АсАТ-ВИТАЛ-01/11

АсАТ-ВИТАЛ-01/11
НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В
СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ УНИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ РАЙТМАНА-ФРЕНКЕЛЯ
Кат. № В 02.01 - 400 определений
Кат. № В 02.11 - 1000 определений
(при объеме пробы 3,05 мл)
ПРИНЦИП МЕТОДА
1.L-аспартат + -кетоглутарат АсАТ 
оксалоацетат + L-глутамат
2. фотометрическое определение содержания оксалоацетата
в пробе на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином
ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ)
Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза
СОСТАВ НАБОРА
РЕАГЕНТ № 1 - СУБСТРАТНАЯ СМЕСЬ
L-аспарагиновая кислота.......................……...0,1 моль/л
-кетоглутаровая кислота…………..............2,0 ммоль/л
фосфатный буфер, рН 7,4.………………........0,1 моль/л
РЕАГЕНТ № 2 - РАСТВОР 2,4-ДНФГ
………….………………………….…………1,0 ммоль/л
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА
№
Проба 1
Проба 2
Проба 3
Проба 4
Проба 5
Проба 6
Контроль
1
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
-
2
0,55
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,60
3
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
Внести в пробирки компоненты 1-3, перемешать,
инкубировать 20 мин при 18-25С. Добавить во все пробирки по 5,0 мл рабочего реагента, перемешать и фотометрировать через 5-10 мин против контроля.
РЕАГЕНТ № 4 - НАТРИЙ ЕДКИЙ
NaOH.……………………………………….....4,0 моль/л
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Внести в пробирки:
Линейность - отклонение не более 10 %
в диапазоне активностей 0,067-1,25 мкмоль/(сл)
Чувствительность - не более 0,05 мкмоль/(сл)
Коэффициент вариации – не более 10 %
Время проведения анализа – 90 мин
Реагент № 1
Образец
ХРАНЕНИЕ
1.
Срок годности набора – 12 мес
( хранение при 18-25С).
Срок хранения вскрытых реагентов №№ 1 и 3 –12 мес
( хранение при 2-4С).
Срок хранения вскрытых реагентов №№ 2 и 4 –12 мес
( хранение при 18-25С).
4.2
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
-
1. Реагент № 3 (калибратор), мл
Проба
2. Бидистиллированная вода, мл
3. Реагент № 2 (раствор 2,4-ДНФГ), мл
4.1. Концентрация каталитической активности АсАТ (С)
в калибровочной пробе, мкмоль/(сл)
4.2. Концентрация каталитической активности АсАТ (С)
в калибровочной пробе, ммоль/(чл)
ИЗМЕРЕНИЕ
Длина волны: 500-560 нм (opt=537нм).
Длина оптического пути: 1 см.
Температура инкубации : 1. 37С
2. 18-25С
РЕАГЕНТ № 3 - КАЛИБРАТОР
Пируват натрия……………………………...1,0 ммоль/л
4.1
0,139
0,278
0,417
0,556
0,695
0,834
-
Опытная проба
0,25 мл
0,05 мл
Холостая проба
0,25 мл
-
Пробы перемешать и инкубировать в водяной бане 60 мин
при 37 С.
Добавить в пробирки:
Опытная проба
Холостая проба
Реагент № 2
0,25 мл
0,25 мл
Образец
0,05 мл
ВНИМАНИЕ! Тщательно закрывайте флаконы
непосредственно после каждого использования реагентов.
Пробы перемешать и инкубировать 20 мин при 18-25С.
Далее внести в пробирки по 2,5 мл рабочего реагента,
перемешать.
Фотометрировать через 5-10 мин против холостой пробы.
Стабильность окраски – не менее 30 мин.
Расчет активности фермента в сыворотке и плазме крови
производят по калибровочному графику.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА
РАСЧЕТЫ
Содержимое флакона № 4 (или аликвоту) развести
бидистиллированной водой, свободной от карбонатов, в 10
раз (например, 1 мл реагента № 4 + 9 мл
бидистиллированной воды).
Концентрация NaOH в полученном рабочем реагенте – 0,4
моль/л.
Срок хранения – 3 мес в плотно закрытой полиэтиленовой
таре при 18-25С.
1.
2.
3.
ПРИМЕЧАНИЯ
1.
2.
При
активности
АсАТ,
превышающий
1,5
ммоль/(чл) 0,417 мкмоль/(сл), сыворотку крови
следует развести. При расчете активности учесть
степень разведения.
1U/л=16,67 нмоль/(сл)=
0,0167 мкмоль/сл=0,06 ммоль/чл
2.
По калибровочному графику рассчитать коэффициент
k=C/А,
где: А – адсорбция калибровочной пробы;
С – концентрация каталитической активности
АсАТ в этой пробе.
Каталитическая концентрация АсАТ (активность) в
опытной пробе рассчитывается в мкмоль/(сл) или
ммоль/(чл) по формуле: (Аоп – Ахол ) k,
где: k – коэффициент, рассчитанный по
калибровочному графику,
Аоп - адсорбция опытной пробы,
Ахол - адсорбция холостой пробы.
НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ
0,028 – 0,190 мкмоль/(сл) или 0,1 – 0,68 ммоль/(чл) при 37С
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Правильность проверена при помощи контрольных
сывороток “Sigma enzyme control 2N” & “Sigma enzyme
control 2E” (Sigma chemical company, USA).