Использование инертных газов для консервации клеток и тканей

Использование инертных газов для консервации клеток и тканей
137
А. Н. Худяков*, О. Н. Соломина*, О. О. Зайцева*,
Т. В. Полежаева*, С. В. Утёмов**, М. Г. Князев**, А. А. Костяев**

Использование инертных газов
для консервации клеток и тканей
* ФГБУН Институт физиологии Коми НЦ Уральского отделения РАН
** ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России»
В
настоящее время инертные газы активно применяются
в различных отраслях биологии и медицины (Preckel B. et al.,
2004; Abraini J. H. et al., 2005; Coburn M. et al., 2008; Campos-Pires R.
et al., 2010; Liu W. et al., 2011; Esencan E. et al., 2013;
Fahlenkamp A. V. et al., 2014).
Применение ксенона и других инертных газов в комплексе
с температурным воздействием позволяет избежать пагубного
влияния ишемии на различные органы и части тела. Так, (Ma D.
et al., 2005; Ma D. et al., 2006) была выявлена высокая нейропротекторная активность ксенона при охлаждении клеток мозга до
температуры гипотермии. In vivo исследования проводились на
подвергшихся асфиксии новорожденных крысах. Было отмечено,
что предварительное воздействие ксенона уменьшало размеры
инфаркта мозга. Более того, в течение месяца сохранялось улучшение неврологического статуса. Подобные исследования проводятся на клетках человека (Lobo N. et al., 2013). Помимо ксенона аналогичным действием обладает также аргон, а другие
инертные газы, такие как неон и криптон, в условиях in vitro не
оказывают протекторное действие, а гелий вообще ухудшает состояние культуры нейронных клеток животных (Jawad N. et al.,
2009). Охлаждение в комплексе с насыщением ксеноном значительно повышают выживаемость донорских органов, в частности почек и сердечной мышцы крыс (Zhao H. et al., 2013;
Roehl A. B. et al., 2013). Помимо протекторного действия инертных газов на клетки и органы при охлаждении до 0+4°С, в работе
Сабрины Спагьяри и соавт. (Spaggiari S. et al., 2013) зафиксирован
138
Вопросы экспериментальной, производственной и клинической …
антиапоптический эффект от применения ксенона и аргона в отношении клеток и митохондрий.
Использование инертных газов в качестве криопротекторов при замораживании до низких температур было предложено
Робертом Прегода ещё в 60 гг. XX в. (Prehoda R. W., 1969). В последующие годы эта идея не привлекала большого внимания, и
количество исследований в этом направлении было небольшим.
Однако, начиная с середины 80-х годов, появляются работы, посвящённые применению инертных газов как вспомогательного
компонента при криоконсервировании тканей и органов (Родин В. В. и соавт., 1984; Родин В. В. и соавт., 1986).
В 2006 г. (Щербаков П. В., Тельпухов В. И., 2006) было осуществлено успешное замораживание крысы до –196°С в специально разработанной барокамере-капсуле в среде тяжелых
инертных газов. Выделенное после разморозки сердце животного восстанавливало сократительную активность у крысыреципиента. Однако данные исследования по ряду причин были
прекращены. В США (Sheleg S. et al., 2008) была проведена
успешная заморозка кардиомиоцитов мышей в барокамере в
среде «ксенон-кислород» в парах жидкого азота. Согласно данным электронной микроскопии указанная смесь газов эффективно сохраняет митохондрии клеток. Пульвер А. Ю. и соавторы
(2014) проводили замораживание пекарских дрожжей
S. cerevisidae и культур клеток млекопитающих с ксеноном в качестве криопротектора. Выживаемость дрожжей при парциальных давлениях ксенона в диапазоне от 2,5 до 11 атм. оказалась
выше, чем при использовании стандартных (5% ДМСО или глицерин) криопротекторов, от 35±6 до 68,5±6%; при совместном
применении ксенона и ДМСО обнаружились признаки сочетанного криопротекторного действия (выживаемость 71±15%).
Однако в экспериментах по программному замораживанию суспензий культуральных клеток млекопитающих при указанных
выше парциальных давлениях ксенона во время согревания
происходило полное разрушение клеток. В экспериментах с высокими скоростями охлаждения (максимально быстрое охлаждение от 0°С до –196°С путем погружения барокамеры в жидкий азот) с 7 атм. ксенона показана низкая клеточная выживаемость 22,5 ± 13,4 %.
О. Г. Макеев и соавторы в своих работах (Макеев О. Г. и соавт., 2011; Ponomarev A. et al., 2013) использовали ксенон и другие инертные газы для замораживания, хранения и последующего отогрева стволовых клеток и участков кожи человека. Флаконы для криоконсервации с культурой клеток помещали в холо-
Использование инертных газов для консервации клеток и тканей
139
дильник Sanyo MDF-192 при ‒70°С. В последующем пробы хранили в парах жидкого азота при температуре ‒150°С в течение
48 часов и 6 месяцев. В результате жизнеспособность стволовых
клеток сохранилась на прежнем уровне (число дегенеративных
клеточных форм не отличалось от контрольных показателей),
однако при последующей пролиферации они все погибли. Клетки кожи руки, в отличие от стволовых клеток, не только хорошо
перенесли процедуру замораживания-хранения-отогрева, но и
хорошо культивировалась в последующие 25 суток.
Необходимо отметить, что как в отечественной, так и в зарубежной литературе не встречаются работы по замораживанию
высокодифференцированных клеток крови, а исследования на
стволовых клетках ограничивались лишь оценкой показателей
морфологической сохранности. Таким образом, остается актуальной проблема поиска новых эффективных технологий сохранения клеток в полноценном состоянии при низких температурах замораживания с применением инертных газов.
В лаборатории криофизиологии крови под руководством
д.м.н. профессора Е. П. Сведенцова исследовалась возможность
консервации лейкоцитов крови человека в среде инертного газа
ксенона. Объектом исследования явились лейкоцитные концентраты, полученные из цельной крови доноров-добровольцев методом дискретного цитафереза. Лейкоцитные концентраты в
пластикатном контейнере «Компопласт» 300, помещенном в
разработанный бароконтейнер, насыщали инертным газом ксеноном под давлением 6 атм., выдерживали при комнатной температуре (21 град С) в течение 20 минут. Затем пластикатный
контейнер извлекали из металлического после удаления избытка газа. Замораживание биообъекта осуществляли по двухступенчатой программе: в охлажденной до –28 град С спиртовой
(96°) ванне морозильника «Криостат» в течение 15 мин, затем в
воздушной среде электроморозильника на –80°С, где хранили в
течение 1 и 30 суток. Быстрый отогрев производили в водяной
ванне (38°С) в течение 35-50 сек до температуры биообъекта
+2÷+4°С.
При отогреве через 1 сутки хранения взвеси клеток (n=10)
сохранность общего количества лейкоцитов составила 97,6±2,5%
(от исходного уровня), их жизнеспособность – 64,5±14,4%, число
гранулоцитов – 86,0±11,0%, уровень лизосомально-катионных
белков (ЛКБ) нейтрофилов статистически значимо (p<0,05) не
отличался от исходного уровня. Анализ полученных хемилюминограмм показал, что у лейкоцитов в среде ксенона в первые минуты после отогрева через 1 сутки отмечается совместное и рав-
140
Вопросы экспериментальной, производственной и клинической …
нозначное снижение показателей интенсивности перекисного
окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной активности (АОА),
что, возможно, связано с постепенным удалением газа из клеточной взвеси и медленным восстановлением процессов метаболизма в отогретых лейкоцитах. После 30 суток хранения при ‒
80°С (n=10) по большинству показателей (общее количество
лейкоцитов, гранулоцитов, устойчивость мембран клеток к
эозину, количество ЛКБ, ПОЛ, АОА) не наблюдалось статистически значимого различия (p<0,05) в сравнении с таковыми через
1 сутки.
Таким образом, разработана и применена на практике методика насыщения клеточной взвеси инертным газом (ксенон)
для последующего охлаждения и хранения при отрицательных
(–80°С) температурах.