высокую антибактериальную активность в отношении синегнойной и кишечной палочек, а также фунгистатическое действие в отношении грибов рода Кандида. Токсиколого-гигиеническая оценка данного экстракта подтвердила абсолютную его безвредность. Получено заключение, разрешающее применение спиртоводного экстракта сфагнового мха в качестве биологически активной добавки в косметические препараты. ПОЛУЧЕНИЕ ПЕКТИНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ СТРУКТУРНО-ХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПОЛИСАХАРИДОВ А.Г. Донцов, О.В. Попейко, А.В. Артеева Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, Республика Коми, 167982 (Россия) e-mail: [email protected] Направленный ферментативный гидролиз является важным инструментом структурно-химического исследования природных полисахаридов. Основным требованием к ферментным препаратам является их высокая чистота как по составу белков (гомогенность), так и по количеству примесей углеводов и пектиновых веществ (остатков субстрата), наличие которых может исказить результаты анализа состава продуктов ферментолиза полисахаридов. Затруднения, возникающие при получении высокоочищенных ферментных препаратов, определяются тем, что часто фермент присутствует в культуральной жидкости в виде фермент-субстратного комплекса (ФСК), который проявляет свойства индивидуального соединения. Связь фермента с субстратом достаточно прочна, но не является ковалентной. ФСК разрушается в результате термической диссоциации или за счет вытеснения остатков субстрата при образовании более прочных ионных пар с другими реагентами. ФСК имеет меньшую удельную активность по сравнению с чистым ферментом, но более высокую термо- и рН-стабильность. 162 Нами исследована возможность использования сильных катионитов Амберлит CG-120, КУ-2, а также смолы КБ-4 для разрушения ФСК при выделении полигалактуроназ из ферментного препарата пектофоетидин Г3х (ПФ), получаемого глубинным культивированием гриба Aspergillus foetidus. При обработке смолами CG-120, КУ-2 и КБ-4 (фракции 50-100 мкм) раствора ПФ с концентрацией 10 г/дм3 при различных значениях рН максимальное поглощение ферментов наблюдается при рН 3,5 (рис. 1). При увеличении рН эффективность извлечения ферментов снижается, а при рН выше 5,0 полигалактуроназная (ПГ) активность раствора после обработки смолами CG-120 и КУ-2 увеличивается по сравнению с исходной на 20–50%. (1 единица ПГ-активности – количество фермента, способствующее образованию 1 ммоль D-галактуроновой кислоты из полигалактуроновой кислоты за 1 мин при рН 4,0 и 50°С). По-видимому, обработка при рН 5,0-6,0 способствует удалению свободных ионов металлов, которые ингибируют ферменты, а также катионов, входящих в состав ФСК. Выделение ферментов сильными катионообменниками при рН 3,5–4,0 может привести к их инактивации и даже к денатурации в результате смещения рН в кислую область на 0,5–1,0 единиц у поверхности катионообменника (эффект Доннана). Поэтому фактическую эффективность катионообменника для выделения фермента целесообразно оценивать по выходу ПГ-активности после десорбции фермента со смолы. Активность, % от исходной 1 200 2 150 3 100 50 0 3 4 5 6 рН Рис. 1. ПГ-активность раствора пектофоетидина при обработках смолами: 1 – КУ2, 2 – CG-120, 3 – КБ-4 163 При работе в диапазоне рН 4,0–5,0 выход активности после десорбции увеличивается в 1,25–1,50 раза от количества адсорбированного фермента (рис. 2). Это может свидетельствовать о разрушении ФСК в результате образования более прочной ионной пары фермент–смола и вытеснения остатков субстрата из состава комплекса, что приводит к увеличению подвижности молекул фермента и росту его активности. Снижение выхода при рН раствора ниже 4,0 связано с действием упомянутого эффекта Доннана. Наибольшей избирательностью извлечения полигалактуроназ отличается смола КБ-4 (рис. 3): ее использование при рН 3,5–4,5 позволяет получить после десорбции белковые фракции с удельной ПГ-активностью в 3–10 раз выше, по сравнению со смолами КУ-2 и CG-120. Однако обменная емкость смолы КБ-4 значительно ниже по сравнению с аналогичным показателем смол КУ-2 и CG-120, что снижает технологичность процесса очистки при ее использовании. При рН 5,0 и выше избирательность смол КУ-2, CG-120 и КБ-4 отличается незначительно. Таким образом, сильные катионообменники весьма эффективны при выделении полигалактуроназ в тех случаях, когда ферменты образуют комплексы с субстратом. Однако их применение требует строгого ограничения условий обработки. Еуд, ед/мг 3 белка Выход, % 1 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 2500 2 2000 1500 1 1000 3 pH 3 3,5 4 4,5 5 5,5 Рис. 2. Выход фермента после десорбции: 1 – КУ-2; 2 – CG-120; 3 – КБ-4 164 2 500 рН 0 3 3,5 4 4,5 5 5,5 Рис. 3. Удельная активность полигалактуроназы после десорбции со смолами: 1 – КУ-2; 2 – CG-120; 3 – КБ-4 На основании полученных результатов предложен комбинированный способ получения очищенных препаратов полигалактуроназы, включающий коагуляционное осветление культуральной жидкости хлоридом кальция в среде фосфатного буфера с рН 6,0, обработку раствора смолой КУ-2 при рН 6,0 для удаления ионов металлов, концентрирование и диафильтрацию на половолоконном модуле с пределом пропускания 15 кДа при 4°С, автогидролиз в процессе диафильтрации при 35–37°С в присутствии стабилизаторов (глицерин, Трилон Б, неактивный белок), сорбциюдесорбцию ферментов смолой КУ-2 (50–100 мкм) при рН 4,5–5,0, концентрирование и лиофилизацию препарата. Способ позволил получить препарат полигалактуроназы с более высокой, по сравнению с известными аналогами, удельной ПГактивностью – 1060 ед/мг белка (пектиназа «Sigma» – 10,9 ед/мг белка, пектиназа «Serva» – 120 ед/мг белка). Выход фермента (по общей активности) составил 130,6%. Результаты ферментативного гидролиза пектиновых полисахаридов, выделенных из смолевки обыкновенной Silene vulgaris (каллус и интактное растение), с последующим анализом гидролизатов методами ГЖХ и бумажной хроматографии показали возможность использования препарата без дополнительной очистки в связи с низким уровнем фонового содержания нейтральных и кислых сахаров в гидролизатах. ПОЛУЧЕНИЕ ФУРФУРОЛА ПУТЕМ ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Fe3+ Е.В. Нестерова, В.А. Елкин Санкт-Петербургская государственная лесотехническая академия им. С.М. Кирова, Институтский пер., 5, СанктПетербург, 194021 (Россия) e-mail: [email protected] Фурфурол – ценный химический продукт, широко используемый в промышленности органического синтеза. Разнообразие путей его применения объясняет все возрастающий спрос на этот продукт. 165