Донцов А.Г., Попейко О.В., Артеева А.В. ПОЛУЧЕНИЕ

Реклама
высокую антибактериальную активность в отношении синегнойной и
кишечной палочек, а также фунгистатическое действие в отношении
грибов рода Кандида. Токсиколого-гигиеническая оценка данного
экстракта подтвердила абсолютную его безвредность. Получено
заключение, разрешающее применение спиртоводного экстракта
сфагнового мха в качестве биологически активной добавки в
косметические препараты.
ПОЛУЧЕНИЕ ПЕКТИНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО
ПРЕПАРАТА ДЛЯ СТРУКТУРНО-ХИМИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ ПОЛИСАХАРИДОВ
А.Г. Донцов, О.В. Попейко, А.В. Артеева
Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, ул. Первомайская,
50, Сыктывкар, Республика Коми, 167982 (Россия)
e-mail: [email protected]
Направленный ферментативный гидролиз является важным
инструментом структурно-химического исследования природных
полисахаридов. Основным требованием к ферментным препаратам
является их высокая чистота как по составу белков (гомогенность), так
и по количеству примесей углеводов и пектиновых веществ (остатков
субстрата), наличие которых может исказить результаты анализа
состава продуктов ферментолиза полисахаридов.
Затруднения, возникающие при получении высокоочищенных
ферментных препаратов, определяются тем, что часто фермент
присутствует в культуральной жидкости в виде фермент-субстратного
комплекса (ФСК), который проявляет свойства индивидуального
соединения. Связь фермента с субстратом достаточно прочна, но не
является ковалентной. ФСК разрушается в результате термической
диссоциации или за счет вытеснения остатков субстрата при
образовании более прочных ионных пар с другими реагентами. ФСК
имеет меньшую удельную активность по сравнению с чистым
ферментом, но более высокую термо- и рН-стабильность.
162
Нами исследована возможность использования сильных
катионитов Амберлит CG-120, КУ-2, а также смолы КБ-4 для
разрушения ФСК при выделении полигалактуроназ из ферментного
препарата пектофоетидин Г3х (ПФ), получаемого глубинным
культивированием гриба Aspergillus foetidus.
При обработке смолами CG-120, КУ-2 и КБ-4 (фракции 50-100
мкм) раствора ПФ с концентрацией 10 г/дм3 при различных значениях
рН максимальное поглощение ферментов наблюдается при рН 3,5
(рис. 1). При увеличении рН эффективность извлечения ферментов
снижается, а при рН выше 5,0 полигалактуроназная (ПГ) активность
раствора после обработки смолами CG-120 и КУ-2 увеличивается по
сравнению с исходной на 20–50%. (1 единица ПГ-активности –
количество фермента, способствующее образованию 1 ммоль
D-галактуроновой кислоты из полигалактуроновой кислоты за 1 мин
при рН 4,0 и 50°С).
По-видимому, обработка при рН 5,0-6,0 способствует удалению
свободных ионов металлов, которые ингибируют ферменты, а также
катионов, входящих в состав ФСК.
Выделение ферментов сильными катионообменниками при рН
3,5–4,0 может привести к их инактивации и даже к денатурации в
результате смещения рН в кислую область на 0,5–1,0 единиц у
поверхности
катионообменника
(эффект
Доннана).
Поэтому
фактическую эффективность катионообменника для выделения
фермента целесообразно оценивать по выходу ПГ-активности после
десорбции фермента со смолы.
Активность,
% от
исходной
1
200
2
150
3
100
50
0
3
4
5
6
рН
Рис. 1. ПГ-активность
раствора пектофоетидина при
обработках смолами: 1 – КУ2, 2 – CG-120, 3 – КБ-4
163
При работе в диапазоне рН 4,0–5,0 выход активности после
десорбции увеличивается в 1,25–1,50 раза от количества
адсорбированного фермента (рис. 2). Это может свидетельствовать о
разрушении ФСК в результате образования более прочной ионной пары
фермент–смола и вытеснения остатков субстрата из состава комплекса,
что приводит к увеличению подвижности молекул фермента и росту
его активности. Снижение выхода при рН раствора ниже 4,0 связано с
действием упомянутого эффекта Доннана.
Наибольшей избирательностью извлечения полигалактуроназ
отличается смола КБ-4 (рис. 3): ее использование при рН 3,5–4,5
позволяет получить после десорбции белковые фракции с удельной
ПГ-активностью в 3–10 раз выше, по сравнению со смолами КУ-2 и
CG-120. Однако обменная емкость смолы КБ-4 значительно ниже по
сравнению с аналогичным показателем смол КУ-2 и CG-120, что
снижает технологичность процесса очистки при ее использовании. При
рН 5,0 и выше избирательность смол КУ-2, CG-120 и КБ-4 отличается
незначительно.
Таким образом, сильные катионообменники весьма эффективны
при выделении полигалактуроназ в тех случаях, когда ферменты
образуют комплексы с субстратом. Однако их применение требует
строгого ограничения условий обработки.
Еуд, ед/мг
3
белка
Выход, %
1
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
2500
2
2000
1500
1
1000
3
pH
3
3,5
4
4,5
5
5,5
Рис. 2. Выход фермента после
десорбции: 1 – КУ-2; 2 – CG-120;
3 – КБ-4
164
2
500
рН
0
3
3,5
4
4,5
5
5,5
Рис. 3. Удельная активность
полигалактуроназы после
десорбции со смолами: 1 – КУ-2; 2 –
CG-120; 3 – КБ-4
На
основании
полученных
результатов
предложен
комбинированный способ получения очищенных препаратов
полигалактуроназы,
включающий
коагуляционное
осветление
культуральной жидкости хлоридом кальция в среде фосфатного буфера
с рН 6,0, обработку раствора смолой КУ-2 при рН 6,0 для удаления
ионов
металлов,
концентрирование
и
диафильтрацию
на
половолоконном модуле с пределом пропускания 15 кДа при 4°С,
автогидролиз в процессе диафильтрации при 35–37°С в присутствии
стабилизаторов (глицерин, Трилон Б, неактивный белок), сорбциюдесорбцию ферментов смолой КУ-2 (50–100 мкм) при рН 4,5–5,0,
концентрирование и лиофилизацию препарата.
Способ позволил получить препарат полигалактуроназы с более
высокой, по сравнению с известными аналогами, удельной ПГактивностью – 1060 ед/мг белка (пектиназа «Sigma» – 10,9 ед/мг белка,
пектиназа «Serva» – 120 ед/мг белка). Выход фермента (по общей
активности) составил 130,6%.
Результаты
ферментативного
гидролиза
пектиновых
полисахаридов, выделенных из смолевки обыкновенной Silene vulgaris
(каллус и интактное растение), с последующим анализом гидролизатов
методами ГЖХ и бумажной хроматографии показали возможность
использования препарата без дополнительной очистки в связи с низким
уровнем фонового содержания нейтральных и кислых сахаров в
гидролизатах.
ПОЛУЧЕНИЕ ФУРФУРОЛА ПУТЕМ ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ
ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Fe3+
Е.В. Нестерова, В.А. Елкин
Санкт-Петербургская государственная лесотехническая
академия им. С.М. Кирова, Институтский пер., 5, СанктПетербург, 194021 (Россия) e-mail: [email protected]
Фурфурол – ценный химический продукт, широко используемый в
промышленности органического синтеза. Разнообразие путей его
применения объясняет все возрастающий спрос на этот продукт.
165
Скачать