2pc101

II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ,
Казань, 24–27 июня 2002 г
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
ПРИМЕНЕНИЕ СИЛЬНЫХ КАТИОНООБМЕННИКОВ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ
ПЕКТИНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ СТРУКТУРНОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПОЛИСАХАРИДОВ
А.Г.Донцов, О.В.Попейко, А.В.Артеева
Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, [email protected]
Направленный ферментативный гидролиз является важным инструментом структурно-химического
исследования природных полисахаридов. Основным требованием к ферментным препаратам является их
высокая чистота по составу белков (гомогенность) и количеству примесей углеводов и пектиновых веществ,
наличие которых может исказить результаты анализа состава продуктов ферментолиза полисахаридов.
Как правило, фермент присутствует в культуральной жидкости в виде фермент-субстратного комплекса (ФСК), что значительно затрудняет процесс очистки. Связь фермента с субстратом достаточно прочна,
но не является ковалентной. ФСК разрушается при термической диссоциации или за счет вытеснения
субстрата при образовании более прочных ионных пар с другими реагентами. ФСК имеет меньшую
удельную активность по сравнению с чистым ферментом, но более высокую термо- и рН-стабильность.
Нами исследована возможность использования сильных катионитов Амберлит CG-120, КУ-2, а также
смолы КБ-4 для разрушения ФСК при выделении полигалактуроназ из ферментного препарата Пектофоетидин Г3х (ПФ), получаемого глубинным культивированием гриба Aspergillus foetidus. Установлено, что
максимальное поглощение ферментов смолами наблюдается при рН 3,5. При увеличении рН эффективность
извлечения ферментов снижается, а при рН выше 5,0 полигалактуроназная (ПГ) активность раствора после
обработки смолами CG-120 и КУ-2 увеличивается на 20-50 %. Это связано, по-видимому, с удалением
свободных ионов металлов, ингибирующих ферменты, а также катионов, входящих в состав ФСК.
Выделение ферментов сильными катионообменниками при рН 4,0-5,0 сопровождается также увеличением выхода активности после десорбции в 1,25-1,50 раза от количества поглощенного смолой фермента.
Это может свидетельствовать о разрушении ФСК в результате образования более прочной ионной пары
фермент-смола и вытеснения остатков субстрата из состава комплекса, что приводит к увеличению подвижности молекул ферментов и росту их активности.
Наибольшей избирательностью извлечения полигалактуроназ отличается смола КБ-4: ее использование при рН 3,5-4,5 позволяет получить после десорбции раствор с удельной ПГ-активностью в 3-10 раз выше, по сравнению со смолами КУ-2 и CG-120. Однако обменная емкость смолы КБ-4 значительно ниже в
сравнении со смолами КУ-2 и CG-120, что снижает технологичность процесса очистки при ее использовании. При рН 5,0 и выше избирательность смол КУ-2, CG-120 и КБ-4 отличается незначительно.
Таким образом, сильные катионообменники весьма эффективны при выделении полигалактуроназ в
тех случаях, когда ферменты образуют комплексы с субстратом. Однако их применение требует строгого
ограничения условий обработки для предотвращения инактивации ферментов в кислой среде. в результате
смещения рН в кислую область на 0,5-1,0 единиц у поверхности катионообменника (эффект Доннана).
Процесс получения очищенного препарата полигалактуроназы включал коагуляционное осветление
культуральной жидкости хлоридом кальция в среде фосфатного буфера с рН 6,0, обработку раствора смолой
КУ-2 при рН 6,0 для удаления ионов металлов, концентрирование и диафильтрацию на половолоконном
модуле с пределом пропускания 15 кДа при 4°С, автогидролиз в процессе диафильтрации при 35-37°С в
присутствии стабилизаторов (глицерин, Трилон Б, неактивный белок), сорбцию-десорбцию ферментов
смолой КУ-2 (50-100 мкм) при рН 4,5-5,0. Удельная ПГ-активность фермента на данном этапе очистки
составила 1060 ед/мг белка, при выходе 130,6 %.
Дальнейшую очистку проводили методом твердофазной экстракции: 150 мл сконцентрированного
ферментного раствора пропускали через колонку с гидроксиапатитом (100-250 мкм), термостатированную
при 4°С, промывали ее 50 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера (КФБ) с рН 6,0, после чего элюировали
активную фракцию 50 мл 0,25 М КФБ. Полученный раствор фермента фракционировали на колонке с
Toyopearl HW-50, отбирая фракцию с молекулярной массой около 42 кДа. Сухой препарат получали с помощью лиофильной сушки. Конечное значение удельной активности препарата составило 2090 ед/мг белка,
что соответствовало степени очистки в 8,8 раза.
Результаты ферментативного гидролиза пектиновых полисахаридов, выделенных из смолевки обыкновенной Silene vulgaris (каллус и интактное растение), с последующим анализом гидролизатов методами
ГЖХ и бумажной хроматографии показали возможность использования препарата без дополнительной
очистки в связи с низким уровнем фонового содержания нейтральных и кислых сахаров в гидролизатах.
92
II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ. Стендовый доклад