Динамическое рассеяние света I(t) Cell Подвижность Laser Lazer L1 Z Aperture Флуктуация интенсивности L2 Pinhole <I> Photomultiplier Размеры, форма, масса Graph Correlator Различные названия метода Динамическое рассеяние света как метод, описывающий динамическую составляющую рассеяния света, которая связана с подвижностью молекул в растворе. Квазиэластическое рассеяние подчеркивает, что в процессе рассеяния возникает новая волна, центральная частота которой совпадает частотой падающего излучения, но амплитуда и фаза частотно модулирована движением молекул. Фотонная корреляционная спектроскопия подчеркивает, что с экспериментальной точки зрения речь идет о процессе счете фотонов, в результате которого строятся корреляционные функции. Спектроскопия оптического смешения означает, что речь идет о спектроскопии очень высокого разрешения, с которым не может сравниться 1 ни одна из известных форм спектроскопий. Динамическое рассеяние света, как спектроскопия очень высокого разрешения Первое фундаментальное утверждение статистической физики состоит в том, что система из многих частиц никогда не бывает однородной. Термодинамические переменные такой системы флюктуируют относительно наиболее вероятных значений. Сигнал одномодовогo лазера Демодуляция Модуляция Полезный сигнал ω ω0 ω0 + Δω Сигнал от обычного источника ω Dt Δ (ω) ω Интервал частот таких флюктуаций (1 Hz -106 Hz) , определяемый движениями молекул как целого в растворе, очень мал по сравнению с частотой падающего света (1015 Hz) Dt q , где q 2 Для 4 sin( / 2) Для λ= 6328Å, θ=90o и Dt=10x10-7 см2/сек Δω ~ 1 kHz 2 -12 выделения спектра такой частоты требуется очень высокое разрешение, 10 Три способа демодуляции сигнала (a) SCATTERED INTERFEROMETER PHOTOMULTIPLIER GRAPH Метод фильтра: стандартные подходы оптической спектроскопии AUTOCORRELATOR GRAPH Метод само-биений или метод гомодинирования AUTOCORRELATOR GRAPH Метод гетеро-биений или метод гетеродинирования LIGHT Filter (b) (c) SCATTERED PHOTOMULTIPLIER LIGHT P UNORT SC I ON A LI G TT EO F HT RE D D RE E T AT HT C S LI G No filter PHOTOMULTIPLIER Физика процесса Dt q 2 Геометрия измерения q 4 sin( / 2) Для быстрых процессов (10-7-10-13 сек используется интерферометр Фабри-Перо Для медленных процессов (1 сек -10-6 сек) может быть использована только 3 спектроскопия оптического смешения (ДРС) Флюктуации и временные корреляционные функции Когда τ мало с типичным временем флюктуаций переменной А(t), A(t + τ) будет близко к величине A(t). Когда величина τ увеличивается отклонение A(t + τ) from A(t) становится более вероятным. Таким образом, можно сказать, что величина A(t + τ) коррелирует с A(t) когда τ мало, но эта корреляция теряется когда τ становится большим по сравнению с характерным периодом флюктуаций. Мерой такой корреляции является корреляционная функция T 1 G( ) A(0) A( ) lim A(t ) A(t )dt T0 G(τ) Медленный процесс Быстрый процесс 4 Время Корреляционная функция поля и корреляционная функция интенсивности Cell Laser L1 G(1)(τ) = < E(t) E(t+τ) > Z Aperture q 4 Метод гетеро-биений или метод L2 sin( / 2) Pinhole гетеродинирования Photomultiplier Graph Аналогия с радиоволнами СВ и УКВ Correlator Для сферические макромолекул малых по сравнению с длиной волны света G ( ) e (1) Dt q 2 Достоинст во метода: Вирусная сферическая частица G (1) -Dtq2 Быстрота (1-5 мин) и точность (1-2%) 5 Динамическое рассеяние света в условиях гауссовой статистики (большое число молекул в рассеивающем обьеме). G (1) (q, ) A exp( Dt q 2t )[1 B j exp( t / j )][1 C exp( t / c )] j Поступательная диффузия вращательная диффузия спектр внутренних движений Для частиц, малых по сравнению с длиной волны падающего света, коэффициенты Bj и C равны 0 G (1) ( ) exp (6 DR ) 60 20 п.о 50 10 - 6(s- 1) G (1) ( ) a1 exp( Dt q 2 ) Альтернативный подход, основанный на методе оптического фильтра (Фабри-Перо) 40 ДНК 30 12 п.о 20 8 п.о 10 6 0 5 10 15 Oligonucleotide concentration (mg/ml) 1.47 2.47 Клубок Палочка Концевые эффекты Зависимость вращательного релаксациооного времени τ20w от молекулярной массы ДНК (в bp) в двойном логарифмическом масштабе, начиная от коротких ДНК фрагментов (8bp) и заканчивая нативной ДНК из насекомого Drosophila 7 melanogaster (119,71 Mbp). Динамическое рассеяние света в условиях гауссовой статистики (большое число молекул в рассеивающем объеме). G (1) (q, ) A exp( Dt q 2t )[1 B j exp( t / j )][1 C exp( t / c )] j Поступательная диффузия Вращательная диффузия Cпектр внутренних движений Для жестких частиц, существенно больших длины волны падающего света: 1.0 Вклад поступательной диффузии 0.8 B n (qL) Вклад вращательной диффузии ∑ вклад 0.6 G(1) (q, t) ~ Dtq2 + 6DR. B 0.4 B0 q = 4π/λ sinθ 0.2 B2 Для не жестких частиц, больших по сравнению с длиной волны падающего света ……??? 8 B1 0 2 4 6 qL 8 10 Динамическое рассеяние света в условиях негауссовой статистики (малое число частиц) Второе фундаментальное утверждение статистической физики: относительная величина флуктуаций в системе из N частиц пропорциональна √N G ( 2 ) ( , q) A[ N 0 exp( t ) BN 02 exp( 2 Dt q 2t )] 2 N 0 Флуктуации числа частиц Гауссов вклад √100 10.0 =10% N0 γ есть характерное время, необходимое для того, чтобы частица диффундировала вдоль объема, а A и B - константы √10 000 10 000 =1% 0 1 2 TIME (msec) 3 4 5 Временная корреляционная функция света рассеянного раствором ~ 10 000 частиц вируса myelblastosis обезьяны (M = 4×108, s = 680S, Dt = 0.3110-7 см2сек-1) 9