ИССЛЕДОВАНИЕ БИОКОНВЕРСИИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

УДК 579.66:547.94
Л. М. Султанова (ст. преп.)1, А. А. Егорова (студ.)1, Р. Н. Шахмаев (к.х.н., доц.) 1,
Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.)1 , Л. В. Спирихин (к.х.н., зав. лаб.)2 ,
В. В. Зорин (чл.#корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)1
Исследование биоконверсии растительного сырья с помощью
сольвентогенных бактерий Clostridium sp. С1
1
Уфимский государственный нефтяной технический университет,
кафедра биохимии и технологии микробиологических производств
450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1, тел. (347) 2431935, email: Bio1@rusoil.net
2
Институт органической химии Уфимского научного центра РАН,
лаборатория физикохимических методов анализа
450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, тел. (347) 2355560, email: spector@anrb.ru
L. M. Sultanova1, A. A. Egorova 1, R. N. Shakhmaev1, N. I. Petukhova 1, L.V. Spirikhin2 , V. V. Zorin1
Research of bioconversion of vegetable substrates into butanol
by Clostridium sp. C1
1
Ufa State Petroleum Technological University
1, ul. Kosmonavtov, 450062, Ufa, Russia; Ph.: (347)2431935, email: Bio1@rusoil.net
2
Institute of Organic Chemistry of Ufa Scientific Centre of Russian Academy of Sciences
71, Oktyabrya Pr., Ufa, 450054, Bashkortostan, Russia, , tel. (347) 2355560, email: spector@anrb.ru
Выделен и охарактеризован новый продуцент
биобутанола Сlostridium sp. C1. Показана спо
собность микроорганизма сбраживать ряд моно
и дисахаридов (глюкозу, мальтозу, ксилозу,
маннозу), а также глицерин и некоторые виды
растительного сырья (стебли подсолнуха, соло
му, древесные отходы, зерна рапса, кукурузы,
пшеницы, картофель и крахмал).
Clostridium sp. C1 – new producent of
biobutanol was isolated and characterized.
Ability of microorganism to ferment a number of
mono and disaccharides (glucose, maltose,
xylose, mannose), and also glycerol and some
kinds of vegetal substrates (stalks of sunflower,
straw, wood waste, grains of rape, corn, wheat,
potato and starch) was shown.
Ключевые слова: брожение; бутанол; клост
ридии; растительное сырье.
Key words : butanol; Clostridium;
mentation; vegetal substrates.
Ферментация углеводов в ацетон, бутанол
и этанол с помощью сольвентогенных клостри
дий – хорошо известный процесс 1, 2. В начале
XX века ацетонобутиловое производство
по объему выпускаемой продукции являлось
вторым после процесса получения этанола
с помощью дрожжей. Развитие нефтехимичес
кой промышленности и повышение цен на суб
страты (муку, крахмал) привело к повсемест
ному сокращению ацетонобутилового произ
водства вплоть до его полного прекращения
в 80х годах прошлого века 3.
В наши дни интерес к ацетонобутиловому
брожению вновь возрос благодаря растущей
потребности в бутаноле. Бутанол, как жидкий
энергоноситель, может частично заменить бен
зин и дизельное топливо благодаря высокой
энергоемкости, хорошей смешиваемости,
высокому октановому числу и низкой летучес
ти 4. Он также широко используется как сырье
при производстве пластиков, как экстрагент
в пищевой и парфюмерной промышленности 5.
Продуцентами бутанола являются бактерии
Clostridium acetobutylicum 6, C. beijerinckii 7, 8,
C. saccharoperbutylacetonicum 9, C. ther
mosaccharolyticum 10, которые могут использо
вать довольно широкий спектр субстратов.
Наиболее активные штаммы клостридий спо
собны накапливать в оптимальных условиях
около 15 г/л бутанола. Удаление в ходе фер
ментации сопутствующих кислот (уксусной и
масляной), ингибирующих процесс брожения,
позволяет дополнительно увеличить выход це
левого продукта 11.
Экономическая эффективность процесса
ацетонобутилового брожения напрямую зави
сит от стоимости субстрата. При использова
нии для производства бутанола традиционных
Дата поступления 05.02.09
114
fer
Башкирский химический журнал. 2009. Том 16. № 1
время было установлено, что галактоза и лак
тоза практически не сбраживались бактериями
Сlostridium sp. С1.
Полученные результаты показывают, что
данная культура бактерий представляет инте
рес для получения бутанола из гидролизатов
углеводных компонентов растительного сырья
(крахмала, целлюлозы, гемицеллюлозы) и от
работанной микробной биомассы, содержащих
глюкозу, мальтозу, ксилозу или маннозу, а
также из глицерина, образующегося как отход
при получении биодизеля. В тоже время мо
лочная сыворотка (отход переработки моло
ка), в состав которой входит лактоза, не может
быть использована в качестве сырья для про
изводства бутанола с помощью бактерий
Сlostridium sp. С1.
Известные раздельные двухстадийные
процессы получения бутанола, основанные
на химическом гидролизе полимерного сырья
и последующей ферментации продуктов гидро
лиза, оказались экономически не выгодными.
Вместе с тем известно, что некоторые штаммы
клостридий могут продуцировать ферменты,
расщепляющие полимерные компоненты рас
тительной биомассы, что позволяет осуществ
лять стадию гидролиза и ферментацию в од
ном реакторе 12–16. Такой подход значительно
сокращает затраты на производство биобута
нола. В связи с этим была исследована способ
ность бактерий Сlostridium sp. C1 гидролизо
вать и сбраживать растительное сырье различ
ного углеводного состава, в частности, стебли
подсолнуха, солому, древесные отходы (опи
лок), зерна рапса, кукурузы, пшеницы, а так
же картофель и крахмал.
бутанол
этанол
4
3
2
солома
опилки
рапс
пшеница
кукуруза
0
картофель
1
этанол
Рис. 1. Выход продуктов брожения при использова
нии различных углеводов и глицерина
ацетон
5
крахмал
глицерин
галактоза
6
подсолнечник
ацетон
лактоза
мальтоза
Продукты брожения, г/л
бутанол
манноза
ксилоза
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
глюкоза
Продукты брожения, г/л
субстратов – муки, мелассы, крахмала и глю
козы, стоимость последних составляет до 60%
от общих затрат. Для того, чтобы сделать аце
тонобутиловое брожение экономически выгод
ным в современных условиях, необходимы
высокопродуктивные штаммы микроорганиз
мов, растущие на доступном и дешевом сырье.
В результате скрининга продуцентов бу
танола среди 90 почвенных культур анаэроб
ных спорообразующих микроорганизмов, вы
деленных из различных мест обитания, был
выявлен штамм С1, накапливающий при рос
те на глюкозе в неоптимизированных условиях
около 4 г/л бутанола.
Бактерии представляют собой анаэроб
ные, грамположительные, подвижные палочки
с перетрихальным жгутикованием, образую
щие овальные эндоспоры. При ферментации
глюкозы помимо бутанола в среду выделяются
масляная кислота, ацетон и этанол, а также
газообразные продукты. Штамм идентифици
рован как Сlostridium sp. и депонирован
в коллекции культур микроорганизмов кафе
дры биохимии и технологии микробиологичес
ких производств ГОУ ВПО «Уфимский госу
дарственный нефтяной технический универси
тет».
При исследовании субстратной специфич
ности было обнаружено, что найденные бакте
рии способны сбраживать ряд моно и дисаха
ридов (глюкозу, мальтозу, ксилозу, маннозу),
а также глицерин с образованием ацетона, бу
танола и этанола (рис. 1). Выход продуктов
ферментации соответствовал известному для
ацетонобутилового брожения соотношению
3 : 6 : 1 (ацетон:бутанол:этанол) 11. В то же
Рис. 2. Выход продуктов брожения при использова
нии растительного сырья
Башкирский химический журнал. 2009. Том 16. № 1
115
В результате исследования было обнару
жено, что полученный штамм активно сбражи
вает крахмал, а также крахмалсодержащее сы
рье (картофель, пшеницу, кукурузу), что указы
вает на наличие у него амилолитических фер
ментов (αамилаз или амилоглюкозидаз) 12.
Наибольший выход бутанола был получен при
сбраживании крахмала, что, вероятно, связано
с большей доступностью этого субстрата для
бактерий.
Обнаружено также, что исследуемая
культура бактерий способна синтезировать бу
танол на зернах масленичных культур, в част
ности рапса, используемого для производства
биодизеля (рис. 2).
Кроме того, установлено, что бактерии
Сlostridium sp. C1 осуществляют биоконвер
сию соломы, стеблей подсолнуха и древесных
опилок, состоящих главным образом из целлю
лозы, гемицеллюлозы и лигнина (рис. 2). Дег
радация подобных растительных субстратов
у клостридий происходит с участием ксилана
зы 11, 13 и целлюлолитического ферментативно
го комплекса (целлюлосомы) 14. Это позволяет
предполагать наличие у исследуемого штамма
аналогичных ферментов, гидролизующих цел
люлозу и расщепляющих ксилан – главный
компонент гемицеллюлозы.
Таким образом, полученные данные пока
зывают перспективность использования най
денных бактерий Сlostridium sp. C1 для про
изводства биобутанола на основе растительно
го сырья и отходов производства биодизеля.
Однако требуется поиск оптимальных условий
ферментации с целью увеличения выхода це
левых продуктов.
Экспериментальная часть
Микроорганизмы выращивали на пита
тельной среде, содержащей 2% мясопептонно
го бульона (МПБ) с добавлением различных
источников углерода. В качестве источников
углерода использовали моно и дисахариды:
глюкозу, мальтозу, ксилозу, маннозу, лактозу
и галактозу, а также глицерин и некоторые
виды растительного сырья: стебли подсолну
ха, солому, древесные отходы, зерна рапса,
кукурузы, пшеницы, картофель и крахмал
в концентрации 5%. Микроорганизмы культи
вировали в анаэробных условиях в стериль
ных флаконах в термостате при 37 оС в тече
ние 1.5–4 сут.
Идентификацию бактерий осуществляли
15
по .
116
Концентрацию бутанола, ацетона и этано
ла в культуральной жидкости определяли ме
тодом ГЖХ после предварительного осветле
ния проб центрифугированием в течение
10 мин при 12000 об/мин. Анализ проводили
на газожидкостном хроматографе ЛХМ80
с детектором по теплопроводности. Использо
вали газноситель – гелий (расход газа –
30 мл/мин), хроматографическую колонку
2000 × 3 мм с неподвижной жидкой фазой SE
– 30–50 % на хроматоне NAW, с изотермой
на 60 оС.
Идентификацию продуктов брожения
осуществляли методом хроматомассспектро
скопии на аппаратнопрограмном комплексе
ХроматэкКристалл 500 с массселективным
детектором Finigan DSQ (электронная иониза
ция при 70 эВ).
Литература
1.
Jones D. T., Woods. D. R. // Microbiol. Rev.–
1986.– V. 50.– P. 484.
2.
Rogers P. // Adv. Appl. Microbiol.– 1986.–
V. 31.– P. 1.
3.
Zverlov V. V., Berezina O., Velikodvorskaya G. A.,
Schwarz W. H. // Appl. Microbiol.
Biotechnol.– 2006.– V.71.– P. 587.
4.
Ladisch M. R. // Enzyme Microb. Technol. –
1991.– V. 13.– P. 280.
5.
Ezeji T., Qureshi N., Blaschek H. P. // Process
Biochemistry.– 2007.– V.42.– P. 34.
6.
Qureshi N., Li X–L., Hughes S., Saha B. C.,
Cotta M. A. // Biotechnol. Prog. –2006.–
V.22.– P. 673.
7.
Formanek J., Mackie R., Blaschek H. P. //
Appl. Envron. Microbiol.– 1997.– V. 63, № 6.–
P. 2306.
8.
Durre P. // Appl. Microbiol. Biotechnol.–
1998.– V.49.– P. 639.
9.
Kobayashi G., Eto K., Tashibo Y., Okubo K.,
Sonomoto K., Ishizaki A. // J. Bioschem.
Bioeng.– 2005.– V. 99, № 5.– P. 517.
10. Landuyt S. M., Hsu E. J., Wang B–T., Tsay S–S.
// Envron. Microbiol.– 1995.– V. 61, № 3.–
P. 1153.
11. Qureshi N., Saha B. C., Cotta M. A. //
Bioprocess Biosyst Eng.– 2007.– V. 30.– P. 419.
12. Ezeji T. C., Qureshi N., Blaschek H. P. //
Journal of Biotechnology.– 2005.– V. 115.–
P. 179.
13. Marichamy S., Mattiasson B. // Enzyme and
Microbial Technology.– 2005.– V. 37.– P. 497.
14. Desvaux M. // Enzyme and Microbial
Technology.– 2005.– V. 37.– P. 373.
15. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., Стейли Дж.,
Уильямс С. Определитель бактерий Берджи.–
М.: Мир.– 1997.– T.2.– 368 с.
Башкирский химический журнал. 2009. Том 16. № 1