АлАТ-ВИТАЛ-01/11 НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ УНИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ РАЙТМАНА-ФРЕНКЕЛЯ Кат. № В 01.01 - 400 определений Кат. № В 01.11 - 1000 определений (при объеме пробы 3,05 мл) ПРИНЦИП МЕТОДА 1. L-аланин + -кетоглутарат АлАТ пировиноградная кислота + L-глутамат 2. фотометрическое определение содержания пирувата в пробе на основе реакции с 2,4-динитрофенилгидразином ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ (ОБРАЗЕЦ) Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТ № 1 - СУБСТРАТНАЯ СМЕСЬ D, L-аланин…………….........................……...0,2 моль/л -кетоглутаровая кислота…………..............2,0 ммоль/л фосфатный буфер, рН 7,4.………………........0,1 моль/л РЕАГЕНТ № 2 - РАСТВОР 2,4-ДНФГ ………….………………………………….…1,0 ммоль/л ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА № Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4 Проба 5 Проба 6 Контроль 1 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 - 2 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,60 3 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 4.1 0,278 0,556 0,834 1,112 1,390 1,668 - 4.2 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 - 1. Реагент № 3 (калибратор), мл Проба 2. Бидистиллированная вода, мл 3. Реагент № 2 (раствор 2,4-ДНФГ), мл 4.1. Концентрация каталитической активности АлАТ (С) в калибровочной пробе, мкмоль/(сл) 4.2. Концентрация каталитической активности АлАТ (С) в калибровочной пробе, ммоль/(чл) Внести в пробирки компоненты 1-3, перемешать, инкубировать 20 мин при 18-25С. Добавить во все пробирки по 5,0 мл рабочего реагента, перемешать и фотометрировать через 5-10 мин против контроля. ИЗМЕРЕНИЕ РЕАГЕНТ № 3 - КАЛИБРАТОР Пируват натрия…………...………………...1,0 ммоль/л РЕАГЕНТ № 4 - НАТРИЙ ЕДКИЙ NaOH.………………………………………....4,0 моль/л АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Линейность - отклонение не более 10 % в диапазоне активностей 0,067-1,25 мкмоль/(сл) Чувствительность - не более 0,05 мкмоль/(сл) Коэффициент вариации – не более 10 % Время проведения анализа – 60 мин ХРАНЕНИЕ 1. 2. 3. Срок годности набора – 12 мес ( хранение при 18-25С). Срок хранения вскрытых реагентов №№ 1 и 3 –12 мес ( хранение при 2-4С). Срок хранения вскрытых реагентов №№ 2 и 4 –12 мес ( хранение при 18-25С). ВНИМАНИЕ! Тщательно закрывайте флаконы непосредственно после каждого использования реагентов. Длина волны: 500-560 нм (opt=537нм). Длина оптического пути: 1 см. Температура инкубации : 1. 37С 2. 18-25С Внести в пробирки: Реагент № 1 Образец Реагент № 2 0,05 мл РАСЧЕТЫ 2. 2. - Холостая проба 0,25 мл Пробы перемешать и инкубировать 20 мин при 18-25С. Далее внести в пробирки по 2,5 мл рабочего реагента, перемешать. Фотометрировать через 5-10 мин против холостой пробы. Стабильность окраски – не менее 30 мин. Расчет активности фермента в сыворотке и плазме крови производят по калибровочному графику. Содержимое флакона № 4 (или аликвоту) развести бидистиллированной водой, свободной от карбонатов, в 10 раз (например, 1 мл реагента № 4 + 9 мл бидистиллированной воды). Концентрация NaOH в полученном рабочем реагенте – 0,4 моль/л. Срок хранения – 3 месяца в плотно закрытой полиэтиленовой таре при 18-25С. При активности АлАТ, превышающий 3 ммоль/(чл) 0,834 мкмоль/(сл), сыворотку крови следует развести. При расчете активности учесть степень разведения. 1U/л=16,67 нмоль/(сл)= 0,0167 мкмоль/сл=0,06 ммоль/чл Опытная проба 0,25 мл Образец 1. 1. Холостая проба 0,25 мл - Пробы перемешать и инкубировать в водяной бане 30 мин при 37 С. Добавить в пробирки: ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РЕАГЕНТА ПРИМЕЧАНИЯ Опытная проба 0,25 мл 0,05 мл По калибровочному графику рассчитать коэффициент k=C/А, где: А – адсорбция калибровочной пробы; С – концентрация каталитической активности АлАТ в этой пробе. Каталитическая концентрация АлАТ (активность) в опытной пробе рассчитывается в мкмоль/(сл) или ммоль/(чл) по формуле: (Аоп – Ахол ) k, где: k – коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику, Аоп - адсорбция опытной пробы, Ахол - адсорбция холостой пробы. НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ 0,028 – 0,190 мкмоль/(сл) или 0,1 – 0,68 ммоль/(чл) при 37С КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА Правильность проверена при помощи контрольных сывороток “Sigma enzyme control 2N” & “Sigma enzyme control 2E” (Sigma chemical company, USA).