Биотехнология и эффективные штаммыпродуценты альтернативного топлива – биобутанола 23-24 февраля 2010 г. Ашхабад Шульга Сергей Михайлович [email protected] ГУ “ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ И ГЕНОМИКИ” НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК УКРАИНЫ, г. Киев Создание производства жидких топлив из возобнавляемого сырья растительного происхождения (биомассы) 1 Биодизель 2 Биоэтанол 3 Биобутанол Метанол СН3ОН Этанол С2Н5ОН Пропанол С3Н7ОН Бутанол С4Н9ОН Бензин смесь октановое число 91 октановое число 92 октановое число 91 октановое число 94 октановое число 96 Преимущества бутанола в сравнении с этанолом: Большее содержание энергии (теплообразующая способность), чем у этанола. Бутанол в шесть раз меньше испаряется чем этанол и в 13,5 раз меньше испаряется чем бензин, поэтому его безопаснее использовать как добавки к бензину. Бутанол можно транспортировать через существующие топливные трубопроводы, в то время как этанол необходимо транспортировать железной дорогой, баржами или грузовиками-цистернами. Бутанол можно использовать вместо бензина в соотношении один к одному, например 100% или любые другие проценты, а этанол может использоваться только как добавка к бензину до 85% и то только после значительных модификаций двигателя. Во всем мире отдают предпочтение смеси с 10% содержанием этанолу. Бутанол не дает окисей серы или азота. Бутанол получают: • Путем синтеза химического сырья; • Путем микробиологического синтеза -переработка сахара или растительных культур; -переработка лигноцелюлози. крахмала с/х Химический синтез бутанола Биосинтез бутанола из сахаров etanol acetone butanol Оптимизация технологии биосинтеза метаболитов состоит из следующих основных этапов: 1 Первичная селекция штаммов микроорганизмов; 2 Определение оптимальних значений температуры, рН и потребности в кислороде; 3 Определение оптимального режима питания и накопления биомассы; -выхода продукта в перерасчете на потребленный субстрат; -концентрации продукта; -скорости образования продукта; 4 Иммобилизация клеток продуцентов; 5 Изменение генетической структуры организма для увеличения образования продукта. Отобранные штаммы-продуценты клостридий 1. Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (АТСС 51743), 2. Clostridium acetobutylicum ATCC-55025, 3. Clostridium acetobutylicum ATCC-4259 (ATCC-39236), 4. Clostridium acetobutylicum ATCC-824, 5. Clostridium tyrobutyricum ATCC-25755. Контроллер Образец Вход Водяная рубашка Выход и Перистальтический насос Реактор с взвешенной твердой фазой с иммобилизированными клетками продуцента 4 1 5 3 6 2 14 12 20 г/л 10 80 г/л 40 г/л Бутанол, г/л 8 10 г/л 6 4 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Час, год. Влияние концентрации глюкозы на кинетику образования бутанола Катализируемые переходы ацетил-CоА в ацетоацетил-CоА (ацетил-CoA ацетилтрансфераза) ацетоацетил-CоА в 3-гидроксибутирил-CоА (3-гидроксибутирил-СоА дегидрогеназа) 3-гидроксибутирил-CоА в кротонил-CоА (кротоназа) кротонил-CоА в бутирил-CоА (бутирил-СоА дегидрогеназа) бутирил-CоА в бутиральдегид (бутиральдегид дегидрогеназа) бутиральдегид в бутанол (бутанол дегидрогеназа) Метаболическая инженерия клостридий Штаммы АТСС 824 Clostridium acetobutylicum и АТСС 25755 Clostridium tyrobutyricum Штаммы-суперпродуценты Clostridium acetobutylicum и Clostridium tyrobutyricum Геном и мегаплазмида Clostridium acetobutylicum ATCC 824 из работы Journal of Bacteriology 2001, v.183, № 16, p. 4823-4838 3778 генов хромосома 3940880 п.н. мегаплазмида 192000 п.н. Гены, кодирующие синтез ацетона aad, ctfA, ctfB, adc. Гены, кодирующие образование бутанола bdhA, bdhB, adhE. Праймеры pE1 (BamH1 подчеркнуто) 5'-ATGGATCCTTTTATAAAGGAGTGTATATAAA TGAAAG-3'; pE2 (SfoI подчеркнуто) 5'-TTGGCGCCATAATGAAGCAAAGACTATTTTA CATTC-3'. Вектор pGEM-T 7622 п.н. Схематическое изображение плазмиды pE5α, 2600 п.н. содержит adhE2 и клонирован в вектор pSOS95 между thl-промотором (Р) и adc-терминатором (Т) Биосинтез бутанола в два этапа Масляная кислота Бутанол Бутанол Ферментер 1 Крахмал/ глюкоза Ферментер 2 ШТАММПРОДУЦЕНТ БУТАНОЛ (g/l) МАСЛЯНАЯ КИСЛОТА (g/l) NCIMB 8052 12,9 - ATCC 824 12,1 - ATCC 824 (иммобилизированный) 21,6 - ATCC 824 (рекомбинантный) 32,4 - АТСС 25755 - 49,8 АТСС 25755 (иммобилизированный) - 62,1 СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ