колесо або на колесі чи тільки для утримання голови на поверхні води. У даному тесті поведінковими показниками є: кількість рухів колеса за хвилину та час настання його нерухомості. При цьому початок стадії нерухомості інтерпретують як прояв “відчаю”, тривалість якої може бути чутливою до впливу досліджуваних речовин. Під впливом антидепресантів кількість рухів водяного колеса та час настання стадії нерухомості також збільшуються. 4.1.4. Тест підвішування за хвіст [55] Даний тест є близьким до тесту Порсолта. Він ґрунтується на спостереженні за гризунами, що підвішені за хвіст і залишаються певний час нерухомі. Останній свідчить про рівень тривожності/страху та депресивності. При тестуванні щурів поміщають у камеру 51х25х15 см., яка розділена на три відсіки по 16 см., підвішують тварин за хвіст на лейкопластир на відстані 1,5 см. від кінчика хвоста. Тривалість тесту 6 хв., протягом яких одночасно реєструється поведінка 3 щурів. Ураховують час, протягом якого тварина буде лишатись нерухомою (до моменту, доки кінчик носа не досягне основи хвоста). Під впливом антидепресантів латентний період іммобільності зменшується. 4.2. НЕЙРОФАРМАКОЛОГІЧНІ ТЕСТИ 4.2.1. Дослідження ефектів потенційних антидепресантів на дію речовин, що мають гальмівний вплив на ЦНС Вплив на депресивні ефекти резерпіну [31]. Особливістю нейромедіаторних препаратів у цьому методі є збільшення вмісту моноамінів в області постсинаптичних рецепторів, навіть при одноразовому введенні сполук, що виявляють виражений антагонізм із резерпіном і резерпіноподібними (тетрабеназин) речовинами. 21 Така протидія характерна для інгібіторів МАО і для блокаторів зворотного нейронального захоплення моноамінів. Антидепресанти, що мало впливають на захоплення моноамінів (тразодон, міансерин, іприндол), зовсім не проявляють антирезерпінової активності або проявляють її в незначному ступені. Резерпін – антагоніст серотонінергічної системи, має депресивний вплив на ЦНС тварин. Експерименти виконуються на мишах і щурах. Резерпін вводять внутрішньоочеревинно мишам у дозі 2,5 мг/кг, щурам − у дозі 4 мг/кг маси тіла. Для дослідження профілактичної дії препарат порівняння та досліджувані сполуки вводять внутрішньоочеревинно або підшкірно за 30 хвилин до ін’єкції резерпіну, а при уведенні per os за 60 хвилин. Також речовини можна застосовувати в лікувальному режимі на фоні розвитку змодельованої патології через 4-17 годин. Оцінку депресивних ефектів проводять через 4 години від початку експерименту. В основі тесту знаходиться спостереження за тваринами, оцінюють: зменшення рухової активності, блефароптоз, гіпотермію, наявність або відсутність пілоерекції та пози “горба”. Дослідження рухової активності. Щурів поміщають до установки “відкрите поле”, що являє собою прямокутну платформу розміром 100х100 см. із прозорими стінками висотою 40 см.. Підлогою слугує лист білого пластика, на ньому чорною фарбою нанесена решітка, яка поділяє поле на квадрати довжина сторони яких дорівнює 10 см.. Освітлення проводиться лампою 100 Вт, розміщеною на висоті 150 см. над центром підлоги. Зовнішніми квадратами вважають ті, що прилягають до стін поля, а внутрішні – не торкаються стін поля. Тест триває 5 хв., протягом яких спостерігають за тваринами. Рухова активність оцінюється за кількістю пересічених квадратів. Дослідження вегетативних порушень. Птоз у щурів вимірюється в балах за розміром очної щілини: 3 бали – повне закриття ока, 2 бали – щілина до 1 мм., 1 бал – щілина до 2 мм., 0 балів – око відкрите повністю. Температура тіла тварин вимірюється електротермометром з ректальним датчиком, електрод вводиться на глибину 1,5-1,8 см. у пряму кишку. Ригідність м’язів тулуба оцінюють за позою “горба” – зменшенням відстані від шиї до основи хвоста за рахунок згорбленості щура. Ригідність оцінюють у бальній системі: 0 балів – відсутність ригідності, 1 бал – зменшення відстані від шиї до основи хвоста менше ніж на 3 см., 2 бала – більше ніж на 3 см.. Пілоерекція – шерсть стає дибом на шиї щурів. Оцінюють відсоток тварин у групі, в яких виник указаний симптом. Введення антидепресантів разове чи повторне (попереднє чи на фоні дії резерпіну) зменшує або попереджає розвиток блефароптозу, гіпотермії, пози “горба”, пілоерекції та запобігає порушенням рухової активності тварин. 22 Вплив на депресивні ефекти галоперидолу (нейролептиків). Галоперидол є типовим нейролептиком. Механізм його дії пов'язаний з блокадою дофамінових рецепторів, центральною αадреноблокуючою дією та порушенням процесів зворотного захоплення і депонування норадреналіну. Галоперидол вводять внутрішньоочеревинно в дозі 1 мг/кг маси тіла. Оцінку депресивних ефектів проводять через 30-60 хвилин. В основі тесту знаходиться спостереження за тваринами, оцінюють: пригнічення рухової активності, втрату м’язового тонусу, розвиток каталепсії та гіпотермії [22]. Рухову активність тварин визначають у тесті “відкрите поле” [37] – кількість пересічених квадратів за 5 хвилин. Втрату м’язового тонусу – в тесті вертикальний екран [37]. Для цього тварин поміщають на екран, що являє собою металеву сітку з розміром вічка 1х1 см., яка натягнута на дерев’яну раму 40х60 см., товщиною 1 см.. У центрі рамки вбудована вертикальна дерев’яна перетинка висотою 10 см. та товщиною 1 см., яка поділяє сітку на дві частини так, що можна проводити тестування двох щурів одночасно. По краях (окрім нижнього) рамка має стінки аналогічного розміру. Екран розміщується вертикально, на краю стола, на висоті 60 см. від поверхні підлоги. Тест триває 3 хвилини, протягом яких тварини намагаються утриматися на сітці, тобто протидіяти силі тяжіння. Реєструють час утримування на сітці щурів (сек.). Якщо тварина падає вниз, її підсаджують на сітку знову, і так до трьох разів, та підраховують загальний час утримання. Також враховують латентний період першого падіння (сек.). Метод оцінки каталепсії за Morpurgo [63]. Тривалість каталепсії в щурів визначають за здатністю зберігати протягом певного часу незвичну позу. Тварину розміщують так, щоб спочатку передня ліва лапка опиралась на сходинку висотою 3 см., а передня права лапка була без опори, а потім навпаки. Якщо щур зберігає надану позу протягом 10 секунд, нараховується 0,5 бали на кожну лапку. Задня ліва лапка опирається на сходинку висотою 10 см., а задня права лапка – без опори. Аналогічні маніпуляції проводять з правою задньою лапкою. Якщо тварина зберігає надану вимушену позу 10 секунд і більше, нараховується 1 бал за кожну лапку. Максимальний розвиток каталепсії в одного щура оцінюється в 3 бали. Для оцінки каталепсії також можна використовувати шкалу Di Chiara-Morelli [51]. Її розвиток оцінюють за здатністю зберігати надану тварині незвичну позу. При збереженні наданої пози твариною протягом 15-29 секунд нараховується 1 бал, 30-59 секунд − 2 бали, 60 та більше секунд − 3 бала. Наявність каталепсії можна оцінити якісно. З цією метою тварині надається вимушене положення – “поза лектора”, при цьому передні лапки тварини розміщують на горизонтальній рейці, що піднята на висоту 10 см.. “Позу лектора” можна оцінити і кількісно, визначаючи час утримання 23 даної пози протягом 5 хвилин, а потім підраховують середній час збереження “пози лектора” для групи тварин. Метод оцінки каталепсії з використанням паралельних перекладин. Передні та задні кінцівки тварини кладуть на паралельні перекладини таким чином, щоб спина щура була пряма. Фіксують час перебування тварини в нерухомому стані, оцінюють загальну тривалість каталепсії та відсоток щурів із каталепсією в групі. Наявність каталепсії відмічають при перебуванні щурів у нерухомому стані протягом 45 секунд. Температуру тіла вимірюють електротермометром з ректальним датчиком, електрод вводять у пряму кишку на глибину 1,5-1,8 см.. Застосування антидепресантів разове чи повторне зменшує або попереджає пригнічення м'язового тонусу, явища каталепсії і зниження ректальної температури. Вплив на ефекти клофеліну [31, 32]. Клофелін – антигіпертензивний препарат, дія якого пов’язана з активацією центральних пресинаптичних α2-адренорецепторів і зменшенням викиду в синаптичну щілину норадреналіну. Клофелін вводять внутрішньоочеревинно в дозі 0,1-0,2 мг/кг маси тіла. Оцінку депресивних ефектів проводять через 2-4 години. В основі тесту знаходиться спостереження за тваринами, оцінюють: загальне пригнічення, зменшення рухової активності, гіпотермію. Зміну поведінкових реакцій під впливом досліджуваних сполук оцінюють у тесті “відкрите поле”. Рухову активність підраховують за кількістю пересічених квадратів. Наявність загального пригнічення щурів оцінюють за тривалістю та кількістю актів фризингу (замирання). На фоні введення центрального α2-адреноміметика і потенційних антидепресантів температуру тіла вимірюють електротермометром з ректальним датчиком, електрод вводять у пряму кишку на 1,5-1,8 см.. Застосування речовин з антидепресивними властивостями разове чи повторне, профілактичне чи лікувальне зменшує або попереджає розвиток депресивних явищ, викликаних клофеліном. Вплив на гіпнотичну дію барбітуратів [32]. Гексенал (тіопентал натрію) вводять внутрішньоочеревинно в дозі 20-40 мг/кг маси тіла. Препарат порівняння та досліджувані сполуки вводять за 30 хвилин до застосування барбітурату. Оцінку гіпнотичної дії проводять через 5 хвилин. В основі тесту − спостереження за тваринами. При цьому реєструють латентний час виникнення бокового положення і його тривалість за втратою та відновленням рефлексу перевертання. Методика оцінки гіпнотичного ефекту за боковим положенням тварин. Щури контрольної групи при наданні їм незручної пози (на спині або боці) швидко повертаються в нормальне положення, тобто 24 відбувається рефлекс перевертання. Під впливом гексеналу щури протягом деякого часу залишаються в незручній позі на спині або на боці. Уведення трициклічних антидепресантів (разове чи профілактичне) подовжує снодійний вплив гексеналу, це пов’язане з наявністю седативної дії у препаратах цієї групи. Інгібітори МАО підсилюють дію гексеналу, такий ефект спостерігається, коли антидепресанти вводять за 1-6 годин до ін’єкції барбітурату. 4.2.2. Дослідження ефектів потенційних антидепресантів на дію речовин, що мають активуючий вплив на ЦНС Вплив на ефекти фенаміну [37]. Дія фенаміну зумовлена вивільненням дофаміну і норадреналіну в синаптичну щілину. При цьому вивільнення дофаміну в мезолімбічній ділянці супроводжується збільшенням рухової активності, а вивільнення в нігростриарній області – появою стереотипії поведінки. Взаємодію потенційних антидепресантів з фенаміном вивчають за показниками фенамінової стереотипії та гіпертермії в мишей і щурів, “групової токсичності” − в мишей, десинхронізації електроенцефалограми − в котів і кролів. Фенамін вводять внутрішньоочеревинно в дозі 2,5-5,0 мг/кг маси тіла. Препарат порівняння та досліджувані сполуки уводять таким же шляхом за 30 хвилин до ін’єкції фенаміну. В основі тесту − спостереження за тваринами, через 15-30 хвилин оцінюють наявність стереотипної поведінки та гіпертермії. Фенамінову стереотипію оцінюють у кожної тварини протягом 1 хвилини спостереження. Стереотипні реакції – це принюхування, гризіння, лизання. Їх інтенсивність визначають у балах: окремі стереотипні рухи – 1 бал, наявність нетривалої стереотипії – 2 бали, постійна інтенсивна стереотипія – 3 бали. Після введення фенаміну температуру тіла тварин вимірюють електротермометром з ректальним датчиком кожну годину протягом 4 годин. При вивченні “групової токсичності” визначають летальність у мишей, яких групують по 10 у клітки розмірами 25 х 15 х 10 см.. У цих дослідах фенамін використовують у дозах 2,5 – 5,0 – 7,5 – 10,0 мг/кг підшкірно. В електрофізіологічних дослідженнях на котах і кролях при вивченні впливу на десинхронізуючу дію, фенамін застосовують у дозах 0,5 – 1,0 мг/кг внутрішньовенно. Введення антидепресантів разове чи повторне підсилює ефекти фенаміну. 25 Вплив на ефекти апоморфіну [37]. Антагоністична взаємодія з апоморфіном (за тестом з гіпотермії) характерна для іміпраміноподібних речовин – номіфензина, мапротиліна, тобто для блокаторів зворотного захоплення катехоламінів. При цьому інгібітори МАО і блокатори серотонінових рецепторів (міансерин, тразодон) антагонізму з апоморфіном не виявляють. Гіпотермічний ефект апоморфіну має інший механізм розвитку, ніж у резерпіну, тому дає можливість розмежувати антидепресанти, що є блокаторами зворотного захоплення дофаміну чи серотоніну. Ефекти апоморфіну пов’язані із стимуляцією дофамінових рецепторів у нігростриарній області. Експерименти виконуються на щурах. Апоморфін вводять підшкірно в дозі 10-25 мг/кг маси тіла для оцінки гіпотермії. Препарат порівняння та досліджувані сполуки вводять за 30120 хвилин до ін’єкції апоморфіну. В основі тесту знаходиться спостереження за тваринами, яке проводять через 15-30 хвилин, визначають наявність гіпотермії, стереотипної поведінки, підвищеної рухової активності, агресивності та феномен гризіння (паперова підлога). Температуру тіла вимірюють через 30, 60, 90 хвилин після введення апоморфіну електротермометром з ректальним датчиком, електрод уводять у пряму кишку на 1,5-1,8 см.. Наявність гіперлокомоції тварин оцінюють у тесті “відкрите поле”, яку підраховують за кількістю пересічених квадратів протягом 5 хвилин тестування. Також оцінюють агресивність тварин. У клітку поміщають два щури та підраховують кількість агресивних атак за 5 хвилин спостереження. Попереднє введення антидепресантів – блокаторів зворотного захоплення катехоламінів зменшує або усуває гіпотермію і посилює ряд інших ефектів апоморфіну: гризіння, стереотипію, рухову активність, агресивність та інше. Антидепресанти, що володіють антимоноаміноксидазною активністю, підсилюють та подовжують гіпотермічний ефект апоморфіну. Вплив на ефекти L-ДОФА (L-3,4-диоксифеніланін) [37]. L-ДОФА – попередник катехоламінів, його введення підвищує вміст дофаміну в головного мозку. Уведення L-ДОФА внутрішньоочеревинно в дозі 100-200 мг/кг, що викликає пригнічення дихання, гіпотермію і зменшення рухової активності. У дозі 500 мг/кг та більших дозах попередник катехоламінів викликає такі ефекти як збудження, збільшення рухової активності, агресивність, стереотипну поведінку, підвищення температури тіла та підвищення тонусу вегетативної нервової системи (пілоерекцію, гіперсалівацію, екзофтальм, збільшення сечовиділення та ін.). Препарат порівняння та досліджувані сполуки вводять за 30-90 хвилин до введення L-ДОФА. Дослідження проводять через 30-60 хвилин. В основі тесту лежить спостереження за тваринами, оцінюють: збільшення 26 рухової активності, агресивність, стереотипію, температуру тіла та збудження вегетативної нервової системи. Поведінкові зміни рухової активності тварин досліджують у тесті “відкрите поле” за кількістю пересічених квадратів за 5 хвилин. Паралельно підраховують кількість уринацій. Наявність стереотипної поведінки вивчають у кожної тварини протягом 1 хвилини, інтенсивність якої визначають у балах: окремі стереотипні рухи – 1 бал, наявність нетривалої стереотипії – 2 бали, постійна інтенсивна стереотипія – 3 бали. Температуру тіла вимірюють електротермометром з ректальним датчиком, який вводять у пряму кишку на 1,5-1,8 см.. Методика дослідження салівації в щурів. Салівацію оцінюють за розміром вологої плями на шиї в балах: до 2 см. – 3 бали, до 1 см. – 2 бали, до 0,5 см. – 1 бал, при відсутності ефекту бали не нараховуються. Запобіжне введення антидепресантів, особливо інгібіторів МАО, сприяє тому, що L-ДОФА в дозі 100-200 мг/кг викликає таку ж саму дію, як і при введенні його в дозі 500 мг/кг, тобто підсилюється стимулююча дія попередника катехоламінів. Вплив на ефекти 5-окситриптофана [37]. Центральні ефекти 5-окситриптофана пов’язані із стимуляцією серотонінергічних структур головного мозку. При цьому відмічається тремор, стереотипна поведінка, гіпертермія в кролів і гіпотермія та струшування головою в мишей. Уводять 5-окситриптофан внутрішньоочеревинно в дозі 50 та 300 мг/кг маси тіла. Препарат порівняння та досліджувані сполуки вводять за 30-60 хвилин до застосування стимулятора серотонінергічної системи 5-окситриптофана. Судомна активність 5-окситриптофану найвираженіша через 20-30 хвилин після його введення. В основі тесту знаходиться спостереження за тваринами. Феномен струшування головою (head twich, “хитання”) є найрозповсюдженішим методом оцінки впливу на серотонінергічні структури головного мозку. У дозі 50 мг/кг 5-окситриптофан практично не викликає струшування головою. Попереднє введення інгібіторів МАО підсилює дію 5-окситриптофана в цій дозі, та сприяє появі множинних похитувань головою. У дозі 300 мг/кг маси тіла 5-окситриптофан викликає струшування головою, що суттєво зменшується під впливом антидепресантів не інгібіторів МАО. Найбільш активні атипові антидепресанти (міансерин, тразодан) та блокатори зворотного захоплення моноамінів (амітриптилін, іміпрамін) також володіють серотонінолітичним ефектом. 27 Вплив на дію триптаміну [37]. Дія триптаміну пов’язана із стимуляцією серотонінергічних структур головного мозку. Введення триптаміну щурам внутрішньовенно в дозі 5 мг/кг маси тіла і мишам внутрішньоочеревинно у дозі 25 мг/кг не впливає на стан і поведінку тварин. Лише його великі дози (40 мг/кг) викликають зміни поведінки (нетривалі, до 15 секунд), клонічні судоми, “гру на роялі” передніх лап, появу пози “горба”, ціаноз хвоста та кінчика морди, явища ядухи). Зазвичай препарат порівняння та досліджувані сполуки вводять за 30-60 хвилин до введення триптаміну. Оцінку проводять через 20-30 хвилин. Вона полягає в спостереженні за тваринами, оцінюють: нетривалі (15 сек.) клонічні судоми, “гру на роялі” передніх лап, позу “горба”, ціаноз хвоста та кінчика морди, наявність ядухи. Після попереднього введення інгібіторів МАО триптамін у дозі 5 мг/кг маси тіла викликає клонічні судоми, “гру на роялі” передніх лап, позу “горба”, ціаноз хвоста та кінчика морди, наявність ядухи. Антидепресанти з іншим механізмом дії не підсилюють ефекти триптаміну, що характерні для дози 40 мг/кг. Взаємодія з оксотреморином, ареколіном [37]. Оксотреморин – активний метаболіт треморину (специфічний холінергічний антагоніст мускарину). Експерименти проводять на мишах. Оксотреморин уводять внутрішньоочеревинно в дозі 0,25 – 0,5 мг/кг маси тіла. Оцінку проводять через 30-60 хвилин. В основі тесту знаходиться спостереження за тваринами, визначають наявність: тремору, ригідності м’язів (поза “горба”), пілоерекції, салівації та гіпотермії. Методика оцінки тремору. Визначають наявність і виразність тремору і виражають у балах у залежності від його тривалості (час початку та закінчення). Оцінка тремору в балах: 0 – відсутній, 1 – локальний дрібноамплітудний тремор голови, передніх лап або хвоста, 2 – локальний середньоамплітудний тремор, 3 – генералізований дрібно- або середньоамплітудний тремор усього тіла. Профілактичне введення антидепресантів, що володіють антихолінергічною активністю (амітриптилін, мапротилін, імізин та інші), попереджають розвиток тремору, ригідністі м’язів, пілоерекції, гіперсалівації та гіпотермії. Найбільш виражено зменшують гіпотермію. Вплив на центральні холінергічні рецептори можна вивчати в дослідах на ненаркотизованих кролях і котах, яким для нерухомості попередньо вводять диплацин (4–6 мг/кг внутрішньовенно). При цьому досліджують зменшення десинхронізуючої дії на ЕЕГ антихолінестеразних засобів галантаміна (1 – 2 мг/кг), фізостигміна (0,1 – 0,2 мг/кг) і холіноміметика ареколіна (0,25 – 0,5 мг/кг), що вводять внутрішньовенно. Холінопозитивні засоби викликають виразну десинхронізацію біоелектричної активності мозку. При цьому антидепресивні засоби, що 28 володіють центральною антихолінергічною дією (іміпрамін, амітриптилін, фторацезин, мапротилін), зменшують, або повністю знімають активацію ЕЕГ, викликану антихолінестеразними та холіноміметичними засобами. 4.3. Біохімічні методи досліджень 4.3.1. Визначення активності моноамінооксидази in vitro та в тканинах [4]. В експериментах “in vitro” використовують суспензії фрагментів мітохондріальних мембран печінки та мозку щурів. Досліди “in vivo” також проводять на щурах. Активність МАО визначають у сироватці крові, гомогенатах печінки та мозку щурів. Тварин піддають евтаназії в різні терміни після введення досліджуваної речовини і референс-препарату. Для визначення активності МАО типу А використовують в якості субстрату норадреналін і серотонін, а для визначення активності МАО типу Б використовують у якості субстрату фенілетиламін і бензиламін. Препарат порівняння та досліджувані сполуки вводять за 30 хвилин до евтаназії тварин. Активність МАО визначають у 50% гомогенатах печінки та мозку тварин, що приготовані на 10 мМ фосфатному буфері (рН 7,4), що містить 2% детергента Тритона Х-100. У дослідах з МАО мозку, в якості субстрактів використовують (у мкмолях на 1,8 мл. проби): норадреналіну бітартрат – 4; серотоніну креатинінсульфат – 12; дофаміну гідрохлорид – 6; тераміну гідрохлорид – 8; 2-фенілетиламіну гідрохлорид – 2. Для визначення активності МАО печінки субстрати використовують у наступних оптимальних концентраціях (у мкмолях на 1,8 мл. проби): серотонін і дофамін – 10; терамін – 6; 2-фенілетиламін гідрохлорид – 0,8. Про активність МАО судять за виділенням аміаку в процесі інкубації проб протягом 50 хв. при температурі 37 0С в атмосфері кисню. У суспензії мітохондрій вміст білку визначають за Лоурі. 4.3.2. Визначення активності моноамінооксидази в сироватці крові [8]. У скляні центрифужні пробірки наливають 0,5 мл. фосфатного буфера 0,2 М із рН 7,4; 2,0 мл. дистильованої води; 0,5 мл. сироватки або плазми крові; 0,1 мл. 1% розчину бензиламіну гідрохлориду. У контрольні пробірки замість бензиламіна вносять 0,1 мл. води. Дослідні та контрольні проби інкубують протягом 3 годин при температурі 37 С0, періодично помішують, потім додають по 1 мл. 20% розчину трихлороцтової кислоти, добре перемішують скляною паличкою і через 5-7 хвилин центрифугують протягом 5-10 хвилин при 2-3 тис. об/хв. Надосадову рідину зливають у центрифужні пробірки та додають по 0,5 мл. 0,1% розчину 2,4-динітрофенілгідразину, приготованого на 2Н розчині HCI. Для приготування розчину 2,4-динітрофенілгідразину його кип’ятять 30 хв.. Вміст пробірок 29 перемішують і залишають на 20-30 хвилин при кімнатній температурі, потім центрифугують 20-30 хвилин при 2,5-3,0 тис. об/хвилину, швидко зливають надосадову рідину із видаленням останньої краплі розчину з країв пробірки фільтрувальним папером. До осаду гідразону бензальдегіду додають 1-2 краплі розчину 1-3 Н їдкого натрію і струшують. Швидко утворюється бурий колір. Через 1-2 хвилини в проби додають по 1 мл. дистильованої води, а безпосередньо перед колориметрією по 1 мл. ацетону (або етанолу), після чого утворюється малиново-фіолетове забарвлення. Швидко колориметрують на ФЭК-56 (або ФЭК-М) проти води, зелений фільтр, кювета товщиною 0,5 см.. Активність МАО розраховують за формулою: А = (Е0 − Ех) х 2 х 1/3 (результат виражають в одиницях екстинкції на 1 мл. сироватки крові за 1 годину інкубації), де 2 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл. сироватки (якщо в пробу вносять 0,5 мл. сироватки), 1/3 − коефіцієнт перерахунку на 1 годину інкубації (при інкубації проб протягом 3 годин). Активність МАО можна виражати і в абсолютній кількості продукту реакції (бензальдегіду), що утворився за 1 годину інкубації на 1 мл. сироватки. Потім будують калібрувальний графік з урахуванням залежності величини екстинкції розчину гідразона від кількості доданого в інкубаційне середовище бензальдегіду. Вимірювання активності МАО потрібно проводити в перші 2 години після взяття крові, сироватку зберігають на холоді. Збільшення часу інкубації (від 1 до 5 годин) і об’єму сироватки в інкубаційному середовищі (від 0,1 до 1,0 мл.) супроводжується лінійним збільшенням екстинкції проб. Насичуюча концентрація субстрату досягається при внесенні в пробу 0,35-1,0 мг. бензиламіну солянокислого. Оптимальна рН інкубаційного середовища для МАО сироватки дорівнює 7,2-7,4. 4.3.3. Визначення вмісту катехоламінів, серотоніну та їх метаболітів у структурах головного мозку щурів [37]. Найбільш чутливим, точним і загальноприйнятим є метод високоефективної рідинної хроматографії з електрохімічною детекцією. Для визначення вмісту моноамінів у структурах головного мозку рекомендується використовувати високоефективну рідинну хроматографію з електрохімічною детекцією в звернених фазах з іонпарним реагентом оксилсульфатом натрію. Стандартні розчини моноамінів і внутрішнього стандарту 3,4-діоксибензиламіну з концентрацією 0,1 мг/кг готують 2 рази на місяць, на 0,1 Н HClO4, з додаванням 1% метабісульфату натрію. Стандартні розчини (100 нг/мл.) , що необхідні для калібровки прибору, готують щодня. Для визначення катехоламінів і ДОФА використовують метод вибіркового осадження їх на оксиді алюмінію в лужному середовищі. 30 Досліджувані субстанції вводять внутрішньоочеревинно або перорально за 1 годину до проведення евтаназії тварин та взяття матеріалу для дослідження. Тканини гомогенізують у 20 об’ємах 0,1 Н HClO4. Потім зразки центрифугують при 10000 g протягом 5 хвилин. Осадження на оксиді алюмінію проводять у гранульованій бульбашці. Суміш містить: 2 мл. супернатанта, 2,5 мл. 3,4-діоксибензиламіна, 50 мг. Al2O3 і 1 мл. трис-HCl буфера з етилендиамінтрихлороцетовою кислотою (1,5 М, pH=8,6). Після триразового промивання 2 мл. бідистильованою водою катехоламіни і ДОФА елюірують за допомогою 200 мкл. 0,1 Н HClO4, шляхом центрифугування через целюлозні фільтри (0,2 мкм.). Для визначення катехоламінів, 5-НТ, 5-оксиіндолоцетової кислоти, 3,4-диоксифенілоцетової кислоти та гомованілової кислоти до гомогенату тканини додають 20 об’ємів 0,1 Н HClO4, що містить 3,4діоксибензиламіна. Потім зразки центрифугують при 15000g протягом 10 хвилин. Супернатант фільтрують шляхом центрифугування протягом 2 хвилин через целюлозні фільтри діаметром 0,2 мкл. На наступному етапі 20 мкл. чистого фільтрату наносять на колонку шляхом прямої ін’єкції. Розділення досліджуваних речовин проводять на хроматографі типу LC-304 T з інжектором 7125 Reodyne 20 мкл. і петлею для нанесення зразків. Використовують колонку Biophase RP-18 октадецилсіланову 250 мм., захищену предколонкою RP-18 4,6 мм., 30 мм., 20 мкл. колонку термостатують при температурі 45 0С. У якості детектора використовують подвійний амперметричний детектор LC-4B з гніздами LC-17D, двома паралельними стекловуглецевими електродами TL-5. Потенціали, що прикладають до робочих електродів, складають +650 мВ і +850 мВ проти Ag/AgCl електрода порівняння RE-1. Швидкість потоку – 1 мл/хв. Для визначення катехоламінів: серотоніну, 5-оксиіндолоцетової кислоти, 3,4-діоксифенілоцетової кислоти та гомованілової кислоти використовують наступну рухому фазу. Основні розчини 0,02 М лимонної кислоти і 0,02 М NaH2PO4, буфера, що містить 0,269 мМ ЕДТА, змішують у пропорції 2,45:1. Потім додають 0,3мМ OCH і 40% ацетонітрила, рН=3,6 встановлюється додаванням фосфорної кислоти. Рухому фазу фільтрують, застосовуючи вакуумний насос, через целюлозні фільтри (0,25мкм.) типу “Синпор”. Для визначення катехоламінів і ДОФА в якості рухомої фази використовують 0,15 М буфер монохлороцетової кислоти, що містять 2 мМ Na2ЕДТА і 25-30мг/л. ОСН, рН=3,0, яка доводиться додаванням NaОН. Рухому фазу фільтрують. Підвищення кількості катехоламінів (навіть незначне) є ознакою їх захоплення. При цьому різні антидепресанти неоднаково гальмують зворотне захоплення тих або інших моноамінів. 31 4.4. Метод радіолігандного зв’язування з різними типами рецепторів [37]. Метод радіолігандного зв’язування дозволяє безпосередньо оцінити взаємодію сполуки з рецепторами. З цією метою застосовують специфічні радіоліганди (з визначеною питомою радіоактивністю), що специфічно зв’язуються з різними типами адрено-, серотоніно-, холіно-, ГАМК- та іншими рецепторами головного мозку. У якості радіолігандів адренорецепторів використовують [3Н]-празозин або [3Н]-2-(2,6диметоксіфеноксиетил) амінометилбензодіоксан; α1-адренорецепторів – [3Н]клофелін; β-адренорецепторів – [3Н]-дигідроальпренолол; 5-НТ1А- рецепторів − [3Н]-серотонін, [3Н]-ЛСД [3Н]-ЛСД, а також [3Н]-(ЗН)-8-гідрокси-nдипропіламінотетралін виявляє високу спорідненість як до 5-НТ1-, так і до 5-НТ2-рецепторів; 5-НТ2-рецепторів – [3Н]- спіроперидол (у стріатумі та структурах лімбічної системи), [3Н]-спіроперидол у інших структурах ЦНС зв’язується переважно з D1-рецепторами; М-холінорецепторів – [3Н]хінуклідилбензилат; гістамінових рецепторів – [3Н]-мепирамін. Техніка дослідження заключається у визначенні різниці у зв’язуванні гомогенатами мозку щурів радіолігандів у присутності та відсутності відповідних антидепресантів. Різні антидепресанти викликають відповідну блокувальну на рецептори дію, але майже всі вони значно подавляють зв’язування радіолігандів з β-адрено- і 5-НТ2-рецепторами. При тривалому введенні антидепресивних засобів відбувається перебудова рецептурних систем організму. 5. ВИСНОВКИ 1. При доклінічному дослідженні нових сполук – потенційних антидепресантів, виникають певні труднощі, що пов’язані з відсутністю адекватної моделі депресії на тваринах. Це обумовлено неможливістю відтворити психічну депресію, характерну для людини, в експериментах на тваринах. 2. Для дослідження антидепресивної активності нових хімічних сполук застосовуються сучасні експериментальні моделі, на яких з великою вірогідністю можливо виявити потенційні антидепресанти. Однак, більшість з них трудомісткі і тому можуть бути рекомендовані лише в якості додаткових методів. 3. За даними літератури, а також з досвіду нашої роботи, рекомендується раціональний методологічний підхід для скринінгового фармакологічного дослідження потенційних антидепресивних засобів, який базується на застосуванні таких методів, як: тест Porsolt (та його модифікації) і тест з водяним колесом Nomura et al. [43], які виявляють активуючий ефект сполук за умов помірного емоційного стресу [26], тести, 32 що виявляють антирезерпінову активність, а також потенціюють вплив фенаміну, L-ДОФА і 5-окситриптофану. Поряд з цим, тести, що виявляють антисеротонінову дію, найбільш характерні для виявлення потенційних атипових антидепресантів, таких як міансерин і тразодон. Методи мають інформативну цінність тому, що відображають вплив сполук на певні ланки нейрохімічних процесів головного мозку, з якими, за сучасними уявленнями, пов'язаний патогенез депресії. 33 ПЕРЕЛІК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ 1. Абрамец И.И. Изменения пластических свойств и метапластичности глутаматергических синапсов головного мозга при депрессии и действии антидепрессантов (обзор литературы и собственных исследований) / И.И. Абрамец, И.В. Комисаров, Д.В. Евдокимов // Журнал академії медичних наук України. – 2007. – Т.13, №4. – С. 636-654. 2. Амон М. Перспективы в изучении патогенеза и терапии аффективных расстройств: роль мелатонина и серотонина / М. Амон, П.-А. Буде, Е. Моке // Журнал неврологии и психиатрии имени С. С. Корсакова. – 2007. – Т.107, - № 11. – С. 77-83. 3. Арушанян Э.Б. Антидепрессанты / Э.Б. Арушанян. - Ставрополь, 2002. - 331с. 4. Балаклеевский А.И. Колориметрический способ определения активности моноаминоксидазы в сыворотке крови / А.И. Балаклеевский // Лаб. дело. – 1976. - №3. - С. 151-153. 5. Быков Ю.В. Резистентные к терапии депрессии. – Ставрополь, 2009. - 77 с. 6. Биоскрининг. Лекарственные средства / [Стефанов А.В., Бухтиярова Т.А., Громов Л.А, Соловьев А. И.]. – К.: Авицена. – 1998. – 250 c. 7. Васюк Ю.А. Депрессия и хроническая сердечная недостаточность / Ю.А. Васюк. – М.:, Анахарсис, 2006. – 112 с. 8. Волошина О.Н., Москвитина Т.А. Метод определения активности тромбоцитарной моноаминоксидазы / О.Н. Волошина, Т.А. Москвитина // Лаб. дело. – 1985. - №5. – С. 289-291. 9. Гельман В.Я. Медицинская информатика: практикум / Гельман В. Я. – СПб: 2001. – 480 с. 10. Громов Л.А. Межполушарная психофармакология / Л.А. Громов, О.А. Евтушенко, И.Н. Танасова // Журн. АМН України – 2007, Т.13, № 1. – С. 346–353. 11. Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації / [Літвінова Н.В., Філоненко - Патрушева М.А., Франццузова С. Б. та ін.] : під ред. О.В. Стефанова. – К.: Авицена. – 2001. – 528c. 12. Дослідження антидепресивної активності похідних 2оксоіндолін-3-гліоксилової кислоти в тесті Порсолта / Р.В. Луценко, Т.О. Дев’яткіна, А.Г. Сидоренко [та ін.] // Вісник Фармації. – 2008. – Т.56, №2. – С.4-8. 13. Заморський І.І. Агоністи та антагоністи серотоніноих рецепторів: реалії та перспективи клінічного застосування / І.І. Заморсікий, О.Г. Резніков // Журнал АМН Укриїни. – 2004. – Т.10, №3. – С. 429-445. 14. Иванов С.В. Депрессия и сердечно-сосудистая патология / С. В. Иванов // Кардиология. – 2009. – №7–8: С.115–120. 15. Иззати-Заде К.Ф. Нарушения обмена серотонина в патогенезе заболеваний нервной системы / К.Ф. Иззати-Заде, А. В. Баша, Н. Д. Демчук 34 // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова – 2004. – Т.104, - №9. – С. 62-70. 16. Калуев А.В. О роли ГАМК в тревоге и депресии / А.В. Калуев, Д. Натт // Экспер. и клин. фармакол. – 2005. – Т.67, №4. – С. 71-76. 17. Калуев А.В. Принципы експериментального моделирования тревожно-депрессивного патогенеза / А.В. Калуев // Нейронауки. – 2006. №1 (3). – С. 34-56. 18. Калуев А.В. Роль ГАМК в патогенезе тревоги и депрессии нейрогенетика, нейрохимия и нейрофизиология / А.В. Калуев // Нейронауки. – 2006. - №2 (4). – С. 29-41. 19. Кеннеди C. Ограничения современной терапии антидепрессантами / С. Кеннеди // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. – 2007. – №12. – С. 12-18. 20. Кеннеди С. Ограничения современной терапии антидепрессантами / С. Кеннеди // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. – 2007. – Т.107, № 12. – С. 87-93. 21. Коваленко И.Л. Половые особенности реагирования на психоэмоциональное воздействие и коррекцию антидепрессантами у мишей линии С57ВL/6J: автореф. дисс. на соискание ученой степени канд.. биол. наук: спец. 03.00.13 “Физиология” / И. Л. Коваленко. - Новосибирск, 2006. – 18 с. 22. Козловський В.Л. Стойкие нарушения поведения у мишей, вызванные поочередным введениям фенамина и галоперидола / В.Л. Козловський, И. В. Прахье // Нейронауки. – 2006. – №2 (4). – С.13-17. 23. Комиссаров И.В. Роль моноаминергического компонента в антидепрессивном эффекте неконкурентных антогонистов N-метил-Dаспартата / И.В. Комиссаров, Ю.В. Кидин // Журн. АМН України. – 2005. – Т.11, № 3. – С.583-591. 24. Корнетов А.Н. Онтогенетические аспекты депрессивных расстройств / А.Н. Корнетов // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. – 2003. – Т.103, №8. – С. 80-81. 25. Кочетков Я.А. Мелатонин и депрессия / Я. А. Кочетков // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. – 2007. – Т.107, №6. – С. 79-83. 26. Лем Р.В. Расстройства сна и депрессия в аспекте действия антидепрессантов / Р.В. Лем // Журнал неврологии и психиатрии имени С. С. Корсакова – 2008. – Т.108, №12. – С. 75-78. 27. Малин Д.И. Побочное действие психотропных средств / Д.И. Малин. – Москва, Вузовская книга. – 2000. – 207с. 28. Малин Д.И. Побочное действие антидепрессантов / Д.И. Малин, Медведев В. // Психиатрия и психофармакотерапия. – 2002. – Т.4Б, № 5. – С. 10-19. 29. Марута Н.О. Депресивні розлади у мешканців сільської місцевості: клініко-психопатологічна характеристика, діагностика та 35 терапія / Н.О. Марута, Ж.І. Білостоцька // Архів психіатрії. – 2008. – Т. 14, № 3. – С. 14–19. 30. Марута Н.О. Особливості потребово-емоційної сфери у хворих похилого віку на тривожно-депресивні розлади з суїцидальним ризиком / Н.О. Марута, І.О. Явдак, О.С. Череднякова // Український вісник психоневрології – 2011. – Т. 19, вип. 3 №68 – С. 50-53. 31. Машковский М.Д. Фармакология антидепрессантов / М.Д. Машковский, Н.И. Андреева, А.И. Полежаева. – М.: Медицина. – 1983. – 240 с. 32. Машковский М.Д. Лекарственные средства - М.: Новая волна, 2006.-1206 с. 33. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения: Пер с англ. Е.Н. Живописцевой / Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П.; Под ред. Бутаева А.С. – М.: Высш. шк., 1991. – 399 с. 34. Мосолов С.Н. Клиническое применение современных антидепресантов / Мосолов С. Н. – СПб.: 1995. – 568 с. 35. Подкорытов В.С. Депрессия и резистентность / В.С. Подкорытов, Ю.Ю. Чайка // Журнал психиатрии и медицинской психологии. – 2002. – № 1. – С.1-11. 36. Приходько В.Ю. Депрессия в терапевтической практике / В.Ю. Приходько, И.Р. Микропуло // Ліки України – 2011. - №2 (148). – С. 58 – 63. 37. Руководство по экспериметальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / [Верстакова О.Л., Арзамасцев Е.В., Бабаян Э. А. и др.]. под ред. Р. У. Хабриева. – [2-е изд. ]. – М.: ОАО “Издательство “Медицина”. – 2005. – 832 с. 38. Скринінгові дослідження в практиці сімейного лікаря: обстеження на схильність до самогубства та депресії : [метод. реком.] / за ред. Г. О. Слабкого. – К., 2011. – 32 с. 39. Смулевич А.Б. Депрессии при соматических заболеваниях / А.Б. Смулевич – М.: Медицинское информационное агентство, 2003. – 432 с. 40. Смулевич А.Б. Дифференцированная терапия при депрессиях и коморбидной патологии / А.Б. Смулевич // Психиатр. и психофармакотерапия. – 2001. – Прил. 3. – С. 3-7. 41. Центральная глутаматергическая синаптическая передача при поведенческой депрессии у крыс / И.И. Абрамец, Д.В. Евдокимов, А.Н. Талалаенко, [и др.] // Нейронауки: теоретичні та клін. аспекти. – 2006. – №2. – С. 22-30. 42. A cholinergic- adrenergic hypothesis of mania and depression / D.S. Janowsky, El- M.K. Yousef, J.M. Davis [et al.] // Lancet. - 1972. - Vol.11. - P. 6732-6735. 43. A new behavioral test for antidepressant drugs / S. Nomura, J. Shimizu, M. Kinjo, [et al.] // European Journal of Pharmacology. – 1982. – Vol. 83, № 3-4, - P. 171-175. 36 44. Alonso, J., Kessler. R., Prevalence and treatment of mental disorders in Germany: results from the European study of the epidemiology of mental disorders (ESEMeD) survey / Alonso, J., Kessler. R. – In: Kessler, Üstun (Eds.). The WHO World Mental Health Surveys: Global Perspectives on the Epidemiology of Mental Disorders. Cam-bridge University Press, New York, 2008. - 331–345 pp. 45. Andlin-Sobocki P. Cost of disorders of the brain in Europe / P. Andlin-Sobocki, J. Olesen, , H.-U. Wittchen, B. Jönsson //. Eur. J. Neurol. – 2005. – №12, – P. 1–27. 46. Best J. Models of Dopaminergic and Serotonergic / J. Best, M. Reed, H. F. Nijhout // Pharmacopsychiatry – 2010, – Vol. 43, №1, – P. 61–66. 47. Blazer D. G. Perception of Unmet Basic Needs as a Predictor of Depressive Symptoms Among Community-Dwelling Older Adults / D. G. Blazer, N. Sachs-Ericsson, C. F. Hybels // Journal of Gerontology: Medical Sciences. – 2007. – №62. – P. 191-195. 48. Blazer D.G. Depression in late life: review and commentary / D.G. Blazer // J. Gerontol a Biol. Sci. Med. Sci. – 2003. – №58. – P. 249-265. 49. Brian Leonard. Clinical implications of mechanisms of action of antidepressants Advances in Psychiatric Treatment. – 2000. - №6. – P. 178–186. 50. Civelly O. Molecular biology of the dopamine receptor subtypes. In, Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. / Civelly O. – New York: Raven Press, 1995, Р. 155-162. 51. Di Chiara G. Modulatory functions of neurotransmitters in the striatum: ACh/dopamine/NMDA interactions / G. Di Chiara, M. Morelli, S. Consolo // Trends Neurosci. – 1994. – Vol.17. – P. 228 – 233. 52. Depression, Anxiety, and Arterial Stiffness / A. Seldenrijk, H.P. Van Hout, H.W. Van Marwijk [et al.] // Biol Psychiatry. – 2011. – Vol. 79. – P. 45-51. 53. Epidemiology of autism spectrum disorders in adults in the community in England / T.S. Brugha, S. McManus, J. Bankart [et al.] // Arch. Gen. Psychiatry. – 2011. – №68. – P.459–466. 54. Eric J.N. The мesolimbic dopamine reward circuit in depression / J.E. Nestler and A.C. William // Biol. psychiatry. – 2006. – №59. – Р. 1151–1159. 55. Greenshaw A.J. Animal models for assessing anxiolytic, neurolepyic and antidepressant drug action: In: Neuromethods (V.10, Analysis of Psychiatric Drugs) Eds / Greenshaw A.J., Nguyen T.V., Sanger D.J. – Humana press, Clifton, 1988, – P. 379-427. 56. Gunnell D. Selective serotonin reuptake inhibitors (SSRis) and suicide in adults: meta-analysis of drug company data from placebo controlled, randomized controlled trials submitted to the MHRA’s safety review / D. Gunnell, J. Saperia, D. Ashby // BMJ. – 2005. – V.330. – P. 385-388. 57. Janet A.B. Homeostatic mechanisms in dopamine synthesis and release: a mathematical model / A. B. Janet, H. F. Nijhout, C.R. Michael // Theoretical Biology and Medical Modelling – 2009. – Vol.6, №21. – P. 46 – 50. 37 58. Latent trajectory classes of depressive and anxiety disorders from adolescence to adulthood: descriptions of classes and associations with risk factors / T.M. Olino, D.N. Klein, P.M. Lewinsohn [et al.] // Compr Psychiatry. – 2010. – Vol.51(3).– P.224-235. 59. Learned helplessness increases 5-hydroxytryptaminelB receptor mRNA levels in the rat dorsal raphe nucleus / J.F. Neumaier, F. Petty, G.L. Kramer [et al.] // Biol. Psychiatry. - 1997. –Vol, 41, № 6. − P. 668-674. 60. Leonard B.E. and Richelson T. Synaptic effects of antidepressants. In, Schizophrenia and Mood Disorders: The New Drugs Therapies in Clinical Practice / Leonard B.E. and Richelson T. – Boston: Butter-worth-Heineman, 2000. − Р.67-84. 61. Lifetime prevalence and age-of-onset distribution of mental disorders in the World Health Organization World Mental Health Survey Initiative / R.C. Kessler, M. Andermeyer J.C. Anthony [et all.] // World Psychiatry. – 2007. − №6. – Р. 168-176. 62. Maternal depression and the quality of marital relationship: a 14-year prospective study / A. A. Mamun, A. M. Clavarino, J. M. Najman [et al.] // J Womens Health (Larchmt). – 2009. – Vol. 18(12). – P. 2023-2031. 63. Morpurgo C. Influence of phenothiazine derivatives on the accumulation of brain amines induced by monoamine oxidase inhibitors / C. Morpurgo // Biochem. Pharmac. − 1962. – №11. – Р. 967-972. 64. Montgomery S. Why do we need new and better antidepressants? / S. Montgomery // Medicographia – 2005. - №27 (3). – Р. 213-216. 65. Nakagawa Y. Possible involvement of GABAB receptors in action of antidepressants / Y. Nakagawa, Т. Ishima // Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi. – 2003. − №4(2). – Р. 83-89. 66. Nemeroff C.B. The neurobiology of depression / C.B. Nemeroff // Sci. Am. − 1998. − Vol. 278, № 6. − P. 42-49. 67. Porsolt R. D. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments / R. D. Porsolt, M. Le. Pinchon, M. Jalfre // Nature. – 1977. – Vol. 266. – P. 730-732. 68. Porsolt R.D., Lenegre A. Behavioral models of depression // Experimental Approaches to Anxiety and Depression / Eds. Elliot J.M., Heal D.J., Marsden C.A. N.Y.: John Willey and Sons, 1992.− P. 73-85. 69. Porsolt R.D., McArthur R.A., Lenegre A. Psychotropic screening procedures: In: Methods in Behavioral Pharmacology, Ed. F. Van Haaren, New York, Elsevier: 1993.− P. 23-51. 70. Pro-inflammatory cytokines and treatment response to escitalopram in major depressive disorder / T. Eller, V. Vasar, J. Shlik [et al.] // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol Psychiatry. – 2008. – Vol. 15, №32(2).− P. 445-450. 71. Rye Serotonergic dorsal rape nucleus projections to the cholinergic and no cholinergic neurons of the pedunculopontine segmental region: a light and electron microscopic anterograde tracing and immunohistochemicai study / 38 L.T. Steininger, H. B. Wainer, D. Randy // The Journal of Comparative Neurology – 1997. − Vol. 382, № 3. − P. 302-322. 72. Schmidt H. D. Functional Biomarkers of Depression: Diagnosis, Treatment, and Pathophysiology / H.D. Schmidt, R.C. Shelton and R.S. Duman // Neuropsychopharm. – 2011. – Vol.36 – P. 2375–2394. 73. Serotonin outflow in the hypothalamus of conscious rats: Origin and possible involvement in cardiovascular control / N. Singewald, L.J. Guo, C. Schneider [et al.] // Eur. J. Pharmacol. − 1995. − Vol. 294, № 2-3. − P. 787-793. 74. Severity of depressive symptoms and response to antidepressants and placebo in antidepressant trials / A. Khan, A.E. Brodhead, R.L. Коlts [et al.] // J Psychiat Res. – 2005. – №39 – P. 145-150. 75. Stein D.J. Serotoninergic neurocircuitry in mood and anxiety disorders / D.J. Stein // Martin Dunitz Ltd. – 2003. – 82 p. 76. "Substance P: structure, function, and therapeutics" / P. Datar, S. Srivastava, E. Coutinho, [et al.] // Current Topics in Medicinal Chemistry 2004. − Vol.1,№.4.– P. 75–103. 77. Taro C., Deakin J.W.F. NMDA receptor subunit NR1 and postsynaptic protein PSD-95 in hippocampal and orbitofrontal cortex in schizophrenia and mood disorder / C. Taro, J.W.F. Deakin // Schizophrenia Res. – 2005. – 80. – P. 323-330. 78. The epidemiology of major depressive disorder: results from the National Comorbidity Survey replication (NCS-R) / Kessler RC, Berglund P, Demler O [et al.] // JAMA – 2003. №289. – Р. 3095–3105. 79. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010 / H.-U Wittchen, F. Jacobi, J. Rehm [et all.]. European Neuropsychopharmacology. – 2011. - №21. P. 655-679. 80. Time to recovery, chronicity and levels of psychopathology in major depression: a 5-year prospective follow-up of 431 sujects / M.B. Keller, P.M. Lavori, T.I. Mueller [et al.] // Arch. Gen. Psychiat. – 1992. – №49. – Р. 809 – 816. 81. Versaevel C. Affective dependency and psychiatry: A discord. / C. Versaevel // Encephale – 2011. – Vol.37(1). – Р. 25-32. 82. Wang P.S., Simon G, Kessler R.C. The economic burden of depression and the cost-effectiveness of treatment // Int. J. Methods Psychiatr Res. 2003;12(1):22-33. 83. Wittchen H-U. Size and burden of mental disorders in Europe a critical review and appraisal of 27 studies / H-U. Wittchen, F. Jacobi // Eur. Neuropsychopharmacol. – 2005. Vol.15, №4. – Р. 357–376. 39
