ÊÐÀÒÊÎÅ ÑÎÎÁÙÅÍÈÅ ÑÒÀÁÈËÈÇÀÖÈß ÏÎËÈÊÀÒÈÎÍÎÌ LysK – ÔÅÐÌÅÍÒÀ, Staphylococcus Aureus À.Ê. Ãëàäèëèí,

472
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2009. Ò. 50. ¹ 6
ÊÐÀÒÊÎÅ ÑÎÎÁÙÅÍÈÅ
ÓÄÊ 577.152.3:579.234
ÑÒÀÁÈËÈÇÀÖÈß ÏÎËÈÊÀÒÈÎÍÎÌ LysK – ÔÅÐÌÅÍÒÀ,
ËÈÇÈÐÓÞÙÅÃÎ ÊËÅÒÊÈ Staphylococcus Aureus
Ë.Þ. Ôèëàòîâà, Ñ.C. Áåêêåð,* Ä.M. Äîíîâàí,* À.Ê. Ãëàäèëèí, Í.Ë. Êëÿ÷êî
(êàôåäðà õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè; e-mail: [email protected])
Èçó÷åíî âëèÿíèå ïîëèêàòèîíà (ïîëèáðåíà) íà àêòèâíîñòü è ñòàáèëüíîñòü LysK – ôåðìåíòà,
ëèçèðóþùåãî êëåòêè Staphylococcus aureus. Îáíàðóæåíî óâåëè÷åíèå ñòàáèëüíîñòè â 10 – 80
ðàç ïðè 37°Ñ. Óñòàíîâëåíî, ÷òî ñòàáèëèçàöèîííûé ýôôåêò îïðåäåëÿåòñÿ ÷èñëîì òî÷å÷íûõ
âçàèìîäåéñòâèé ïðîòèâîïîëîæíî çàðÿæåííûõ ãðóïï ôåðìåíòà è ïîëèêàòèîíà.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: áàêòåðèîëèòè÷åñêèé ôåðìåíò, LysK, ñòàôèëîêîêêîâûå èíôåêöèè, ñòàáèëèçàöèÿ ôåðìåíòîâ, ïîëèýëåêòðîëèòû, ïîëèáðåí.
Çîëîòèñòûé ñòàôèëîêîêê (Staphylococcus aureus)
ÿâëÿåòñÿ âîçáóäèòåëåì àíãèíû, ïíåâìîíèè, ìàñòèòà,
ôëåáèòà, ýíäîêàðäèòà è äðóãèõ îïàñíûõ çàáîëåâàíèé.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ áîëåå 90% øòàììîâ çîëîòèñòîãî
ñòàôèëîêîêêà óñòîé÷èâû ê îäíîìó è áîëåå àíòèáèîòèêàì [1].
Áàêòåðèîôàãè, âèðóñû áàêòåðèé, è èõ ëèòè÷åñêèå
ôåðìåíòû ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê ïîòåíöèàëüíóþ
àëüòåðíàòèâó àíòèáèîòèêàì [2, 3]. Ôåðìåíò LysK ïðîäóöèðóåòñÿ áàêòåðèîôàãîì Ê ïðè çàðàæåíèè èì êëåòîê Staphylococcus aureus [4]. LysK ðàçðóøàåò (ëèçèðóåò) êîâàëåíòíûå ñâÿçè ïåòèäîãëèêàíîâîãî îñòîâà
êëåòî÷íûõ ñòåíîê ñòàôèëîêîêêîâ, ðåçèñòåíòíûõ ê
ìåòèöèëëèíó, âàíêîìèöèíó è òåéêîïëàíèíó, âûçûâàÿ èõ
ãèáåëü [4, 5]. Îñíîâíûì îãðàíè÷åíèåì äëÿ èñïîëüçîâàíèÿ LysK â ìåäèöèíå ÿâëÿåòñÿ åãî íèçêàÿ ñòàáèëüíîñòü ïðè ôèçèîëîãè÷åñêîé òåìïåðàòóðå (37°).
Äàííàÿ ðàáîòà ïîñâÿùåíà èññëåäîâàíèþ âçàèìîäåéñòâèÿ LysK ñ ïîëèêàòèîíîì (ïîëèáðåíîì), à òàêæå
âûÿâëåíèþ îñîáåííîñòåé è çàêîíîìåðíîñòåé ñòàáèëèçèðóþùåãî äåéñòâèÿ äàííîãî ñîåäèíåíèÿ íà ôåðìåíò
ïðè 37°.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Ìàòåðèàëû
Ðåêîìáèíàíòíûé ôåðìåíò, ëèçèðóþùèé êëåòêè
Staphylococcus aureus (LysK), áûë âûäåëåí è î÷èùåí ïî ìåòîäèêå [4]. Ïðåïàðàò ôåðìåíòà õðàíèëè â
âèäå âîäíîãî ðàñòâîðà (20 ìÌ òðèñ, pH 7,5) â êîíöåíòðàöèè 3,5 ìã/ìë. Ïðåïàðàò àâòîêëàâèðîâàííûõ
êëåòîê Staphylococcus aureus (øòàìì C 47) ïðåäîñ-
òàâëåí êîìïàíèåé “Âåêòîð” (ã. Íîâîñèáèðñê). Âñå
îñòàëüíûå ðåàãåíòû ïðîèçâåäåíû ôèðìîé “Sigma”
(÷èñòîòà ~99%).
Ìåòîäèêè
Àêòèâíîñòü ôåðìåíòà îïðåäåëÿëè ïî ñëåäóþùåé
ìåòîäèêå.  áóôåðå (pH 7,5), ñîäåðæàùåì 20 ìÌ
ôîñôàòà êàëèÿ, ãîòîâèëè ñóñïåíçèþ êëåòîê
Staphylococcus aureus òàêèì îáðàçîì, ÷òîáû îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü áûëà ðàâíîé 0,6 ïðè äëèíå âîëíû
600 íì. Ê 0,5 ìë ñóñïåíçèè êëåòîê äîáàâëÿëè 5 ìêë
ðàñòâîðà ôåðìåíòà êîíöåíòðàöèåé 0,5 ìã/ìë è ïðîâîäèëè èçìåðåíèå óìåíüøåíèÿ îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè âî
âðåìåíè íà ñïåêòðîôîòîìåòðå “Ultrospec 2100-pro”
ñ òåðìîñòàòèðóåìûì êþâåòíûì îòäåëåíèåì ïðè òåìïåðàòóðå 37°Ñ è äëèíå âîëíû 600 íì. Àêòèâíîñòü
ôåðìåíòà îïðåäåëÿëè ïî òàíãåíñó óãëà íàêëîíà íà÷àëüíîãî ó÷àñòêà íà êðèâîé çàâèñèìîñòè îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè ñóñïåíçèè êëåòîê îò âðåìåíè.
Êîìïëåêñû LysK ñ ïîëèêàòèîíîì ãîòîâèëè ñåìèêðàòíûì ðàçáàâëåíèåì èñõîäíîãî ïðåïàðàòà ôåðìåíòà (äî êîíöåíòðàöèè 0,5 ìã/ìë) ðàñòâîðîì ïîëèáðåíà
çàäàííîé êîíöåíòðàöèè â 20 ìÌ òðèñîâîì áóôåðå
(ðÍ 9). Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð âûäåðæèâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 10 ìèí, à çàòåì èçìåðÿëè àêòèâíîñòü LysK. Ñîäåðæàíèå ïîëèáðåíà â êîíå÷íûõ ðàñòâîðàõ ñîñòàâëÿëî 0,001–0,5%.
Äëÿ èññëåäîâàíèÿ ñòàáèëüíîñòè ðàñòâîðû ôåðìåíòà (ñ äîáàâëåíèåì è áåç äîáàâëåíèÿ ïîëèýëåêòðîëèòà) êîíöåíòðàöèåé 0,5 ìã/ìë èíêóáèðîâàëè â âûáðàííûå ïðîìåæóòêè âðåìåíè ïðè 37°, çàòåì îòáèðàëè
àëèêâîòû ïî 5 ìêë äëÿ èçìåðåíèÿ àêòèâíîñòè.
*Animal Biosciences and Biotechnology Laboratory, Animal and Natural Resources Institute, Beltsville Agricultural Research Center, USA.
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2009. Ò. 50. ¹ 6
473
Àöèëèðîâàíèå àìèíîãðóïï ìîëåêóë LysK ÿíòàðíûì
àíãèäðèäîì ïðîâîäèëè ïî ìåòîäèêå [6]. Ñòåïåíü ìîäèôèêàöèè îïðåäåëÿëè ïî ìåòîäèêå [7] òèòðîâàíèåì
àìèíîãðóïï ìîëåêóë LysK ðàñòâîðîì 2,4,6-òðèíèòðîáåíçîëñóëüôîêèñëîòû.
Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå
 ëèòåðàòóðå ïîäðîáíî îïèñàíû êîìïëåêñû ôåðìåíòîâ ñ ïîëèýëåêòðîëèòàìè â âîäíûõ ðàñòâîðàõ.
Óñòàíîâëåíî, ÷òî òàêèå êîìïëåêñû îáðàçóþòñÿ
ñïîíòàííî ïðè ñìåøåíèè êîìïîíåíòîâ è ñóùåñòâóþò
çà ñ÷åò ýëåêòðîñòàòè÷åñêèõ âçàèìîäåéñòâèé ìåæäó
ïðîòèâîïîëîæíî çàðÿæåííûìè ãðóïïàìè áåëêà è ïîëèèîíà [8, 9].
Óñòàíîâëåíî, ÷òî çíà÷åíèå èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷êè ìîëåêóëû LysK ñîñòàâëÿåò 8,6. Ïðè âåëè÷èíå
ðÍ < 8,6 ìîëåêóëû ôåðìåíòà çàðÿæåíû ïîëîæèòåëüíî, à ïðè áîëåå âûñîêîì çíà÷åíèè – îòðèöàòåëüíî.
Ïîýòîìó âçàèìîäåéñòâèå LysK ñ ïîëèáðåíîì èññëåäîâàëè ïðè ðÍ 9, ò.å. â óñëîâèÿõ, êîãäà ôåðìåíò è ïîëèèîí ïðîòèâîïîëîæíî çàðÿæåíû.
Ïðè âêëþ÷åíèè ôåðìåíòà â êîìïëåêñû ñ ïîëèáðåíîì ñîõðàíÿåòñÿ àêòèâíîñòü LysK è óâåëè÷èâàåòñÿ
ñòàáèëüíîñòü (ðèñ. 1). Íà ðèñ. 1 ïðèâåäåíû êðèâûå
èíàêòèâàöèè ôåðìåíòà è ôåðìåíò-ïîëèýëåêòðîëèòíûõ
êîìïëåêñîâ. Ïîêàçàíî, ÷òî âåëè÷èíà ñòàáèëèçàöèîííîãî ýôôåêòà îïðåäåëÿåòñÿ ñîäåðæàíèåì ïîëèýëåêòðîëèòà â ñèñòåìå, ò.å. êîëè÷åñòâîì ïîëîæèòåëüíûõ çàðÿäîâ íà ìîëåêóëó LysK. ×åðåç 2 ÷ èíêóáàöèè ïðè
37°Ñ ôåðìåíò áåç äîáàâîê ïîëèáðåíà ñîõðàíÿë 3%
àêòèâíîñòè, â òî âðåìÿ êàê ïðè êîíöåíòðàöèÿõ ïîëèêàòèîíà 0,001; 0,1 è 0,5% îñòàòî÷íàÿ àêòèâíîñòü
LysK äîñòèãàëà óðîâíÿ 30, 60 è 90% ñîîòâåòñòâåííî.
Ðèñ. 1. Ñòàáèëèçàöèÿ LysK ïîëèáðåíîì. Óñëîâèÿ ýêñïåðèìåíòà:
ðÍ 9, Ò = 37°Ñ, êîíöåíòðàöèÿ ôåðìåíòà 0,5 ìã/ìë â ðàñòâîðå,
ñîäåðæàùåì 0 (1); 0,001 (2); 0,1 (3); 0,5 (4) % ïîëèýëåêòðîëèòà
Ðèñ. 2. Ñòàáèëèçàöèÿ ïîëèáðåíîì LysK, ìîäèôèöèðîâàííîãî
ÿíòàðíûì àíãèäðèäîì. Óñëîâèÿ ýêñïåðèìåíòà: ðÍ 9, Ò = 37°Ñ,
ñîäåðæàíèå ïîëèáðåíà â ðàñòâîðå 0,1%, êîíöåíòðàöèÿ ôåðìåíòà 0,5 ìã/ìë. Ñòåïåíè ìîäèôèêàöèè ìîëåêóëû LysK: 0 (1), 30 (2),
50 (3) è 70 (4)%
Îñòàòî÷íàÿ àêòèâíîñòü ôåðìåíòà â êîìïëåêñàõ ñ ïîëèáðåíîì äîñòèãàëà ïðàêòè÷åñêè íóëåâîãî óðîâíÿ çà
îòðåçîê âðåìåíè, íà ïîðÿäîê ïðåâûøàþùèé âðåìÿ
èíàêòèâàöèè LysK áåç äîáàâîê ïîëèýëåêòðîëèòà. Ñòàáèëèçèðóþùåå äåéñòâèå ïîëèáðåíà ìîæíî îáúÿñíèòü
òåì, ÷òî ìíîãîòî÷å÷íûé õàðàêòåð âçàèìîäåéñòâèÿ
ìåæäó ìîëåêóëàìè ôåðìåíòà è ïîëèáðåíà ñïîñîáñòâóåò çàêðåïëåíèþ êàòàëèòè÷åñêè àêòèâíîé êîíôîðìàöèè LysK.
Äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ äàííîé ãèïîòåçû áûëè ïîëó÷åíû êîìïëåêñû ñ ïîëèáðåíîì LysK, ìîäèôèöèðîâàííîãî ÿíòàðíûì àíãèäðèäîì. Ïðè ìîäèôèêàöèè
àìèíîãðóïï ìîëåêóëû ôåðìåíòà ÿíòàðíûì àíãèäðèäîì óâåëè÷èâàåòñÿ ÷èñëî îòðèöàòåëüíî çàðÿæåííûõ
ãðóïï íà åå ïîâåðõíîñòè è, ñëåäîâàòåëüíî, ÷èñëî
ýëåêòðîñòàòè÷åñêèõ êîíòàêòîâ ñ ìîëåêóëàìè ïîëèèîíà. Ïðè òèòðîâàíèè LysK òðèíèòðîáåíçîëñóëüôîêèñëîòîé áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ìîëåêóëà ôåðìåíòà ñîäåðæèò 20 àìèíîãðóïï. Íà ðèñ. 2 ïðèâåäåíû êðèâûå
èíàêòèâàöèè êîìïëåêñîâ LysK ñ ïîëèáðåíîì. Ñòåïåíü
ìîäèôèêàöèè LysK ñîñòàâëÿëà 0, 30, 50 è 70%, ñîäåðæàíèå ïîëèýëåêòðîëèòà (0,1%) áûëî ôèêñèðîâàííûì. Èç ðèñóíêà âèäíî, ÷òî ÷åì âûøå ñòåïåíü ìîäèôèêàöèè, òåì áîëüøå ñòàáèëèçàöèîííûé ýôôåêò.
Ýòîò ôàêò óêàçûâàåò íà âàæíóþ ðîëü â ñòàáèëèçàöèè êàòàëèòè÷åñêè àêòèâíîé êîíôîðìàöèè ìîëåêóëû
ôåðìåíòà òî÷å÷íûõ ýëåêòðîñòàòè÷åñêèõ âçàèìîäåéñòâèé ïðîòèâîïîëîæíî çàðÿæåííûõ ãðóïï LysK è ïîëèêàòèîíà. Ïðè ñòåïåíè ìîäèôèêàöèè 30–70% ñòàáèëüíîñòü ôåðìåíòà â êîìïëåêñå ñ ïîëèêàòèîíîì âîçðàñòàåò â 3–10 ðàç ïî ñðàâíåíèþ ñ íåìîäèôèöèðîâàííûì LysK â êîìïëåêñå ñ ïîëèáðåíîì è â 20 – 80 ðàç
474
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2009. Ò. 50. ¹ 6
ïî ñðàâíåíèþ ñ ôåðìåíòîì áåç äîáàâîê ïîëèýëåêòðîëèòà è ìîäèôèêàöèè àìèíîãðóïï.
Òàêèì îáðàçîì, îñíîâíîé ïðè÷èíîé ñòàáèëèçàöèè
LysK ïðè îáðàçîâàíèè êîìïëåêñà ñ ïîëèêàòèîíîì ÿâ-
ëÿåòñÿ çàêðåïëåíèå êàòàëèòè÷åñêè àêòèâíîé êîíôîðìàöèè ìîëåêóëû ôåðìåíòà áëàãîäàðÿ ìíîãîòî÷å÷íîìó
âçàèìîäåéñòâèþ ïðîòèâîïîëîæíî çàðÿæåííûõ ãðóïï
áåëêîâîé ãëîáóëû è ïîëèáðåíà.
ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ
1. Ôàäååâà Ò.Â., Âåðåùàãèíà Ñ.À., Êîãàí À.Ñ., Ãðèãîðüåâ Å.Ã.
// Èíôåêöèè â õèðóðãèè. 2007. 5. ¹1. Ñ. 578.
2. Fishetti V.A. // Trends in Microbiology. 2005. 13. P. 491.
3. Fishetti V.A. // Current Opinion in Microbiology. 2008. 11.
P. 393.
4. Flaherty S.O. et al. // J. Bacteriology. 2005. 187. P. 7161.
5. Flaherty S.O. et. al. // J. Bacteriology. 2004. 186. P. 2862.
6. Riordan J.F., Valee B.L. // Meth. Enzymol. 1967. 11. P. 565.
7. Fields R. // Biochemistry. 1971. 124. P. 581.
8. Chaniotakis N.A. // Anal. Bioanal. Chem. 2004. 378. P. 89.
9. Iyer P.V., Ananthanarayan L.À. // Process Biochemistry. 2005.
43. P. 1019.
Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 15.06.09
STABILIZATION BY POLYCATION OF LYSK THE ENZYME LYSING
STAPHYLOCOCCUS AUREUS CELLS
L.Yu Filatova, S.C. Becker, D.M. Donovan, A.K. Gladilin, N.L. Klyachko
(Division of Chemical Enzymology)
Influence of polycation (polybrene) on activity and stability of LysK – the enzyme lysing
Staphylococcus aureus cells was investigated. As found, polybrene caused 10–80 times increase
of LysK stability at 37°C. Stabilizing effect depended on a number of point interactions of
oppositively charged groups of the enzyme and polycation.
Key words: Bacteriophage lytic enzyme, LysK, Staphylococcus infections, Enzyme
stabilization, Polyelectrolytes, Polybrene.
Ñâåäåíèÿ îá àâòîðàõ: Ôèëàòîâà Ëþáîâü Þðüåâíà – ñîòð. êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî
ôàêóëüòåòà ÌÃÓ ([email protected]); Stephen C. Becker – Animal Biosciences and Biotechnology Laboratory, Animal
and Natural Resources Institute, Beltsville Agricultural Research Center, USA;Dr. Phone: 301-504-9150; fax: 301504-8571; David M. Donovan – Animal Biosciences and Biotechnology Laboratory, Animal and Natural Resources
Institute, Beltsville Agricultural Research Center, USA, Dr. Phone: 301-504-9150; fax: 301-504-8571
([email protected]); Ãëàäèëèí Àëåêñàíäð Êèðèëëîâè÷ – ïðîôåññîð êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè
õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ, äîêò. õèì. íàóê ([email protected]); Êëÿ÷êî Íàòàëüÿ Ëüâîâíà – ïðîôåññîð êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ, äîêò. õèì. íàóê ([email protected]).