(19) RU (51) ÌÏÊ 5 (11) 2 012 869 (13) C1 G 01 N 21/78 ÐÎÑÑÈÉÑÊÎÅ ÀÃÅÍÒÑÒÂÎ ÏÎ ÏÀÒÅÍÒÀÌ È ÒÎÂÀÐÍÛÌ ÇÍÀÊÀÌ (12) ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÈÇÎÁÐÅÒÅÍÈß Ê ÏÀÒÅÍÒÓ (21), (22) Çà âêà: 4912443/25, 18.02.1991 (71) Çà âèòåëü(è): Êàçàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé òåõíîëîãè÷åñêèé óíèâåðñèòåò (46) Îïóáëèêîâàíî: 15.05.1994 (57) Ðåôåðàò: Ñóùíîñòü: ñïîñîá ïîçâîë åò ñåëåêòèâíî îïðåäåëèòü ïðîëèí èëè òðèïòîôàí â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò. Äë ýòîãî ê ðàñòâîðó ïðîáû äîáàâë þò èçáûòîê ðàñòâîðà 7-õëîð-4,6äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà â îðãàíè÷åñêîì ðàñòâîðèòåëå, íåéòðàëèçóþò ðàñòâîð è ðåãèñòðèðóþò îïòè÷åñêóþ ïëîòíîñòü ðàñòâîðà â îáëàñòè 500 - 550 íì.  ýòîé îáëàñòè ñïåêòðà ïîãëîùàþò òîëüêî ïðîäóêòû ðåàêöèè ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà ñ öâåòîðåàãåíòîì, ÷òî ïîçâîë åò ñåëåêòèâíî îïðåäåë òü óêàçàííûå àìèíîêèñëîòû â ñìåñè ñ äðóãèìè àìèíîêèñëîòàìè áåç ïðåäâàðèòåëüíîãî èõ âûäåëåíè . 1 òàáë. R U 2 0 1 2 8 6 9 C 1 C 1 (54) ÑÏÎÑÎÁ ÑÏÅÊÒÐÎÔÎÒÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈß ÀÌÈÍÎÊÈÑËÎÒ Ñòðàíèöà: 1 RU 2 0 1 2 8 6 9 (73) Ïàòåíòîîáëàäàòåëü(ëè): Êàçàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé òåõíîëîãè÷åñêèé óíèâåðñèòåò R U (72) Àâòîð(û): Åâãåíüåâ Ì.È., Íèêîëàåâà Í.Ã., Åâãåíüåâà È.È., Ëåâèíñîí Ô.Ñ., Ïîáåäèìñêèé Ä.Ã. (19) RU (51) Int. Cl. 5 (11) 2 012 869 (13) C1 G 01 N 21/78 RUSSIAN AGENCY FOR PATENTS AND TRADEMARKS (12) ABSTRACT OF INVENTION (21), (22) Application: 4912443/25, 18.02.1991 (71) Applicant(s): KAZANSKIJ GOSUDARSTVENNYJ TEKHNOLOGICHESKIJ UNIVERSITET (46) Date of publication: 15.05.1994 (54) METHOD OF SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF AMINOACIDS density is registered at wave- length 500-550 nm. Proposed method enables selective determination of proline or triptophan in the presence of other aminoacids. EFFECT: improves efficiency of the method. 1 tbl R U 2 0 1 2 8 6 9 C 1 C 1 (57) Abstract: FIELD: analytic chemistry. SUBSTANCE: excess of 7-chlorine-4,6-dinitrobenzofuroxane solution in organic solvent is added into sample. Thus prepared solution is neutralized, its optical Ñòðàíèöà: 2 EN 2 0 1 2 8 6 9 (73) Proprietor(s): KAZANSKIJ GOSUDARSTVENNYJ TEKHNOLOGICHESKIJ UNIVERSITET R U (72) Inventor(s): EVGEN'EV M.I., NIKOLAEVA N.G., EVGEN'EVA I.I., LEVINSON F.S., POBEDIMSKIJ D.G. RU 2 012 869 C1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê àíàëèòè÷åñêîé õèìèè àìèíîêèñëîò, à èìåííî ñïîñîáó ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â ðàñòâîðàõ â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ α -àìèíîêèñëîò (ëåéöèí, èçîëåéöèí, âàëèí, ãëóòàìèíîâà êèñëîòà, àëàíèí) ñ ïîìîùüþ ðåàãåíòà 7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà. Èçîáðåòåíèå ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî äë àíàëèçà ïðîäóêòîâ ôåðìåíòàöèîííîãî ïðîöåññà áèîñèíòåçà ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà, â õîäå êîòîðîãî îáðàçóþòñ óêàçàííûå âûøå àëèôàòè÷åñêèå àìèíîêèñëîòû. Èçâåñòåí ñïîñîá êîëè÷åñòâåííîãî ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîò, ðåàêöèîííîñïîñîáíûõ ïî îòíîøåíèþ ê ïàðà-íèòðîàíèëèäàì (íà íåðàñòâîðèìûõ íîñèòåë õ). Ïîëèìåð îáðàáàòûâàþò íèòðîàíèëèäîì àìèíîêèñëîòû (ëåéöèíà, ãëèöèíà, àëàíèíà). Îïðåäåë þò ðåàêöèîííûå ïî îòíîøåíèþ ê íèòðîàíèëèäàì ôóíêöèîíàëüíûå ãðóïïû (àëüäåãèäíûå, áåíçîõèíîíîâûå è ò. ä. ), ôîòîìåòðèðó ïðè 310 íì [1] . Îäíàêî ñïîñîá äëèòåëåí, òðóäîåìîê è íå ïîçâîë åò ïðîâîäèòü ðàçäåëüíîå îïðåäåëåíèå àìèíîêèñëîò â ñìåñè. Èçâåñòåí ñïîñîá ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîò ñ ïîìîùüþ öâåòîðåàãåíòà (1-õèíîêñàëèë-2)-3-ìåòèë-5(n-êàðáîêñèôåíèë) ôîðìàçàíà â ïðèñóòñòâèè íèòðàòà ðòóòè [2] . Îäíàêî ïðåäëîæåííûé ñïîñîá íå îáåñïå÷èâàåò ñåëåêòèâíîñòè îïðåäåëåíèé àìèíîêèñëîò â ñìåñè. Èçâåñòåí ñïîñîá ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè òðèïòîôàíà ïóòåì ðàñùåïëåíè ãåòåðîöèêëà äåéñòâèåì àçîòèñòîé êèñëîòû è ïîëó÷åíèåì îêðàøåííûõ ïðîäóêòîâ [3] . Ïðåäëîæåííûé ñïîñîá òàêæå íå îáåñïå÷èâàåò ñåëåêòèâíîñòü îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîò â ñìåñ õ. Íàèáîëåå áëèçêèì ïî òåõíè÷åñêîé ñóùíîñòè è äîñòèãàåìîìó ðåçóëüòàòó ê íàñòî ùåìó ñïîñîáó âë åòñ ñïîñîá êîëè÷åñòâåííîãî ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîò ñ ïðèìåíåíèåì íèíãèäðèíîâîãî ðåàãåíòà [4] . Îäíàêî èñïîëüçîâàíèå óêàçàííîãî ðåàãåíòà íå ïîçâîë åò ïðîâîäèòü ñåëåêòèâíûå îïðåäåëåíè îäíèõ àìèíîêèñëîò â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ, ïîñêîëüêó îáðàçóþùèåñ ïðîäóêòû ðåàêöèè äë áîëüøèíñòâà àìèíîêèñëîò èìåþò ïîëîñû ïîãëîùåíè , íàêëàäûâàþùèåñ äðóã íà äðóãà. Òàêèì îáðàçîì, èçâåñòíûå ñïîñîáû íå ïîçâîë þò ïðîâîäèòü êîëè÷åñòâåííûå îïðåäåëåíè îòäåëüíûõ àìèíîêèñëîò â ñìåñ õ áåç èõ ïðåäâàðèòåëüíîãî ðàçäåëåíè . Öåëüþ èçîáðåòåíè âë åòñ ïîâûøåíèå ñåëåêòèâíîñòè îïðåäåëåíè ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò, îáðàçóþùèõñ â ïðîäóêòàõ ôåðìåíòàöèè ïðè èõ áèîñèíòåçå, à òàêæå óïðîùåíèå ñïîñîáà. Öåëü äîñòèãàåòñ çà ñ÷åò òîãî, ÷òî â ñïîñîáå îïðåäåëåíè òðèïòîôàíà èëè ïðîëèíà â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò àíàëèçèðóåìóþ ñìåñü îáðàáàòûâàþò ðàñòâîðîì 7-õëîð4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà è îïðåäåë þò ñîäåðæàíèå ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà ôîòîìåòðèðîâàíèåì ðàñòâîðà â îáëàñòè 500-550 íì. 7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàí â óêàçàííûõ óñëîâè õ ðåàãèðóåò ñî âñåìè àìèíîêèñëîòàìè, íàõîä ùèìèñ â àíàëèçèðóåìîé ñìåñè. Îäíàêî êîíòðàñòíîñòü ïðîäóêòîâ ðåàêöèè (ñäâèã ìàêñèìóìà ïîãëîùåíè ïðîäóêòà ðåàêöèè ïî ñðàâíåíèþ ñ ìàêñèìóìîì ïîãëîùåíè ðåàãåíòà) äë ïðîëèíà è òðèïòîôàíà çíà÷èòåëüíî áîëüøå, ÷åì äë äðóãèõ àìèíîêèñëîò. Ýòîò ôàêò ïîçâîë åò ïðîâîäèòü îïðåäåëåíèå ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò. Ï ð è ì å ð 1. Îïðåäåëåíèå ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â èñêóññòâåííîé ñìåñè àìèíîêèñëîò. Äë îïðåäåëåíè ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â àíàëèçèðóåìîé ñìåñè àìèíîêèñëîò ãîòîâ ò íåâîäíûé (àöåòîíèòðèë, ñïèðòû) ðàñòâîð ðåàãåíòà - 7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà ñ êîíöåíòðàöèåé 10 -2 ìîëü/ë.  ìåðíóþ êîëáó îáúåìîì 25 ñì 3 îòáèðàþò 1 ñì 3 àíàëèçèðóåìîãî ðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî 0,01-0,2 ìã àìèíîêèñëîò, äîáàâë þò 4 ñì 3 ðàñòâîðà ðåàãåíòà (7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà) è äîâîä ò ñîäåðæèìîå ìåðíîé êîëáû äî ìåòêè áóôåðíûì ðàñòâîðîì ñ pH 6,86. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ôîòîìåòðèðóþò ïðè Ñòðàíèöà: 3 DE RU 2 012 869 C1 5 10 15 20 25 30 äëèíàõ âîëí 500-550 íì îòíîñèòåëüíî ðàñòâîðà ñðàâíåíè , ñîäåðæàùåãî ðàñòâîð ðåàãåíòà òîé æå êîíöåíòðàöèè. Ñîäåðæàíèå ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà îïðåäåë þò ïî ãðàäóèðîâî÷íîìó ãðàôèêó èëè ìåòîäîì äîáàâîê. Äë ïîñòðîåíè ãðàäóèðîâî÷íîãî ãðàôèêà ãîòîâ ò ðàñòâîðû, ñîäåðæàùèå 0,01-0,2 ìã ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â ìåðíîé êîëáå íà 25 ñì 3, äîáàâë þò 4 ñì 3 ðåàãåíòà è äîâîä ò ñîäåðæèìîå êîëáû äî ìåòêè áóôåðíûì ðàñòâîðîì ñ pH 6,86.  óêàçàííûõ óñëîâè õ íàáëþäàåòñ ïî âëåíèå îðàíæåâîé îêðàñêè àíàëèçèðóåìîãî ðàñòâîðà, ñâ çàííîé ñ îáðàçîâàíèåì ïðîäóêòîâ ðåàêöèè ñ òðèïòîôàíîì èëè ïðîëèíîì.  òî æå âðåì îñòàëüíûå àìèíîêèñëîòû (âàëèí, ëåéöèí, èçîëåéöèí, àëàíèí, ãëóòàìèíîâà êèñëîòà, ãëèöèí) ñ ðåàãåíòàìè îáðàçóþò ïðîäóêòû ðåàêöèè, íå ìåøàþùèå îïðåäåëåíèþ òðèïòîôàíà èëè ïðîëèíà. Ðåçóëüòàòû, àíàëîãè÷íûå îïðåäåëåíèþ òðèïòîôàíà, ïîëó÷åíû äë îïðåäåëåíè ïðîëèíà.  òàáëèöå ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíè ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â ïðèñóòñòâèè óêàçàííûõ âûøå àìèíîêèñëîò. Ï ð è ì å ð 2. Îïðåäåëåíèå òðèïòîôàíà â êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè áèîñèíòåçà òðèïòîôàíà. Ôåðìåíòàöèîííûé ðàñòâîð ïîäãîòîâëåí â àíàëèçó ñëåäóþùèì îáðàçîì: Áèîìàññà ïðîäóöåíòà îòäåëåíà öåíòðèôóãèðîâàíèåì, Ïîñëå ïîäêèñëåíè ñîë íîé êèñëîòîé ôèëüòðàòà êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè äî pH 1 âûïàâøèé îñàäîê îòäåëåí ïîâòîðíûì öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Ôèëüòðàò íåéòðàëèçîâàí áóôåðíûì ðàñòâîðîì 7,05 è çàòåì ïðîâåäåíî îïðåäåëåíèå ñîäåðæàíè òðèïòîôàíà ìåòîäîì äîáàâîê íàñòî ùèì ñïîñîáîì.  ðåçóëüòàòå îïðåäåëåíè ïîëó÷åíî ñîäåðæàíèå òðèïòîôàíà â êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè 8,7±0,1 ã/ë. Ôîðìóëà èçîáðåòåíè ÑÏÎÑÎÁ ÑÏÅÊÒÐÎÔÎÒÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈß ÀÌÈÍÎÊÈÑËÎÒ, çàêëþ÷àþùèéñ â òîì, ÷òî ê àíàëèçèðóåìîé ïðîáå äîáàâë þò ðàñòâîð öâåòîðåàãåíòà è ôîòîìåòðèðóþò ïîëó÷åííûé ðàñòâîð, îòëè÷àþùèéñ òåì, ÷òî, ñ öåëüþ ñåëåêòèâíîãî îïðåäåëåíè òðèïòîôàíà èëè ïðîëèíà â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò è óïðîùåíè ñïîñîáà, â êà÷åñòâå öâåòîðåàãåíòà äîáàâë þò ðàñòâîð 7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà â îðãàíè÷åñêîì ðàñòâîðèòåëå, çàòåì íåéòðàëèçóþò ðàñòâîð, à ôîòîìåòðèðóþò ïðè 500 550 íì. 35 40 45 50 Ñòðàíèöà: 4 CL RU 2 012 869 C1 Ñòðàíèöà: 5 DR