ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ

Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ
Ðàçðåøåíî Ìèíçäðàâîì Ðåñïóáëèêè
Áåëàðóñü äëÿ ïðàêòè÷åñêîãî èñïîëüçîâàíèÿ
Ïåðâûé çàìåñòèòåëü ìèíèñòðà çäðàâîîõðàíåíèÿ, ïðåäñåäàòåëü êîìèññèè ïî ñïîñîáàì
ïðîôèëàêòèêè, äèàãíîñòèêè, ëå÷åíèÿ è
îðãàíèçàöèîííûì ôîðìàì ðàáîòû ÌÇ ÐÁ
__________________ Â.Ì. Îðåõîâñêèé
28 ôåâðàëÿ 2001 ã.
Ðåãèñòðàöèîííûé ¹ 160-0011
ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÖÈÒÎÒÎÊÑÈ×ÍÎÑÒÈ
ÃÅÏÀÒÎÒÐÎÏÍÛÕ ÏÐÅÏÀÐÀÒÎÂ
Ñ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈÅÌ ÊËÅÒÎ×ÍÛÕ ÊÓËÜÒÓÐ
(èíñòðóêöèÿ ïî ïðèìåíåíèþ)
Ó÷ðåæäåíèå-ðàçðàáîò÷èê: Âèòåáñêèé ãîñóäàðñòâåííûé ìåäèöèíñêèé óíèâåðñèòåò
Àâòîðû: À.À. ×èðêèí, Å.Î. Äàí÷åíêî
1
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
Îãëàâëåíèå
ÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ .................................................................................................................. 4
ÏÅÐÅ×ÅÍÜ ÍÅÎÁÕÎÄÈÌÎÃÎ ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈß................................................................................... 4
ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈß ÌÅÒÎÄÀ ............................................................... 12
ÂÎÇÌÎÆÍÛÅ ÎÑËÎÆÍÅÍÈß È ÎØÈÁÊÈ.......................................................................................... 22
ÏÐÎÒÈÂÎÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ ........................................................................................... 22
2
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
Ãåïàòîïðîòåêòîðû — ïðåïàðàòû, íîðìàëèçóþùèå ñòðîåíèå, ìåòàáîëèçì è ôóíêöèþ
ïàðåíõèìû ïå÷åíè, ÿâëÿþòñÿ ñðåäñòâàìè ïàòîãåíåòè÷åñêîé òåðàïèè îñòðûõ è õðîíè÷åñêèõ
çàáîëåâàíèé ãåïàòîáèëèàðíîé ñèñòåìû. Îäíàêî, êàê è ëþáûå ÷óæåðîäíûå âåùåñòâà,
ãåïàòîòðîïíûå ïðåïàðàòû ìîãóò ïðîÿâëÿòü öèòîòîêñè÷åñêèå ñâîéñòâà, â çàâèñèìîñòè îò äîçû
èëè îñîáåííîñòåé ïðèìåíåíèÿ (Àëüáåðò À., 1989). Íàïðèìåð,óñòàíîâëåíî, ÷òî íåêîòîðûå
æåë÷íûå êèñëîòû ñïîñîáíû âêëþ÷àòü ïðîãðàììó àïîïòîçà (Kwo P.Y. et al., 1995), âåäóùóþ
ê ãèáåëè ãåïàòîöèòîâ. Ïî ìíåíèþ R.Epstein (1990) öèòîòîêñè÷åñêèå àãåíòû îêàçûâàþò
ïåðâè÷íîå ïîâðåæäàþùåå äåéñòâèå íà ñòðóêòóðíóþ îðãàíèçàöèþ è ôóíêöèè ÄÍÊ.  òî æå
âðåìÿ öèòîòîêñè÷íîñòü ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ìîæåò ëåæàòü â îñíîâå ìîëåêóëÿðíûõ
ìåõàíèçìîâ âîññòàíîâèòåëüíûõ ïðîöåññîâ â ïå÷åíè ïîñëå ïîâðåæäåíèÿ (×èðêèí À.À.,
Äàí÷åíêî Å.Î., 2000).
Èññëåäîâàíèÿ öèòîòîêñè÷íîñòè ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì ñèñòåì in vivo îñëîæíÿþòñÿ
íàëè÷èåì ñòðóêòóðíîé è ôóíêöèîíàëüíîé ãåòåðîãåííîñòè êëåòîê è íå ìîãóò áûòü
èñïîëüçîâàíû äëÿ ðàñêðûòèÿ òî÷íûõ ìîëåêóëÿðíûõ ìåõàíèçìîâ äåéñòâèÿ ïðåïàðàòîâ (Davila
J.C., 1998). Ïîýòîìó êðàéíå âàæíà ðàçðàáîòêà ìîäåëåé in vitro äëÿ îöåíêè òîêñè÷íîñòè
êñåíîáèîòèêîâ è ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ, ÷òî ïîçâîëèò òàêæå óìåíüøèòü êîëè÷åñòâî
æèâîòíûõ, èñïîëüçóåìûõ äëÿ áèîëîãè÷åñêîãî òåñòèðîâàíèÿ.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ñóùåñòâóåò òûñÿ÷è ðàçëè÷íûõ òåñò-ñèñòåì äëÿ èññëåäîâàíèé in
vitro: 1) èçîëèðîâàííûå ïåðôóçèðóåìûå îðãàíû; 2) òêàíåâûå ñðåçû; 3) êëåòî÷íûå
êóëüòóðû/ñóñïåíçèè; 4) èçîëèðîâàííûå îðãàíåëëû/ìåìáðàíû/ôåðìåíòû; 5) ñèñòåìû
áåçïîçâîíî÷íûõ; 6) non-living-ñèñòåìû; 7) êîìïüþòåðíûå ìîäåëè (Silber P.M., Ruegg C.E.,
1994). Íàèáîëåå ïðîñòûìè è äîñòóïíûìè ñèñòåìàìè ÿâëÿþòñÿ ìîíîñëîéíûå êëåòî÷íûå êóëüòóðû
(Guillouzo A.; 1986, Blaauboer B.J., Boobis A.R., 1994).
3
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
Ïðåäëîæåíà òðåõýòàïíàÿ ìåòîäèêà îöåíêè öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ãåïàòîòðîïíûõ
ïðåïàðàòîâ:
1. Èçó÷åíèå ïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòîê ñ
ðåäóöèðîâàííûì ýíäîïëàçìàòè÷åñêèì ðåòèêóëóìîì L929 è L41 (ñíèæåíà áèîòðàíñôîðìàöèÿ
ïðåïàðàòîâ) ïî ñëåäóþùèì ïàðàìåòðàì: ðîñò êëåòîê â ìîíîñëîå, ïðîëèôåðàöèÿ ïî
âêëþ÷åíèþ 3Í-òèìèäèíà â ÄÍÊ, áèîñèíòåç áåëêà ïî âêëþ÷åíèþ ìå÷åíûõ àìèíîêèñëîò.
2. Èçó÷åíèå íåïðÿìîãî (îïîñðåäîâàííîãî) öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ ïðåïàðàòîâ íà
ñåêðåöèþ öèòîêèíîâ (ñåêðåöèÿ ôàêòîðà íåêðîçà îïóõîëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ïåðèòîíåàëüíûõ
ìàêðîôàãîâ).
3. Èçó÷åíèå öèòîòîêñè÷åñêîãî âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ â ïðîöåññå èõ áèîòðàíñôîðìàöèè íà
ãåïàòîöèòû ïåðâè÷íîé êóëüòóðû (áèîñèíòåç ÄÍÊ, áåëêà, àïîïòîç, íåêðîç).
ÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ
Ðåêîìåíäóåòñÿ äëÿ âñåõ ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ êàê ïåðâûé ýòàï ýêñïåðèìåíòàëüíîé
àïðîáàöèè è äîêëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé.
ÏÅÐÅ×ÅÍÜ ÍÅÎÁÕÎÄÈÌÎÃÎ ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈß
I ýòàï. Îöåíêà ïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà
1. Îïðåäåëåíèå ÷èñëà êëåòîê â ìîíîñëîå:
– êëåòêè L929 èëè L41;
– ñðåäà 199;
– ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà;
– àíòèáèîòèêè;
– êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè;
4
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
– ëàìèíàð;
– èíâåðòèðîâàííûé ìèêðîñêîï;
– 10% ðàñòâîð êðèñòàëëâèîëåòà;
– 2% ýòèëîâûé ñïèðò;
– ðàñòâîð Ýðëà;
– 10% óêñóñíàÿ êèñëîòà;
– ïèïåòêè;
– âàêóóìíûé àñïèðàòîð;
– ñïåêòðîôîòîìåòð.
2. Îïðåäåëåíèå áèîñèíòåçà ÄÍÊ:
– êëåòêè L929 èëè L41;
– ñðåäà 199;
– ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà;
– àíòèáèîòèêè;
– êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè;
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
– ðàñòâîð Ýðëà;
– 3Í-òèìèäèí;
– 10% óêñóñíàÿ êèñëîòà;
– ýòèëîâûé ñïèðò;
– 0,3 N ÊÎÍ;
– 1 N õëîðíàÿ êèñëîòà;
– äèîêñàíîâûé ñöèíòèëëÿòîð;
5
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
– ïèïåòêè;
– òåðìîñòàò;
– b-ñ÷åò÷èê.
3. Îïðåäåëåíèå áèîñèíòåçà áåëêà:
– êëåòêè L929 èëè L41;
– ñðåäà 199;
– ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà;
– àíòèáèîòèêè;
– êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè;
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
– ðàñòâîð Ýðëà;
– 14Ñ-àìèíîêèñëîòû;
– 10% óêñóñíàÿ êèñëîòà;
– ýòèëîâûé ñïèðò;
– 0,3 N ÊÎÍ;
– 1 N õëîðíàÿ êèñëîòà;
– ïèïåòêè;
– äèîêñàíîâûé ñöèíòèëëÿòîð;
– òåðìîñòàò;
– b-ñ÷åò÷èê.
II ýòàï. Îöåíêà íåïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà
– 3% ðàñòâîð ïåïòîíà;
– ñðåäà Õåíêñà;
– ãåïàðèí;
6
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
– àêòèíîìèöèí Ä;
– öåíòðèôóãà;
– êëåòêè L929 èëè L41;
– ñðåäà 199;
– ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà;
– àíòèáèîòèêè;
– êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè;
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
– 10% ðàñòâîð êðèñòàëëâèîëåòà â 2% ñïèðòå;
– ðàñòâîð Ýðëà;
– 10% óêñóñíàÿ êèñëîòà;
– ïèïåòêè;
– âàêóóìíûé àñïèðàòîð;
– ñïåêòðîôîòîìåòð.
III ýòàï. Îöåíêà öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà íà ãåïàòîöèòû
1. Ïîëó÷åíèå ãåïàòîöèòîâ:
– êåòàìèí (êîíöåíòðàöèÿ 100 ìêã/ìë);
– ðîìïóí (êîíöåíòðàöèÿ 50 ìêã/ìêë);
– ñòåðèëüíûé ìàðëåâûé ôèëüòð;
– ñòåðèëüíûå íîæíèöû, ïèíöåò, ÷àøêà Ïåòðè;
– ñòåðèëüíàÿ ïîñóäà äëÿ ïîëó÷åíèÿ è ðàçâåäåíèÿ ãåïàòîöèòîâ (öèëèíäðû, ñòàêàíû);
– ôèëüòðû äëÿ ñòåðèëèçàöèè ðàñòâîðîâ;
– ëàìèíàð;
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
7
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
– ðÍ-ìåòð;
– èãëà äëÿ ïåðôóçèè;
– ïëàñòèêîâûé êàòåòåð;
– ëèãàòóðû;
– ñâåòîâîé ìèêðîñêîï;
– èíâåðòèðîâàííûé ìèêðîñêîï;
– öåíòðèôóãà
– òðèïàí ãîëóáîé 0,4%
– êàìåðà Áþðêåðà;
– ñðåäà William E;
– ãåíòàìèöèí;
– ãëþêîçà 5,5 ììîëü;
– HEPES 10 ììîëü è 50 ììîëü;
– NaHCO3 4,17 ììîëü è 125 ììîëü;
– Na2HPO4 0,27 ììîëü è 16,85 ììîëü;
– ÊÍ2ÐÎ4 0,44 ììîëü è 22,04 ììîëü;
– KCl 5,36 ììîëü è 268,2 ììîëü;
– NaCl 136,9 ììîëü;
– êîëëàãåíàçà (òèï I, SeromedR, Biochrom KG, Berlin, Germany)
– ÑàÑl2 476 ììîëü;
– MgSO4´7 H2O 4,06 ììîëü;
– àëüáóìèí;
– ÄÍÊ-àçà (1 ìêã).
8
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
2. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà áèîñèíòåç ÄÍÊ:
– 12-ëóíî÷íûå êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè;
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
– âàêóóìíûé àñïèðàòîð;
– ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô»;
– öåíòðèôóãà ñ îõëàæäåíèåì;
– òåðìîáëîê;
– b-ñ÷åò÷èê;
– 6–3Í-òèìèäèí;
– ñìåñü òðèõëîðóêñóñíàÿ êèñëîòà (5%)/ìåòàíîë (95%);
– 0,3 ìîëü ÊÎÍ;
– 5%, 10% è 40% òðèõëîðóêñóñíàÿ êèñëîòà;
– ñöèíòèëëÿöèîííàÿ æèäêîñòü;
– ôîñôàòíûé áóôåð (ðÍ 7,4);
– êðàñèòåëü Hoechst 33342 (1 ìã/ìë);
– êîëëàãåíàçà (0,5 ìã/ìë);
– Òðèñ-ÍÑl 100 ììîëü;
– ÝÄÒÀ 1 ììîëü;
– äîäåöèëñóëüôàò íàòðèÿ 0,1%;
– ñòàíäàðò: ÄÍÊ òèìóñà òåëåíêà
– ôëóîðåñöåíòíûé ñïåêòðîôîòîìåòð.
3. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà áèîñèíòåç áåëêà:
– 12-ëóíî÷íûå êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè;
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
9
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
– âàêóóìíûé àñïèðàòîð;
– ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô»;
– öåíòðèôóãà ñ îõëàæäåíèåì;
– óëüòðàçâóêîâîé äåçèíòåãðàòîð;
– ñïåêòðîôîòîìåòð;
– áóìàæíûå ôèëüòðû;
– b-ñ÷åò÷èê;
– 35S-ìåòèîíèí;
– Òðèñ-ÍÑl 25 ììîëü;
– ÝÄÒÀ 5 ììîëü;
– NaCl 250 ììîëü;
– 1% Òðèòîí Õ-100;
– 10% òðèõëîðóêñóñíàÿ êèñëîòà;
– êîëëàãåíàçà (0,1 ìã/ìë);
– ôîñôàòíûé áóôåð (ðÍ 7,4);
– ðåàêòèâû äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà áåëêà: «Àíàëèç-Õ», «Êîðìåé ÄèÀíà», BCA
protein assay (Rockford, IL, USA);
– ñòàíäàðò: áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí.
4. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà íåêðîç ãåïàòîöèòîâ:
– 12-ëóíî÷íûå êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè;
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
– âàêóóìíûé àñïèðàòîð;
– 0,1% Òðèòîí Õ-100;
– ñòàíäàðòíûå íàáîðû äëÿ îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû.
10
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
5. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà àïîïòîç ãåïàòîöèòîâ:
– 35 ìì êóëüòóðàëüíûå ÷àøêè;
– ÑÎ2-èíêóáàòîð;
– âàêóóìíûé àñïèðàòîð;
– ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô»;
– öåíòðèôóãà ñ îõëàæäåíèåì;
– ôîñôàòíûé áóôåð (ðÍ 7,4);
– Òðèñ-ÍÑl 10 ììîëü è 100 ììîëü;
– NaCl 200 ììîëü;
– ÝÄÒÀ 5 ììîëü;
– äîäåöèëñóëüôàò íàòðèÿ 2%;
– ïðîòåèíêèíàçà Ê (20 ìã/ìë)
– ôåíîë;
– õëîðîôîðì;
– èçîàìèëîâûé ñïèðò;
– 70% ýòàíîë;
– ðèáîíóêëåàçà À (10 ìã/ìë);
– àãàðîçà;
– ýòèäèóì áðîìèä;
– ñïåêòðîôîòîìåòð;
– ïðèáîð äëÿ ýëåêòðîôîðåçà;
– óñòðîéñòâî ñ èñòî÷íèêîì ÓÔ äëÿ îöåíêè ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ;
– êàìåðà äëÿ âûïîëíåíèÿ ôîòîñíèìêîâ.
11
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ ÈÑÏÎËÜÇÎÂÀÍÈß ÌÅÒÎÄÀ
I ýòàï. Îöåíêà ïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà
1. Îïðåäåëåíèå ÷èñëà êëåòîê â ìîíîñëîå
Èñïîëüçóþòñÿ òðàíñôîðìèðîâàííûå îïóõîëåâûå êëåòêè L929 èëè L41. Äëÿ êóëüòèâèðîâàíèÿ
êëåòîê èñïîëüçóåòñÿ ñðåäà 199, ñîäåðæàùàÿ 10% ñûâîðîòêè êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà,
àíòèáèîòèêè. Ïàññèðîâàíèå êëåòîê ïðîèçâîäèòñÿ â 24 è 48-ëóíî÷íûå êóëüòóðàëüíûå ïëàøêè
ñ èñïîëüçîâàíèåì ñðåäû 199, ñîäåðæàùåé 5% áû÷üåé ñûâîðîòêè. Êëåòêè âûñåâàþòñÿ â ïëàøêè
(1´105 êëåòîê íà ëóíêó), ÷åðåç 2 ÷ ìåíÿåòñÿ ñðåäà, è äîáàâëÿþòñÿ èññëåäóåìûå ïðåïàðàòû â
êîíöåíòðàöèè 50–1000 ìêã/ìë.  êà÷åñòâå êîíòðîëÿ èñïîëüçóåòñÿ êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà. Èíêóáàöèÿ
êëåòîê ñ ïðåïàðàòàìè ïðîèçâîäèòñÿ â òå÷åíèå 1–4 ñóò. ïðè 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2. Ïîñëå
èíêóáàöèè ñðåäà óäàëÿåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ òðèæäû õîëîäíûì ðàñòâîðîì Ýðëà è
îêðàøèâàþòñÿ 0,2% ðàñòâîðîì êðèñòàëëâèîëåòà â 2% ñïèðòå â òå÷åíèå 10 ìèí. Êðàñèòåëü
ýêñòðàãèðóåòñÿ 10% ðàñòâîðîì óêñóñíîé êèñëîòû â òå÷åíèå 1 ÷. Îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü
èçìåðÿåòñÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ïðè l 590 íì. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ â ïðîöåíòàõ ïî
îòíîøåíèþ ê êîíòðîëþ.
12
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
2. Îïðåäåëåíèå áèîñèíòåçà ÄÍÊ
Êëåòêè êóëüòèâèðóþòñÿ àíàëîãè÷íî îïèñàííîìó âûøå. ×åðåç 2 ÷ èíêóáàöèè ïðåïàðàòà
ñ êëåòêàìè äîáàâëÿåòñÿ 3Í-òèìèäèí â äîçå 2,5 ìêÊè/ìë. ×åðåç 18 ÷ èíêóáàöèè (37° Ñ, 5%
ÑÎ 2) êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà àñïèðèðóåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ òðèæäû õîëîäíûì
ðàñòâîðîì Ýðëà, 3Í-òèìèäèí ýêñòðàãèðóåòñÿ ñìåñüþ 10% óêñóñíîé êèñëîòû ñ ýòèëîâûì
ñïèðòîì (1:9) â òå÷åíèå 10 ìèí. Êëåòêè ãèäðîëèçóþòñÿ 0,3 N ÊÎÍ â òå÷åíèå íî÷è â
òåðìîñòàòå ïðè 37° Ñ. Ïðîáû íåéòðàëèçóþòñÿ 1 N õëîðíîé êèñëîòîé äî ðÍ 7,0. Äëÿ
îïðåäåëåíèÿ ðàäèîàêòèâíîñòè èñïîëüçóåòñÿ 0,1 ìë ãèäðîëèçàòà â äèîêñàíîâîì
ñöèíòèëëÿòîðå. Ïðîèçâîäèòñÿ ïîäñ÷åò êëåòîê ïî îêðàñêå êðèñòàëëâèîëåòîì è
ðàññ÷èòûâàåòñÿ ÷èñëî èìïóëüñîâ â ìèíóòó íà 1000 êëåòîê. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ â
ïðîöåíòàõ ïî îòíîøåíèþ ê êîíòðîëþ.
3. Îïðåäåëåíèå áèîñèíòåçà áåëêà
Êëåòêè êóëüòèâèðóþòñÿ àíàëîãè÷íî îïèñàííîé âûøå ìåòîäèêå. ×åðåç 2 ÷ èíêóáàöèè
ïðåïàðàòà ñ êëåòêàìè äîáàâëÿåòñÿ 14Ñ-àìèíîêèñëîòû â äîçå 40 ìêÊè/ìë. ×åðåç 6 ÷ èíêóáàöèè
(37° Ñ, 5% ÑÎ2) êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà àñïèðèðóåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ òðèæäû õîëîäíûì
ðàñòâîðîì Ýðëà, 14Ñ-àìèíîêèñëîòû ýêñòðàãèðóþòñÿ ñìåñüþ 10% óêñóñíîé êèñëîòû ñ
ýòèëîâûì ñïèðòîì (1:9) â òå÷åíèå 10 ìèí. Êëåòêè ãèäðîëèçóþòñÿ 0,3 N ÊÎÍ â òå÷åíèå íî÷è
â òåðìîñòàòå ïðè 37° Ñ. Ïðîáû íåéòðàëèçóþòñÿ 1 N õëîðíîé êèñëîòîé äî ðÍ 7,0. Äëÿ
îïðåäåëåíèÿ ðàäèîàêòèâíîñòè èñïîëüçóåòñÿ 0,1 ìë ãèäðîëèçàòà â äèîêñàíîâîì
ñöèíòèëëÿòîðå. Ïðîèçâîäèòñÿ ïîäñ÷åò êëåòîê ïî îêðàñêå êðèñòàëëâèîëåòîì è ðàññ÷èòûâàåòñÿ
÷èñëî èìïóëüñîâ â ìèíóòó íà 1000 êëåòîê. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ â ïðîöåíòàõ ïî îòíîøåíèþ
ê êîíòðîëþ.
13
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
II ýòàï. Îöåíêà íåïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà
1. Ïîëó÷åíèå àêòèâèðîâàííûõ ïåðèòîíåàëüíûõ ìàêðîôàãîâ
Ìûøàì âíóòðèáðþøèííî ââîäèòñÿ 5 ìë 3% ðàñòâîðà ïåïòîíà â ñðåäå Õåíêñà. ×åðåç 3
ñóò âíóòðèáðþøèííî ââîäèòñÿ 7 ìë õîëîäíîé ñðåäû 199, ñîäåðæàùåé 10% áû÷üåé ñûâîðîòêè,
àíòèáèîòèêè è 10 ÅÄ ãåïàðèíà (ðàñòâîð À). ×åðåç 1 ìèí æèäêîñòü èç áðþøíîé ïîëîñòè,
ñîäåðæàùàÿ àêòèâèðîâàííûå ìàêðîôàãè, àñïèðèðóåòñÿ, öåíòðèôóãèðóåòñÿ â òå÷åíèå 10 ìèí
ïðè 1000 îá./ìèí. Çàòåì ìàêðîôàãè ïðîìûâàþòñÿ 10 ìë ðàñòâîðà À áåç ãåïàðèíà è
ñóñïåíçèðóþòñÿ â òîì æå ðàñòâîðå. Ïîëó÷åííûå ìàêðîôàãè ïàññèðóþòñÿ íà 24-ëóíî÷íûå
ïëàíøåòû ñ ïëîòíîñòüþ 5´106 êëåòîê/ìë.
2. Îïðåäåëåíèå öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà
×åðåç ñóòêè ê îáðàçîâàâøåìóñÿ ìîíîñëîþ äîáàâëÿþòñÿ èññëåäóåìûå ïðåïàðàòû è
ìàêðîôàãè èíêóáèðóþòñÿ â òåðìîñòàòå ïðè 37° Ñ â òå÷åíèå 24 ÷. ×åðåç 24 ÷
êîíäèöèîíèðîâàííàÿ ñðåäà ìàêðîôàãîâ ñîáèðàåòñÿ, öåíòðèôóãèðóåòñÿ è òåñòèðóåòñÿ íà
êëåòêàõ L929. Äëÿ ýòîãî ê ìîíîñëîþ êëåòîê L929 äîáàâëÿåòñÿ ñóïåðíàòàíò ìàêðîôàãîâ è
àêòèíîìèöèí Ä (0,05 ìã/ìë ñðåäû). ×åðåç 18 ÷ èíêóáàöèè ïðè 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2
ñðåäà óäàëÿåòñÿ, êîëè÷åñòâî êëåòîê ïîäñ÷èòûâàþò ïîñëå îêðàñêè êðèñòàëëâèîëåòîì (ñì.
âûøå). Ðàññ÷èòûâàåòñÿ öèòîòîêñè÷åñêèé èíäåêñ:
(a-b) ´ 100% ,
à
ãäå à — îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü êîíòðîëÿ (ñóïåðíàòàíò áåç äîáàâëåíèÿ ïðåïàðàòà), b —
îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü îïûòà (ñóïåðíàòàíò ñ äîáàâëåíèåì ïðåïàðàòà).
14
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
III ýòàï. Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ñ èñïîëüçîâàíèåì êóëüòóðû ãåïàòîöèòîâ
1. Ïîëó÷åíèå ãåïàòîöèòîâ
Ïåðåä íà÷àëîì îïåðàöèè îïåðàöèîííûé áîêñ è ñòîë ïðîòèðàþòñÿ äåçèíôèöèðóþùèì
ðàñòâîðîì. Àíåñòåçèÿ ïðîèçâîäèòñÿ ïóòåì âíóòðèìûøå÷íîãî ââåäåíèÿ ñìåñè êåòàìèí/
ðîìïóí (êåòàìèí (ìêë) = ìàññà (ã)´1; ðîìïóí (ìêë) = ìàññà (ã) ´0,4). Íîæíèöàìè è ïèíöåòîì
óäàëÿåòñÿ øåðñòü îò æèâîòà äî ãðóäíîé êëåòêè. Ïî ñðåäíåé ëèíèè âñêðûâàåòñÿ áðþøíàÿ
ïîëîñòü. Íàêëàäûâàþòñÿ ëèãàòóðû íà âîðîòíóþ âåíó è íèæíþþ ïîëóþ âåíó íèæå ïå÷åíè.
Âîðîòíàÿ âåíà âñêðûâàåòñÿ, êàíþëèðóåòñÿ èãëîé äëÿ ïåðôóçèè, êîòîðàÿ ôèêñèðóåòñÿ
ëèãàòóðîé. Íèæíÿÿ ïîëàÿ âåíà ïåðåðåçàåòñÿ. Âñêðûâàåòñÿ ãðóäíàÿ êëåòêà, íà íèæíþþ ïîëóþ
âåíó âûøå ñåðäöà íàêëàäûâàåòñÿ ëèãàòóðà, âñòàâëÿåòñÿ ïëàñòèêîâûé êàòåòåð è ëèãàòóðà
çàòÿãèâàåòñÿ. Íèæíÿÿ ïîëàÿ âåíà íèæå ïå÷åíè ïåðåæèìàåòñÿ ëèãàòóðîé.
Ïå÷åíü ïåðôóçèðóåòñÿ ñáàëàíñèðîâàííûì ðàñòâîðîì Õåíêñà, ñîäåðæàùèì ãëþêîçó
(5,5 ììîëü), HEPES (10 ììîëü), NaHCO3 (4,17 ììîëü), Na 2HPO4 (0,27 ììîëü), ÊÍ2ÐÎ4
(0,44 ììîëü), KCl (5,36 ììîëü), NaCl (136,9 ììîëü) ñî ñêîðîñòüþ 20 ìë/ìèí ïðè
òåìïåðàòóðå ðàñòâîðà 37° Ñ. Äëÿ ðàçðóøåíèÿ ñîåäèíèòåëüíîé òêàíè ïå÷åíè ïåðôóçèÿ
ïðîäîëæàåòñÿ ðàñòâîðîì êîëëàãåíàçû (òèï I, SeromedR, Biochrom KG, Berlin, Germany, 40
ìã/100 ìë ñðåäû Õåíêñà), ñîäåðæàùèì 1 ììîëü/ë Ñà2 +, â ðåöèðêóëèðóþùåì ðåæèìå â
òå÷åíèå 10 ìèí (II ýòàï). Âñå ðàñòâîðû äî ïðèìåíåíèÿ íàñûùàþòñÿ 95% Î2 è 5% ÑÎ2 è
äîâîäèòñÿ ðÍ äî 7,2. Ïåðåä èñïîëüçîâàíèåì ðàñòâîðû ñòåðèëèçóþòñÿ ïðîïóñêàíèåì ÷åðåç
ôèëüòðû.
15
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
Äëÿ ïîëó÷åíèÿ ñóñïåíçèè ãåïàòîöèòîâ ïîñëå ðàçðóøåíèÿ ñîåäèíèòåëüíîé òêàíè ïå÷åíü
âûäåëÿåòñÿ è èçìåëü÷àåòñÿ â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì HEPES (50 ììîëü), ÑàÑl2 (476 ììîëü),
NaHCO3 (125 ììîëü), KCl (268,2 ììîëü), MgSO4´7 H2O (4,06 ììîëü), Ê2ÍÐÎ4 (22,04 ììîëü),
Na 2HPO4 (16,85 ììîëü), àëüáóìèí (1,0 ã), ÄÍÊ-àçó (1 ìêã). Ñóñïåíçèÿ ãåïàòîöèòîâ
ôèëüòðóåòñÿ ÷åðåç 6-ñëîéíûé ñòåðèëüíûé ìàðëåâûé ôèëüòð è öåíòðèôóãèðóåòñÿ ïðè 500 g
â òå÷åíèå 2 ìèí äëÿ óäàëåíèÿ íåïàðåíõèìàòîçíûõ è ïîãèáøèõ êëåòîê. Ãåïàòîöèòû
ðåñóñïåíçèðóþòñÿ â ñðåäå William E, ñîäåðæàùåé 10% ôåòàëüíîé ñûâîðîòêè, 26 ììîëü
NaHCO3 è 50 ìêã/ìë ãåíòàìèöèíà. Îöåíêà æèçíåñïîñîáíîñòè ïðîèçâîäèòñÿ ïîñëå îêðàñêè
ãåïàòîöèòîâ òðèïàíîâûì ãîëóáûì. Äëÿ ýòîãî 20 ìêë êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè ñìåøèâàåòñÿ ñ 20
ìêë 0,4% ðàñòâîðà òðèïàíîâîãî ãîëóáîãî, ïðîèçâîäèòñÿ ïîäñ÷åò âñåõ áîëüøèõ ñâåòëûõ êëåòîê
è áîëüøèõ ãîëóáûõ êëåòîê â 20 ïîëÿõ çðåíèÿ êàìåðû Áþðêåðà (âîçìîæíî èñïîëüçîâàíèå
êàìåðû Ãîðÿåâà). Ðàñ÷åò âèòàëèòåòà ïðîèçâîäèòñÿ ïî ôîðìóëå: (îáùåå êîëè÷åñòâî êëåòîê–
êîëè÷åñòâî ãîëóáûõ êëåòîê/îáùåå êîëè÷åñòâî êëåòîê)´100.  ýêñïåðèìåíòå èñïîëüçóþòñÿ
ñóñïåíçèè ñ êîëè÷åñòâîì æèçíåñïîñîáíûõ êëåòîê íå ìåíåå 85%.
16
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
2. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà áèîñèíòåç ÄÍÊ
Èçîëèðîâàííûå ãåïàòîöèòû (ïî 0,6 ìë ñóñïåíçèè, ïëîòíîñòü 0,5´10 6 êëåòîê/ìë)
ïàññèðóþòñÿ â îáðàáîòàííûå êîëëàãåíîì 12-ëóíî÷íûå ïëàíøåòû è êóëüòèâèðóþòñÿ ïðè
òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2. ×åðåç 2 ÷ ïîñëå ïàññàæà ñðåäà çàìåíÿåòñÿ,
äîáàâëÿþòñÿ ïðåïàðàòû â äèàïàçîíå äîç 25–1000 ìêã/ìë è 1 ìêÊè/ëóíêà (6–3Í-òèìèäèíà).
Êëåòêè ñ ïðåïàðàòàìè èíêóáèðóþòñÿ ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2 â
òå÷åíèå 12 ÷. Ïîñëå èíêóáàöèè ñðåäà óäàëÿåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ ñìåñüþ
òðèõëîðóêñóñíàÿ êèñëîòà/ìåòàíîë è ñîëþáèëèçèðóþòñÿ 1 ìë 0,3 N ÊÎÍ â òå÷åíèå 30 ìèí
ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ. Ñóïåðíàòàíò ñîáèðàåòñÿ â ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô», äîáàâëÿåòñÿ 1 ìë
40% òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòû, ïðîáèðêè âñòðÿõèâàþòñÿ è öåíòðèôóãèðóþòñÿ 10 ìèí ïðè
14 000 g. Ê ñåäèìåíòàì äîáàâëÿåòñÿ ïî 1 ìë 5% òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòû è ïðîáû
ïîìåùàþòñÿ â òåðìîáëîê íà 15 ìèí ïðè òåìïåðàòóðå 90° Ñ. Ïîñëå îõëàæäåíèÿ ïðîáû
öåíòðèôóãèðóþòñÿ 10 ìèí ïðè 14 000 g è ïî 250 ìêë ñóïåðíàòàíòà äîáàâëÿþòñÿ ê 4 ìë
ñöèíòèëëÿöèîííîé æèäêîñòè «Rotiscint eco plus». Êîëè÷åñòâî èìïóëüñîâ ïîäñ÷èòûâàåòñÿ ñ
ïîìîùüþ b-ñ÷åò÷èêà. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ êàê èìïóëüñû/ìèí/ìêã ÄÍÊ.
17
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
Äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà ÄÍÊ ïîñëå èíêóáàöèè êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ ôîñôàòíûì
áóôåðîì (37° Ñ), ñíèìàþòñÿ ñ ïëàøåê èíêóáàöèåé ñ ðàñòâîðîì êîëëàãåíàçû (0,5 ìã/ìë
ôîñôàòíîãî áóôåðà, 30 ìèí, 37° Ñ), ïåðåíîñÿòñÿ â ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô» è
öåíòðèôóãèðóþòñÿ 5 ìèí ïðè 5 000 g. Ñåäèìåíòû çàìîðàæèâàþòñÿ ïðè –20° Ñ äî
èññëåäîâàíèÿ. Ïåðåä îïðåäåëåíèåì ÄÍÊ ïðîáû ðàçìîðàæèâàþòñÿ è êëåòêè ëèçèðóþòñÿ
áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 0,1% äîäåöèëñóëüôàò íàòðèÿ, 1 ììîëü ÝÄÒÀ, 100 ììîëü ÒðèñÍÑl (ðÍ 7,4) â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè ïîñòîÿííîì âñòðÿõèâàíèè. Êîëè÷åñòâî ÄÍÊ îïðåäåëÿåòñÿ
ôëóîðåñöåíòíîé ñïåêòðîìåòðèåé ïîñëå îêðàøèâàíèÿ êðàñèòåëåì Hoechst 33342 (1 ìã/
ìë), èñïîëüçóÿ â êà÷åñòâå ñòàíäàðòà ÄÍÊ òèìóñà òåëåíêà. Äëèíà âîçáóæäåíèÿ 350 íì,
äëèíà âûäåëåíèÿ 450 íì.
18
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
3. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà áèîñèíòåç áåëêà
Ãåïàòîöèòû ïàññèðóþòñÿ è èíêóáèðóþòñÿ àíàëîãè÷íî îïèñàííîìó âûøå ìåòîäó (ñì.
èññëåäîâàíèå áèîñèíòåçà ÄÍÊ). 35S-ìåòèîíèí (40 ìêÊè/ìë) è ïðåïàðàòû äîáàâëÿþòñÿ ê
ãåïàòîöèòàì ÷åðåç 2 ÷ êóëüòèâèðîâàíèÿ ïîñëå çàìåíû ñðåäû. ×åðåç 3 ÷ èíêóáàöèè 50 ìêë
ñðåäû ïåðåíîñèòñÿ íà ôèëüòð (äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñåêðåòèðóåìûõ èç êëåòêè áåëêîâ).
Îñòàëüíàÿ ñðåäà êóëüòèâèðîâàíèÿ óäàëÿåòñÿ, êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ äâàæäû õîëîäíûì
ôîñôàòíûì áóôåðîì, â ëóíêè äîáàâëÿåòñÿ ïî 0,5 ìë ëèçèðóþùåãî áóôåðà (25 ììîëü ÒðèñÍÑl (ðÍ 7,5), 5 ììîëü ÝÄÒÀ, 250 ììîëü NaCl, 1% Òðèòîí Õ-100) è ïðîáû èíêóáèðóþòñÿ
30 ìèí ïðè 4° Ñ. Êëåòêè ìåõàíè÷åñêè ñíèìàþòñÿ ñ ïëàøåê è ïåðåíîñÿòñÿ â ïðîáèðêè
«Ýïïåíäîðô». Ëóíêè ïðîìûâàþòñÿ äâàæäû (ïî 250 ìêë) ëèçèðóþùèì áóôåðîì è
ïðîáèðêè èíêóáèðóþòñÿ 30 ìèí ïðè 4° Ñ. Ïîñëå èíêóáàöèè ïðîáèðêè öåíòðèôóãèðóþòñÿ
5 ìèí ïðè 14 000 g è ïî 50 ìêë ñóïåðíàòàíòà ïåðåíîñÿòñÿ íà ôèëüòðû. Ôèëüòðû
ïðîìûâàþòñÿ 3 ðàçà õîëîäíîé 10% òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòîé (ïî 5 ìë), 1 ðàç âîäîé è
ïåðåíîñÿòñÿ â ñöèíòèëëÿöèîííóþ æèäêîñòü. Êîëè÷åñòâî èìïóëüñîâ ïîäñ÷èòûâàåòñÿ íà bñ÷åò÷èêå. Ðåçóëüòàòû âûðàæàþòñÿ êàê èìïóëüñû/ìèí/ìã áåëêà.
Äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà áåëêà ïîñëå êóëüòèâèðîâàíèÿ ñðåäà óäàëÿåòñÿ, êëåòêè
ïðîìûâàþòñÿ ôîñôàòíûì áóôåðîì, ñíèìàþòñÿ ñ ïëàøåê èíêóáàöèåé ñ ðàñòâîðîì êîëëàãåíàçû
(0,1 ìã/ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà) â òå÷åíèå 15 ìèí ïðè 37° Ñ, ïåðåíîñÿòñÿ â ïðîáèðêè
«Ýïïåíäîðô» è öåíòðèôóãèðóþòñÿ 5 ìèí ïðè 5 000 g. Êëåòêè ðåñóñïåíçèðóþòñÿ â 0,5 ìë
ôîñôàòíîãî áóôåðà è ðàçðóøàþòñÿ ñ ïîìîùüþ óëüòðàçâóêà. Êîëè÷åñòâî áåëêà
îïðåäåëÿåòñÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè (l 562 íì) ñ ïîìîùüþ Pierce ÂÑÀ-ìèêðîìåòîäà,
èñïîëüçóÿ â êà÷åñòâå ñòàíäàðòà áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí. Âîçìîæíî èñïîëüçîâàíèå
äðóãèõ íàáîðîâ, îñíîâàííûõ íà áèóðåòîâîì ìåòîäå.
19
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
4. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà íåêðîç ãåïàòîöèòîâ
Èçîëèðîâàííûå ãåïàòîöèòû (ïî 0,6 ìë ñóñïåíçèè, ïëîòíîñòü 0,5´10 6 êëåòîê/ìë)
ïàññèðóþòñÿ â îáðàáîòàííûå êîëëàãåíîì 12-ëóíî÷íûå ïëàíøåòû è êóëüòèâèðóþòñÿ ïðè
òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2. ×åðåç 2 ÷ ïîñëå ïàññàæà ñðåäà çàìåíÿåòñÿ è
äîáàâëÿþòñÿ ïðåïàðàòû â äèàïàçîíå äîç 25–1000 ìêã/ìë. Êëåòêè ñ ïðåïàðàòàìè
èíêóáèðóþòñÿ ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2 â òå÷åíèå 4 ÷. Ïîñëå èíêóáàöèè
êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà ñîáèðàåòñÿ è èññëåäóåòñÿ àêòèâíîñòü ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû ñ
èñïîëüçîâàíèåì ñòàíäàðòíûõ íàáîðîâ ôèðìû «Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).
Âîçìîæíî èñïîëüçîâàíèå äðóãèõ íàáîðîâ äëÿ îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû.
Îáùàÿ àêòèâíîñòü ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû îïðåäåëÿåòñÿ ïîñëå îáðàáîòêè êëåòîê 0,1% ðàñòâîðîì
Òðèòîíà Õ-100. Âûñâîáîæäåíèå ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû ðàññ÷èòûâàåòñÿ êàê ïðîöåíò îò îáùåé
àêòèâíîñòè ôåðìåíòà.
20
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
5. Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ïðåïàðàòîâ íà àïîïòîç ãåïàòîöèòîâ
Èçîëèðîâàííûå ãåïàòîöèòû (ïî 1,5 ìë ñóñïåíçèè, ïëîòíîñòü 0,5´10 6 êëåòîê/ìë)
ïàññèðóþò íà îáðàáîòàííûå êîëëàãåíîì 35 ìì êóëüòóðàëüíûå ÷àøêè. ×åðåç 2 ÷ ñðåäó
çàìåíÿþò è äîáàâëÿþò èññëåäóåìûå ïðåïàðàòû. Êîíòðîëü — ñðåäà êóëüòèâèðîâàíèÿ. ×åðåç
4 ÷ èíêóáàöèè ïðè òåìïåðàòóðå 37° Ñ â àòìîñôåðå ñ 5% ÑÎ2 êëåòêè ïðîìûâàþòñÿ õîëîäíûì
ôîñôàòíûì áóôåðîì è ëèçèðóþòñÿ áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 100 ììîëü Òðèñ-ÍÑl (ðÍ 8,0), 200
ììîëü NaCl, 5 ììîëü ÝÄÒÀ è 2% ðàñòâîð äîäåöèëñóëüôàòà íàòðèÿ è ÷åðåç 15 ìèí ìåõàíè÷åñêè
ñíèìàþòñÿ ñ ïëàøåê è ïåðåíîñÿòñÿ â ïðîáèðêè «Ýïïåíäîðô». Çàòåì ê ãåïàòîöèòàì
äîáàâëÿåòñÿ ïðîòåèíêèíàçà Ê (20 ìã/ìë) è ñìåñü èíêóáèðóåòñÿ â òå÷åíèå íî÷è ïðè 56° Ñ.
ÄÍÊ ýêñòðàãèðóåòñÿ ñìåñüþ ôåíîë/õëîðîôîðì/èçîàìèëîâûé ñïèðò (25:24:1)
(öåíòðèôóãèðîâàíèå 30 ìèí, 15 000 g, ïðè 4° Ñ), ïðîìûâàåòñÿ 70% ýòàíîëîì, îñàäîê
âûñóøèâàåòñÿ (ïåðåâåðíóâ ïðîáèðêó íà ôèëüòðîâàëüíóþ áóìàãó), ðåñóñïåíçèðóåòñÿ â 10
ììîëü Òðèñ-ÍÑl è îáðàáàòûâàåòñÿ ðèáîíóêëåàçîé À (10 ìã/ìë) â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè
òåìïåðàòóðå 37° Ñ. Ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè îïðåäåëÿþò êîëè÷åñòâî ïîëó÷åííîé ÄÍÊ (l
260 è 280 íì). Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ (5 ìêã/ïðîáà) îñóùåñòâëÿþò â 1,5% àãàðîçíîì ãåëå,
îêðàøåííîì ýòèäèóì áðîìèäîì, ïðè 35  â òå÷åíèå 4 ÷. Íàëè÷èå àïîïòîçà îöåíèâàþò ïî
îáðàçîâàíèþ ïðè ýëåêòðîôîðåçå «ÄÍÊ-ëåñòíèöû», êîòîðàÿ âûÿâëÿåòñÿ ïðè ïðîïóñêàíèè
óëüòðàôèîëåòîâûõ ëó÷åé ÷åðåç ãåëü.
21
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷íîñòè ãåïàòîòðîïíûõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð
ÂÎÇÌÎÆÍÛÅ ÎÑËÎÆÍÅÍÈß È ÎØÈÁÊÈ
Âîçìîæíûå îøèáêè ïðè îïðåäåëåíèè ïðÿìîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ìîãóò âîçíèêíóòü
ïðè óâåëè÷åíèè èëè óìåíüøåíèè êîëè÷åñòâà ïàññèðóåìûõ êëåòîê.
Ïðè èçó÷åíèè öèòîòîêñè÷íîñòè íà ãåïàòîöèòàõ ìîãóò âîçíèêíóòü çàòðóäíåíèÿ ïðè
ïîëó÷åíèè ñóñïåíçèè, îáóñëîâëåííûå íåäîñòàòî÷íîé ïåðôóçèåé ïå÷åíè ðàñòâîðîì
êîëëàãåíàçû. Ïðè èçáûòî÷íîì âðåìåíè ïåðôóçèè âîçìîæíî ðàçðóøåíèå ãåïàòîöèòîâ è
ñíèæåíèå âèòàëèòåòà.
ÏÐÎÒÈÂÎÏÎÊÀÇÀÍÈß Ê ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÞ
Ïðîòèâîïîêàçàíèÿ ê èñïîëüçîâàíèþ ìåòîäà îòñóòñòâóþò.
22
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ