Апоптоз

LOGO
Санкт-Петербургская государственная
химико-фармацевтическая академия,
Институт эволюционной физиологии
и биохимии им. И.М.Сеченова,
Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии
им. В.А. Алмазова
Предпосылка новой технологии
клеточной терапии поврежденных
органов и тканей
А.И. Тюкавин, Г.Б. Белостоцкая, M.М. Галагудза , Е.А.
Захаров, Т.А. Голованова, Н.В. Буркова, Д.Ю. Ивкин,
А.А. Карпов
Санкт-Петербург
2012
Актуальность
• Результаты традиционной клеточной терапии сократительной
дисфункции миокарда при сердечной недостаточности после инфаркта
миокарда неоднозначные, а ее эффективность и безопасность в
клинике не подтверждается методами доказательной медицины.
• Это свидетельствует о необходимости разработки новой стратегии
клеточной терапии, основанной на знании фундаментальных
физиологических механизмов миграции стволовых клеток, а также их
пролиферации и дифференцировки в органах и тканях.
• Ключевым механизмом поддержания постоянства и идентичности
клеточной среды организма является программированная гибель –
апоптоз. Апоптоз (в отличие от некроза) вызывает каскад реакций,
которые стимулируют пролиферацию клеток, находящихся на
различной стадии дифференцировки.
Природа гипотезы
Установлено, что апоптозные тела
эндотелиоцитов оказывают
дозозависимую стимуляцию
пролиферации эндотелиальных
прогениторных клеток
(Hristov et al., 2004)
Апоптоз кардиомиоцитов
Апоптозные тела
Оригинальная гипотеза: продукты апоптоза являются
универсальными физиологическими «манками» для
мезенхимальных стволовых клеток, циркулирующих в
крови, а также они активируют пролиферацию и
дифференцировку прогениторных клеток в органах и
тканях.
Цель исследования
Проверка гипотезы, согласно которой продукты
апоптоза служат универсальным физиологическим
стимулом целевой миграции стволовых клеток из
крови в кожу, а также они активируют пролиферацию
и дифференцировку резидентных предшественников
кардиомиоцитов.
Методика инициации
апоптоза ex vivo
 Апоптоз и некроз клеток вызывали импульсными
воздействиями лазеров на александрите (755 нм)
фирмы “Candela”.
 Дозы лазерного излучения, инициирующие апоптоз
или некроз клеток в диапазоне от 6 до 10 Дж/см2,
определяли в культуре фибробластов эмбриона
лёгкого человека (Институт Цитологии РАН).
Соотношение апоптоза и
некроза фибробластов
до и после облучения
Александрит (755 нм)
Апоптоз, %
Некроз, %
Доза
импульса,
Дж/см2
До
облучения
Опыт
До
облучения
Опыт
6,0
6,8 ± 1,2
28,0 ± 2,0
**
3,1 ± 0,5
4,5 ± 0,5
8,0
6,8 ± 1,2
14,7 ± 1,0
**
3,1 ± 0,5
3,6 ± 0,5
10,0
6,8 ± 1,2
13,0 ± 2,0
*
3,1 ± 0,5
5,6 ± 1,0
*
Примечание: * – достоверность различий между значениями до облучения и опытом (р
< 0,05); ** – р<0,01; % клеток с апоптозом и некрозом – до и после облучения, n = 10.
Методика стимуляции миграции
СК инициированием апоптоза
Мезенхимальные
стволовые
клетки
GFP-позитивные
мыши линии
C57BL/6 (дар
Окландского
детского
госпиталя, США)
Лазер (6 Дж/cм2)
Введение клеток в
яремную вену
24 h
Конфокальная
микроскопия
(Институт
цитологии РАН,
проф. В.М. Михайлов)
Микропрепарат (контроль), x10
Микропрепарат
( 6 Дж/см2), x10
Микропрепарат
( 6 Дж/см2), x40
Влияние апоптозных тел на
пролиферацию и дифференцировку
кардиомиоцитов в культуре
 В первичной культуре клеток миокарда новорожденных
крыс была разработана модель кардиомиогенеза, от
незрелого предшественника до сокращающихся колоний
клеток и гибели кардиомиоцитов, включая апоптоз (Г.Б.
Белостоцкая, Т.А. Голованова, ИЭФБ РАН).
 Модельная культура инкубировалась на протяжении 3
суток в присутствии апоптозных тел, полученных в культуре
миокарда крыс линии Wistar (Е.А.Захаров, ФЦСКЭ им. В.А.
Алмазова).
Колонии, сформированные в
контроле и после 3-х суток
действия апоптозных тел
Контроль
Апоптозные тела
10-й день культивирования (х40)
Сокращение колонии на 25-й день
культивирования
25-й день культивирования без
апоптозных тел - 46 сокр./мин
25-й день культивирования с
апоптозными телами - 99 сокр./мин
Цифровая камера Leica DFC300 FX, (х40)
Динамика внутрижелудочкового
давления изолированного сердца
крысы линии Wistar
Перевязка левой
коронарной артерии
Введение апоптозных тел или
культуральной жидкости
28 days
LV давление
7 days
Тотальная ишемия миокарда (30-мин)
Перфузия сердца по
Langendorff
Предварительная оценка влияния
продуктов апоптоза на миграцию,
пролиферацию и дифференцировку
СК в тканях

Продукты апоптоза являются универсальными физиологическими
«манками» для мезенхимальных стволовых клеток, циркулирующих в
крови, а также они активируют пролиферацию и дифференцировку
резидентных предшественников зрелых клеток в органах и тканях.

На этой основе могут быть разработаны методы целевой миграции
мезенхимальных стволовых клеток, а также технологии
фармакологической активации пролиферации и дифференцировки
клеток-предшественников стволовых клеток в органах и тканях.

Расшифровка молекулярно-биологических характеристик тканевых
«манков» и активаторов стволовых клеток открывает перспективу
получения инновационных лекарственных препаратов – имитаторов
апоптоза, направленных на восстановление целостности органов и
тканей при различных видах патологии.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 11-04-00993а)
LOGO