Информация о выполнении проекта ФЦП «Исследования и
advertisement
Краткий отчет о выполнении проекта, выполняемого в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020» <1-ый этап работ, 2014 год> Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.604.21.0020 Тема: «Научное обоснование и экспериментальная разработка клеточной биотехнологии программирования реверсивного фенотипа иммунных клеток для терапии рака» Приоритетное направление: Науки о жизни; Критическая технология: Клеточные технологии Период выполнения: 17.06.2014 – 31.12.2015 Плановое финансирование проекта: Бюджетные средства: 10,0 млн. руб.; Внебюджетные средства: 2,0 млн. руб.; Общее плановое финансирование проекта: 12,0 млн. руб Получатель/Исполнитель: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Индустриальный партнер: ООО «Уай Ви Эм Корпорэйшн» Ключевые слова: макрофаг, опухоль, репрограммирование, биотехнология, факторы транскрипции, цитокины 1. Цель проекта 1) Формулировка задач, на решение которых направлен реализуемый проект. Отработка in vitro способов программирования «реверсного» М1 фенотипа макрофагов, обладающего способностью усиливать продукцию провоспалительных антиопухолевых цитокинов в ответ на действие антивоспалительных проопухолевых медиаторов; Отработка способов введения репрограммированных макрофагов и оценка антиопухолевого эффекта in vivo и in vitro на модели асцитной карциномы Эрлиха. 2) Формулировка цели проекта; продукта, создаваемого с использованием результатов проекта. Разработка клеточной биотехнологии программирования реверсивного фенотипа макрофагов для ограничения опухолевого роста. 2. Основные результаты проекта Написан аналитический обзор, в котором проанализированы механизмы формирования фенотипа макрофагов, а также механизмы репрограммированния иммунных клеток при развитии опухоли. Обоснованы «реверсного» условия программирования антиопухолевого фенотипа фенотипа макрофага, макрофагов способного для формирования усиливать продукцию антиопухолевых факторов пропорционально действию проопухолевых факторов опухоли. Мы ожидаем, что это 1) не только не позволит опухоли перепрограммировать макрофаг на проопухолевый М2 фенотип, но и 2) адекватно усилит провоспалительное антиопухолевое действие макрофага именно в зоне опухоли, а также 3) ограничит избыточное воспаление и повреждение тканей и 4) ограничит активацию супрессорных Treg клеток и MDSC, которые подавляют антиопухолевый иммунитет. Отработаны процедуры репрограммирования фенотипа макрофагов на М1 фенотип. В проекте будет использоваться комбинированная модель с использованием и пониженных концентраций сыворотки и добавления IFN-γ. В такой модели активация IFN-γ сигнального пути может увеличивать экспрессию ингибиторного SMAD7, который может препятствовать фосфорилированию SMAD2/3. Этот эффект будет способствовать ингибированию TGF-β/SMAD-зависимого сигнального пути с помощью ингибиторов SMAD2/3/4/, которое мы будем проводить на втором этапе создания реверсного фенотипа. Отработка модели была проведена на мышах линий С57 и BALB/c. Получены данные о том, что уязвимость организма или вида к развитию опухоли может предопределяться генетическими особенностями систем генерации NO. Продукция NO макрофагами оценивалась спектрофотометрически, по содержанию нитритов в культуральной среде с помощью реакции Грисса. Содержание индуцибельной NO-синтазы оценивалось методом Western blot. Полученные данные позволили сделать вывод, что, уязвимость организма или вида к развитию опухоли может предопределяться генетическими особенностями систем генерации NO. Факт важной роли NO в увеличении продолжительности жизни при наиболее агрессивном виде опухоли карциноме, делает перспективным поиск новых подходов к лечению опухолей с помощью манипулирования NO в зоне опухоли. Сопоставление наших данных и анализ литературы, показывает, что ген и белок NNT и различия в SNP, обнаруженные у разных сублиний C57BL/6 также заслуживают внимания при разработке новых методов противоопухолевой терапии. Проведены патентные исследования по теме «Новая стратегия иммунного подавления роста опухоли на основе комплексного блокирования факторов транскрипции макрофагов: клеточная биотехнология «умный макрофаг»». Сделан вывод о том, что тема охраноспособна. Материально-техническое обеспечение работ было проведено в форме технического обслуживания проточного цитометра и закупки расходных материалов и реактивов. Достигнуты индикаторы и показатели результативности проекта в 2014 году, такие как «Число публикаций по результатам исследований и разработок в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science) - опубликованы 2 статьи (2 статья включены в Scopus”; “Доля исследователей в возрасте до 39 лет - 66,7”; ”Объем привлеченных внебюджетных средств - 0,8 млн. руб”; “Средний возраст исследователей – не более 38,8” и “Количество мероприятий по популяризации результатов - 2: симпозиумы в Балтиморе (США) и Суджоу (Китай)”. Таким образом индикаторы и показатели достигнуты. Проведена модернизация лаборатории в форме установки кондиционеров и систем очистки воздуха для обеспечения условий по культивированию клеток. 3. Назначение и применение результатов проекта. Результаты могут быть использованы в области медицинских биотехнологий лечения рака, а также в образовательном процессе студентов медиков. Практическое внедрение результатов, оценка их влияния на развитие научно-технических направлений; на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, развитие материально-технической и информационной инфраструктуры будет возможным описать в 2015 году. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом. Информация о выполнении проекта ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» <2-ой этап работ, 1-ое полугодие 2015 года> Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.604.21.0020 с дополнительным соглашением №1 от «25» мая 2015 г. «6» июля 2015 г. Тема: «Научное обоснование и экспериментальная разработка клеточной биотехнологии программирования реверсивного фенотипа иммунных клеток для терапии рака» Приоритетное направление: Науки о жизни Критическая технология: Клеточные технологии Период выполнения: 01.01.2015 – 30.06.2015 Получатель/Исполнитель: БОУ ВПО «Московский государственный медико- стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Индустриальный партнер: ООО «Уай Ви Эм Корпорэйшн» Руководитель проекта: Малышев И.Ю. Ключевые слова: макрофаг, опухоль, репрограммирование, биотехнология 1. Цель проекта 1) Отработка in vitro способов программирования «реверсного» М1 фенотипа макрофагов, обладающего способностью усиливать продукцию провоспалительных антиопухолевых цитокинов в ответ на действие антивоспалительных проопухолевых медиаторов; 2) Отработка способов введения репрограммированных макрофагов и оценка антиопухолевого эффекта in vivo и in vitro на модели асцитной карциномы Эрлиха. 3) Разработка клеточной биотехнологии программирования реверсивного фенотипа макрофагов для ограничения опухолевого роста. 2. Краткое описание основных полученных результатов (основные теоретические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности) Завершены исследования по оценке роли NO в антиопухолевом действии макрофагов и формировании антиопухолевого М1 фенотипа. Проанализировано влияние асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на фенотип и секреторную NO-продуцирующую активность макрофагов и влияние асцитической жидкости и опухолевых клеток на фенотип и секреторную NO-продуцирующую активность макрофагов. Показано, что увеличение соотношения «опухолевые клетки/макрофаги» при АКЭ сопровождалось двух-кратным снижением концентрации нитритов в брюшной полости и угнетением способности макрофагов синтезировать NO, как в базальных условиях, так и в ответ на стимуляцию ЛПС. На терминальной стадии АКЭ базальная продукция NO макрофагами снижалась в 3 раза, а стимулированная - в 4 раза, по сравнению с контролем. Низкая продукция NO является маркером проопухолевого М2 фенотипа макрофагов. Результаты, также показали, что и асцитическая жидкость и клетки АКЭ существенно угнетают NO-продуцирующую активность макрофагов. Так под действием асцитической жидкости базальная продукция NO снижалась на 50%, а индуцированная - на 20%. При действии клеток АКЭ базальная продукция NO снижалась на 27%, а индуцированная - на 29%. Проведены исследования по оценке содержания про- и антивоспалительных цитокинов в асцитической жидкости на разных стадиях развития опухоли. Результаты показали, что перитонеальная среда контрольных мышей С57/BL6J имеет существенно более выраженный провоспалительный сдвиг, по сравнению с мышами BALB/c. На lag-фазе АКЭ асцитическая жидкость мышей С57/BL6J имеет существенно более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c. При переходе с lag-фазы на log-фазу АКЭ происходит снижение содержания практически всех цитокинов, но при этом асцитическая жидкость мышей С57/BL6J сохраняет существенно более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c. При переходе с log-фазы АКЭ в терминальную происходит дальнейшее снижение провоспалительных цитокинов, но повышение большинства антивоспалительных цитокинов у обеих генетических линий, при этом межлинейные отличия между мышами С57/BL6J и BALB/c сохраняются и характеризуются тем, что асцитическая жидкость мышей С57/BL6J имеет более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c. Проведены эксперименты по отработке процедуры формирования реверсного антиопухолевого М1 фенотипа макрофагов с обратной связью. Установлено, что при действии асцитической жидкости на макрофаги М1 фенотипа происходило снижение продукции большинства провоспалительных цитокинов. Это снижение отражает репрограммирующее проопухолевое действие асцитической жидкости и репрограммирование макрофагов на проопухолевый М2 фенотип. При действии асцитической жидкости на М1 макрофаги с заблокированным Stat3/6, напротив происходило увеличение продукции большинства провоспалительных цитокинов. Это увеличение означает, в результате блокирования Stat3/6 реакция М1 макрофагов на проопухолевую асцитическую жидкость изменилась на противоположную, а именно в ответ на М2 репрограммирующую асцитическую жидкость макрофаги вместо антиопухолевых цитокинов стали отвечать снижения продукции провоспалительных усилением провоспалительных антиопухолевых цитокинов. Феномен переключения фенотипа при блокировании Stat3/6 также проявляется и в отношении антивоспалительных цитокинов. При действии асцитической жидкости на макрофаги М1 фенотипа происходило увеличение продукции антивоспалительных цитокинов IL-5 и IL-10. Это увеличение согласуется с репрограммирующим проопухолевым действием асцитической жидкости и репрограммированием макрофагов на проопухолевый М2 фенотип. При действии асцитической жидкости на М1 макрофаги с заблокированным Stat3/6, происходило значительное снижение продукции всех антивоспалительных цитокинов. Разработан лабораторный технологический регламент репрограммирования макрофагов с целью получения антиопухолевого М1 реверсного фенотипа макрофагов. В проекте будет использоваться комбинированная модель с использованием и пониженных концентраций сыворотки и добавления IFN-γ и ингибиторов факторов транскрипции Stat3/6 Наработаны экспериментальные образцы репрограммированых макрофагов. Разработан план исследований экспериментальных образцов репрограммированых макрофагов антиопухолевого М1 реверсного фенотипа. Проведены эксперименты по отработке способов обратного введения репрограммированных макрофагов внутрибрюшинно. Проведены эксперименты по оценке воспалительных реакций у нормальных мышей без опухоли на введение репрограммированных макрофагов с реверсивным фенотипом. Результаты показали, что у мышей Balb/c введение М1 макрофагов с фенотипом переключения не оказало достоверного влияния на локальный (перитонеальная полость) и системный воспалительный статус. У мышей C57/BL6J введение М1 макрофагов с фенотипом переключения не оказало достоверного влияния на общий системный воспалительный статус, но привело к достоверному увеличению локального воспаления в перитонеальной полости. Достигнуты индикаторы и показатели результативности проекта в 2015 году. Индикатор 1. Опубликована 1 статья в журнал, входящий в базу данных SCOPUS. 1. Калиш С.В., Буданова О.П., Лямина С.В., Малышев И.Ю. Генетические особенности систем генерации оксида азота предопределяют устойчивость организма к развитию карциномы. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2015, №1, с. 65-71. Таким образом индикатор 1 начинает выполняться. Показатель 2: «Количество мероприятий по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта организация исполнитель проекта, не менее» (конференции, семинары, симпозиумы, выставки и т.п., в том числе, международные). Исполнители приняли участие в 5-и мероприятиях по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта организация - исполнитель проекта. Таким образом, показатель 2 выполнен полностью. 3. Основные характеристики полученных результатов (в целом и/или отдельных элементов), созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции Результаты полученные в 2015 году при оценке роли NO в антиопухолевом действии макрофагов и формировании антиопухолевого М1 фенотипа имеют следующие характеристики: АКЭ сдвигает фенотип макрофагов мышей в сторону проопухолевого М2 фенотипа. Снижение концентрации нитритов в асците при развитии АКЭ отражает снижение NOпродуцирующей активности М2 фенотипа макрофагов. Растворимые в асците, мышей с опухолью, факторы и факторы, продуцируемые клетками АКЭ вносят вклад в репрограммирование макрофагов на М2 фенотип и снижение NOпродуцирующей активности макрофагов. Результаты полученные при оценке содержания про- и антивоспалительных цитокинов в асцитической жидкости мышей на разных стадиях развития опухоли имеют следующие характеристики. Динамика цитокинов в асцитической жидкости мышей с опухолью отражает реакцию иммунитета на появление опухоли и имеет четкий 3-х стадийный характер: 1. первоначальная активация антиопухолевого иммунного ответа, 2. снижение активности иммунных клеток и антиопухолевого иммунитета и 3. существенная трансформацию фенотипа иммунных клеток, и прежде всего макрофагов в проопухолевый М2 фенотип. Результаты полученные при отработке процедуры формирования реверсного антиопухолевого М1 фенотипа макрофагов с обратной связью характеризуются следующими положениями: Реакции макрофагов с заблокированным Stat3/6 на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость меняется с угнетения на увеличение продукции провоспалительных цитокинов, что отражает формирование фенотипа переключения (М2/М1). Реакции макрофагов с заблокированным Stat3/6 на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость меняется с увеличения некоторых на угнетение продукции всех антивоспалительных цитокинов, что подтверждает формирование фенотипа переключения (М2/М1). Альтернативное изменение репрограммирования макрофагов с заблокированным Stat3/6 на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость с формирования М2 фенотипа на формирование М1 фенотип доказывает, что с помощью блокирования Stat3/6 удалось сформировать у макрофагов фенотип переключения (М2/М1). Результаты полученные при оценке воспаления у мышей после введения М1 макрофагов с фенотипом переключения показал отсутствие существенного влияния инъекции М1 макрофагов с фенотипом переключения на системное воспаление как у мышей Balb/c, так и C57/BL6J. При оценке влияния инъекции макрофагов на локальное воспаление в перитонеальной полости выявились генетические отличия: у Balb/c изменения в общем воспалительном статусе были недостоверны, а у C57/BL6J локальное воспаление достоверно увеличилось. 4. Оценка элементов новизны научных, конструкторских и технологических решений, информацию о полученных на отчетном этапе охраноспособных РИД Впервые теоретически обоснована целесообразность разработки и использования комбинированной модели репрограммирования на М1 фенотип на стадии создания реверсного фенотипа, с тем чтобы создать больше предпосылок для формирования реверсного фенотипа, когда будут блокироваться факторы транскрипции М2-зависимых путей. Целесообразность связана с тем, что добавление цитокина IFN-γ (цитокиновая модель) к пониженным концентрациям сыворотки (сывороточная модель) во время репрограммирования приведет к активации IFN-γ-зависимого сигнального пути и увеличит экспрессию ингибиторного SMAD7 (пониженные концентрации сыворотки таким эффектом не обладают). SMAD7 препятствует фосфорилированию SMAD2/3. Таким образом, накопление SMAD7 на этапе репрограммирования на М1 фенотип будет способствовать ингибированию TGF-β/SMAD-(М2-) зависимого сигнального пути. Целесообразность использования пониженных концентраций сыворотки (сывороточная модель) в комбинированной модели репрограммирования связана с тем, что в сыворотке содержится TGF-β и его удаление (вместе с сывороткой) облегчит не только формирование М1 фенотипа, но и будет способствовать более эффективному блокированию TGF-β/SMAD-(М2) зависимого сигнального пути с помощью SMAD7. Ингибирование SMAD-(М2)-зависимого пути приведет к тому что сигнал от М2 цитокина TGF-β будет передаваться на SMAD-независимый (М1) путь, способствуя формированию фенотипа переключения М2/М1. Дополнительно в репрограммирующий коктейль добавляется ингибиторы факторов транскрипции М2 фенотипа Stat 3/6. Целесообразность введения этих ингибиторов связан с тем, что Stat опосредует репрограммирующее действие на М2 фенотип многих цитокинов, которые выделяет опухоль, таких как IL-4, IL-10 и IL-13. Ингибирование Stat3/6-(М2)-зависимых путей приведет к тому, что сигналы от М2 цитокинов будут передаваться на Tyk2/STAT1-зависимый (М1) путь, способствуя формированию фенотипа переключения М2/М1. Кроме того, блокирование Stat3/6 приведет к снижению активности SOCS1, который блокирует фактор транскрипции М1 фенотипа Stat1. Это также будет способствовать формированию фенотипа переключения М2/М1. Впервые экспериментально проверена возможность репрограммирования макрофагов на фенотип переключения М2/М1. Проведенный анализ параметров фенотипа макрофагов: секреторная активность по оценке продукции NO, цитокинов, а также поверхностно-клеточные CD маркеры позволяет рассматривать нашу комбинированную модель, сочетающую удаление FBS, добавление IFN- и ингибиторов Stat3/6 при культивировании макрофагов, как хорошую модель репрограммирования макрофагов in vitro на провоспалительный фенотип переключения (М2/М1). Представленные данные подтвердили нашу гипотезу о том, что с помощью комбинированной модели, сочетающей удаление FBS, добавление IFN- и ингибиторов факторов транскрипции, можно целенаправленно репрограммировать макрофаги на провоспалительный фенотип переключения. Это имеет исключительно важное значение для ПНИ в целом, поскольку разработка биотехнологии репрограммирования такого фенотипа является необходимым условием для выполнения проекта в целом. На третьем этапе будет оценено антиопухолевое действие макрофагов с фенотипом переключения на модели асцитной карциномы Эрлиха. В 2014 году проведены патентные исследования. На 2 этапе 2015 проводилось оформление заявок. Подача заявок будет осуществлена на 3 этапе проекта в 2015 году 5. Оценка соответствия полученных результатов техническим требованиям к выполняемому проекту и перспектив продолжения работ по проекту. Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту. 6. Назначение и область применения результатов проекта. Результаты могут быть использованы в области медицинских биотехнологий лечения рака, а также в образовательном процессе студентов медиков. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом. Информация о выполнении проекта ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» <3 этап работ, 2015 год> Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.604.21.0020 с дополнительным соглашением №1 от «25» мая 2015 г. «6» июля 2015 г. Тема: «Научное обоснование и экспериментальная разработка клеточной биотехнологии программирования реверсивного фенотипа иммунных клеток для терапии рака» Приоритетное направление: Науки о жизни Критическая технология: Клеточные технологии Период выполнения: 01.01.2015 – 30.12.2015 Получатель/Исполнитель: БОУ ВПО «Московский государственный медико- стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Индустриальный партнер: ООО «Уай Ви Эм Корпорэйшн» Руководитель проекта: Малышев И.Ю. Ключевые слова: макрофаг, опухоль, репрограммирование, биотехнология, цитокины, факторы транскрипции 1. Цель проекта 1) Отработка in vitro способов программирования «реверсного» М1 фенотипа макрофагов, обладающего способностью усиливать продукцию провоспалительных антиопухолевых цитокинов в ответ на действие антивоспалительных проопухолевых медиаторов; 2) Отработка способов введения репрограммированных макрофагов и оценка антиопухолевого эффекта in vivo и in vitro на модели асцитной карциномы Эрлиха. 3) Разработка клеточной биотехнологии программирования реверсивного фенотипа макрофагов для ограничения опухолевого роста. 2. Основные результаты проекта - Завершены исследования по оценке роли NO в антиопухолевом действии макрофагов и формировании антиопухолевого М1 фенотипа. Проанализировано влияние асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на фенотип и секреторную NO-продуцирующую активность макрофагов и влияние асцитической жидкости и опухолевых клеток на фенотип и секреторную NO- продуцирующую активность макрофагов. Показано, что увеличение соотношения «опухолевые клетки/макрофаги» при АКЭ сопровождалось двух-кратным снижением концентрации нитритов в брюшной полости и угнетением способности макрофагов синтезировать NO, как в базальных условиях, так и в ответ на стимуляцию ЛПС. На терминальной стадии АКЭ базальная продукция NO макрофагами снижалась в 3 раза, а стимулированная - в 4 раза, по сравнению с контролем. Низкая продукция NO является маркером проопухолевого М2 фенотипа макрофагов. Результаты, также показали, что и асцитическая жидкость и клетки АКЭ существенно угнетают NO-продуцирующую активность макрофагов. Так под действием асцитической жидкости базальная продукция NO снижалась на 50%, а индуцированная - на 20%. При действии клеток АКЭ базальная продукция NO снижалась на 27%, а индуцированная - на 29%. - Проведены исследования по оценке содержания про- и антивоспалительных цитокинов в асцитической жидкости на разных стадиях развития опухоли. Результаты показали, что перитонеальная среда контрольных мышей С57/BL6J имеет существенно более выраженный провоспалительный сдвиг, по сравнению с мышами BALB/c. На lag-фазе АКЭ асцитическая жидкость мышей С57/BL6J имеет существенно более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c. При переходе с lag-фазы на log-фазу АКЭ происходит снижение содержания практически всех цитокинов, но при этом асцитическая жидкость мышей С57/BL6J сохраняет существенно более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c. При переходе с log-фазы АКЭ в терминальную происходит дальнейшее снижение провоспалительных цитокинов, но повышение большинства антивоспалительных цитокинов у обеих генетических линий, при этом межлинейные отличия между мышами С57/BL6J и BALB/c сохраняются и характеризуются тем, что асцитическая жидкость мышей С57/BL6J имеет более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c. - Проведены эксперименты по отработке процедуры формирования реверсного антиопухолевого М1 фенотипа макрофагов с обратной связью. Установлено, что при действии асцитической жидкости на макрофаги М1 фенотипа происходило снижение продукции большинства провоспалительных цитокинов. Это снижение отражает репрограммирующее проопухолевое действие асцитической жидкости и репрограммирование макрофагов на проопухолевый М2 фенотип. При действии асцитической жидкости на М1 макрофаги с заблокированным Stat3/6, напротив происходило увеличение продукции большинства провоспалительных цитокинов. Это увеличение означает, в результате блокирования Stat3/6 реакция М1 макрофагов на проопухолевую асцитическую жидкость изменилась на противоположную, а именно в ответ на М2 репрограммирующую асцитическую жидкость макрофаги вместо снижения продукции провоспалительных антиопухолевых цитокинов стали отвечать усилением провоспалительных антиопухолевых цитокинов. Феномен переключения фенотипа при блокировании Stat3/6 также проявляется и в отношении антивоспалительных цитокинов. При действии асцитической жидкости на макрофаги М1 фенотипа происходило увеличение продукции антивоспалительных цитокинов IL-5 и IL-10. Это увеличение согласуется с репрограммирующим проопухолевым действием асцитической жидкости и репрограммированием макрофагов на проопухолевый М2 фенотип. При действии асцитической жидкости на М1 макрофаги с заблокированным Stat3/6, антивоспалительных цитокинов. происходило значительное снижение продукции всех - Разработан лабораторный технологический регламент репрограммирования макрофагов с целью получения антиопухолевого М1 реверсного фенотипа макрофагов. В проекте будет использоваться комбинированная модель с использованием и пониженных концентраций сыворотки и добавления IFN-γ и ингибиторов факторов транскрипции Stat3/6 - Наработаны экспериментальные образцы репрограммированых макрофагов. - Разработан план исследований экспериментальных образцов репрограммированых макрофагов антиопухолевого М1 реверсного фенотипа. - Проведены эксперименты по отработке способов обратного введения репрограммированных макрофагов внутрибрюшинно. - Проведены эксперименты по оценке воспалительных реакций у нормальных мышей без опухоли на введение репрограммированных макрофагов с реверсивным фенотипом. Результаты показали, что у мышей Balb/c введение М1 макрофагов с фенотипом переключения не оказало достоверного влияния на локальный (перитонеальная полость) и системный воспалительный статус. У мышей C57/BL6J введение М1 макрофагов с фенотипом переключения не оказало достоверного влияния на общий системный воспалительный статус, но привело к достоверному увеличению локального воспаления в перитонеальной полости. - Проведены исследования по оценке терапевтического антиопухолевого эффекта репрограммированных макрофагов с реверсным М1 фенотипом (М3 фенотип). М3 фенотип макрофагов формировали in vitro с помощью усиления провоспалительных сигнальных путей с помощью ЛПС и удаления FBS, и одновременной блокады факторов транскрипции М2 фенотипа STAT3/6 (M3STAT3/6-фенотип), SMAD3 (M3SMAD3-фенотип) или STAT3/6 и SMAD3 (M3STAT3/6+SMAD3-фенотип). Показано, что М3 макрофаги останавливают деление клеток асцитной карциномы эрлиха (АКЭ) in vitro и в два раза увеличивают продолжительность жизни мышей с АКЭ. Антиопухолевое действие М3 макрофагов превосходит антиопухолевый эффект известного антиопухолевого препарата цисплатина и эффект М1 макрофагов как in vitro, так и in vivo. Антиопухолевый эффект М3 макрофагов обусловлен антипролиферативным действием и способностью репрограммировать опухолевое микроокружение с антивоспалительного в провоспалительное. - Проведены эксперименты по оптимизации новой биотехнологии с учетом полученных данных, с целью облегчения воспроизводимости и увеличения терапевтической эффективности. Показано, что 1. наибольшей антиопухолевой активностью обладает M3STAT3/6+SMAD3-фенотип макрофагов и 2. наибольшый антиопухолевый эффект M3STAT3/6+SMAD3 макрофагов можно получить при введении макрофагов на ранних стадиях (log- и lag-стадиях) развития АКЭ. - Проведена оценка эффективности полученных результатов в сравнении с современным научнотехническим уровнем. Проведенная оценка показала, что в исследованиях в других странах в антиопухолевых технологиях, основанных на макрофагах, используют М1 фенотип. Эффективность нашей технологии М3 фенотипа существенно превышает эффективность технологий, основанных на М1 макрофагах. - Разработан лабораторный технологический регламент применения репрограммированных макрофагов для ограничения роста экспериментальной опухоли Эрлиха. - Проведено обобщение и оценка результатов исследований. Показано, что полученные результаты обладают новизной, а разработанный лабораторный прототип биотехнологии репрограммирования М3 макрофагов являются весьма перспективным в плане трансляции в клиническую медицину. - Проведение дополнительных патентных исследований. По результатам патентных исследований поданы две заявки на патенты. - Разработан проект технического задания на проведение ПНИ по теме «Научное обоснование и использование клеточной биотехнологии программирования реверсивного фенотипа макрофагов для терапии рака предстательной железы у человека» с литературным обзором по теме. Выполнение этого ПНИ позволит перейти к клиническим испытаниям новой биотехнологии. - Разработаны учебно-методические пособия для медицинских ВУЗов «Экспериментальная опухоль Эрлиха» и «Репрограммирование макрофагов». Пособия могут быть использованы на курсах дополнительного образования и элективных курсах у студентов медиков. - Проведены мероприятия по информированию общественности о ходе и результатах выполнения ПНИ, включая публикацию статей в отечественных и зарубежных печатных изданиях, выступление с докладами на симпозиумах. Результаты работ представлены на 6 Международных конгрессах, опубликованы в 6 статьях. Материалы также размещены на сайте университета. - Подготовлены видеосюжет о новой технологии. - Проведено материально-техническое обеспечение работ в форме закумки приборов и реактивов, технического обслуживания сложных приборов и оплаты договоров ГПХ. - Достигнуты индикаторы и показатели результативности проекта в 2015 году. Индикатор 1. Опубликованы 6 статей в журналах, входящий в базу данных SCOPUS и Web of Science. 1. Калиш С.В., Буданова О.П., Лямина С.В., Малышев И.Ю. Генетические особенности систем генерации оксида азота предопределяют устойчивость организма к развитию карциномы. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2015, №1, с. 65-71. 2. Igor Malyshev and Yuri Malyshev, Current Concept and Update of the Macrophage Plasticity Concept: Intracellular Mechanisms of Reprogramming and M3 Macrophage “Switch” Phenotype, BioMed Research International Volume 2015 (2015), Article ID 341308, 1-22 pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/341308. 3. Sergey V. Kalish, Svetlana V. Lyamina, Elena A. Usanova, Eugenia B. Manukhina, Nikolai P. Larionov, Igor Y. Malyshev. Macrophages Reprogrammed In Vitro Towards the M1 Phenotype and Activated with LPS Extend Lifespan of Mice with Ehrlich Ascites Carcinoma Med Sci Monit Basic Res, 2015; 21: 226-234. DOI: 10.12659/MSMBR.895563. 4. Kalish S, Lyamina S, Chausova S, Kochetova L, Malyshev Y, Manukhina E, Malyshev I. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 2015 Oct 20;21:235-40. 5. Малышев И.Ю. Феномены и сигнальные механизмы репрограммирования макрофагов. Патологическая физиология и экспериментальная терапия», «рецензируется ВАК» т.59, №2 С.99111. 2015, ISSN посттрансляционные 0031-2991, и получена метаболические 06.04.2015. 6. механизмы Малышев И.Ю. Эпигенетческие, репрограммирования макрофагов. Патологическая физиология и экспериментальная терапия», «рецензируется ВАК» т.59, №3 С.118127. 2015, ISSN 0031-2991, получена 30.06.2015. Таким образом индикатор 1 перевыполнен. Индикатор 2: Число патентных заявок, поданных по результатам исследований и разработок, не менее 2. Подано 2 заявки на патенты. Таким образом индикатор 2 выполнен. Индикатор 3: Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности исследователей - участников проекта составила – 66,7%. Таким образом индикатор 3 выполнен полностью. Индикатор 4: Объем привлеченных внебюджетных средств составил 2 млн. руб. Из них 0.5 млн. руб от Индустриального партнера и 1.5 млн. руб. от МГМСУ. Таким образом индикатор 4 выполнен полностью. Показатель 1: Средний возраст исследователей – участников проекта составил - 34,4, Таким образом Показатель 1 выполнен полностью. Показатель 2: «Количество мероприятий по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта организация исполнитель проекта, не менее» (конференции, семинары, симпозиумы, выставки и т.п., в том числе, международные). Исполнители приняли участие в 6-и мероприятиях по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта организация - исполнитель проекта. 1) Основные характеристики полученных результатов (в целом и/или отдельных элементов), созданной научной (научно- технической, инновационной) продукции. Результаты, полученные в 2015 году при оценке роли NO в антиопухолевом действии макрофагов и формировании антиопухолевого М1 фенотипа, имеют следующие характеристики: · АКЭ сдвигает фенотип макрофагов мышей в сторону проопухолевого М2 фенотипа. · Снижение концентрации нитритов в асците при развитии АКЭ отражает снижение NOпродуцирующей активности М2 фенотипа макрофагов. · Растворимые в асците, мышей с опухолью, факторы и факторы, продуцируемые клетками АКЭ вносят вклад в репрограммирование макрофагов на М2 фенотип и снижение NOпродуцирующей активности макрофагов. Результаты полученные при оценке содержания про- и антивоспалительных цитокинов в асцитической жидкости мышей на разных стадиях развития опухоли имеют следующие характеристики. Динамика цитокинов в асцитической жидкости мышей с опухолью отражает реакцию иммунитета на появление опухоли и имеет четкий 3-х стадийный характер: 1. первоначальная активация антиопухолевого иммунного ответа, 2. снижение активности иммунных клеток и антиопухолевого иммунитета и 3. существенная трансформацию фенотипа иммунных клеток, и прежде всего макрофагов в проопухолевый М2 фенотип. Результаты полученные при отработке процедуры формирования реверсного антиопухолевого М1 фенотипа макрофагов с обратной связью характеризуются следующими положениями: · Реакции макрофагов с заблокированным Stat3/6 на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость меняется с угнетения на увеличение продукции провоспалительных цитокинов, что отражает формирование фенотипа переключения (М2/М1). · Реакции макрофагов с заблокированным Stat3/6 на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость меняется с увеличения некоторых на угнетение продукции всех антивоспалительных цитокинов, что подтверждает формирование фенотипа переключения (М2/М1). · Альтернативное изменение репрограммирования макрофагов с заблокированным Stat3/6 на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость с формирования М2 фенотипа на формирование М1 фенотип доказывает, что с помощью блокирования Stat3/6 удалось сформировать у макрофагов фенотип переключения (М2/М1). Результаты полученные при оценке воспаления у мышей после введения М1 макрофагов с фенотипом переключения показали отсутствие существенного влияния инъекции М1 макрофагов с фенотипом переключения на системное воспаление как у мышей Balb/c, так и C57/BL6J. При оценке влияния инъекции макрофагов на локальное воспаление в перитонеальной полости выявились генетические отличия: у Balb/c изменения в общем воспалительном статусе были недостоверны, а у C57/BL6J локальное воспаление достоверно увеличилось. Результаты полученные при оценке терапевтического антиопухолевого эффекта репрограммированных макрофагов с реверсным М1 фенотипом (М3 фенотип) показали, что 1. M3 макрофаги проявляют прямой антиопухолевый эффект in vitro, который превосходит эффект цисплатина и М1 макрофагов, 2. Антиопухолевый эффект M3STAT3/6 макрофагов обусловлен антипролиферативным, а не цитотоксическим действием, 3. Антиопухолевый эффект M3STAT3/6 макрофагов сопровождается провоспалительным репрограммированием опухолевого микроокружения, 4. M3STAT3/6+SMAD макрофаги обладают более выраженным антиопухолевым эффектом in vitro, чем M3STAT3/6 и M3SMAD макрофаги, 5. M3SMAD3 и M3STAT3/6+SMAD3, также как и M3STAT3/6 макрофаги, репрограммируют опухолевое цитокиновое микроокружение с антивоспалительного на провоспалительное и 6. M3STAT3/6+SMAD макрофаги проявляют антиопухолевый эффект in vivo, который превосходит антиопухолевый эффект цисплатина и M1 макрофагов. Эксперименты по оптимизации новой биотехнологии с учетом полученных данных, с целью облегчения воспроизводимости, снижения побочных эффектов увеличения терапевтической эффективности показали, что наиболее оптимальной схемой введения М3 макрофагов с целью ограничения опухолевого роста является схема 1, когда М3STAT3/6+SMAD макрофаги вводили внутрибрющинно на 1, 3, 5 и 7 день после введения клеток АКЭ, то есть на начальных log и lag стадиях развития АКЭ, по сравнению со схемой 2, когда макрофаги вводили внутрибрющинно на 3, 7, 11 и 13 день после введения клеток АКЭ или схемой 3, когда макрофаги вводили внутрибрющинно на 7, 9, 11 и 13 день после введения клеток АКЭ. Оценка эффективности полученных результатов в сравнении с современным научнотехническим уровнем показала, что с помощью активации М1-репрограммирующих путей с одновременным блокированием факторов транскрипции М2 фенотипа STAT3, STAT6 и SMAD3 можно программировать М3 фенотип переключения. М3 фенотип, в отличие от М1 фенотипа, на действие проопухолевых факторов (антивоспалительные цитокины, выделяемые опухолью), не только не перепрограммируется на проопухолевый М2 фенотип, но напротив, в опухолевом микроокружении еще больше продуцирует антиопухолевые провоспалительные цитокины. Мы показали, что М3 фенотип макрофагов, обладает прямым антиопухолевым антипролиферативным эффектом. Этот эффект М3 макрофагов был существенно превосходит эффекты М1 макрофагов и противоопухолевого лекарства цисплатина. М3 макрофаги практически полностью подавили деление опухолевых клеток. 2) Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявших методик и решений. Впервые теоретически обоснована целесообразность разработки и использования комбинированной модели репрограммирования на М1 фенотип на стадии создания реверсного фенотипа, с тем чтобы создать больше предпосылок для формирования реверсного фенотипа, когда будут блокироваться факторы транскрипции М2-зависимых путей. Целесообразность связана с тем, что добавление цитокина IFN-γ (цитокиновая модель) к пониженным концентрациям сыворотки (сывороточная модель) во время репрограммирования приведет к активации IFN-γ-зависимого сигнального пути и увеличит экспрессию ингибиторного SMAD7 (пониженные концентрации сыворотки таким эффектом не обладают). SMAD7 препятствует фосфорилированию SMAD2/3. Таким образом, накопление SMAD7 на этапе репрограммирования на М1 фенотип будет способствовать ингибированию TGF-β/SMAD-(М2-) зависимого сигнального пути. Целесообразность использования пониженных концентраций сыворотки (сывороточная модель) в комбинированной модели репрограммирования связана с тем, что в сыворотке содержится TGF-β и его удаление (вместе с сывороткой) облегчит не только формирование М1 фенотипа, но и будет способствовать более эффективному блокированию TGF-β/SMAD-(М2) зависимого сигнального пути с помощью SMAD7. Ингибирование SMAD-(М2)-зависимого пути приведет к тому что сигнал от М2 цитокина TGF-β будет передаваться на SMAD-независимый (М1) путь, способствуя формированию фенотипа переключения М2/М1. Дополнительно в репрограммирующий коктейль добавляется ингибиторы факторов транскрипции М2 фенотипа Stat 3/6. Целесообразность введения этих ингибиторов связан с тем, что Stat опосредует репрограммирующее действие на М2 фенотип многих цитокинов, которые выделяет опухоль, таких как IL-4, IL-10 и IL-13. Ингибирование Stat3/6-(М2)-зависимых путей приведет к тому, что сигналы от М2 цитокинов будут передаваться на Tyk2/STAT1-зависимый (М1) путь, способствуя формированию фенотипа переключения М2/М1. Кроме того, блокирование Stat3/6 приведет к снижению активности SOCS1, который блокирует фактор транскрипции М1 фенотипа Stat1. Это также будет способствовать формированию фенотипа переключения М2/М1. Впервые экспериментально проверена возможность репрограммирования макрофагов на фенотип переключения М2/М1. Проведенный анализ параметров фенотипа макрофагов: секреторная активность по оценке продукции NO, цитокинов, а также поверхностно-клеточные CD маркеры позволяет рассматривать нашу комбинированную модель, сочетающую удаление FBS, добавление IFN-g и ингибиторов Stat3/6 при культивировании макрофагов, как хорошую модель репрограммирования макрофагов in vitro на провоспалительный фенотип переключения (М2/М1). Представленные данные подтвердили нашу гипотезу о том, что с помощью комбинированной модели, сочетающей удаление FBS, добавление IFN-g и ингибиторов факторов транскрипции, можно целенаправленно репрограммировать макрофаги на провоспалительный фенотип переключения. Это имеет исключительно важное значение для ПНИ в целом, поскольку разработка биотехнологии репрограммирования такого фенотипа является необходимым условием для выполнения проекта в целом. На третьем этапе было оценено антиопухолевое действие макрофагов с фенотипом переключения на модели асцитной карциномы Эрлиха. Впервые было показано, что М3 макрофаги обладают прямым антипролиферативный антиопухолевым действием, в основе которого может лежать способность этого фенотипа макрофагов репрограммировать опухолевое микроокружение с антивоспалительного на провоспалительное. 3) Подтверждение соответствия полученных результатов требованиям к выполняемому проекту. Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту. 4) Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень. Оценка получаемых результатов показала мировой уровень и потенциально высокую конкурентноспособность разрабатываемой в проекте технологии. 3. Охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности (РИД), полученные в рамках прикладного научного исследования и экспериментальной разработки В 2014 году проведены патентные исследования. На 2 этапе 2015 проводилось оформление заявок. На 3 этапе проекта в 2015 году были поданы 2 заявки: 1) Изобретение, заявка №2015147551 от 06.11.2015, "Способ подавления роста опухоли в эксперименте", РФ 2) Изобретение, заявка №2015147552 от 06.11.2015, "Способ подавления роста опухоли на основе IN VITRO репрограммирования макрофагов на М1 фенотип с повышенной способностью к продукции оксида азота в эксперименте", РФ 4. Назначение и область применения результатов проекта. Результаты могут быть использованы в области медицинских биотехнологий лечения рака, а также в образовательном процессе студентов-медиков. 5. Эффекты от внедрения результатов проекта Описание ожидаемых социально-экономических и др. эффектов от использования товаров и услуг, созданных на основе полученных результатов (повышение производительности труда, снижение материало- и энергоёмкости производства, уменьшение отрицательного техногенного воздействия на окружающую среду, снижение риска смертности, повышение качества жизни и т.п.), а также описание практического внедрения полученных результатов или перспектив их использования, оценка или прогноз влияния полученных результатов на развитие научнотехнических и технологических направлений; разработка новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сфере, а также оценка или прогноз влияния полученных результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечении развития материально-технической и информационной инфраструктуры будет возможным описать после проведения доклинических испытаний новой технологии М3 фенотипа макрофагов. Предварительные оценки дают возможность полагать, что эта технология является весьма перспективной. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.
