МЕТОДИКИ ПО САНИТАРНОіВИРУСОЛОГИЧЕСКОМУ
реклама
ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ ÌÅÒÎÄÈ×ÅÑÊÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ ÑÎÃËÀÑÎÂÀÍÎ Íà÷àëüíèê îòäåëà íàóêè è âíåäðåíèÿ Í.È. Äîñòà ÓÒÂÅÐÆÄÀÞ Çàìåñòèòåëü ìèíèñòðà çäðàâîîõðàíåíèÿ Â.Ï. Ôèëîíîâ 18 ìàÿ 1999 ã. Ðåãèñòðàöèîííûé ¹ 136-9811 18 ìàÿ 1999 ã. ÌÅÒÎÄÈÊÈ ÏÎ ÑÀÍÈÒÀÐÍÎ-ÂÈÐÓÑÎËÎÃÈ×ÅÑÊÎÌÓ ÊÎÍÒÐÎËÞ ÏÈÒÜÅÂÎÉ ÂÎÄÛ È ÎÖÅÍÊÅ ÅÅ ÝÏÈÄÅÌÈ×ÅÑÊÎÉ ÁÅÇÎÏÀÑÍÎÑÒÈ (ÄËß ÑÈÑÒÅÌÛ ÖÅÍÒÐÀËÈÇÎÂÀÍÍÎÃÎ ÕÎÇßÉÑÒÂÅÍÍÎ-ÏÈÒÜÅÂÎÃÎ ÂÎÄÎÑÍÀÁÆÅÍÈß) Ìèíñê 1999 Îñíîâíîå ó÷ðåæäåíèå-ðàçðàáîò÷èê: Áåëîðóññêèé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò ýïèäåìèîëîãèè è ìèêðîáèîëîãèè Ó÷ðåæäåíèå-ñîèñïîëíèòåëü: Áåëîðóññêèé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé ñàíèòàðíî-ãèãèåíè÷åñêèé èíñòèòóò Àâòîðû: Ò.Â. Àìâðîñüåâà, Ñ.Â. Îðëîâà, Î.Â. Äüÿêîíîâà, Ç.Á. Êâà÷åâà, Ð.Ì. Øàðêî, Â.Ô. Åðåìèí, Ç.Ô. Áîãóø, Î.Í. Êàçèíåö, Ò.À. Ñòåëüìàõ, Ï.À. Àìâðîñüåâ Ðåöåíçåíòû: Ñ.Ã. Ïîçèí, Ñ.Ô. Êðåòîâà  ìåòîäèêàõ îáîáùåí îïûò ðàáîòû ñîòðóäíèêîâ ÁåëÍÈÈÝÌ è ÁåëÍÈÑÃÈ. Îïèñàíû îðãàíèçàöèÿ è ïîðÿäîê îñóùåñòâëåíèÿ ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîãî êîíòðîëÿ êà÷åñòâà âîäû, ìåòîäû óëàâëèâàíèÿ âèðóñîâ èç âîäû è èõ êîíöåíòðèðîâàíèå. Ñ ó÷åòîì ðåêîìåíäàöèé ÂÎÇ äàíû ìåòîäû âûäåëåíèÿ è èäåíòèôèêàöèè ýíòåðîâèðóñîâ. Ïðåäíàçíà÷åíû äëÿ ñïåöèàëèñòîâ ÍÈÈ, ñàíýïèäñëóæáû, à òàêæå ñïåöèàëèñòîâ ïðåäïðèÿòèé ñèñòåìû öåíòðàëèçîâàííîãî õîçÿéñòâåííî-ïèòüåâîãî âîäîñíàáæåíèÿ: âèðóñîëîãîâ, áàêòåðèîëîãîâ, ñàíèòàðíûõ âðà÷åé, ýïèäåìèîëîãîâ. Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè óòâåðæäåíû Ìèíèñòåðñòâîì çäðàâîîõðàíåíèÿ Ðåñïóáëèêè Áåëàðóñü â êà÷åñòâå îôèöèàëüíîãî äîêóìåíòà. ÑÏÈÑÎÊ ÑÎÊÐÀÙÅÍÈÉ ÁÎÅ áëÿøêîîáðàçóþùàÿ åäèíèöà ÂÃÀ âèðóñ ãåïàòèòà À ÈÔÀ èììóíîôåðìåíòíûé àíàëèç ÌÅÌ ìèíèìàëüíàÿ ñðåäà Èãëà ÍÌÔÀ íåïðÿìîé ìåòîä ôëóîðåñöèðóþùèõ àíòèòåë ÏÝ× êëåòêè ïî÷êè ýìáðèîíà ÷åëîâåêà ÐÍ ðåàêöèÿ íåéòðàëèçàöèè ÐÒ-ÏÖÐ ïîëèìåðàçíàÿ öåïíàÿ ðåàêöèÿ ñî ñòàäèåé îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè ÒÖÄ 50/ìë òêàíåâàÿ öèòîïàòè÷åñêàÿ äîçà âèðóñà, âûçûâàþùàÿ ÖÏÝ â 50% çàðàæåííûõ êëåòî÷íûõ êóëüòóð ÔÈÒÖ ôëóîðåñöåèíèçîòèîöèîíàò ÔÝ× ôèáðîáëàñòû ýìáðèîíà ÷åëîâåêà ÖÏÀ öèòîïàòè÷åñêèé àãåíò ÖÏÝ öèòîïàòè÷åñêèé ýôôåêò BGM êëåòêè ïî÷êè àôðèêàíñêîé çåëåíîé ìàðòûøêè Hep-2 êëåòêè êàðöèíîìû ãîðòàíè ÷åëîâåêà FL êëåòêè àìíèîíà ÷åëîâåêà RD êëåòêè ðàáäîìèîñàðêîìû ÷åëîâåêà Vero êëåòêè ïî÷êè çåëåíîé ìàðòûøêè ! ÂÂÅÄÅÍÈÅ Â ñâÿçè ñ óñèëèâàþùåéñÿ â ïîñëåäíèå äåñÿòèëåòèÿ àíòðîïîãåííîé è òåõíîãåííîé íàãðóçêîé íà îáúåêòû îêðóæàþùåé ñðåäû ïðîáëåìà çàãðÿçíåíèÿ âîäû ïàòîãåííûìè âèðóñàìè ñòàíîâèòñÿ âñå áîëåå àêòóàëüíîé. Ðàñïðîñòðàíÿåìûå ñ âîäîé âèðóñíûå èíôåêöèè ïðîäîëæàþò îñòàâàòüñÿ îäíîé èç îñíîâíûõ ïðè÷èí ðîñòà êèøå÷íûõ è ðÿäà ñîìàòè÷åñêèõ çàáîëåâàíèé ÷åëîâåêà. Ñðåäè íèõ íàèáîëüøóþ ñîöèàëüíóþ çíà÷èìîñòü èìåþò âèðóñíûå ãåïàòèòû (À, Å), ìåíèíãèòû, ðîòàâèðóñíàÿ èíôåêöèÿ, çàáîëåâàíèÿ ñåðäöà (ìèî-, ïåðèêàðäèò, äèëàòàöèîííàÿ êàðäèîìèîïàòèÿ), ãàñòðîýíòåðîêîëèòû ïå÷åíè (íåêðîòè÷åñêèé ãåïàòèò), ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû (äèàáåò) è äð. Ê òàê íàçûâàåìûì «âîäíûì âèðóñàì», íàèáîëåå ÷àñòî îáíàðóæèâàåìûì â âîäå, îòíîñÿòñÿ: ýíòåðîâèðóñû (âèðóñû ÅÑÍÎ, Êîêñàêè À è Â, âèðóñû ïîëèîìèåëèòà), âèðóñû ãåïàòèòà À è Å, àäåíî-, ðåî-, êîðîíà-, ðåòðîâèðóñû.  îñíîâå ïðîôèëàêòèêè âûçûâàåìûõ äàííûìè âîçáóäèòåëÿìè âèðóñíûõ èíôåêöèé ëåæèò ðàçðàáîòêà ýôôåêòèâíîé ñèñòåìû ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîãî êîíòðîëÿ êà÷åñòâà âîäû, à òàêæå ñîâåðøåíñòâîâàíèå êðèòåðèåâ îöåíêè åå ýïèäåìè÷åñêîé áåçîïàñíîñòè. Äàííîé ïðîáëåìå ïîñâÿùåíû íàñòîÿùèå ìåòîäèêè, êîòîðûå ïðåäíàçíà÷åíû äëÿ îðãàíèçàöèé, ïðåäïðèÿòèé è èíûõ õîçÿéñòâåííûõ ñóáúåêòîâ, íåçàâèñèìî îò ïîä÷èíåííîñòè è ôîðì ñîáñòâåííîñòè, ýêñïëóàòèðóþùèõ ñèñòåìû öåíòðàëèçîâàííîãî õîçÿéñòâåííî-ïèòüåâîãî âîäîñíàáæåíèÿ, à òàêæå îðãàíîâ è ó÷ðåæäåíèé ñàíèòàðíîýïèäåìèîëîãè÷åñêîé ñëóæáû, îñóùåñòâëÿþùèõ ãîñóäàðñòâåííûé è âåäîìñòâåííûé ñàíèòàðíûé íàäçîð. Ðàçðàáîòêà è óòâåðæäåíèå äàííûõ ìåòîäèê îáóñëîâëåíû íåîáõîäèìîñòüþ ïðèâåäåíèÿ ìåòîäè÷åñêèõ äîêóìåíòîâ Ðåñïóáëèêè Áåëàðóñü â ñîîòâåòñòâèå ñ ðåêîìåíäàöèÿìè Âñåìèðíîé îðãàíèçàöèè çäðàâîîõðàíåíèÿ (ÂÎÇ) è íîâûìè íàó÷íûìè çíàíèÿìè î âëèÿíèè ïèòüåâîé âîäû íà ýïèäåìè÷åñêîå áëàãîïîëó÷èå íàñåëåíèÿ, à òàêæå ïðèìåíåíèåì òåõíîëîãèé âîäîî÷èñòêè, ÷àñòî íå îòâå÷àþùèõ óðîâíþ çàãðÿçíåíèÿ âîäîèñòî÷íèêîâ. 1. ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈß È ÏÎÐßÄÎÊ ÎÑÓÙÅÑÒÂËÅÍÈß ÑÀÍÈÒÀÐÍÎ-ÂÈÐÓÑÎËÎÃÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÊÎÍÒÐÎËß ÊÀ×ÅÑÒÂÀ ÂÎÄÛ Êîíòðîëü êà÷åñòâà ïèòüåâîé âîäû ïðåäóñìàòðèâàåò åå ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîå èññëåäîâàíèå íà äâóõ óðîâíÿõ: âîäîèñòî÷íèêîâ (ïîâåðõíîñòíûõ, ïîäçåìíûõ) è ðàñïðåäåëèòåëüíîé ñåòè. 1.1. Âèäû êîíòðîëÿ Ðàçëè÷àþò 4 âèäà ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîãî êîíòðîëÿ: 1) òåêóùèé; 2) â ïåðèîä «ðèñêà»; 3) ýêñòðåííûé; 4) ïî ñàíèòàðíî-ýïèäåìèîëîãè÷åñêèì ïîêàçàíèÿì. Òåêóùèé êîíòðîëü îñóùåñòâëÿåòñÿ ïëàíîâî (â òå÷åíèå ãîäà) â ñîîòâåòñòâèè ñ ðàçðàáîòàííîé ðåãèîíàëüíîé ðàáî÷åé ïðîãðàììîé äëÿ êîíêðåòíîé òåððèòîðèè (ãîðîäà, íàñåëåííîãî ïóíêòà). Ðàáî÷àÿ ïðîãðàììà äîëæíà ñîäåðæàòü: " − ïåðå÷åíü êîíòðîëèðóåìûõ ïîêàçàòåëåé; − ïåðå÷åíü ïðèìåíÿåìûõ äëÿ èññëåäîâàíèé ìåòîäèê; − ïëàí ïóíêòîâ (òî÷åê) îòáîðà ïðîá âîäû â ìåñòàõ âîäîçàáîðà ïåðåä ïîäà÷åé â ðàñïðåäåëèòåëüíóþ ñåòü è â ìåñòàõ âîäîðàçáîðà â ðàñïðåäåëèòåëüíîé ñåòè âîäîïðîâîäà; − êîëè÷åñòâî êîíòðîëèðóåìûõ ïðîá âîäû è ïåðèîäè÷íîñòü èõ îòáîðà; − êàëåíäàðíûå ãðàôèêè îòáîðà ïðîá âîäû è ïðîâåäåíèÿ èõ èññëåäîâàíèé. Ðàáî÷àÿ ïðîãðàììà, ðàçðàáîòàííàÿ öåíòðîì ãèãèåíû è ýïèäåìèîëîãèè (ÖÃÝ), óòâåðæäàåòñÿ ãëàâíûì ãîñóäàðñòâåííûì ñàíèòàðíûì âðà÷îì ÖÃÝ íà ñðîê íå áîëåå 1 ãîäà.  íåé äîëæåí áûòü îïðåäåëåí ïîðÿäîê ïåðåäà÷è èíôîðìàöèè îðãàíó ìåñòíîãî ñàìîóïðàâëåíèÿ. Ðàáî÷àÿ ïðîãðàììà, ðàçðàáîòàííàÿ âåäîìñòâåííûìè ëàáîðàòîðèÿìè âîäîêàíàëîâ (ïðè îñóùåñòâëåíèè ïðîèçâîäñòâåííîãî êîíòðîëÿ), à òàêæå âñå èçìåíåíèÿ è äîïîëíåíèÿ â íåé äîëæíû ñîãëàñîâûâàòüñÿ ñ òåððèòîðèàëüíûìè ÖÃÝ, à ïîëó÷åííàÿ èíôîðìàöèÿ íàïðàâëÿòüñÿ â ÖÃÝ è îðãàíû ìåñòíîãî ñàìîóïðàâëåíèÿ. Ïðîèçâîäñòâåííûé êîíòðîëü êà÷åñòâà ïèòüåâîé âîäû ïî âèðóñîëîãè÷åñêèì ïîêàçàòåëÿì ìîæåò îñóùåñòâëÿòüñÿ òàêæå ïî äîãîâîðó ñî ñïåöèàëèçèðîâàííûìè ëàáîðàòîðèÿìè ÍÈÈ è ñàíèòàðíîé ñëóæáû. Êîíòðîëü â ïåðèîä «ðèñêà» ïðåäóñìàòðèâàåò ïðîâåäåíèå ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé â âåñåííå-ëåòíå-îñåííåå âðåìÿ IIIIÕ ìåñÿöû êàæäîãî ãîäà, êîòîðûå ÿâëÿþòñÿ íàèáîëåå óÿçâèìûìè â ïëàíå âèðóñíîãî çàãðÿçíåíèÿ âîäû. Ýêñòðåííûé êîíòðîëü ïðåäóñìàòðèâàåò îñóùåñòâëåíèå èññëåäîâàíèé â ñëó÷àå êàêèõ-ëèáî âíåçàïíûõ íàðóøåíèé èëè àâàðèé â ñèñòåìå âîäîñíàáæåíèÿ, â ðåçóëüòàòå êîòîðûõ ìîæåò ïðîèçîéòè ìèêðîáíîå çàãðÿçíåíèå âîäîïðîâîäíîé âîäû â ðàñïðåäåëèòåëüíîé ñåòè. Êîíòðîëü ïî ñàíèòàðíî-ýïèäåìèîëîãè÷åñêèì ïîêàçàíèÿì îñóùåñòâëÿåòñÿ â ñëó÷àå ïîäúåìà çàáîëåâàåìîñòè íàñåëåíèÿ êèøå÷íûìè âèðóñíûìè èíôåêöèÿìè, óðîâåíü êîòîðîé ïðåâûøàåò ñðåäíèå ñåçîííûå ïîêàçàòåëè, à òàêæå ïðè âñïûøêå èëè ýïèäåìèè âîäíîãî ïðîèñõîæäåíèÿ. Ýêñòðåííûé êîíòðîëü è êîíòðîëü ïî ñàíèòàðíî-ýïèäåìèîëîãè÷åñêèì ïîêàçàíèÿì îñóùåñòâëÿþòñÿ ïî ñîãëàñîâàíèþ çàèíòåðåñîâàííûõ ñïåöèàëèñòîâ (ýïèäåìèîëîãà, ñàíèòàðíîãî âðà÷à, áàêòåðèîëîãà, âèðóñîëîãà) è ïðåäóñìàòðèâàþò áîëåå ÷àñòûå èññëåäîâàíèÿ ïî ñðàâíåíèþ ñ óñòàíîâëåííûìè â ïðîãðàììå òåêóùåãî êîíòðîëÿ. 1.2. Âèðóñîëîãè÷åñêèå ïîêàçàòåëè êà÷åñòâà ïèòüåâîé âîäû Ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêèé êîíòðîëü êà÷åñòâà ïèòüåâîé âîäû ïðåäóñìàòðèâàåò èññëåäîâàíèÿ ïî äâóì ïîêàçàòåëÿì: − íàëè÷èå èëè îòñóòñòâèå êîëèôàãîâ â 100 ìë âîäû (ÁÎÅ); − íàëè÷èå èëè îòñóòñòâèå èíôåêöèîííûõ ýíòåðîâèðóñîâ (âèðóñîâ ïîëèîìèåëèòà, ÅÑÍÎ, Êîêñàêè À è Â) â 1000 ë âîäû (ÒÖÄ50/ìë). Îñíîâíûì êîíòðîëèðóåìûì ïîêàçàòåëåì ÿâëÿþòñÿ êîëèôàãè, êîòîðûå â ñîîòâåòñòâèè ñ ðàáî÷åé ïðîãðàììîé îïðåäåëÿþòñÿ êàê â âîäîèñòî÷íèêàõ, òàê è â âîäå ðàñïðåäåëèòåëüíîé ñåòè. # Ïðè îáíàðóæåíèè â ïðîáå (100 ìë) ïèòüåâîé âîäû êîëèôàãîâ ïðîâîäèòñÿ èõ îïðåäåëåíèå â ïîâòîðíî âçÿòîé â ýêñòðåííîì ïîðÿäêå ïðîáå (â òå÷åíèå ñóòîê). Ïðè îáíàðóæåíèè êîëèôàãîâ â ïîâòîðíî âçÿòîé ïðîáå âîäû ïðîâîäÿòñÿ èññëåäîâàíèÿ íà ýíòåðîâèðóñû. 2. ÎÖÅÍÊÀ ÝÏÈÄÅÌÈ×ÅÑÊÎÉ ÁÅÇÎÏÀÑÍÎÑÒÈ ÏÈÒÜÅÂÎÉ ÂÎÄÛ Ïèòüåâàÿ âîäà äîëæíà áûòü áåçîïàñíà â ýïèäåìè÷åñêîì îòíîøåíèè. Êðèòåðèåì ýïèäåìè÷åñêîé áåçîïàñíîñòè ïèòüåâîé âîäû ÿâëÿåòñÿ îòñóòñòâèå èçìåíåíèé â ñîñòîÿíèè çäîðîâüÿ íàñåëåíèÿ, îáóñëîâëåííûõ, íàðÿäó ñ äðóãèìè ìèêðîáèîëîãè÷åñêèìè ôàêòîðàìè, âîçáóäèòåëÿìè âèðóñíûõ èíôåêöèé, ïåðåäàþùèõñÿ âîäíûì ïóòåì. Îñíîâíûì ïðèíöèïîì ðåãëàìåíòèðîâàíèÿ âèðóñíîãî çàãðÿçíåíèÿ âîäû íà íàñòîÿùåì ýòàïå ðàçâèòèÿ ãèãèåíû, âèðóñîëîãèè è ýïèäåìèîëîãèè ÿâëÿåòñÿ îòñóòñòâèå âîçáóäèòåëåé âèðóñíûõ èíôåêöèé â îïðåäåëåííîì îáúåìå âîäû äëÿ êàæäîãî âèäà âîäîïîëüçîâàíèÿ. Îöåíêà ýïèäåìè÷åñêîé áåçîïàñíîñòè ïèòüåâîé âîäû äîëæíà îñóùåñòâëÿòüñÿ èñõîäÿ èç íîðìàòèâîâ, ïðåäñòàâëåííûõ â òàáë. 1. Òàáëèöà 1 Âèðóñîëîãè÷åñêèå êðèòåðèè äëÿ îöåíêè ýïèäåìè÷åñêîé áåçîïàñíîñòè ïèòüåâîé âîäû Ïîêàçàòåëè Åäèíèöà èçìåðåíèÿ Íîðìàòèâû Êîëèôàãè ÁÎÅ Îòñóòñòâèå â 100 ìë âîäû Ýíòåðîâèðóñû ÒÖÄ50/ìë Îòñóòñòâèå â 1000 ë âîäû 3. ÌÅÒÎÄÛ ÑÀÍÈÒÀÐÍÎ-ÂÈÐÓÑÎËÎÃÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÊÎÍÒÐÎËß ÏÈÒÜÅÂÎÉ ÂÎÄÛ Ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîå èññëåäîâàíèå ïèòüåâîé âîäû ïðîâîäèòñÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèâåäåííîé íà ðèñ.1 ñõåìîé ïðèìåíåíèÿ âèðóñîëîãè÷åñêèõ, ñåðîëîãè÷åñêèõ è ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ. Îñíîâíûå íåîáõîäèìûå ìàòåðèàëû, îáîðóäîâàíèå, ðåàêòèâû è ðå-àãåíòû ïðèâåäåíû â Ïðèëîæåíèÿõ 1 è 2. 3.1. Óëàâëèâàíèå âèðóñîâ èç âîäû è èõ êîíöåíòðèðîâàíèå Äëÿ óëàâëèâàíèÿ âèðóñíûõ àãåíòîâ èç âîäíîé ñðåäû èñïîëüçóåòñÿ ïðîòî÷íûé ìåòîä, îñíîâàííûé íà ïðèìåíåíèè ñïåöèàëüíî èçãîòîâëåííûõ ëîâóøåê èëè ëîâóøå÷íûõ óñòðîéñòâ, âõîäÿùèõ â ñîñòàâ íàáîðîâ äëÿ ñáîðà è êîíöåíòðèðîâàíèÿ âèðóñîâ. Äàííîå óñòðîéñòâî ñîñòîèò èç íàñàäêè íà âîäîïðîâîäíûé êðàí, ê êîòîðîé ñ ïîìîùüþ ñèíòåòè÷åñêîé òðóáêè ïðèêðåïëåí äåðæàòåëü.  äåðæàòåëü, ñîñòîÿùèé èç äâóõ ñâèí÷èâàþùèõñÿ ÷àñòåé ñ ðåçüáîé, âñòàâëÿåòñÿ ñïåöèàëüíûé êàðòðèäæ-ëîâóøêà, âíóòðè êîòîðîãî íàõîäèòñÿ àäñîðáåíò, $ ñîðáèðóþùèé âèðóñû èç âîäû. Ïðèìåíÿåìàÿ ëîâóøêà ÿâëÿåòñÿ îäíîðàçîâîé, à ñàìî óñòðîéñòâî ìîæåò èñïîëüçîâàòüñÿ ïîñëå ñòåðèëèçàöèè ìíîãîêðàòíî â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìîé èíñòðóêöèåé. 3.1.1. Îáùèå ïðàâèëà îòáîðà ïðîá Îòáîð ïðîá îñóùåñòâëÿþò â õàëàòå è ðåçèíîâûõ ïåð÷àòêàõ. Ïîñëå îêîí÷àíèÿ ðàáîòû ïåð÷àòêè îáðàáàòûâàþò ñïèðòîì, à õàëàòû ñòåðèëèçóþò. Ïðîáû ìàðêèðóþò, óêàçûâàÿ íàñåëåííûé ïóíêò, òî÷êó îòáîðà, äàòó (÷èñëî, ìåñÿö, ãîä), äîëæíîñòü è Ô.È.Î. ïðîèçâîäèâøåãî îòáîð. Ìàòåðèàë äîñòàâëÿþò â ëàáîðàòîðèþ â ìàêñèìàëüíî êîðîòêèé ñðîê (íå áîëåå 6 ÷). Äîñòàâëåííûé ìàòåðèàë íåìåäëåííî îáðàáàòûâàþò.  ïîðÿäêå èñêëþ÷åíèÿ äîïóñêàåòñÿ åãî õðàíåíèå ïðè òåìïåðàòóðå +4°Ñ±0,1°Ñ â òå÷åíèå îäíèõ ñóòîê. Êàæäóþ ïðîáó ðåãèñòðèðóþò â ðàáî÷åì æóðíàëå. 3.1.2. Îòáîð ïðîá Ïåðåä èñïîëüçîâàíèåì â ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî âñòàâëÿþò ëîâóøêó, ïîñëå ÷åãî åãî çàâîðà÷èâàþò â áóìàãó äëÿ ñòåðèëèçàöèè è ñòåðèëèçóþò ñóõèì æàðîì ïðè òåìïåðàòóðå 80°Ñ 45 ìèí. Ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî ñî âñòàâëåííîé ëîâóøêîé äîñòàâëÿþò íà ìåñòî îòáîðà â ñòåðèëüíîé óïàêîâêå. Ïîñëå òðåõêðàòíîãî îáæèãàíè ÿ âîäîïðîâîäíîãî êðàíà è ñïóñêà âîäû â òå÷åíèå 15 ìèí óñòàíàâëèâàþò íåîáõîäèìóþ ñêîðîñòü åå ïðîòåêàíèÿ 1ë çà ~ 1,5 ìèí, ÷òî ñîñòàâëÿåò 4045 ë/÷.  òî÷êå îòáîðà ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî èçâëåêàþò èç ñòåðèëüíîé óïàêîâêè è óñòàíàâëèâàþò íà êðàí ñ ïîìîùüþ íàñàäêè. Îáúåì ïðîïóñêàåìîé âîäû äîëæåí ñîñòàâèòü 1000 ë. Ñïóñòÿ 24 ÷ ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî ïîìåùàþò â ñòåðèëüíûé ïàêåò è äîñòàâëÿþò â âèðóñîëîãè÷åñêóþ ëàáîðàòîðèþ. Ïîñëå èçâëå÷åíèÿ ëîâóøêè èñïîëüçîâàííîå ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî ïîäâåðãàþò îáåççàðàæèâàíèþ â 3%-ì ðàñòâîðå ïåðåêèñè âîäîðîäà â òå÷åíèå 12 ÷, çàòåì ìíîãîêðàòíî (íå ìåíåå 10 ðàç) ïðîìûâàþò â ïðîòî÷íîé âîäå è âûñóøèâàþò äëÿ ïîñëåäóþùåé ñòåðèëèçàöèè è ïîâòîðíîãî èñïîëüçîâàíèÿ. 3.1.3. Îáðàáîòêà ïðîá è êîíöåíòðèðîâàíèå âèðóñîâ Ëîâóøêó ñ àäñîðáåíòîì â ñòåðèëüíûõ óñëîâèÿõ èçâëåêàþò èç ëîâóøå÷íîãî óñòðîéñòâà è ïîìåùàþò â ÷àøêó Ïåòðè. Ñ ïîìîùüþ íîæíèö ëîâóøêó âñêðûâàþò, ñîäåðæàùèéñÿ âíóòðè àäñîðáåíò âûìûâàþò â ÷àøêó Ïåòðè ñòåðèëüíîé äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé â îáúåìå 510 ìë. Ïîëó÷åííóþ âçâåñü àäñîðáåíòà â äèñòèëëèðîâàííîé âîäå ïåðåíîñÿò ñ ïîìîùüþ ïèïåòêè ñ îòïèëåííûì êîíöîì â ñòåêëÿííóþ êîëîíêó. Âûòåêàþùóþ èç êîëîíêè âîäó ñîáèðàþò â ñòåðèëüíûé ïåíôëàêîí. Ýëþ-èðîâàíèå «óëîâëåííûõ» àäñîðáåíòîì âèðóñîâ îñóùåñòâëÿþò ñ ïîìîùüþ ñïåöèàëüíîãî ýëþåíòà. Äàííûé ýëþåíò (10× êîíöåíòðàò) íàõîäèòñÿ â ñîñòàâå íàáîðà1 . Äëÿ ïîëó÷åíèÿ ðàáî÷åãî ðàñòâîðà êîíöåíòðàò ýëþåíòà ðàçâîäÿò â ñòåðèëüíîé äèñòèëëèðîâàííîé âîäå â ñîîòíîøåíèè 1:10 (îáúåì ýëþåíòà/îáúåì âîäû). Âèðóñ ýëþèðóþò ïóòåì ïðîïóñêàíèÿ ýëþåíòà â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè â îáúåìå 3 ìë ÷åðåç ñòîëá àäñîðáåíòà â êîëîíêå. Ïîëó÷åííóþ ôðàêöèþ (ýëþàò) ñîáèðàþò â ñòåðèëüíûé ïåíôëàêîí. Äëÿ óäàëåíèÿ áàêòåðèàëüíîé ôëîðû ñîáðàííûé ýëþàò îáðàáàòûâàþò õëîðîôîðìîì â ñîîòíîøåíèè 1/2 (îáúåì ïðîáû/îáúåì õëîðîôîðìà). Ïîëó÷åííóþ ñìåñü âñòðÿõèâàþò â òå÷åíèå 10 ìèí íà øþòòåëü-àïïàðàòå, à çàòåì öåíòðèôóãèðóþò Íàáîðû äëÿ ñáîðà è êîíöåíòðèðîâàíèÿ âèðóñîâ èç âîäû ïðîèçâîäÿòñÿ â ÁåëÍÈÈÝÌ (220050 ã. Ìèíñê, óë. Ê. Öåòêèí, 4, òåë. ôàêñ. (0172) 226-52-63) 1 % ïðè 2000 îá/ìèí 10 ìèí. Ïîñëå öåíòðèôóãèðîâàíèÿ âåðõíþþ ôàçó îñòîðîæíî îòáèðàþò ñ ïîìîùüþ ïèïåòêè â ñòåðèëüíûé ôëàêîí. Äëÿ óäîáñòâà â ðàáîòå ïîëó÷åííûé ýëþàò ñðàçó ìîæíî ðàçäåëèòü íà ïîðöèè (àëèêâîòû) ïî âèäàì èññëåäîâàíèÿ (êóëüòóðàëüíûå, ñåðîëîãè÷åñêèå, ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêèå). Èñïîëüçîâàííûé àäñîðáåíò çàëèâàþò 3%-ì ðàñòâîðîì ïåðåêèñè âîäîðîäà äëÿ îáåççàðàæèâàíèÿ íà 12 ÷. Ýëþàò ìîæíî õðàíèòü ïðè òåìïåðàòóðå -20°Ñ íå áîëåå 6 ìåñ. ïðè òåìïåðàòóðå +4°Ñ íå áîëåå 3 ñóòîê. Ïðè ýòîì àëèêâîòû ýëþàòà, ïðåäíàçíà÷åííûå äëÿ âèðóñîëîãè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé, íå ñëåäóåò ðàçìîðàæèâàòü áîëåå 2 ðàç. 3.2. Âûäåëåíèå ýíòåðîâèðóñîâ íà êóëüòóðàõ êëåòîê 3.2.1. Ðåêîìåíäóåìûå êóëüòóðû êëåòîê Ñáîð âèðóñà â ïðîòî÷íîé ñèñòåìå ñ ïîìîùüþ ëîâóøåê èëè ëîâóøå÷íîãî óñòðîéñòâà Ýëþèðîâàíèå àäñîðáèðîâàííîãî âèðóñà ñ èñïîëüçîâàíèåì êîëîíêè Ýëþàò Îáíàðóæåíèå àíòèãåíîâ âèðóñà ãåïàòèòà À è ðîòàâèðóñà ñ ïîìîùüþ ÈÔÀ Îáíàðóæåíèå ÐÍÊ ýíòåðîâèðóñîâ ñ ïîìîùüþ ÐÒ-ÏÖÐ Âûäåëåíèå âèðóñîâ íà 2 êóëüòóðàõ êëåòîê Èíäèêàöèÿ âèðóñ- Èäåíòèôèêàöèÿ âû- íûõ àíòèãåíîâ â äåëåííûõ ÖÏÀ â ÐÍ ÍÌÔÀ Ðèñ. 1. Ñõåìà âûäåëåíèÿ êèøå÷íûõ âèðóñîâ èç âîäû è èõ èäåíòèôèêàöèÿ & Íàèáîëåå ÷àñòî äëÿ âûäåëåíèÿ ýíòåðîâèðóñîâ ïðèìåíÿþòñÿ ïåðåâèâàåìûå ëèíèè êëåòîê ÷åëîâåêà è îáåçüÿíû. Ê íèì îòíîñÿòñÿ êëåòêè RD, BGM, â êîòîðûõ àêòèâíî ðåïðîäóöèðóþòñÿ âèðóñû ïîëèîìèåëèòà, Êîêñàêè À, áîëüøèíñòâî âèðóñîâ ÅÑÍÎ; â Hep-2 ðåïðîäóöèðóþòñÿ âèðóñû Êîêñàêè Â, à òàêæå çíà÷èòåëüíàÿ ÷àñòü âèðóñîâ ÅÑÍÎ.  âèðóñîëîãè÷åñêèõ ëàáîðàòîðèÿõ ÐÁ äëÿ âûäåëåíèÿ ýíòåðîâèðóñîâ øèðîêî èñïîëüçóþòñÿ ïåðåâèâàåìûå ëèíèè êëåòîê FL è Vero, êîòîðûå òàêæå ÷óâñòâèòåëüíû ê ýíòåðîâèðóñàì. Êðîìå ïåðåâèâàåìûõ, âåñüìà ÷óâñòâèòåëüíûìè ÿâëÿþòñÿ ïåðâè÷íûå è äèïëîèäíûå êóëüòóðû êëåòîê ÷åëîâåêà è îáåçüÿíû. Ñðåäè íèõ â êà÷åñòâå íàèáîëåå ïîäõîäÿùèõ ìîæíî ðåêîìåíäîâàòü ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûå êëåòêè ÏÝ× è ÔÝ×. Äëÿ ðàáîòû èñïîëüçóþòñÿ êóëüòóðû êëåòîê ñî ñôîðìèðîâàííûì ìîíîñëîåì íà 2-å3-è ñóòêè èõ ðîñòà in vitro. 3.2.2. Ðàáîòà ñ êóëüòóðîé êëåòîê Ïðè ðàáîòå ñ êóëüòóðàìè êëåòîê îáÿçàòåëüíû ñîáëþäåíèå ïðàâèë àñåïòèêè è òùàòåëüíàÿ ïîäãîòîâêà ñòåêëÿííîé ïîñóäû, ñðåä è ðåàãåíòîâ. Êóëüòèâèðîâàíèå êëåòîê ìîæíî îñóùåñòâëÿòü âî ôëàêîíàõ èç íåéòðàëüíîãî ñòåêëà (íàïðèìåð ¹ 179, åìêîñòüþ 50 ìë), à òàêæå â ïðîáèðêàõ è ïåíôëàêîíàõ èëè â ïëàñòèêîâûõ ôëàêîíàõ è ïëàíøåòàõ (96-, 24-ëóíî÷íûõ). Íà ïåðâîé ñòàäèè âûðàùèâàíèÿ êëåòêè ïîìåùàþò â ðîñòîâóþ ñðåäó, ñîäåðæàùóþ ñûâîðîòêó. Êàê òîëüêî êëåòêè îáðàçóþò ñïëîøíîé ìîíîñëîé, êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó ìåíÿþò íà ïîääåðæèâàþùóþ, êîòîðàÿ ïðåäíàçíà÷åíà äëÿ ïîääåðæàíèÿ êóëüòóð â æèçíåñïîñîáíîì ñîñòîÿíèè êàê ìîæíî äîëüøå áåç ñòèìóëÿöèè èõ ðîñòà. Ýòî îáû÷íî äîñòèãàåòñÿ ñíèæåíèåì êîíöåíòðàöèè ñûâîðîòêè â ïèòàòåëüíîé ñðåäå äî 12 % èëè åå îòñóòñòâèåì. Èñïîëüçóþò ïðåèìóùåñòâåííî ýìáðèîíàëüíóþ òåëÿ÷üþ ñûâîðîòêó, òàê êàê îíà ñïîñîáñòâóåò ðîñòó êëåòîê è íå ñîäåðæèò èíãèáèòîðîâ ýíòåðîâèðóñîâ. Åñëè èñïîëüçóþò ñûâîðîòêó äðóãîãî ïðîèñõîæäåíèÿ, ñëåäóåò ïðåäâàðèòåëüíî ïðîâåðèòü íàëè÷èå èíãèáèòîðîâ èçó÷àåìûõ âèðóñîâ. Ïðè èñïîëüçîâàíèè êóëüòóð êëåòîê ðåêîìåíäóåòñÿ ïðèìåíÿòü ñòàíäàðòíûå ïèòàòåëüíûå ñðåäû, ê êîòîðûì àäàïòèðîâàíû èñïîëüçóåìûå ëèíèè êëåòîê. Ïðè ðàáîòå ñ êóëüòóðàìè êëåòîê ñëåäóåò ÷åòêî âûïîëíÿòü ìåòîäè÷åñêèå èíñòðóêöèè äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ ìèêðîáíîé êîíòàìèíàöèè êëåòî÷íûõ êóëüòóð è çàùèòû îò êîíòàìèíàöèè êóëüòóðàëüíûìè ìàòåðèàëàìè îêðóæàþùåãî ðàáî÷åãî ïðîñòðàíñòâà. Âñÿ ðàáîòà äîëæíà ïðîâîäèòüñÿ â ñïåöèàëüíûõ ñòåðèëüíûõ ïîìåùåíèÿõ èëè ëàìèíàðíûõ áîêñàõ. 3.2.3. Ìîðôîëîãè÷åñêàÿ õàðàêòåðèñòèêà ÖÏÝ ýíòåðîâèðóñîâ â êóëüòóðàõ êëåòîê Öèêë ðåïðîäóêöèè ýíòåðîâèðóñîâ â ÷óâñòâèòåëüíûõ êóëüòóðàõ äëèòñÿ 57 ÷. Ïðè ìèêðîñêîïèè èíôèöèðîâàííûõ êóëüòóð ìîðôîëîãè÷åñêèå ïðîÿâëåíèÿ ðàçìíîæåíèÿ âèðóñîâ çàêëþ÷àþòñÿ â ðàâíîìåðíîé ìåëêîçåðíèñòîé äåñòðóêöèè êëåòîê, âûðàæàþùåéñÿ â èõ îêðóãëåíèè è ïîñòåïåííîì îòñëîåíèè îò ñòåíêè êóëüòóðàëüíûõ ôëàêîíîâ.  îêðàøåííûõ ïîðàæåííûõ êëåòêàõ ìîæíî âèäåòü ýîçèíîôèëüíûå ìàññû, îòòåñíÿþùèå ÿäðî ê ïåðèôåðèè (ïðîäóêòû âíóòðèêëåòî÷íîãî ðàçâèòèÿ âèðóñîâ). Ê ôàêòîðàì, îïðåäåëÿþùèì ìîðôîëîãè÷åñêóþ êàðòèíó ÖÏÝ, è ñðîêàì åãî ïðîÿâëåíèÿ îòíîñÿòñÿ òàêæå êîíêðåòíûå óñëîâèÿ èññëåäîâàíèÿ, âàðèàöèè â õèìè÷åñêîì ñîñòàâå è ðÍ êóëüòóðàëüíîé ñðåäû, òåìïåðàòóðå èíêóáàöèè, êîíöåíòðàöèè êëåòîê, ñðîêàõ èõ ðîñòà in vitro è ìíîæåñòâåííîñòè çàðàæåíèÿ è ò. ä. ' 3.2.4. Ïîðÿäîê è òåõíèêà âûäåëåíèÿ ýíòåðîâèðóñîâ Âûäåëåíèå ýíòåðîâèðóñîâ ñëåäóåò îñóùåñòâëÿòü ïàðàëëåëüíî íå ìåíåå ÷åì íà äâóõ êóëüòóðàõ êëåòîê, ïðè âûáîðå êîòîðûõ ñëåäóåò ó÷èòûâàòü èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê ðàçíûì âèðóñíûì òèïàì ñ öåëüþ ñîçäàíèÿ áëàãîïðèÿòíûõ óñëîâèé äëÿ ðàçìíîæåíèÿ êàê ìîæíî áîëåå øèðîêîãî ñïåêòðà ýíòåðîâèðóñíûõ àãåíòîâ. Íàïðèìåð: RD + Hep-2; Hep-2 + BGM; RD + BGM; ÔÝ× + RD è ò. ä. Âûäåëåíèå ïðîèçâîäèòñÿ â òðåõ ïîñëåäîâàòåëüíûõ ïàññàæàõ. Íèæåîïèñàííàÿ òåõíèêà âûäåëåíèÿ âèðóñîâ êàñàåòñÿ îñóùåñòâëåíèÿ ïðîöåäóðû íà ïðîáèðêàõ èëè ïåíôëàêîíàõ ñ îáùèì îáúåìîì çàëèâàåìîé æèäêîñòè 1 ìë. −  ïðîáèðêàõ (ïåíôëàêîíàõ) ñ õîðîøî ñôîðìèðîâàííûì êëåòî÷íûì ìîíîñëîåì çàìåíÿþò ðîñòîâóþ ñðåäó íà ïîääåðæèâàþùóþ ñ 12% ñûâîðîòêè êðîâè ýìáðèîíîâ êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà è äîáàâëåíèåì àíòèáèîòèêîâ: ãåíòàìèöèíà Ê â äîçå 80100 ìêã/ìë, àìôîòåðèöèíà  2,5 ìêã/ìë. Ïðè êóëüòèâèðîâàíèè êëåòîê â èíêóáàòîðå áåç ñîäåðæàíèÿ ÑÎ2 ðåêîìåíäóåòñÿ äëÿ ñòàáèëèçàöèè ðÍ â ñèíòåòè÷åñêèå ñðåäû äîáàâëÿòü áóôåð Hepes (25 ìÌ). − Íà ýòèêåòêå ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíà) îáîçíà÷àþò ðåãèñòðàöèîííûé íîìåð ïðîáû ïî æóðíàëó, ãîä, âèä êëåòî÷íîé êóëüòóðû, íîìåð ïàññàæà. −  äâå ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíà) ñ êóëüòóðîé êëåòîê êàæäîãî âèäà èíîêóëèðóþò ïî 0,2 ìë èññëåäóåìîé ïðîáû, èíêóáèðóþò â ãîðèçîíòàëüíîì, ñëåãêà íàêëîíåííîì ïîëîæåíèè ïðè 36,537°Ñ â òåðìîñòàòå. Äëÿ êîíòðîëÿ îñòàâëÿþò ïî íåñêîëüêî ïðîáèðîê (ïåíôëàêîíîâ) ñ êóëüòóðîé ñî ñìåíîé è áåç ñìåíû ñðåäû. − Çà êóëüòóðîé êëåòîê íàáëþäàþò, ìèêðîñêîïèðóÿ èõ åæåäíåâíî è ñëåäÿ çà ïîÿâëåíèåì ÖÏÝ â ïåðåâèâàåìûõ êóëüòóðàõ êëåòîê â òå÷åíèå 710 äíåé è â ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûõ êóëüòóðàõ êëåòîê 45 äíåé. − Ïðè ïåðâûõ ïðèçíàêàõ ñòàðåíèÿ êîíòðîëüíûõ êóëüòóð êëåòîê (îáû÷íî 57 äíåé ïîñëå ïîñåâà ïåðåâèâàåìûõ êóëüòóð êëåòîê è 46 ñóòîê äëÿ ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûõ è äèïëîèäíûõ) îïûòíûå ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû) çàìîðàæèâàþò ïðè -20°Ñ. Ìàòåðèàë 1-ãî ïàññàæà èñïîëüçóþò äàëåå â êà÷åñòâå çàðàæàþùåãî äëÿ îñóùåñòâëåíèÿ 2-ãî ïàññàæà. Äëÿ ýòîãî îí òðåõêðàòíî çàìîðàæèâàåòñÿîòòàèâàåòñÿ, çàòåì âíîñèòñÿ â ñâåæóþ êóëüòóðó òîãî æå âèäà êëåòîê â îáúåìå 0,2 ìë, ê êîòîðîìó ïðèáàâëÿåòñÿ 0,8 ìë ïîääåðæèâàþùåé ñðåäû. Çàðàæåííûå íà 2-ì ïàññàæå ïåðåâèâàåìûå êóëüòóðû íàáëþäàþò åæåäíåâíî â òå÷åíèå 7 ñóòîê, à ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûå 45 ñóòîê. Òðåòèé ïàññàæ èññëåäóåìîãî ìàòåðèàëà îñóùåñòâëÿþò àíàëîãè÷íî âòîðîìó. Îáùèé ïåðèîä íàáëþäåíèÿ çà òðåìÿ ïàññàæàìè ñîñòàâëÿåò ~21 è 15 äíåé ñîîòâåòñòâåííî. Åñëè çà ýòî âðåìÿ õàðàêòåðíûé ýíòåðîâèðóñíûé ÖÏÝ íå âûÿâëÿåòñÿ, òî ðåçóëüòàò îöåíèâàåòñÿ êàê îòðèöàòåëüíûé.  ñëó÷àå íàëè÷èÿ òèïè÷íîãî âèðóñíîãî ÖÏÝ äåëàåòñÿ âûâîä î âûäåëåíèè ÖÏÀ, êîòîðûé äàëåå èäåíòèôèöèðóåòñÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì ðÿäà ìåòîäèê. 3.2.5. Îïðåäåëåíèå èíôåêöèîííîãî òèòðà ÖÏÀ è âûäåëåííûõ ýíòåðîâèðóñîâ Âûäåëåííûå ÖÏÀ, äàþùèå áûñòðûé ÖÏÝ íà 3-ì ïàññàæå (â òå÷åíèå 12 äíåé ïîñëå èíôèöèðîâàíèÿ), íå òðåáóþò îïðåäåëåíèÿ òèòðà ïåðåä ïîñòàíîâêîé îïûòîâ ïî èäåíòèôèêàöèè.  äàííîì ñëó÷àå ïðè èäåíòèôèêàöèè èñïîëüçóþòñÿ ïðîèçâîëüíî âûáðàííûå ðàçâåäåíèÿ (10310-4) ÖÏÀ-ñîäåðæàùåãî ìàòåðèàëà.  äðóãèõ ñëó÷àÿõ íåîáõîäèìî ïðîâåñòè îïðåäåëåíèå òèòðà âûäåëåííîãî ÖÏÀ. Äëÿ ýòîãî ãîòîâÿò äåñÿòèêðàòíûå åãî ðàçâåäåíèÿ â êóëüòóðàëüíîé ñðåäå. Ñíà÷àëà ðàçëèâàþò ñðåäó ïî 0,9 ìë â ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû), çàòåì â ïåðâóþ ïðîáèðêó (ïåíôëàêîí) âíîñÿò 0,1 ìë öåëüíîãî (íåðàçâåäåííîãî) âèðóñà, íå äîòðàãèâàÿñü äî ñðåäû. Íîâîé ïèïåòêîé ïåðåìåøèâàþò ñîäåðæèìîå ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíà), èçáåãàÿ âñïåíèâàíèÿ, è ïåðåíîñÿò ïî 0,1 ìë èç ïåðâîãî ðàçâåäåíèÿ âî âòîðîå è ò. ä. Ñõåìàòè÷íî ýòó ïðîöåäóðó ìîæíî ïðåäñòàâèòü ñëåäóþùèì îáðàçîì: Öåëüíûé âèðóñ 10-1 → 10-2 → 10-3 → 10-4 è ò. ä. ×òîáû èñêëþ÷èòü ïåðåíîñ èçáûòêà âèðóñà ïèïåòêîé, íåîáõîäèìî ñëåäîâàòü ïðàâèëó: ñìåøàé, ïåðåíåñè, âûáðîñè. Äàëåå ïðèãîòîâëåííûìè ðàçâåäåíèÿìè âèðóñà èíôèöèðóþò êóëüòóðû êëåòîê ñ õîðîøî ñôîðìèðîâàâøèìñÿ ìîíîñëîåì, íà êîòîðîì áûë ðàíåå âûäåëåí ÖÏÀ. Íà êàæäîå ðàçâåäåíèå ñ 10-1 äî 10-8 èñïîëüçóþò íå ìåíåå äâóõ ïðîáèðîê (ïåíôëàêîíîâ) ñ êóëüòóðîé êëåòîê, êóäà âíîñÿò ïî 0,9 ìë ñðåäû ïîääåðæêè è ïî 0,1 ìë êàæäîãî ðàçâåäåíèÿ âèðóñà, íà÷èíàÿ ñ íàèáîëüøåãî. Ïðè ýòîì ïèïåòêó ìîæíî íå ìåíÿòü. Ïîñòàíîâêó ìîæíî îñóùåñòâëÿòü ìèêðîìåòîäîì, èñïîëüçóÿ ìèêðîòèòðîâàëüíûå ïëîñêîäîííûå ïëàíøåòû (Ïðèëîæåíèå 1), èëè ìàêðîìåòîäîì, èñïîëüçóÿ äëÿ êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòîê ïðîáèðêè èëè ïåíôëàêîíû, à òàêæå ñòåðèëüíûå ïëîñêîäîííûå 24-ëóíî÷íûå ïëàñòèêîâûå ïëàíøåòû. Òèòð âèðóñà (ÒÖÄ50/ìë) îïðåäåëÿåòñÿ êàê íàèáîëüøåå ðàçâåäåíèå, êîòîðîå âûçûâàåò ÖÏÝ â 50% çàðàæåííûõ êëåòî÷íûõ êóëüòóð. Ðàññ÷èòûâàåòñÿ òèòð âèðóñà ïî ôîðìóëå Êåðáåðà: lg ÒÖÄ50 = L-d (S-0,5), ãäå L lg íàèìåíüøåãî ðàçâåäåíèÿ, èñïîëüçóåìîãî â òèòðîâàíèè; d èíòåðâàë â lg ìåæäó äâóìÿ ïîñëåäîâàòåëüíûìè ðàçâåäåíèÿìè; S ñóììà ïðîïîðöèé ïîëîæèòåëüíûõ òåñò-åäèíèö (ò.å. ëóíîê èëè ïðîáèðîê ñ êóëüòóðîé, ãäå ïðîÿâèëñÿ ÖÏÝ) â êàæäîì ðàçâåäåíèè. Ïðèìåð: Ðàçâåäåíèå âèðóñà Äîëÿ êóëüòóð ñ ÖÏÝ 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 2/2 = 1 2/2 = 1 2/2 = 1 1/2 = 0,5 1/2 = 0,5 0/2 = 0 0/2 = 0 0/2 = 0 lg ÒÖÄ50 = -1 -1(4 - 0,5) = -4,5 Ôîðìóëà Êåðáåðà èñïîëüçóåò «îòðèöàòåëüíûé ëîãàðèôì». 10-4,5 ýòî êîíå÷íîå ðàçâåäåíèå, ñîäåðæàùåå 1 ÒÖÄ50 â åäèíèöå îáúåìà. Ïðè îêîí÷àòåëüíîì âûðàæåíèè èíôåêöèîííîé àêòèâíîñòè ñëåäóåò óêàçûâàòü îáúåì âèðóñíûõ ðàçâåäåíèé, âíîñèìûõ â êàæäóþ êóëüòóðó êëåòîê (â äàííîì ñëó÷àå 0,1 ìë). Òàêèì îáðàçîì, èíôåêöèîííàÿ àêòèâíîñòü âèðóññîäåðæàùåãî ìàòåðèàëà (òèòð âèðóñà) ñîñòàâëÿåò 10-4,5 ÒÖÄ50 â 0,1 ìë, ò. å. òèòð âèðóñà = 4,5 lg ÒÖÄ50/0,1ìë Òèòðîâàíèå ýíòåðîâèðóñîâ îñóùåñòâëÿåòñÿ àíàëîãè÷íî âûøåîïèñàííîé äëÿ ÖÏÀ ïðîöåäóðå. Ïðè ýòîì âàæíî ïîìíèòü, ÷òî ëþáûå èçìåíåíèÿ â èñïîëüçóåìîé êëåòî÷íîé ñèñòåìå, îáúåìàõ âèðóñíîãî ìàòåðèàëà èëè äíåé ó÷åòà ðåçóëüòàòîâ îïûòà äåëàþò íåîáõîäèìûì ïîâòîðíîå òèòðîâàíèå èñõîäíîãî âèðóñíîãî ìàòåðèàëà. Ãðóïïà ýíòåðîâèðóñîâ õàðàêòåðèçóåòñÿ âûñîêîé ñòàáèëüíîñòüþ ïðè õðàíåíèè ïðè -20°Ñ, ïîýòîìó èõ òèòðû îáû÷íî âîñïðîèçâîäèìû è ïîñëå îòòàèâàíèÿ âî âðåìÿ ïîäãîòîâêè ê èññëåäîâàíèþ. 3.3. Èäåíòèôèêàöèÿ âûäåëåííûõ ÖÏÀ â ÐÍ Ñóùíîñòü ìåòîäà çàêëþ÷àåòñÿ â ñïîñîáíîñòè èììóííîé ñûâîðîòêè íåéòðàëèçîâàòü ñîîòâåòñòâóþùèé åé òèï âèðóñà. Îñíîâíîé ýôôåêò â êóëüòóðå êëåòîê çàêëþ÷àåòñÿ â ðàçðóøàþùåì öèòîïàòîãåííîì äåéñòâèè âèðóñà íà êëåòêè ïðè îòñóòñòâèè òàêîâîãî â ñëó÷àå íåéòðàëèçàöèè èíôåêöèîííîñòè âèðóñà ñîîòâåòñòâóþùåé åìó ñûâîðîòêîé. Ïîñòàíîâêó ìåòîäà ìîæíî ïðîâåñòè, èñïîëüçóÿ ïëàñòèêîâûå ïëàíøåòû ñ ïëîñêèì äíîì (ìèêðîìåòîä) èëè ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû) ñ êóëüòóðîé êëåòîê (ìàêðîìåòîä). Âìåñòî ïðîáèðîê (ïåíôëàêîíîâ) â ìàêðîìåòîäå ìîæíî èñïîëüçîâàòü ñòåðèëüíûå ïëàñòèêîâûå ïëîñêîäîííûå 24-ëóíî÷íûå ïëàíøåòû. Ìèêðîìåòîä ÿâëÿåòñÿ áîëåå ýêîíîìè÷íûì, òàê êàê ðàñõîäóåòñÿ ìåíüøå äîðîãîñòîÿùèõ äèàãíîñòè÷åñêèõ ñûâîðîòîê è äðóãèõ êîìïîíåíòîâ, îäíàêî çíà÷èòåëüíî âîçðàñòàåò âîçìîæíîñòü ïåðåêðåñòíîé âèðóñíîé êîíòàìèíàöèè ìåæäó èçîëÿòàìè. Ìàêðîìåòîä òðåáóåò áîëüøèõ îáúåìîâ ðåàãåíòîâ, íî èìååò è ïðåèìóùåñòâî: êàæäàÿ îòäåëüíàÿ ïðîáèðêà (ïåíôëàêîí) îòêðûâàåòñÿ òîëüêî îäèí ðàç. Åñëè èç îäíîãî è òîãî æå ìàòåðèàëà ÖÏÀ âûäåëåí â ðàçíûõ êëåòî÷íûõ êóëüòóðàõ, íåîáõîäèìî ïðîâîäèòü èäåíòèôèêàöèþ îáîèõ èçîëÿòîâ, òàê êàê ïåðìèññèâíîñòü ðàçíûõ ëèíèé êëåòîê äëÿ ðàçëè÷íûõ òèïîâ ýíòåðîâèðóñîâ íåîäèíàêîâà. Ïðè ïîñòàíîâêå ÐÍ íà êóëüòóðå êëåòîê ñîáëþäàþòñÿ ðàâíûå êîëè÷åñòâåííûå è îáúåìíûå ñîîòíîøåíèÿ âèðóññîäåðæàùåé æèäêîñòè è äèàãíîñòè÷åñêîé ñûâîðîòêè.  ðåàêöèþ âêëþ÷àåòñÿ ìàòåðèàë, ñîñòîÿùèé èç 100 ÒÖÄ50/ìë âèðóñà è ñûâîðîòêè, ñîäåðæàùåé 20 âèðóñíåéòðàëèçóþùèõ åäèíèö. 3.3.1. Ïðèãîòîâëåíèå ðàáî÷èõ ðàçâåäåíèé äèàãíîñòè÷åñêèõ ñûâîðîòîê Äëÿ èäåíòèôèêàöèè ýíòåðîâèðóñíûõ èçîëÿòîâ âíà÷àëå èñïîëüçóþò ãðóïïîñïåöèôè÷åñêèå ãîìîëîãè÷íûå äèàãíîñòè÷åñêèå ñûâîðîòêè1 ê ñëåäóþùèì ãðóïïàì ýíòåðîâèðóñîâ: à) âèðóñó ïîëèîìèåëèòà 13; á) Êîêñàêè  16; Êîêñàêè À 15, 610, 1115, 1619, 2024; â) ÅÑÍÎ 16, 713, 1424, 1522, 2532; ã) ýíòåðîâèðóñàì 68, 69, 70, 71. Ïåðåä ïîñòàíîâêîé ÐÍ ñóõóþ ñûâîðîòêó, ñîáëþäàÿ ñòåðèëüíîñòü, ðàñòâîðÿþò â óïàêîâî÷íîé àìïóëå â 1 ìë ñòåðèëüíîé äèñòèëëèðîâàííîé âîäû. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ìîæíî ðàñôàñîâàòü è çàìîðîçèòü ïðè -20°Ñ. Ïåðåä ðàáîòîé ñûâîðîòêó èíàêòèâèðóþò ïðè 56°Ñ â òå÷åíèå 30 ìèí, à çàòåì ðàçâîäÿò äî ðàáî÷åãî ðàçâåäåíèÿ, óêàçàííîãî íà ýòèêåòêå, ïèòàòåëüíîé ñðåäîé èëè ðàñòâîðîì Õåíêñà. Ðàçâåäåííûå ñûâîðîòêè ìîæíî õðàíèòü ïðè +4°Ñ â òå÷åíèå 14 äíåé. Ïðè âûÿâëåíèè íåéòðàëèçàöèè èññëåäóåìîãî âèðóñà îäíîé èç ñìåñåé ãðóïïîâûõ ñûâîðîòîê ïðîâîäèòñÿ ðàçäåëüíîå òèïèðîâàíèå âèðóñà ñ èñïîëüçîâàíèåì êàæäîé òèïîñïåöèôè÷åñêîé ñûâîðîòêè, âîøåäøåé â ñîñòàâ äàííîé ãðóïïîâîé ñìåñè. Äëÿ òèïèðîâàíèÿ âèðóñà ïîëèîìèåëèòà ãîòîâÿò òðè ñìåñè ïîëèâàëåíòíûõ ãðóïïîâûõ èììóííûõ ñûâîðîòîê: Ð1+Ð2; Ð1+Ð3; Ð2+Ð3. Ïðè ýòîì ñûâîðîòêè ðàçâîäÿò â äâà ðàçà ìåíüøå, ÷åì óêàçàíî íà ýòèêåòêå, ó÷èòûâàÿ èõ äàëüíåéøåå ñìåøèâàíèå. 3.3.2. Ïðèãîòîâëåíèå ñìåñåé âèðóñà è àíòèñûâîðîòîê äëÿ ÐÍ Èç ðàâíûõ îáúåìîâ ñîñòàâëÿþò: ñìåñü ðàáî÷åãî ðàçâåäåíèÿ ñûâîðîòêè è ðàáî÷åãî ðàçâåäåíèÿ âèðóññîäåðæàùåé æèäêîñòè êàæäîãî èñïûòóåìîãî øòàììà (âèðóñ + àíòèñûâîðîòêà); ñìåñü òåõ æå ðàçâåäåíèé âèðóññîäåðæàùåé æèäêîñòè è ðàçáàâèòåëÿ (êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà èëè ðàñòâîð Õåíêñà) äëÿ êîíòðîëÿ äåéñòâèÿ âèðóñà (êîíòðîëü âèðóñà); ñìåñü ðàáî÷èõ ðàçâåäåíèé ñûâîðîòêè è ðàçáàâèòåëÿ äëÿ êîíòðîëÿ òîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ ñûâîðîòêè (êîíòðîëü ñûâîðîòêè). Êàæäûé èíãðåäèåíò âõîäèò â ñîñòàâ ñìåñè â îáúåìå 0,25 ìë ïðè ïîñòàíîâêå ìàêðîìåòîäà è 0,05 ìë ïðè ïîñòàíîâêå ìèêðîìåòîäà. Ñìåñè èíêóáèðóþò ïðè òåìïåðàòóðå 36° 36,5°Ñ â òå÷åíèå 1 ÷àñà èëè ïðè òåìïåðàòóðå +4°Ñ â òå÷åíèå 18 ÷. 3.3.3. Ïîñòàíîâêà ìàêðîìåòîäà ÐÍ − Ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû) ñ êóëüòóðîé êëåòîê (ïî äâå ïðîáèðêè èëè ïåíôëàêîíà íà êàæäóþ ñìåñü) ìàðêèðóþò è îñóùåñòâëÿþò ñìåíó ðîñòîâîé ñðåäû íà 0,8 ìë ïîääåðæèâàþùåé. − Ïåðåíîñÿò ïî 0,2 ìë ñìåñè âèðóñà ñ àíòèñûâîðîòêîé â êàæäóþ ïðîáèðêó (ïåíôëàêîí). − Ñòàâÿò ñîîòâåòñòâóþùèå êîíòðîëè: à) êîíòðîëü ðàáî÷åãî ðàçâåäåíèÿ âèðóñà, á) êîíòðîëü òîêñè÷íîñòè äèàãíîñòè÷åñêîé ñûâîðîòêè, â) êîíòðîëü òèòðà âèðóñà, ã) êîíòðîëü êëåòîê (ñî ñìåíîé ðîñòîâîé ñðåäû íà ïîääåðæèâàþùóþ è áåç ñìåíû ðîñòîâîé ñðåäû). − Èíêóáèðóþò ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû) â ñòàöèîíàðíîì íàêëîííîì ïîëîæåíèè ïðè 36,5°Ñ37°Ñ. − Åæåäíåâíî ïðîáèðêè ìèêðîñêîïèðóþò äî îáíàðóæåíèÿ ïîëíîãî ÖÏÝ âèðóñà (îáû÷íî 3 äíÿ). Àíòèñûâîðîòêà, êîòîðàÿ ñäåðæèâàåò ðàçâèòèå ÖÏÝ âèðóñà, íàõîäÿùåãîñÿ â ñìåñè ñ íåé, óêàçûâàåò íà òèï âûäåëåííîãî âèðóñà. 3.3.4. Ïîñòàíîâêà ìèêðîìåòîäà ÐÍ Ïîñòàíîâêà ïðîèçâîäèòñÿ â ïëîñêîäîííûõ 96-ëóíî÷íûõ ïàíåëÿõ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè â ðîñòîâîé ñðåäå â îáúåìå 0,1 ìë è ñìåñè àíòèñûâîðîòêè ñ âèðóñîì â òàêîì æå îáúåìå íà îäíó ëóíêó. Òàêèì îáðàçîì, îáùèé îáúåì âíîñèìûõ èíãðåäèåíòîâ ñîñòàâëÿåò 0,2 ìë íà îäíó ëóíêó. Ìåòîä âêëþ÷àåò ñëåäóþùóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ýòàïîâ: ! − ðàáî÷åå ðàçâåäåíèå ñûâîðîòêè â êîëè÷åñòâå 50 ìêë ñìåøèâàþò â ëóíêàõ ìèêðîïàíåëåé ñ 50 ìêë èññëåäóåìîãî àãåíòà ñ òèòðîì 100 ÒÖÄ50/ìë. Äëÿ àãåíòîâ, êîòîðûå â ïàññàæå áûñòðî âûçûâàþò ÖÏÝ (â òå÷åíèå ïåðâûõ 2-õ ñóòîê), îáû÷íî èñïîëüçóþò ðàçâåäåíèÿ 10-3 è 10-4, à äëÿ âèðóñîâ, êîòîðûå âûçûâàþò ÖÏÝ â áîëåå ïîçäíèå ñðîêè, 10-1 è 10-2; − â êîíòðîëè êëåòîê âíîñÿò íà ëóíêó 100 ìêë ïèòàòåëüíîé ñðåäû ñ 2% òåëÿ÷üåé ýìáðèîíàëüíîé ñûâîðîòêîé (ÒÝÑ); − â êîíòðîëè âèðóñà âíîñÿò íà ëóíêó 50 ìêë òîé æå ñðåäû è 50 ìêë èññëåäóåìîãî âèðóñà â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè (100 ÒÖÄ50/ìë); − ìèêðîïàíåëè ïîìåùàþò â ÑÎ2-èíêóáàòîð ïðè +36°– 36,5°Ñ íà 1 ÷ äëÿ êîíòàêòà âèðóñà ñî ñïåöèôè÷åñêèìè ñûâîðîòêàìè; − ïîñëå êîíòàêòà âî âñå ëóíêè äîáàâëÿþò ïî 100 ìêë ñóñïåíçèè êóëüòóð êëåòîê: ïåðåâèâàåìûõ 200250 è ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûõ 500 òûñ. êëåòîê â 1 ìë ïèòàòåëüíîé ñðåäû; − ìèêðîïàíåëè çàêðûâàþò ñòåðèëüíîé êëåéêîé ëåíòîé è ïîìåùàþò â ÑÎ 2-èíêóáàòîð; åæåäíåâíî ïðîñìàòðèâàþò ïîä èíâåðòèðîâàííûì ìèêðîñêîïîì, îêàí÷èâàþò ó÷åò ðåçóëüòàòîâ ïîñëå âûÿâëåíèÿ 100% ÖÏÝ â ëóíêàõ êîíòðîëÿ âèðóñà. 3.4. Îáíàðóæåíèå âèðóñíîãî ìàòåðèàëà â ïðîáàõ âîäû  íàñòîÿùåå âðåìÿ äëÿ ýêñïðåññ-îáíàðóæåíèÿ âèðóñîâ èñïîëüçóåòñÿ êîìïëåêñ âèðóñîëîãè÷åñêèõ, ñåðîëîãè÷åñêèõ è ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ èññëåäîâàíèÿ, êîòîðûå âêëþ÷àþò: èììóíîôåðìåíòíûé àíàëèç (ÈÔÀ) äëÿ âûÿâëåíèÿ àíòèãåíîâ âèðóñà ãåïàòèòà À (ÂÃÀ) è ðîòàâèðóñîâ, íåïðÿìîé ìåòîä ôëóîðåñöèðóþùèõ àíòèòåë (ÍÌÔÀ) äëÿ îïðåäåëåíèÿ àíòèãåíîâ ýíòåðîâèðóñîâ, ìåòîä ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè ñî ñòàäèåé îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè (ÐÒ-ÏÖÐ) äëÿ îáíàðóæåíèÿ âèðóñíîé ÐÍÊ. 3.4.1. Îáíàðóæåíèå àíòèãåíîâ ÂÃÀ è ðîòàâèðóñîâ ìåòîäîì ÈÔÀ Ìåòîä ÈÔÀ âåñüìà ñïåöèôè÷åí, îáëàäàåò âûñîêîé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ è âîñïðîèçâîäèìîñòüþ. Èíãðåäèåíòû ðåàêöèè ñòàáèëüíû è íå òðåáóþò ñïåöèàëüíûõ ìåð ïðåäîñòîðîæíîñòè. Ê ïðåèìóùåñòâàì ìåòîäà îòíîñèòñÿ òàêæå âîçìîæíîñòü èññëåäîâàíèÿ èíôåêöèîííîãî è èíàêòèâèðîâàííîãî ìàòåðèàëà áåç äëèòåëüíîãî ýòàïà íàêîïëåíèÿ åãî â êóëüòóðå êëåòîê. Ó÷åò ïðîâîäÿò ôîòîìåòðè÷åñêè, íà èììóíîôåðìåíòíîì àíàëèçàòîðå èëè ìóëüòèñêàíå ïðè äëèíå âîëíû 492 íì èëè âèçóàëüíî ïî èíòåíñèâíîñòè îêðàñêè, ÷òî òàêæå äàåò ïðåèìóùåñòâî â ïðàêòè÷åñêîé ðàáîòå. 1 Äàííûé íàáîð äèàãíîñòè÷åñêèõ ñûâîðîòîê ìîæíî ïðèîáðåñòè â Èíñòèòóòå ïîëèîìèåëèòà è âèðóñíûõ ýíöåôàëèòîâ èì. Ì.Ï.×óìàêîâà, ã. Ìîñêâà " Äëÿ îáíàðóæåíèÿ ìîæíî èñïîëüçîâàòü êîììåð÷åñêèå òåñò-ñèñòåìû ïðîèçâîäñòâà ÁåëÍÈÈÝÌ ÌÇ ÐÁ (ã. Ìèíñê).  ñâÿçè ñ òåì, ÷òî ÂÃÀ è ðîòàâèðóñû â ïèòüåâîé âîäå ìîãóò ïðèñóòñòâîâàòü â î÷åíü íèçêèõ êîíöåíòðàöèÿõ, êîòîðûå íàõîäÿòñÿ çà ïðåäåëàìè ïîðîãîâîé ÷óâñòâèòåëüíîñòè äàííûõ ñèñòåì, íåîáõîäèìî: 1) èñïîëüçîâàíèå ñïåöèàëüíîãî ìåòîäà êîíöåíòðèðîâàíèÿ, ïðåäóñìîòðåííîãî ïðè îòáîðå ïðîá âîäû (ðàçäåë 3.1.); 2) èçìåíåíèå óñëîâèé ñåíñèáèëèçàöèè òâåðäîé ôàçû èììóíîãëîáóëèíîì ïóòåì óâåëè÷åíèÿ âðåìåíè êîíòàêòà äî 1 ÷ ïðè òåìïåðàòóðå 37°Ñ ñ ïîñëåäóþùèì êîíòàêòîì â òå÷åíèå 1618 ÷ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Îñòàëüíûå ýòàïû ïîñòàíîâêè ÈÔÀ ïðîèçâîäÿòñÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìîé ê òåñòñèñòåìàì èíñòðóêöèåé. 3.4.2. Âûÿâëåíèå âèðóñíûõ àíòèãåíîâ ñ ïîìîùüþ ÍÌÔÀ Ìåòîä ôëóîðåñöèðóþùèõ àíòèòåë îáåñïå÷èâàåò âèçóàëüíîñòü ðåàêöèè ìåæäó àíòèãåíîì è àíòèòåëîì è íàõîäèò ïðèìåíåíèå òàì, ãäå èìååòñÿ ëþìèíåñöåíòíûé ìèêðîñêîï, àíòèâèäîâàÿ ìå÷åííàÿ ôëóîðîõðîìîì ñûâîðîòêà, íàáîð äèàãíîñòè÷åñêèõ ñûâîðîòîê. Ýòîò ìåòîä øèðîêî èñïîëüçóåòñÿ â âèðóñîëîãèè áëàãîäàðÿ ñâîåé ñïåöèôè÷íîñòè, äîñòóïíîñòè, áûñòðîòå è îòíîñèòåëüíîé ïðîñòîòå. ÍÌÔÀ äåëàåò âîçìîæíûì ìîðôîëîãè÷åñêîå èçó÷åíèå ïðîöåññîâ âçàèìîîòíîøåíèÿ âèðóñîâ ñ êëåòêàìè, à òàêæå èññëåäîâàíèå äèíàìèêè íàêîïëåíèÿ âèðóñíûõ àíòèãåíîâ â êëåòêå è àíòèãåííûõ ñâÿçåé âèðóñîâ. Äëÿ èíäèêàöèè âèðóñíûõ àíòèãåíîâ æåëàòåëüíî âûáèðàòü îïòèìàëüíûå ñðîêè íàáëþäåíèÿ, êîãäà â êóëüòóðå óæå èìååòñÿ äîñòàòî÷íî áîëüøîå êîëè÷åñòâî èíôèöèðîâàííûõ êëåòîê, íî åùå îòñóòñòâóþò çíà÷èòåëüíûå äåãåíåðàòèâíûå èçìåíåíèÿ, ïðèâîäÿùèå ê ãèáåëè è ñïîñîáñòâóþùèå íåñïåöèôè÷åñêîé îêðàñêå òàêèõ ñòðóêòóð. 3.4.2.1. Ïðèãîòîâëåíèå ïðåïàðàòîâ èíôèöèðîâàííûõ êëåòîê Ïðîöåäóðà ïðèãîòîâëåíèÿ: − êóëüòóðó êëåòîê (Hep-2, FL, RD, Vero) ñ ïîñåâíîé äîçîé 100150 òûñ. êëåòîê/ìë âûðàùèâàþò íà ïîêðîâíûõ ñòåêëàõ â ïðîáèðêàõ èëè ïåíôëàêîíàõ; − ê íå ïîëíîñòüþ ñôîðìèðîâàííîìó ìîíîñëîþ êëåòîê (2-å ñóòêè in vitro) äîáàâëÿþò âûäåëåííûé ðàíåå íà êóëüòóðå èññëåäóåìûé ÖÏÀ èëè âèðóñ â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè (100 ÒÖÄ50 /ìë) ïî 0,2 ìë íà 2 ìë ïîääåðæèâàþùåé ñðåäû; − êóëüòóðó êëåòîê èíêóáèðóþò ñ èññëåäóåìûì ìàòåðèàëîì â òå÷åíèå 1216 ÷ ïðè òåìïåðàòóðå 3636,5°Ñ; − êóëüòóðàëüíóþ æèäêîñòü óäàëÿþò èç ïðîáèðîê èëè ïåíôëàêîíîâ, à ñòåêëà ïðîìûâàþò ôèçðàñòâîðîì èëè ôîñôàòíî-ñîëåâûì áóôåðîì (ðÍ 7,27,4); − êëåòêè íà ñòåêëàõ ôèêñèðóþò îõëàæäåííûì äî -20°Ñ àöåòîíîì èëè ñìåñüþ àöåòîí:ìåòàíîë (1:1). Ïîëó÷åííûå ïðåïàðàòû ìîæíî õðàíèòü ïðè -20°Ñ. # 3.4.2.2. Ïîñòàíîâêà ÍÌÔÀ Îñíîâíûå ýòàïû: − ïðèêðåïèòü ïîêðîâíûå ñòåêëà ñ êëåòêàìè íà ïðåäìåòíîì ñòåêëå è ïðîíóìåðîâàòü; − íàíåñòè íà ôèêñèðîâàííûå êëåòêè ñ àíòèãåíîì äèàãíîñòè÷åñêèå ñûâîðîòêè (êðîëè÷üè) â ðàáî÷èõ ðàçâåäåíèÿõ, óêàçàííûõ íà ýòèêåòêå; − ïîìåñòèòü ñòåêëà ñ íàíåñåííîé ñûâîðîòêîé âî âëàæíóþ êàìåðó è ïîñòàâèòü â òåðìîñòàò ïðè 37°Ñ íà 30 45 ìèí; − ïîñëå îêîí÷àíèÿ èíêóáàöèè ïðîìûòü ñòåêëà òðèæäû â ñîëåâîì ôîñôàòíîì áóôåðå ïî 57 ìèí è ïîäñóøèòü íà âîçäóõå; − íàíåñòè íà ôèêñèðîâàííûå êëåòêè àíòèñûâîðîòêó ïðîòèâ ãëîáóëèíîâ êðîëèêà, ìå÷åííóþ ÔÈÒÖ, â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè; äëÿ óäàëåíèÿ íåñïåöèôè÷åñêîãî ñâå÷åíèÿ ìîæíî äîáàâèòü ýâàíñ-ãîëóáîé â êîíöåíòðàöèè 0,005% èëè àëüáóìèí, ìå÷åííûé ðîäàìèíîì, â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè, ñîãëàñíî ïðèëàãàåìîé èíñòðóêöèè (ïðîèçâîäñòâî Èíñòèòóòà ïîëèîìèåëèòà, ã. Ìîñêâà); − ïîìåñòèòü ñòåêëà âî âëàæíóþ êàìåðó è èíêóáèðîâàòü ïðè 37°Ñ â òå÷åíèå 3045 ìèí; − ïîñëå îêîí÷àíèÿ èíêóáàöèè ïðîìûòü ñòåêëà îäèí ðàç â ôîñôàòíî-ñîëåâîì áóôåðå (ðÍ 7,27,4) ïî 5 ìèí è äâàæäû â äèñòèëëèðîâàííîé âîäå ïî 10 ìèí; − ïàðàëëåëüíî ñ îïèñàííûìè âûøå ìàíèïóëÿöèÿìè ïîñòàâèòü êîíòðîëè ñïåöèôè÷íîñòè ñâå÷åíèÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìîé ê íàáîðó äèàãíîñòè÷åñêèõ ëþìèíåñöèðóþùèõ àíòèâèäîâûõ ñûâîðîòîê èíñòðóêöèåé. Ïîëó÷åííûå ïðåïàðàòû èññëåäóþòñÿ â ëþìèíåñöåíòíîì ìèêðîñêîïå.  ñëó÷àå ïîëîæèòåëüíûõ ðåçóëüòàòîâ â öèòîïëàçìå êëåòîê, ñîäåðæàùèõ àíòèãåíû, îáíàðóæèâàåòñÿ ñâå÷åíèå â âèäå îòäåëüíûõ ñâåòÿùèõñÿ ãðàíóë (ñïóñòÿ 56 ÷ ïîñëå èíôèöèðîâàíèÿ), à çàòåì â âèäå áîëüøîãî âêëþ÷åíèÿ, îòòåñíÿþùåãî ÿäðî êëåòêè ê ïåðèôåðèè, èëè ïåðèíóêëåàðíî ðàñïîëîæåííîãî îäíîðîäíîãî ñâå÷åíèÿ (ñïóñòÿ 1216 ÷ ïîñëå èíôèöèðîâàíèÿ). Îêðàøåííûå ïðåïàðàòû ðåêîìåíäóåòñÿ èçó÷àòü ïîä ìèêðîñêîïîì íåìåäëåííî ïîñëå ïðèãîòîâëåíèÿ. Íàèáîëåå ÿðêàÿ ôëóîðåñöåíöèÿ íàáëþäàåòñÿ â äåíü îêðàñêè. Ïðåïàðàòû ìîæíî ñîõðàíÿòü ïðè +4°Ñ, íî èíòåíñèâíîñòü ôëóîðåñöåíöèè ïîñòåïåííî ïàäàåò. 3.4.3. Îáíàðóæåíèå âèðóñíîé ÐÍÊ ìåòîäîì ÐÒ-ÏÖÐ ÐÒ-ÏÖÐ ïîçâîëÿåò âûÿâèòü ãåíåòè÷åñêèé âèðóñíûé ìàòåðèàë â èññëåäóåìîì ýëþàòå â òå÷åíèå 6 ÷ ñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ (98%) è ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ (96%). 3.4.3.1. Îáðàáîòêà ýëþàòîâ Ïîëó÷åííûé ýëþàò (ðàçäåë 3.1) â îáúåìå 3 ìë: − çàëèòü â öåíòðèôóæíóþ ïðîáèðêó; $ − îñòîðîæíî øïðèöîì íà äíî ïðîáèðêè íàñëîèòü 300 ìêë 10%-é ñàõàðîçû; − âñå ïðîáèðêè òùàòåëüíî óðàâíîâåñèòü ïî îäíîé; − âñòàâèòü ïðîáèðêè â ëþëüêè; − ïîäâåñèòü ëþëüêè ê áàêåò-ðîòîðó SW 50.1; − âñòàâèòü ðîòîð â óëüòðàöåíòðèôóãó; − îñàæäàòü âèðóñ (ÖÏÀ) ïðè ñêîðîñòè 30 000 îá./ìèí â òå÷åíèå 1,5 ÷. Ïîñëå îñàæäåíèÿ âèðóñà (ÖÏÀ): − óäàëèòü ñóïåðíàòàíò; − âèðóñíóþ áëÿøêó ðåñóñïåíäèðîâàòü â 300 ìêë ñòåðèëüíîé äå-èîíèçîâàííîé èëè äèñòèëëèðîâàííîé âîäû; − îñòîðîæíî ñîáðàòü áëÿøêó ñòåðèëüíûì íàêîíå÷íèêîì; − ïåðåíåñòè ðåñóñïåíäèðîâàííûé ìàòåðèàë â ïëàñòèêîâóþ ïðîáèðêó îáúåìîì 0,51,0 ìë. Ïðèãîòîâëåííûå ïðîáû ìîæíî áðàòü ñðàçó â ðåàêöèþ èëè õðàíèòü â õîëîäèëüíèêå ïðè -2050îÑ äî èñïîëüçîâàíèÿ â òå÷åíèå 3 ìåñ. 3.4.3.2. Ïîñòàíîâêà ìåòîäà ÐÒ-ÏÖÐ Äëÿ âûÿâëåíèÿ ÐÍÊ ýíòåðîâèðóñîâ â èññëåäóåìûõ ïðîáàõ ìîæíî èñïîëüçîâàòü êîììåð÷åñêóþ òåñò-ñèñòåìó ôèðìû «Roche» (ÑØÀ). Èññëåäîâàíèÿ âûïîëíÿþòñÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìîé èíñòðóêöèåé. 3.5. Îïðåäåëåíèå êîëèôàãîâ â âîäå 3.5.1. Îòáîð ïðîá Ïðîáû îòáèðàþò â ñòåðèëüíûå åìêîñòè ñ ñîáëþäåíèåì ïðàâèë ñòåðèëüíîñòè. Áóìàæíûé êîëïà÷îê ñ ôëàêîíà ñíèìàþò âìåñòå ñ ïðîáêîé íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä îòáîðîì ïðîáû, íå êàñàÿñü ïðîáêè ðóêàìè. Íàïîëíåííûå åìêîñòè çàêðûâàþò ïðèòåðòûìè ïðîáêàìè (ñèëèêîíîâûìè, ðåçèíîâûìè èëè èç äðóãèõ ìàòåðèàëîâ) è ñòåðèëüíûìè áóìàæíûìè êîëïà÷êàìè. Ìíîãîðàçîâàÿ ïîñóäà äëÿ îòáîðà ïðîá, â òîì ÷èñëå è ïðîáêè, äîëæíà ïîäâåðãàòüñÿ ñòåðèëèçàöèè ñóõèì æàðîì èëè àâòîêëàâèðîâàíèåì. 3.5.2. Ìåòîä îïðåäåëåíèÿ Îïðåäåëåíèå êîëèôàãîâ â âîäå ïðîâîäÿò ìåòîäîì îäíîñëîéíîãî àãàðà â ñîîòâåòñòâèè ñ ñóùåñòâóþùèìè íîðìàòèâíî-ìåòîäè÷åñêèìè äîêóìåíòàìè. % Ïðèëîæåíèå 1 ÎÑÍÎÂÍÛÅ ÌÀÒÅÐÈÀËÛ È ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈÅ 1. Àâòîêëàâ 2. Àâòîìàòè÷åñêèå ìèêðîïèïåòêè ñî ñòåðèëüíûìè íàêîíå÷íèêàìè* 3. Àíàëèçàòîð èììóíîôåðìåíòíûé ÀÈÔ-340 èëè ìóëüòèñêàí 4. Âåñû àíàëèòè÷åñêèå 5. Âåñû òåõíè÷åñêèå àïòå÷íûå 6. Âåñû òîðñèîííûå 7. Âûòÿæíîé øêàô ñ ëàìèíàðíûì ïîòîêîì äëÿ êóëüòóðû êëåòîê** 8. Âûòÿæíîé øêàô ñ ëàìèíàðíûì ïîòîêîì (êëàññà II) ** 9. Èíñòðóìåíòû ëàáîðàòîðíûå: ïèíöåòû, íîæíèöû, ñîâîê äëÿ âçâåøèâàíèÿ 10. Èîíîìåð (ðÍ-121) 11. Ìèêðîñêîï èíâåðòèðîâàííûé 12. Ìèêðîñêîï ëþìèíåñöåíòíûé 13. Ïèïåòêè ñòåêëÿííûå íà 1, 5, 10 ìë 14. Ïîñóäà ëàáîðàòîðíàÿ (÷àøêè Ïåòðè, êîëîíêè 1020 ìë, êîëáû) 15. Ïðîáèðêè 16. Ñòåêëà ïðåäìåòíûå è ïîêðîâíûå 17. Ñòåðèëüíàÿ êëåéêàÿ ëåíòà äëÿ çàêëåèâàíèÿ êóëüòóðàëüíûõ ïàíåëåé 18. Ñòåðèëüíûå ïëîñêîäîííûå 24-ëóíî÷íûå ïëàñòèêîâûå ïëàíøåòû 19. Ñòåðèëüíûå ïëîñêîäîííûå 96-ëóíî÷íûå ïëàñòèêîâûå ïëàíøåòû 20. Ñòåðèëüíûå ñòåêëÿííûå ôëàêîíû äëÿ êóëüòóðû êëåòîê (ïåíôëàêîíû åìêîñòüþ 25, 50 ìë) 21. Òåðìîñòàò, ðåãóëèðóåìûé äî 37îÑ+1îÑ 22. Òåðìîñòàò ÑÎ2 èíêóáàòîð* 23. Óëüòðàöåíòðèôóãà*** 24. Õîëîäèëüíèêè (-20îÑ, +4îÑ) 25. Öåíòðèôóãà ðåôðèæåðàòîðíàÿ íà 1-5 òûñ. îá./ìèí 26. Öåíòðèôóæíûå ïëàñòèêîâûå ïðîáèðêè îáúåìîì 0,51,0 ìë 27. Øïðèöû 28. Øòàòèâû (äëÿ ôèêñàöèè ôëàêîíîâ) 29. Øþòòåëü-àïïàðàò *äëÿ ìèêðîìåòîäà ðåàêöèè íåéòðàëèçàöèè **æåëàòåëüíî ***äëÿ ïîñòàíîâêè ÐÒ-ÏÖÐ & Ïðèëîæåíèå 2 ÎÑÍÎÂÍÛÅ ÐÅÀÊÒÈÂÛ È ÐÅÀÃÅÍÒÛ 1. Àëüáóìèí, ìå÷åííûé ðîäàìèíîì 2. Àíòèáèîòèêè: ãåíòàìèöèí, àìôîòåðèöèí 3. Àíòèñûâîðîòêà ïðîòèâ ãëîáóëèíîâ êðîëèêà, ìå÷åííàÿ ÔÈÒÖ 4. Àöåòîí 5. Áèô-ýêñòðàêò (Sigma, õ.÷.) 6. Âîäà äåèîíèçèðîâàííàÿ (èëè äèñòèëëèðîâàííàÿ âîäà, ñòåðèëèçîâàííàÿ àâòîêëàâèðîâàíèåì ïðè 121îÑ+1îÑ â òå÷åíèå 20 ìèí) 7. Äèýòèëîâûé ýôèð, õ.÷. 8. Êîììåð÷åñêàÿ òåñò-ñèñòåìà ôèðìû «Roche» (CØA) äëÿ ÏÖÐ 9. Êóëüòóðàëüíûå ïèòàòåëüíûå ñðåäû: ÌÅÌ, Èãëà ÌÅÌ, 199, ãåìîãèäðîëèçàò 10. Ìåòèëîâûé ñïèðò (ìåòàíîë, õ. ÷. ÃÎÑÒ 699577) 11. NàÑl (íàòðèé õëîðèñòûé, õ.÷.) 12. Ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûå ëèíèè êëåòîê ÏÝ×, ÔÝ× 13. Ïåðåâèâàåìûå ëèíèè êëåòîê RD, BGM, Hep-2, FL, Vero 14. 33%-ÿ ïåðåêèñü âîäîðîäà (ÒÓ 60257075 ÎÑ.×) 15. Ðàñòâîð Õåíêñà (ðÍ 7,4) 16. 10%-ÿ ñàõàðîçà 17. Ñèëèêîíîâîå ìàñëî 18. ÍÑ1 (ñîëÿíàÿ êèñëîòà, õ. ÷., ÃÎÑÒ 3118-77, 3538%) 19. Ñûâîðîòêè äèàãíîñòè÷åñêèå ýíòåðîâèðóñíûå ñóõèå (äëÿ ðåàêöèè íåéòðàëèçàöèè, ãðóïïîñïåöèôè÷åñêèå è òèïîñïåöèôè÷åñêèå) 20. Ñûâîðîòêà êðîâè ýìáðèîíîâ êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà 21. Òåñò-ñèñòåìà èììóíîôåðìåíòíàÿ äëÿ âûÿâëåíèÿ àíòèãåíîâ âèðóñà ãåïàòèòà À 22. Òåñò-ñèñòåìà èììóíîôåðìåíòíàÿ äëÿ âûÿâëåíèÿ àíòèãåíîâ ðîòàâèðóñà 23. Òðèñ-ÍÑ1 (õ.÷.) 24. Ôîñôàòíî-ñîëåâîé áóôåð (ðÍ 7,27,4) 25. Õåïåñ (áóôåð 4-(2-ãèäðîêñèýòèë)-1-ïèïåðàçèíýòàíîëñóëüôîíîâàÿ êèñëîòà) 26. Õëîðîôîðì (õ. ÷.) 27. Ýâàíñ-ãîëóáîé 28. Ýòèëîâûé ñïèðò (ýòàíîë, ÃÎÑÒ 596267) '
