генетика индукция теломеразной активности увеличивает

8
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 1
ÃÅÍÅÒÈÊÀ
ÓÄÊ 57.085.23
ÈÍÄÓÊÖÈß ÒÅËÎÌÅÐÀÇÍÎÉ ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÈ ÓÂÅËÈ×ÈÂÀÅÒ
ÝÔÔÅÊÒÈÂÍÎÑÒÜ ÐÅÏÐÎÃÐÀÌÌÈÐÎÂÀÍÈß
ÔÈÁÐÎÁËÀÑÒΠÊÎÆÈ ×ÅËÎÂÅÊÀ
Ý.Á. Äàøèíèìàåâ1, È.À. Ìó÷êàåâà1, Ð.Ð. Ôàéçóëëèí1, Å.Å. Åãîðîâ2,
Ñ.Ñ. Àêèìîâ3, Â.Â. Òåðñêèõ1, À.Â. Âàñèëüåâ1, Ì.Ï. Êèðïè÷íèêîâ
(êàôåäðà áèîèíæåíåðèè; e-mail: [email protected])
Òåõíîëîãèè ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ êëåòîê ÷åëîâåêà ÿâëÿþòñÿ ïåðñïåêòèâíûì íàïðàâëåíèåì ðàçâèòèÿ êëåòî÷íîé áèîëîãèè ñ äàëüíåé ïåðñïåêòèâîé èñïîëüçîâàíèÿ äàííûõ ìåòîäîâ
äëÿ êëåòî÷íî-çàìåùàþùåé òåðàïèè â êëèíè÷åñêîé ïðàêòèêå. Îäíîé èç ïðîáëåì, âñòàþùèõ
íà ïóòè èññëåäîâàòåëåé, ÿâëÿåòñÿ íèçêàÿ ýôôåêòèâíîñòü ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ è èñïîëüçîâàíèå íåæåëàòåëüíûõ îíêîãåíîâ â ïåðâîíà÷àëüíûõ ìåòîäèêàõ.  äàííîé ðàáîòå íàìè áûë ïðåäëîæåí àëüòåðíàòèâíûé ìîäèôèöèðîâàííûé ìåòîä ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ôèáðîáëàñòîâ êîæè
÷åëîâåêà. Áûëî ïîêàçàíî, ÷òî èíäóêöèÿ òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòè óâåëè÷èâàåò âûõîä ðåïðîãðàììèðîâàííûõ êëåòîê è ïîçâîëÿåò èñêëþ÷èòü îêîíãåí c-Myc èç èñïîëüçóåìîãî íàáîðà ãåíîâ.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: òåëîìåðàçà, ðåïðîãðàììèðîâàíèå, ôèáðîáëàñòû êîæè ÷åëîâåêà.
Îäíèì èç ñàìûõ ïåðñïåêòèâíûõ è ðàçâèâàþùèõñÿ íàïðàâëåíèé â ñîâðåìåííîé êëåòî÷íîé áèîëîãèè
ÿâëÿåòñÿ ðåïðîãðàììèðîâàíèå ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê
÷åëîâåêà. Ïðè ïîìîùè ìåòîäèê ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ èññëåäîâàòåëè íàäåþòñÿ ïîëó÷àòü ïàöèåíò-ñïåöèôè÷åñêèå êëåòêè ðàçëè÷íûõ òèïîâ òêàíåé, êîòîðûå ìîæíî áûëî áû èñïîëüçîâàòü â çàìåñòèòåëüíîé
êëåòî÷íî-òêàíåâîé òåðàïèè. Ïîìèìî ðàçðàáîòàííûõ
ìåòîäîâ ïîëó÷åíèÿ ïàöèåíò-ñïåöèôè÷åñêèõ ïëþðèïîòåíòíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê ïîñðåäñòâîì ïåðåíîñà
ÿäåð â îîöèòû (somatic cell nuclear transfer, SCNT)
[1, 2], à òàêæå ïðè ïîìîùè ñëèÿíèÿ ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê ñ ýìáðèîíàëüíûìè ñòâîëîâûìè êëåòêàìè (ÝÑÊ) [3]
â 2006—2007 ãã. áûë ðàçðàáîòàí íîâûé ïîäõîä ê ðåïðîãðàììèðîâàíèþ êëåòîê ÷åëîâåêà: ïðè ïîìîùè
ëåíòèâèðóñíûõ òðàíñôåêöèé êëþ÷åâûõ ãåíîâ ïëþðèïîòåíòíîñòè Oct4, Sox2, KLF4, c-Myc (KMOS) óäàëîñü ïîëó÷èòü ðåïðîãðàììèðîâàííûå êëåòêè, íàçâàííûå ïîçäíåå èíäóöèðîâàííûìè ïëþðèïîòåíòíûìè
ñòâîëîâûìè êëåòêàìè (ÈÏÑ êëåòêè) [4, 5]. ÈÏÑ êëåòêè ïîõîäèëè íà ÝÑÊ ïî ìíîãèì õàðàêòåðèñòèêàì,
âêëþ÷àÿ ïðîôèëè ãåííîé ýêñïðåññèè, ìîðôîëîãèþ,
õàðàêòåð ìåòèëèðîâàíèÿ ÄÍÊ, ñïîñîáíîñòü äàâàòü
íà÷àëî âñåì òðåì çàðîäûøåâûì ëèñòêàì in vitro è
ôîðìèðîâàíèå çðåëûõ òåðàòîì â èììóííîäåôèöèòíûõ ìûøàõ.
Îäíîé èç ïðîáëåì ïîäîáíîãî ìåòîäà ÿâëÿåòñÿ íèçêàÿ ýôôåêòèâíîñòü ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ. Â ðàííåé
1
èñõîäíîé ìåòîäèêå òðàíñôåêöèåé ÷åòûðüìÿ ôàêòîðàìè KMOS ðåïðîãðàììèðîâàíèþ ïîäâåðãàëèñü òîëüêî ïîðÿäêà 0,01—0,1% òðàíñôèöèðîâàííûõ êëåòîê.
Äðóãîé ÿâíîé ïðîáëåìîé ïîäîáíîãî ìåòîäà ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ÿâëÿåòñÿ èñïîëüçîâàíèå îíêîãåíà c-Myc
â ñîñòàâå íàáîðà ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ KMOS. Ýêçîãåííàÿ ñâåðõýêñïðåññèÿ ýòîãî ãåíà ìîæåò âûçûâàòü
àêòèâàöèþ ãåíîâ îíêîñóïðåññîðîâ, íàïðèìåð Cdkn1a,
Cdkn2a, p53, êîòîðûå âîâëå÷åíû â ðàçëè÷íûå ïóòè
äèôôåðåíöèðîâêè è ïîäàâëåíèÿ ïðîëèôåðàöèè. Òàêæå èñïîëüçîâàíèå ýòîãî îíêîãåíà íåãàòèâíî âëèÿåò íà âîçìîæíîñòü ïðèìåíåíèÿ ìåòîäà â êëèíèêå,
ïîñêîëüêó íå èñêëþ÷åíà âåðîÿòíîñòü ðåàêòèâàöèè
âñòðîåííîãî ãåíà ñ ïîñëåäóþùåé çëîêà÷åñòâåííîé
òðàíñôîðìàöèåé ðåïðîãðàììèðîâàííûõ êëåòîê [6].
Ïîêàçàòåëüíî, ÷òî ó õèìåðíûõ ìûøåé, ïîëó÷åííûõ
èç ÈÏÑ êëåòîê áåç ââåäåíèÿ c-Myc, íå îáðàçîâûâàëîñü îïóõîëè ïîñëå ðîæäåíèÿ, òîãäà êàê ïðèáëèçèòåëüíî 15% æèâîòíûõ, ïîëó÷åííûõ îò ÈÏÑ êëåòîê
ñ ýêçîãåíîì c-Myc, ñòðàäàëè îíêîëîãè÷åñêèìè çàáîëåâàíèÿìè [7].
 òî æå âðåìÿ èçâåñòíî, ÷òî âî âðåìÿ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê äî ïëþðèïîòåíòíîãî ñîñòîÿíèÿ ïðîèñõîäèò ðåàêòèâàöèÿ òåëîìåðàçíîé
àêòèâíîñòè ñ ïîñëåäóþùèì äîñòðàèâàíèåì òåëîìåðíûõ ó÷àñòêîâ õðîìîñîì è ðåãóëèðîâàíèåì ýïèãåíåòè÷åñêîãî ïðîôèëÿ ñóáòåëîìåðíûõ îáëàñòåé ãåíîìà
[5, 8]. Ðÿä èññëåäîâàòåëåé íàïðÿìóþ ñâÿçûâàþò ðå-
Ó÷ðåæäåíèå Ðîññèéñêîé àêàäåìèè íàóê Èíñòèòóò áèîëîãèè ðàçâèòèÿ èì. Í.Ê. Êîëüöîâà. Ðîññèÿ, 119334, Ìîñêâà, óë. Âàâèëîâà.
Ðîññèéñêîé àêàäåìèè íàóê Èíñòèòóò ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè èì. Â.À. Ýíãåëüãàðäòà. Ðîññèÿ, 119991, Ìîñêâà, óë. Âàâèëîâà, ä. 32.
3 Department of Anatomy and Cell Biology, The George Washington University Medical Center, USA.
2 Ó÷ðåæäåíèå
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 1
àêòèâàöèþ òåëîìåðàçû è ïðèîáðåòåíèå èììîðòàëèçîâàííîãî ñòàòóñà ñ ýôôåêòèâíîñòüþ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê ÷åëîâåêà [9—11]. Òàêæå èçâåñòíî, ÷òî èíäóêöèÿ òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòè
ñòèìóëèðóåò ïðîëèôåðàöèþ êëåòîê, ÷òî ÿâëÿåòñÿ
äîïîëíèòåëüíûì ïîëîæèòåëüíûì ôàêòîðîì äëÿ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ.
Öåëü äàííîé ðàáîòû — ðàçðàáîòêà ìîäèôèöèðîâàííîé òåõíîëîãèè ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê ÷åëîâåêà (íà ïðèìåðå ôèáðîáëàñòîâ
êîæè âçðîñëîãî ÷åëîâåêà), îñíîâàííîé íà ïðåäâàðèòåëüíîé èíäóêöèè òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòè â
ðåïðîãðàììèðóåìûõ êëåòêàõ ñ ïîñëåäóþùèì ââåäåíèåì ãåíîâ ïëþðèïîòåíòíîñòè. Äàííûé ïîäõîä,
ïî íàøåìó ìíåíèþ, ïîçâîëèò èñêëþ÷èòü èñïîëüçîâàíèå îíêîãåíà ñ-Myc â ðåïðîãðàììèðóþùåì íàáîðå ãåíîâ è, âîçìîæíî, ïîâûñèò ýôôåêòèâíîñòü ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Âûäåëåíèå è êóëüòèâèðîâàíèå ïîñòíàòàëüíûõ
ôèáðîáëàñòîâ êîæè ÷åëîâåêà (ÏÔ×)
Ôèáðîáëàñòû âûäåëÿëèñü èç áèîïñèè êîæè âçðîñëîãî ÷åëîâåêà ñ ïîìîùüþ ìåõàíè÷åñêîé äåçàãðåãàöèè
è ôåðìåíòàòèâíîé îáðàáîòêè 0,1%-é êîëëàãåíàçîé
I òèïà (Worthington, ÑØÀ) ñ ïîñëåäóþùåé îòìûâêîé è öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Êëåòêè êóëüòèâèðîâàëè
â ñðåäå DMEM (Ïàíýêî, Ðîññèÿ), ñîäåðæàùåé 10%
ýìáðèîíàëüíîé òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêè (ÝÒÑ) (Hyclone,
ÑØÀ) â ñòàíäàðòíûõ êóëüòóðàëüíûõ óñëîâèÿõ (5%
ÑÎ2, +37°). Ïåðåñåâ êëåòî÷íûõ êóëüòóð ïðîèçâîäèëè ïî ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå ñ èñïîëüçîâàíèåì ðàñòâîðîâ Âåðñåíà (Ïàíýêî, Ðîññèÿ) è Òðèïñèí-ÝÄÒÀ
(PAA, Àâñòðèÿ).
9
ìûøèíûå è ïîëèêëîíàëüíûå êðîëè÷üè àíòèòåëà ïðîòèâ Oct4 (Chemicon, ÑØÀ), Sox2 (Invitrogen, ÑØÀ),
Nanog (Abcam, ÑØÀ), Anti-mouse Alexa 546 (Invitrogen, ÑØÀ), Anti-rabbit Alexa 546 (Invitrogen, ÑØÀ).
Îïðåäåëåíèå ýêñïðåññèè ãåíîâ
ìåòîäîì ÎÒ-ÏÖÐ
Äëÿ âûäåëåíèÿ òîòàëüíîé ÐÍÊ èç êëåòîê èñïîëüçîâàëè íàáîð Invisorb®Spin Cell RNA Mini Kit
(Invitek, Ãåðìàíèÿ) ïî ïðîòîêîëó, ïðåäëîæåííîìó ïðîèçâîäèòåëåì. Èçìåðåíèå êîíöåíòðàöèè ïîëó÷åííîé
òîòàëüíîé ÐÍÊ è íîðìèðîâàíèå ïðîèçâîäèëè ïðè
ïîìîùè êþâåòíîãî ñïåêòðîôîòîìåòðà BioPhotometer (Eppendorf, Ãåðìàíèÿ). Îáðàòíóþ òðàíñêðèïöèþ
ìÐÍÊ îñóùåñòâëÿëè ïðè ïîìîùè íàáîðà äëÿ ñèíòåçà ïåðâîé öåïè êÄÍÊ Îëèãî(dT)15 (ÇÀÎ “Ñèëåêñ”, Ðîññèÿ) ïî ïðîòîêîëó, ïðåäëîæåííîìó ïðîèçâîäèòåëåì. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð êÄÍÊ ðàçâîäèëè
ïî àëèêâîòàì è õðàíèëè ïðè –70°. Äëÿ ïðîâåäåíèÿ
ÏÖÐ èññëåäóåìûõ ãåíîâ èñïîëüçîâàëè íàáîð ãîòîâîé ñìåñè äëÿ ÏÖÐ ScreenMix-HS (ÇÀÎ “Åâðîãåí”,
Ðîññèÿ). Ýêñïðåññèþ ãåíîâ àíàëèçèðîâàëè ïðè ïîìîùè ãåëü-ýëåêòðîôîðåçà â 1%-ì àãàðîçíîì ãåëå è
ñèñòåìû ãåëü-äîêóìåíòàöèè BIO-RAD™XR (BIO-RAD,
ÑØÀ). Äëÿ àíàëèçà ýêñïðåññèè ãåíîâ â èññëåäóåìûõ êóëüòóðàõ êëåòîê èñïîëüçîâàëè ïðàéìåðû, ïðåäñòàâëåííûå â òàáë. 1.
Òàáëèöà 1
Ñòðóêòóðà ïðàéìåðîâ äëÿ ÎÒ-ÏÖÐ, èñïîëüçîâàííûõ â ðàáîòå
Ãåí
5 ÂÌÓ, áèîëîãèÿ, ¹ 1
Äëèíà
ôðàãìåíòà,
í.ï.
Òåìïåðàòóðà
ïëàâëåíèÿ, °Ñ
hOct4
CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG
CCTTCCCAAATAGAACCCCCA
206
61
61,2
hSox2
TGGACAGTTACGCGCACAT
CGAGTAGGACATGCTGTAGGT
215
61,9
60,7
hNanog
GCGTCATAAGGGGTGAGTTTT
AGAACATTCAAGGGAGCTTGC
60
60,4
61,5
hREX1
GCGTCATAAGGGGTGAGTTTT
AGAACATTCAAGGGAGCTTGC
134
60,3
60,6
hNestin
GAAACAGCCATAGAGGGCAAA
TGGTTTTCCAGAGTCTTCAGTGA
167
60,3
61,1
hGFAP
CCTCTCCCTGGCTCGAATG
GGAAGCGAACCTTCTCGATGTA
161
61,5
61,8
202
62
62,1
Èììóíîöèòîõèìè÷åñêîå îêðàøèâàíèå
Êëåòêè âûñàæèâàëè íà ïëàñòèêîâóþ ïîâåðõíîñòü
â 4-ëóíî÷íûõ èëè 24-ëóíî÷íûõ ïëàíøåòàõ (Costar,
ÑØÀ) â ïîëíîé ðîñòîâîé ñðåäå. Êëåòêè ôèêñèðîâàëè 4%-ì ôîðìàëüäåãèäîì íà PBS (Ïàíýêî, Ðîññèÿ)
30 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, äâàæäû ïðîìûâàëè PBS. Ïåðåä îêðàøèâàíèåì àíòèòåëàìè êëåòêè 1 ÷ îáðàáàòûâàëè áëîêèðóþùèì ðàñòâîðîì (ÁÐ)
(PBS + 10% ÝÒÑ + 0,1% Triton X-100). Ïåðâûå àíòèòåëà íàíîñèëè â ðàçâåäåíèè 1/50—1/100 â ÁÐ, èíêóáèðîâàëè 2 ÷ ïðè +37°. Äàëåå êëåòêè îòìûâàëè
3 ðàçà ÐBS è íàíîñèëè âòîðûå àíòèòåëà â ðàçâåäåíèè 1/500 â ÁÐ. Èíêóáèðîâàëè 1 ÷ ïðè +37°, çàòåì
îòìûâàëè 3 ðàçà ÐBS. Çàòåì ïðåïàðàòû ñ êëåòêàìè
îêðàøèâàëè ðàñòâîðîì DAPI (1,5 ìêã/ìë íà PBS,
Sigma, ÑØÀ) 15 ìèí, ïðîìûâàëè PBS è çàêëþ÷àëè
â 100%-é ãëèöåðèí. Ïðîñìàòðèâàëè è ôîòîãðàôèðîâàëè ïðåïàðàòû ñ ïîìîùüþ èíâåðòèðîâàííîãî ôëóîðåñöåíòíîãî ìèêðîñêîïà Olympus CKX41 (OLYMPUS, ÑØÀ). Äëÿ ÈÖÕ õàðàêòåðèñòèêè èññëåäóåìûõ êóëüòóð êëåòîê èñïîëüçîâàëè ìîíîêëîíàëüíûå
(ïîñëåäîâàòåëüíîñòü)
5´ —< 3´
hGAPDH TGTTGCCATCAATGACCCCTT
CTCCACGACGTACTCAGCG
Ëåíòèâèðóñíûå êîíñòðóêöèè
Ãåí êàòàëèòè÷åñêîãî êîìïîíåíòà òåëîìåðàçû ÷åëîâåêà hTERT áûë êëîíèðîâàí â âåêòîð SIN-MU3IR-G-SW ïîä ïðîìîòåðîì Pmscv ñ àìïèöèëëèíîâîé
áàêòåðèàëüíîé óñòîé÷èâîñòüþ. Ãåí hTERT â äàííîé
êîíñòðóêöèè ñîïðÿæåí ñ ðåïîðòåðíûì ãåíîì çåëåíî-
10
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 1
ãî ôëóîðåñöåíòíîãî áåëêà EGFP ÷åðåç ó÷àñòîê IRES,
÷òî ïîçâîëÿåò ïîëó÷àòü ýêñïðåññèþ îáîèõ áåëêîâ
ñ îäíîãî ïðîìîòåðà. Ìîëåêóëÿðíûé ñèíòåç ïëàçìèä
ëåíòèâèðóñíûõ êîíñòðóêöèé ñ ãåíàìè Oct4, Sox2,
Nanog áûë çàêàçàí â ÇÀÎ “Åâðîãåí” (Ðîññèÿ). Ãåíû
Oct4, Sox2 è Nanog áûëè êëîíèðîâàíû â ñòàíäàðòíûé âåêòîð pLVT, ïîñòàâëÿåìûé äàííîé ôèðìîé,
ïîä EF1-short ïðîìîòåðîì, ñ àìïèöèëëèíîâîé áàêòåðèàëüíîé óñòîé÷èâîñòüþ.
Íàðàùèâàíèå è âûäåëåíèå ïëàçìèä âåêòîðîâ ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê E-Coli
(ÇÀÎ “Åâðîãåí”, Ðîññèÿ) è íàáîðà äëÿ âûäåëåíèÿ
è î÷èñòêè ïëàçìèäíîé ÄÍÊ QIAGEN Plasmid Mini
Kit (Qiagen, Ãåðìàíèÿ) ïî ïðîòîêîëàì, ïðåäëîæåííûì ïðîèçâîäèòåëÿìè. Óïàêîâêó ëåíòèâèðóñíûõ êîíñòðóêöèé ïðîèçâîäèëè â êëåòêàõ ëèíèè 293T ïðè
ïîìîùè íàáîðà äëÿ òðàíñôåêöèè ïëàçìèäíîé ÄÍÊ
Lipofectamin 2000 (Invitrogen, ÑØÀ) è íàáîðà äëÿ
óïàêîâêè ëåíòèâèðóñíûõ âèðóñíûõ ÷àñòèö òðåòüåãî
ïîêîëåíèÿ ViraPower™ Lentiviral Expression Systems
(Invitrogen, ÑØÀ) ïî ïðîòîêîëàì, ïðåäëîæåííûì ïðîèçâîäèòåëÿìè. Ïîëó÷åííûå âèðóñíûå ñòîêè ðàçäåëÿëè ïî àëèêâîòàì è õðàíèëè çàìîðîæåííûìè ïðè –80°.
Òðàíñôåêöèÿ êëåòîê ïðè ïîìîùè
ëåíòèâèðóñíûõ êîíñòðóêöèé
Çà ñóòêè äî òðàíñôåêöèè êëåòêè ðàññåâàëè â
ëóíêè 6-ëóíî÷íîãî ïëàíøåòà, 104 êëåòîê íà ëóíêó.
Íà ñëåäóþùèé äåíü ïîñëå óäàëåíèÿ ðîñòîâîé ñðåäû
êëåòêè ïðîìûâàëè ñðåäîé DMEM áåç ñûâîðîòêè è
äîáàâëÿëè âèðóñíûé êîíöåíòðàò, ðàçâåäåííûé ïîëíîé ðîñòîâîé ñðåäîé â ñîîòíîøåíèè 1:1, ñ äîáàâëåíèåì ïîëèáðåíà
(Sigma, ÑØÀ) â êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè
5 ìêã/ìë. Äàëåå êëåòêè èíêóáèðîâàëè
â òå÷åíèå íî÷è, ïîñëå ÷åãî íà ñëåäóþùèé äåíü êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó, ñîäåðæàùóþ âèðóñ, ìåíÿëè íà ïîëíóþ ðîñòîâóþ
ñðåäó. Ýôôåêòèâíîñòü ëåíòèâèðóñíîé
òðàíñôåêöèè îöåíèâàëè ïî ïàðàëëåëüíîìó ýêñïåðèìåíòó ñ òðàíñôåêöèåé ëåíòèâèðóñíîé êîíñòðóêöèè, êîäèðóþùåé
ãåí EGFP, ïðîâåäåííîé ñ òàêèìè æå ïàðàìåòðàìè (ñîîòíîøåíèå êîëè÷åñòâà êîïèé âèðóñà íà 1 êëåòêó). ×åðåç 3 ñóò íà
ôëóîðåñöåíòíîì ìèêðîñêîïå ïîäñ÷èòûâàëè ïðîöåíò òðàíñôåöèðîâàííûõ êëåòîê. Ïðè óñëîâèè ñîîòíîøåíèÿ 5—10 êîïèé âèðóñà íà 1 êëåòêó ýôôåêòèâíîñòü
òðàíñôåêöèè ñîñòàâëÿåò ïîðÿäêà 95%.
Èçìåðåíèå òåëîìåðàçíîé
àêòèâíîñòè ìåòîäîì TRAP
Àíàëèç òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòè ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè íàáîðà äëÿ èçìåðåíèÿ òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòè TRAPEZE® XL Telomerase Detection Kit
(Millipore, ÑØÀ) ïî ïðîòîêîëó, ïðåäëîæåííîìó
ïðîèçâîäèòåëåì. Ðåçóëüòàòû îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ
ñòàíäàðòíîãî ýëåêòðîôîðåçà â ïîëèàêðèëàìèäíîì
ãåëå è ñèñòåìû ãåëü-äîêóìåíòàöèè BIO-RAD™XR
(BIO-RAD, ÑØÀ).
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Áèîïñèè êîæè âçðîñëîãî ÷åëîâåêà áûëè ïîëó÷åíû îò 2 ñîìàòè÷åñêè çäîðîâûõ äîíîðîâ ðàçíîãî âîçðàñòà. Áûëè âûäåëåíû 2 êóëüòóðû ôèáðîáëàñòîâ êîæè
÷åëîâåêà, ïîëó÷èâøèå îáîçíà÷åíèÿ ÏÔ×1 è ÏÔ×2
ñîîòâåòñòâåííî. Ïîñëå âûäåëåíèÿ êëåòêè áûëè ïðîòåñòèðîâàíû íà îòñóòñòâèå ìèêðîáèîëîãè÷åñêîé è
âèðóñíîé êîíòàìèíàöèè (ÎÎÎ “Ëèòåõ”, Ðîññèÿ).
Ïðè âûäåëåíèè êàæäîé êóëüòóðû âîçíèêàëî ìíîæåñòâî îáîñîáëåííûõ öåíòðîâ ðîñòà êëåòîê, ôåíîòèïè÷åñêè íå îòëè÷àþùèõñÿ äðóã îò äðóãà. Êîëîíèè
áûëè ñìåøàíû è êóëüòèâèðîâàëèñü êàê îäíà ïåðâè÷íàÿ êóëüòóðà êëåòîê, áåç êàêîãî-ëèáî êëîíèðîâàíèÿ. Ïîëó÷åííûå êóëüòóðû ïîñòíàòàëüíûõ ôèáðîáëàñòîâ êîæè ÷åëîâåêà ïîñëå 2 ïåðåñåâîâ èìåëè ãîìîãåííûé õàðàêòåð, êëåòêè èìåëè ÿðêî âûðàæåííóþ
ôèáðîáëàñòîïîäîáíóþ ìîðôîëîãèþ, õîðîøî ïðèêðåïëÿëèñü è ðàñïëàñòûâàëèñü ïî ïëàñòèêîâîé ïîäëîæêå
êóëüòóðàëüíûõ ôëàêîíîâ (ðèñ. 1).
Êëåòêè êóëüòóð ÏÔ×1 è ÏÔ×2 áûëè ïðîòðàíñôèöèðîâàíû ïðè ïîìîùè ëåíòèâèðóñíîé êîíñòðóêöèè SIN-hTERT-EGFP, ïîëó÷åííûå òåëîìåðèçîâàííûå êóëüòóðû áûëè îáîçíà÷åíû ÏÔ×1-hTERT è
ÏÔ×2-hTERT ñîîòâåòñòâåííî. Ýôôåêòèâíîñòü òðàíñ-
Ðèñ. 1. Êóëüòóðû ïîñòíàòàëüíûõ ôèáðîáëàñòîâ êîæè ÷åëîâåêà: 1, 2 — êóëüòóðà
ÏÔ×-1, ôàçîâûé êîíòðàñò, âåëè÷èíà øêàëû 1 — 500 ìêì; 2 — 150 ìêì; 3 —
ôëóîðåñöåíöèÿ EGFP â òåëîìåðèçîâàííîé êóëüòóðå ÏÔ×1-hTERT, âåëè÷èíà
øêàëû — 75 ìêì; 4 — ðåçóëüòàòû òåñòà íà òåëîìåðàçíóþ àêòèâíîñòü êóëüòóðû
ÏÔ×1-hTERT; à — ïîëîæèòåëüíûé êîíòðîëü, êëåòî÷íûé ýêñòðàêò HeLa, á — ýêñòðàêò êëåòîê ÏÔ×1-hTERT, â — íåãàòèâíûé êîíòðîëü-1, ã — ýêñòðàêò êëåòîê
ÏÔ×1, ä — íåãàòèâíûé êîíòðîëü-2
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 1
11
ôåêöèè îïðåäåëÿëè ïî ñâå÷åíèþ ðåïîðòåðíîãî ãåíà EGFP, â îáîèõ ñëó÷àÿõ
ýôôåêòèâíîñòü ñîñòàâèëà ïîðÿäêà 75%
(ðèñ. 1). Ñîðòèðîâêó èëè êëîíèðîâàíèå
ïîëó÷åííûõ êóëüòóð íå ïðîèçâîäèëè.
Òðàíñôèöèðîâàííûå êëåòêè ìîðôîëîãè÷åñêè íå îòëè÷àëèñü îò êîíòðîëüíûõ,
ñêîðîñòü ïðîëèôåðàöèè íå èçìåíèëàñü.
Íàëè÷èå ïðîäóêòà ãåíà hTERT â
òðàíñôèöèðîâàííûõ êëåòêàõ àíàëèçèðîâàëè ïðè ïîìîùè ìåòîäà èçìåðåíèÿ òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòè TRAP.  êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëñÿ ýêñòðàêò òåëîìåðàçîïîçèòèâíûõ
îïóõîëåâûõ êëåòîê HeLa.  êà÷åñòâå
íåãàòèâíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè òåðìî-èíàêòèâèðîâàííûå ýêñòðàêòû èññëåäóåìûõ êëåòîê (10 ìèí ïðè +80°) (ðèñ. 1).
 ðåçóëüòàòå ïðîâåäåíèÿ òåñòà ñèëüíûé
è ðàçëè÷èìûé ñèãíàë ïðîäóêòà TRAPðåàêöèè áûë îáíàðóæåí òîëüêî â ðåàêöèÿõ ñ ýêñòðàêòîì òåëîìåðèçîâàííûõ Ðèñ. 2. Êîëîíèè ðåïðîãðàììèðîâàííûõ êëåòîê â êóëüòóðàõ êëåòîê ÏÔ×1-OSN
êóëüòóð è â ïîëîæèòåëüíîì êîíòðîëå. è ÏÔ×1-hT-OSN: 1 — îáðàçîâàíèå êîëîíèè â êóëüòóðå ÏÔ×1-hT-OSN; 2 — îáðàçîâàíèå êîëîíèè â êóëüòóðå ÏÔ×1-OSN; 3, 4 — ðàçâèòèå êîëîíèé ðåïðîãðàìÂî âñåõ îñòàëüíûõ ñëó÷àÿõ, â òîì ÷èñ- ìèðîâàííûõ êëåòîê â êóëüòóðå ÏÔ×1-hT-OSN. Ôàçîâûé êîíòðàñò, âåëè÷èíà
ëå è ñ ýêñòðàêòîì êîíòðîëüíûõ êóëüòóð
øêàëû: 1, 2, 3 — 375 ìêì, 4 — 75 ìêì
êëåòîê, ïðîäóêòîâ ðåàêöèè óäëèíåíèÿ
òåëîìåðíûõ ïîâòîðîâ íå íàáëþäàëîñü.
Äëÿ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ êëåòî÷íûõ êóëüòóð áûëà äîáíûõ èíòàêòíûõ ãîðàçäî áîëüøèìè òåìïàìè ïðîïðèìåíåíà ñòðàòåãèÿ îäíîâðåìåííîé òðàíñôåêöèè ëèôåðàöèè è ñêëîííîñòüþ ê îáðàçîâàíèþ ñîìêíóâñåõ òðåõ ôàêòîðîâ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ Oct4, Sox2, òîãî ìîíîñëîÿ (ðèñ. 2).
Íà 10-å ñóò êóëüòèâèðîâàíèÿ ïîñëå íà÷àëà ýêñNanog. Òðàíñôåêöèþ ïðîèçâîäèëè êàê â èíòàêòíûå
ïåðèìåíòà
â ëóíêàõ îáðàçîâàëñÿ ïëîòíûé ìîíîêóëüòóðû êëåòîê, òàê è â êóëüòóðû ôèáðîáëàñòîâ
ñëîé,
ñîäåðæàùèé
êàê èñõîäíûå êëåòêè ñ ôèáðîáñ èíäóöèðîâàííîé òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòüþ. Ïîëàñòîïîäîáíîé
ìîðôîëîãèåé,
òàê è ðåïðîãðàììèðîëó÷åííûå êóëüòóðû áûëè îáîçíà÷åíû ÏÔ×1-OSN,
âàííûå
êëåòêè.
Êëåòêè
èç
îäíîé
ëóíêè ïåðåñåâàëè
ÏÔ×2-OSN è ÏÔ×1-hT-OSN, ÏÔ×2-hT-OSN ñîíà
äâå
÷àøêè
Ïåòðè
ñì
ôèäåðíûì
ñëîåì èç
Æ10
îòâåòñòâåííî. Äàëåå ïîëó÷åííûå òðàíñôèöèðîâàííûå
èíàêòèâèðîâàííûõ
MEF
â
ñðåäå
äëÿ
ôèáðîáëàñòîâ.
êóëüòóðû êóëüòèâèðîâàëèñü íà ñòàíäàðòíîé ïîëíîé
Íà ñëåäóþùèé äåíü, ïîñëå ïðèêðåïëåíèÿ è ðàñïëàðîñòîâîé ñðåäå äëÿ ôèáðîáëàñòîâ ñî ñìåíîé ñðåäû
ñòûâàíèÿ êëåòîê, ñðåäó äëÿ ôèáðîáëàñòîâ çàìåíèêàæäûå 2 ñóò. Ñîðòèðîâêó èëè êëîíèðîâàíèå ïîëóëè íà ñðåäó äëÿ ïîääåðæàíèÿ ðîñòà ÝÑÊ ÷åëîâåêà
÷åííûõ êóëüòóð íå ïðîèçâîäèëè.
mTeSR1 (Stem Cell Technologies, ÑØÀ).  òå÷åíèå
×åðåç 6 äíåé ïîñëå òðàíñôåêöèè áûëè çàìå÷åñëåäóþùèõ 14 ñóò êóëüòèâèðîâàíèÿ ñðåäó â ÷àøíû ïåðâûå èçìåíåíèÿ â òðàíñôèöèðîâàííûõ êóëüêàõ ìåíÿëè ðàç â 3—4 ñóò. Çà âðåìÿ êóëüòèâèðîâàòóðàõ — ïîÿâëåíèå öåíòðîâ ðîñòà êîëîíèé êëåòîê,
íèÿ â òåëîìåðèçîâàííûõ êóëüòóðàõ ÏÔ×1-hT-OSN,
îòëè÷íûõ ïî ìîðôîëîãèè îò ôèáðîáëàñòîâ (ìîðôîëîãèÿ ýïèòåëèàëüíîãî òèïà) (ðèñ. 2). Ïîìèìî ìîðÒàáëèöà 2
ôîëîãèè äàííûå ðåïðîãðàììèðîâàííûå êëåòêè îòëè÷àëèñü òàêæå óñèëåííîé ïðîëèôåðàöèåé è îòñóòÂûõîä êëîíîâ ðåïðîãðàììèðîâàííûõ êëåòîê â âàðèàíòàõ
ñòâèåì ñâîéñòâà êîíòàêòíîãî òîðìîæåíèÿ, â öåíòñ èíòàêòíûìè è òåëîìåðèçîâàííûìè êëåòêàìè
ðàõ ïîäîáíûõ êîëîíèé êëåòêè íà÷èíàëè îáðàçîâûÊîëè÷åñòâî êëîíîâ
âàòü òðåõìåðíûå ñòðóêòóðû. Ìû íàáëþäàëè çíà÷èÝôôåêòèâíîñòü
Íàçâàíèå
ðåïðîãðàììèðîâàííûõ
ðåïðîãðàì¹
òåëüíûå ðàçëè÷èÿ â âûõîäå ðåïðîãðàììèðîâàííûõ
êóëüòóðû
êëåòîê â ëóíêå 6-ëóìèðîâàíèÿ, %
êëåòîê ìåæäó êóëüòóðàìè ÏÔ×1-OSN, ÏÔ×2-OSN
íî÷íîãî ïëàíøåòà
è ÏÔ×1-hT-OSN, ÏÔ×2-hT-OSN. Â ëóíêàõ ñ èí1 ÏÔ×1-OSN
»5 ± 1
» 0,05
òàêòíûìè
êëåòêàìè
íàñ÷èòûâàëîñü
ïîðÿäêà
2 ÏÔ×2-OSN
»3 ± 1
» 0,03
3—5 öåíòðîâ ðîñòà, â òî âðåìÿ êàê â âàðèàíòå ñ òåëîìåðèçîâàííûìè êóëüòóðàìè — ïîðÿäêà 17—25
3 ÏÔ×1-hT-OSN
» 25 ± 3
» 0,25
(òàáë. 2). Êðîìå ýòîãî, êîëîíèè ðåïðîãðàììèðîâàí4 ÏÔ×2-hT-OSN
» 17 ± 3
» 0,17
íûõ òåëîìåðèçîâàííûõ êëåòîê îòëè÷àëèñü îò ïî6 ÂÌÓ, áèîëîãèÿ, ¹ 1
12
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 1
Ðèñ. 3. Èììóíîöèòîõèìè÷åñêàÿ îêðàñêà àíòèòåëàìè íà Oct4, Sox2, Nanog êóëüòóðû
ÏÔ×1-hT-OSN: 1 — îêðàñêà àíòèòåëàìè; 2 — îêðàñêà ÿäåð êëåòîê DAPI; 3 — ñîâìåùåíèå, âåëè÷èíà øêàëû: 1, 2, 3 — 375 ìêì
ÏÔ×2-hT-OSN íàáëþäàëè ðîñò êîëîíèé ðåïðîãðàììèðîâàííûõ êëåòîê, îòëè÷àþùèõñÿ äðóã îò äðóãà ïî ìîðôîëîãèè è ñêîðîñòè ðîñòà. ×àñòü èç íèõ
èìåëà ìîðôîëîãèþ êëåòîê, õàðàêòåðíóþ äëÿ ÝÑÊ è
iPS êëåòîê (ðèñ. 2) — ïëîòíûé ìîíîñëîé ýïèòåëèîïîäîáíûõ, íåáîëüøèõ ïî ðàçìåðó êëåòîê ñ îáðàçîâàíèåì òðåõìåðíûõ ñòðóêòóð â öåíòðå ðîñòà êîëîíèè.
 êóëüòóðàõ ñ èíòàêòíûìè êëåòêàìè ÏÔ×1-OSN è
ÏÔ×2-OSN ðîñòà ïîäîáíûõ êîëîíèé íå íàáëþäàëè.
Ïîñëå 24 ñóò ñ ìîìåíòà íà÷àëà ýêñïåðèìåíòà êëîíû, ïðåäñòàâëÿþùèå íàèáîëüøèé èíòåðåñ äëÿ èññëåäîâàíèÿ, âûäåëÿëè èç ÷àøêè ìåõàíè÷åñêèì ñïîñîáîì. Êëîíû ïåðåâîäèëè â ñóñïåíçèþ ïðè ïîìîùè
ðàñòâîðà òðèïñèí-ÝÄÒÀ è ïåðåíîñèëè â ëóíêè 24-ëóíî÷íîãî ïëàíøåòà, ïîêðûòûå ìàòðèãåëåì (BD Biosciences, ÑØÀ) äëÿ äàëüíåéøèõ àíàëèçîâ. Èììóíîöèòîõèìè÷åñêîå îêðàøèâàíèå ðåïðîãðàììèðîâàííûõ
êëåòîê ïîêàçàëî íàëè÷èå ýêñïðåññèè ââåäåííûõ ãåíîâ Oct4, Sox2 è Nanog (ðèñ. 3). Ýêñïðåññèÿ ãåíîâ
â ðåïðîãðàììèðîâàííûõ êëåòêàõ êóëüòóðû ÏÔ×1hT-OSN èçó÷àëàñü íàìè òàêæå ïðè ïîìîùè ìåòîäà
ÎÒ-ÏÖÐ (ðèñ. 4). Â õîäå èññëåäîâàíèÿ ìû ïðîâåðèëè ýêñïðåññèþ ãåíîâ Oct4, Sox2, Rex1, Nanog, à òàêæå ãåíîâ ìàðêåðîâ íåéðàëüíîé äèôôåðåíöèðîâêè
Nestin è GFAP.  êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ ìåòîäà áðàëè ìÐÍÊ, âûäåëåííóþ èç êóëüòóðû
ÝÑÊ ÷åëîâåêà, â êà÷åñòâå íåãàòèâíîãî êîíòðîëÿ —
ìÐÍÊ, âûäåëåííóþ èç êóëüòóðû íåðåïðîãðàììèðîâàííûõ òåëîìåðèçîâàííûõ êëåòîê ÏÔ×1-hTERT.
Áûëî óñòàíîâëåíî, ÷òî ãåíû Oct4, Sox2, Nanog, Nestin, GFAP ýêñïðåññèðóþòñÿ â ðåïðîãðàììèðîâàííûõ
êëåòêàõ íà óðîâíå, ñðàâíèìîì ñ ïîëîæèòåëüíûì
êîíòðîëåì. Óäèâèòåëüíûì îêàçàëñÿ ôàêò íàëè÷èÿ
ýêñïðåññèè ãåíà Rex1 âî âñåõ òðåõ ñðàâíèâàåìûõ
Ðèñ. 4. ÎÒ-ÏÖÐ àíàëèç ýêñïðåññèè ãåíîâ
Oct4, Sox2, Rex1, Nanog, Nestin, GFAP
â ðåïðîãðàììèðîâàííûõ êëåòêàõ êóëüòóðû
ÏÔ×1-hT-OSN: 1 — ïîëîæèòåëüíûé êîíòðîëü, êóëüòóðà ÝÑÊ ÷åëîâåêà; 2 — êóëüòóðà êëåòîê ÏÔ×1-hT-OSN; 3 — íåãàòèâíûé
êîíòðîëü, êóëüòóðà êëåòîê ÏÔ×1-hTERT
êóëüòóðàõ êëåòîê, âêëþ÷àÿ òåëîìåðèçîâàííûå êëåòêè ÏÔ×1-hTERT.
Òàêèì îáðàçîì, íàìè áûëè ïîëó÷åíû äàííûå î
òîì, ÷òî èíäóêöèÿ òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòè íå òîëüêî íå èíãèáèðóåò ðåïðîãðàììèðîâàíèå ôèáðîáëàñòîâ êîæè ÷åëîâåêà ïðè ïîìîùè òðàíñôåêöèè ãåíîâ
ïëþðèïîòåíòíîñòè Oct4, Sox2, Nanog, íî äàæå ìîæåò ñïîñîáñòâîâàòü ýòîìó ïðîöåññó. Èñïîëüçîâàíèå
êëåòîê ñ àêòèâíîé òåëîìåðàçîé ïîçâîëèëî èñêëþ÷èòü îíêîãåí c-Myc èç íàáîðà ãåíîâ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ. Ýôôåêòèâíîñòü ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ èíòàêòíûõ êëåòîê ÏÔ×1 è ÏÔ×2 â íàøèõ óñëîâèÿõ
áûëà äîâîëüíî íèçêà è ñîñòàâèëà ïðèáëèçèòåëüíî
0,03—0,05%, ÷òî êîððåëèðóåò ñ äàííûìè èç ëèòåðàòóðíûõ èñòî÷íèêîâ, óòâåðæäàþùèìè, ÷òî ôèáðîáëàñòû, âûäåëåííûå èç êîæè âçðîñëîãî ÷åëîâåêà, îáëàäàþò ñðàâíèòåëüíî íèçêîé ñïîñîáíîñòüþ ê ãåíåðàöèè ÈÏÑ êëåòîê ïî ñðàâíåíèþ ñ ýìáðèîíàëüíûìè
è íåîíàòàëüíûìè ôèáðîáëàñòàìè [12, 13]. Â òî æå
âðåìÿ ýôôåêòèâíîñòü ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ òåëîìåðèçîâàííûõ êëåòîê ÏÔ×1-hT-OSN, ÏÔ×2-hT-OSN
ñîñòàâèëà ïðèáëèçèòåëüíî 0,17—0,25%, ÷òî ÿâëÿåòñÿ îòíîñèòåëüíî âûñîêèì ðåçóëüòàòîì. Ñóùåñòâóåò
íåñêîëüêî òî÷åê çðåíèÿ, êàêèì îáðàçîì òåëîìåðàçíàÿ àêòèâíîñòü ìîæåò ïîëîæèòåëüíî âëèÿòü íà ðåïðîãðàììèðîâàíèå. Èçâåñòíî, ÷òî ñîìàòè÷åñêèå êëåòêè ñ ââåäåííûì ãåíîì hTERT îáëàäàþò ïîâûøåííîé óñòîé÷èâîñòüþ ê ñòðåññó [14—16], ÷òî ìîæåò
ïîâûøàòü èõ âûæèâàåìîñòü â óñëîâèÿõ öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ëåíòèâèðóñíîé òðàíñôåêöèè. Äåéñòâèòåëüíî, íàìè áûë îòìå÷åí ãîðàçäî ìåíüøèé ïðîöåíò àïîïòîòèðóþùèõ êëåòîê âî âðåìÿ òðàíñôåêöèè
ãåíàìè OSN â êóëüòóðàõ ñ òåëîìåðèçîâàííûìè êëåòêàìè (äàííûå íå ïðåäñòàâëåíû). Òàê, íåìàëîâàæíûì
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 1
ÿâëÿåòñÿ òîò ôàêò, ÷òî òåëîìåðèçîâàííûå êëåòêè îáëàäàþò ïîâûøåííîé ïðîëèôåðàòèâíîé ñïîñîáíîñòüþ
è ñîîòâåòñòâåííî ïîâûøåííûì óðîâíåì ýíäîãåííûõ
ãåíîâ ïðîëèôåðàöèè (íàïðèìåð, òîãî æå ñåìåéñòâà
Myc), ÷òî, êàê èçâåñòíî, ÿâëÿåòñÿ êðèòè÷åñêè âàæíûì ýëåìåíòîì ïðîöåññà ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ. Ïîñëåäíèì è ñàìûì ëþáîïûòíûì äëÿ èçó÷åíèÿ ìîæåò
ñòàòü ôàêò, ÷òî â êëåòêàõ ñ èíäóöèðîâàííîé òåëîìåðàçîé óêîðî÷åííûå òåëîìåðíûå ó÷àñòêè õðîìîñîì
ïðèõîäÿò â ñâîå ïåðâîíà÷àëüíîå ñîñòîÿíèå, èçìåíÿÿ ïðè ýòîì ñâîþ òðåõìåðíóþ ñòðóêòóðó [17—19].
Ïîìèìî ýòîãî òåëîìåðàçíàÿ àêòèâíîñòü èçìåíÿåò
òàêæå è ñîñòîÿíèå ñóáòåëîìåðíûõ îáëàñòåé, âëèÿÿ
íà óðîâåíü ìåòèëèðîâàíèÿ ãåíîâ, ðàñïîëîæåííûõ â
ýòèõ îáëàñòÿõ. Êëåòêè, ïîëó÷åííûå òàêèì îáðàçîì,
ïåðåõîäÿò â ñâîå “þâåíèëüíîå” ñîñòîÿíèå, ÷òî, êàê
ìû ïîêàçàëè, óâåëè÷èâàåò ýôôåêòèâíîñòü ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ. Äàííàÿ ìåòîäèêà â ïåðñïåêòèâå ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà â êëèíè÷åñêîé ïðàêòèêå,
ïîñêîëüêó ïàöèåíòàìè äëÿ êëåòî÷íî-çàìåùàþùèõ
òåõíîëîãèé çà÷àñòóþ ñòàíîâÿòñÿ ëþäè â ïîæèëîì
âîçðàñòå, àóòîëîãè÷íûå êëåòêè êîòîðûõ îáëàäàþò ïîíèæåííûì ïðîëèôåðàòèâíûì ïîòåíöèàëîì è ñîîòâåòñòâåííî íèçêîé ñïîñîáíîñòüþ ê ðåïðîãðàììèðîâàíèþ. Èíäóöèðóÿ òåëîìåðàçíóþ àêòèâíîñòü â ýòèõ
êëåòêàõ, ìîæíî áûëî áû ïîëó÷àòü àäåêâàòíûé ìà-
13
òåðèàë äëÿ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ è ïîëó÷åíèÿ ñïåöèàëèçèðîâàííûõ êëåòîê äëÿ êëåòî÷íî-çàìåùàþùèõ òåõíîëîãèé.
Âûâîäû
1. Èíäóêöèÿ òåëîìåðàçíîé àêòèâíîñòè â ôèáðîáëàñòàõ êîæè âçðîñëîãî ÷åëîâåêà óâåëè÷èâàåò ýôôåêòèâíîñòü ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ïðè ïîìîùè ëåíòèâèðóñíûõ òðàíñôåêöèé ãåíîâ ïëþðèïîòåíòíîñòè
Oct4, Sox2, Nanog.
2. Èñïîëüçîâàíèå òåëîìåðèçîâàííûõ êëåòîê â êà÷åñòâå êëåòîê-ìèøåíåé äëÿ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ïîçâîëÿåò èñêëþ÷èòü îíêîãåí c-Myc èç íàáîðà ãåíîâ
äëÿ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ.
Àâòîðû âûðàæàþò áëàãîäàðíîñòü Dr. Robert Hawley (George Washington University, USA) çà ëþáåçíî
ïðåäîñòàâëåííóþ êîíñòóêöèþ SIN-MU3-IR-G-hTERT.
* * *
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ïîääåðæêå ÔÖÍÒÏ “Èññëåäîâàíèÿ è ðàçðàáîòêè ïî ïðèîðèòåòíûì íàïðàâëåíèÿì ðàçâèòèÿ íàóêè è òåõíèêè íà 2007—2012 ãîäû”
(Ãîñóäàðñòâåííûé êîíòðàêò ¹ 16.512.11.2106, øèôð
2011-1.2-512-050-068).
CÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ
1. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I.
Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line //
Nature. 1996. Vol. 380. P. 64—66.
2. Byrne J.A., Pedersen D.A., Clepper L.L., Nelson M.,
Sanger W.G., Gokhale S., Wolf D.P., Mitalipov S.M. Producing primate embryonic stemm cells by somatic cell nuclear
transfer // Nature. 2007. Vol. 450(7169). P. 497—502.
3. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N.,
Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr. Biol. 2001. Vol. 11.
P. 1553—1558.
4. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent
stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures
by defined factors // Cell. 2006. Vol. 126(4). P. 663—676.
5. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent
stem cells from adult human fibroblasts by defined factors //
Cell. 2007. Vol. 131(5). P. 861—872.
6. Okita K., Nakagawa M., Hyenjong H., Ichisaka T.,
Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem
cells without viral vectors // Science. 2008. Vol. 322(5903).
P. 949—953.
7. Nakagawa M., Koyanagi M., Tanabe K., Takahashi K.,
Ichisaka T., Aoi T., Okita K., Mochiduki Y. Takizawa N.,
Yamanaka S. Generation of induced pluripotent stem cells
without Myc from mouse and human fibroblasts // Nature
Biotechnology. 2008.Vol. 26. P. 101—106.
8. Mathew R., Jia W., Sharma A., Zhao Y., Clarke L.E.,
Cheng X., Wang H., Salli U., Vrana K.E., Robertson G.P.,
Zhu J., Wang S. Robust activation of the human but not mouse telomerase gene during the induction of pluripotency //
FASEB J. 2010. Vol. 24. P. 2702—2715.
7 ÂÌÓ, áèîëîãèÿ, ¹ 1
9. Agarwal S., Loh Y.H., McLoughlin E.M., Huang J.,
Park I.H., Miller J.D., Huo H., Okuka M., Dos Reis R.M., Loewer S., Ng H.H., Keefe D.L., Goldman F.D., Klingelhutz A.J.,
Liu L., Daley G.Q. Telomere elongation in induced pluripotent stem cells from dyskeratosis congenita patients // Nature. 2010. Vol. 464 P. 292—296.
10. Utikal J., Polo J.M., Stadtfeld M., Maherali N., Kulalert W., Walsh R.M., Khalil A., Rheinwald J.G., Hochedlinger K. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells // Nature. 2009. Vol. 460.
P. 1145—1148.
11. Yehezkel S., Rebibo-Sabbah A., Segev Y., Tzukerman M., Shaked R., Huber I., Gepstein L., Skorecki K., Selig S. Reprogramming of telomeric regions during the generation of human induced pluripotent stem cells and subsequent
differentiation into fibroblast-like derivatives // Epigenetics.
2011. Vol. 6. P. 63—75.
12. Scheper W., Copray S. The molecular mechanism of
indused pluripotency: a two-stage switch // Stem Cell Rev.
2009. Vol. 5(3). P. 204—223.
13. Patel M., Yang S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells // Stem Cell
Rev. 2010. Vol. 6(3). P. 367—380.
14. Åãîðîâ Å.Å. Òåëîìåðàçà, ñòàðåíèå, ðàê // Ìîëåêóëÿðíàÿ áèîëîãèÿ. 1997. Ò. 31. Ñ. 16—25.
15. Åãîðîâ Å.Å., Ìîëäàâåð Ì.Â., Âèøíÿêîâà Õ.Ñ., Òåðåõîâ Ñ.Ì., Äàøèíèìàåâ Ý.Á., ×åãëàêîâ È.Á., Òîðîïûãèí È.Þ., ßðûãèí Ê.Í., ×óìàêîâ Ï.Ì., Êîðî÷êèí Ë.È.,
Àíòîíîâà Ã.À., Ðûáàëêèíà Å.Þ., Ñàáóðèíà È.Í., Áóðíàåâñêèé Í.Ñ., Çåëåíèí À.Â. Óñèëåíèå êîíòðîëÿ ïðîëèôåðàöèè â òåëîìåðèçîâàíûõ êëåòêàõ // Îíòîãåíåç. 2007. Ò. 38,
¹ 2. Ñ. 105—19.
14
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2012. ¹ 1
16. Armstrong L., Saretzki G., Peters H., Wappler I.,
Evans J., Hole N., von Zglinicki T., Lako M. Overexpression
of telomerase confers growth advantage, stress resistance, and
enhanced differentiation of ESCs toward the hematopoietic
lineage// Stem Cells. 2005. Vol. 23(4). P. 516—529.
17. Zvereva M.I., Shcherbakova D.M., Dontsova O.A.
Telomerase: structure, functions, and activity regulation //
Biochemistry. 2010. Vol. 75(13). P. 1563—83.
18. Bryan T.M., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., Reddel R.R. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity // EMBO J. 1995. Vol. 14(17).
P. 4240—4248.
19. Wright W.E., Shay J.W. Telomere positional effects
and the regulation of cellular senescence // Trends Genet.
1992. Vol. 8(6). P. 193—197.
Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ
04.07.11
INDUCTION OF TELOMERASE ACTIVITY INCREASE
REPROGRAMMING EFFICIENCY OF HUMAN DERMAL FIBROBLASTS
E.B. Dashinimaev, I.A. Muchkaeva, R.R. Faizullin, Y.Y. Yegorov,
S.S. Akimov, V.V. Terskikh, A.V. Vasiliev, M.P. Kirpichnikov
Reprogramming of human cells are a perspective direction of development of cellular biology with distant prospect of use of the given methods for cellular-replacing therapy in clinical practice. One of problems rising on this way is low reprogramming efficiency and application of undesirable oncogenes in initial techniques. In this research we had been offered the alternative modified
method of reprogramming human skin fibroblasts. It has been shown that the telomerase induction increases an exit of reprogrammed cells and allows to exclude oncogen c-Myc from a used
set of genes.
Key words: telomerase, reprogramming, human skin fibroblasts.
Ñâåäåíèÿ îá àâòîðàõ
Äàøèíèìàåâ Ýðäýì Áàèðîâè÷ — êàíä. áèîë. íàóê, íàó÷. ñîòð., Èíñòèòóò áèîëîãèè ðàçâèòèÿ
èì. Í.Ê. Êîëüöîâà ÐÀÍ. Òåë.: 8-499-135-40-81; e-mail: [email protected]
Ìó÷êàåâà Èðèíà Àëåêñååâíà — ñò. ëàáîðàíò, ñïåöèàëèñò â âûñøèì áèîëîãè÷åñêèì îáðàçîâàíèåì,
Èíñòèòóò áèîëîãèè ðàçâèòèÿ èì. Í.Ê. Êîëüöîâà ÐÀÍ. Òåë.: 8-499-135-40-81; e-mail: [email protected]
Ôàéçóëëèí Ðóçåëü Ðàôàýëåâè÷ — áàêàëàâð ôèç.-ìàò. íàóê, ëàáîðàíò, Èíñòèòóò áèîëîãèè ðàçâèòèÿ
èì. Í.Ê. Êîëüöîâà ÐÀÍ. Òåë.: 8-499-135-40-81; e-mail: [email protected]
Åãîðîâ Åãîð Åâãåíüåâè÷ — äîêò. áèîë. íàóê, âåä. íàó÷. ñîòð., Èíñòèòóò ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè
èì. Â.À. Ýíãåëüãàðäòà ÐÀÍ. Òåë.: 8-499-135-98-06; e-mail: [email protected]
Àêèìîâ Ñåðãåé Ñåðãååâè÷ — PhD, Department of Anatomy and Cell Biology, The George Washington
University Medical Center, 2300 I Street NW, Washington, DC 20037, USA. E-mail: [email protected]
Âàñèëüåâ Àíäðåé Âàëåíòèíîâè÷ — äîêò. áèîë. íàóê, çàì. äèðåêòîðà, Èíñòèòóò áèîëîãèè ðàçâèòèÿ
èì. Í.Ê. Êîëüöîâà ÐÀÍ. Òåë.: 8-499-135-76-74; e-mail: [email protected]
Òåðñêèõ Âàñèëèé Âàñèëüåâè÷ — äîêò. áèîë. íàóê, çàâ. ëàáîðàòîðèåé, Èíñòèòóò áèîëîãèè ðàçâèòèÿ
èì. Í.Ê. Êîëüöîâà ÐÀÍ. Òåë.: 8-499-135-40-81; e-mail: [email protected]
Êèðïè÷íèêîâ Ìèõàèë Ïåòðîâè÷ — äîêò. áèîë. íàóê, äåêàí áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà, çàâ. êàôåäðîé áèîèíæåíåðèè ÌÃÓ èìåíè Ì.Â. Ëîìîíîñîâà. Òåë.: 8-495-939-27-76.