Лекция №11 Патогенные спирохеты. Возбудители сифилиса, боррелиозов (возвратный тиф и болезнь Лайма), лептоспироза. 1. 2. 3. 4. План лекции: Общая характеристика и особенности строения спирохет, их классификация Сифилис: возбудитель, патогенез, клиника, диагностика, лечение, профилактика Боррелиозы, общая характеристика Лептоспироз, общая характеристика 5. Общая характеристика и особенности строения спирохет, их классификация Относятся к порядку Spirochetales, семейству SPIROCHAETACAE Спирохеты – это подвижные спиралевидные бактерии. Тело спирохет состоит из: 1) Наружной клеточной оболочки 2) Протоплазматического цилиндра В толще клеточной оболочки находится двигательный аппарат, представленный фибриллами, один конец которых закреплен вблизи полюса цилиндра, а другой свободен. Фибриллы обеспечивают 3 типа движения в жидкой среде: перемещение, вращение вокруг продольной оси и изгибание. Спирохеты грамотрицательны, дифференциальный метод окраски по РомановскомуГимзе, интенсивность окраски по этому методу родоспецифична. В патологии человека значение имеют 3 рода: Treponema. Borrelia. Leptospira Род Treponema 6. Сифилис: возбудитель, патогенез, клиника, диагностика, лечение, профилактика В патологии человека имеют значение 2 вида патогенных трепонем Род Treponema; вид-T. pallidum Подвиды-1) pallidum- эпидемический сифилис 2) endemicum- эндемический сифилис 3) pertenue- фрамбезия вид- T.carateum-возбудитель пинты Возбудитель сифилиса: бледная трепонема-Treponema pallidum, подвид pallidum Морфология: спирохета, имеющая 8-12 равномерных завитков, от каждого полюса клетки отходит по 3 фибриллы. По Романовскому – Гимзе окрашиваются в бледнорозовый цвет. В окрашенных препаратах она неотличима от непатогенных трепонем, обитающих в ротовой полости, пищеварительном тракте и половых органах. (T.vincentii в ассоциации с фузобактериями участвует в развитии некротической ангины ВенсанаПлаута). Их дифференцируют при темно-польной микроскопии по характеру движений: у T. Pallidum –нежные поступательные, реже сгибательные, вращательные; у непатогенных трепонем- грубые движения. Культуральные свойства: Анаэроб. На исскуственных средах вирулентные штаммы не культивируется, растут в яичке кролика. Биохимия изучена плохо. Антигенная структура: имеет специфический термолабильный белковый антиген и неспецифический липоидный антиген, идентичный по своему составу кардиолипину сердца быка. Факторы патогенности: изучены плохо, патогенные свойства связаны с инвазивностью и устойчивостью к фагоцитозу; в организме несколько трепонем могут покрываться общей полисахаридной оболочкой, образуя покоящиеся формы – цисты. Это затрудняет лечение сифилиса. Эпидемиология: T. Pallidum неустойчива во внешней среде. Источник инфекции – больной человек. Пути передачи – половой, реже контактно-бытовой ( при поцелуях, через инфицированную посуду, губную помаду, сигареты) и трансплацентарный . Патогенез и клиника: Сифилис- венерическая антропонозная инфекция, характеризующаяся первичным аффектом, высыпанием на коже и слизистых оболочках с последующим поражением различных органов и систем. Из входных ворот бледные трепонемы проникает в регионарные лимфатические узлы, где размножаются, а затем попадают в кровяное русло, где прикрепляются к эндотелиальным клеткам, вызывая развитие эндартериитов, ведущих к развитию васкулитов и последующему тканевому некрозу. Инкубационный период: 3 - 4 недели Различают несколько периодов заболевания: 1) Первичный сифилис- стадия твердого шанкра на слизистых половых органов, рта, ануса, воспаление лимфатических узлов – продолжительность 6-7 недель 2) Вторичный сифилис – различные высыпания на коже и слизистых оболочках в результате генерализации инфекции- продолжительность до 2-4 лет. В элементах сыпи содержится большое количество живых трепонем и поэтому больной очень заразен. Рецидивы высыпаний во время этого периода несколько раз. 3) Третичный сифилис- образование во внутренних органах инфильтратов- гумм, которые распадаются, вызывая деструктивные изменения в органах и тканях – продолжительность десятки лет 4) Четвертичный период – спинная сухотка, характеризующаяся прогрессирующим параличом вследствие поражения ЦНС Иммунитет: практически отсутствует, возможны многократные повторные заболевания. Заболевание сопровождается формированием ГЗТ (гиперчувствительности замедленного типа). Антитела накапливаются в больших количествах, но защитной роли не играют, а являются только свидетелями инфекционного процесса. Лечение: антибиотики пенициллинового ряда и висмутсодержащие препараты Профилактика: специфической не разработано. Микробиологическая диагностика: используются бактериоскопический и серологический методы в зависимости от периода заболевания. Бактериоскопический метод: материал- отделяемое шанкра (I), кожных высыпаний, пунктаты лимфатических узлов(II) Нативный препарат: темнопольная и люминесцентная микроскопия, Фиксированный препарат: серебрение (импрегнация серебром)- см. атлас Серологический метод: основной метод диагностики сифилиса Материалом для исследований- сыворотки крови. Первичный период- серонегативный (отрицательный результат серологических реакций) Антитела обнаруживаются не ранее чем через 2-3 недели после появления твердого шанкра. Комплекс серологических реакций: I. отборочные неспецифические (реагиновые) тесты используются для массового обследования населения на сифилис и применяют реакцию Вассермана (РСК), реакцию микропреципитации или ее аналоги (флокуляционные тесты) и реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с неспецифическим кардиолипиновым антигеном (холестенизированный спиртовой экстракт из мышц бычьего сердца) Схема постановки реакции микропреципитации Ставят в лунке на пластине из плексигласа или стекле 3 капли инактивированной 30 минутным прогреванием при 56 0 С исследуемой сыворотки + 1 капля кардиолипинового антигена, смешивают и учитывают результат через 10-40 минут. «+» выпадение хлопьев «-» равномерная легкая опалесценция Схема постановки реакции Вассермана (реакции связывания комплемента) Компоненты: 1.инактивированная ( 30 минут при 560 С ) исследуемая сыворотка больного в разведении 1:5 Инактивация проводится для разрушения комплемента 2. неспецифический Аг 3. Комплемент в рабочей дозе - сыворотка морской свинки 4. Гемолитическая система- смесь гемолитической сыворотки ( содержит антителагемолизины против эритроцитов барана, получают путем иммунизации кроликов) и эритроцитов барана I фаза- опыт: соединяют исследуемую сыворотку (1:5) + неспецифический Аг в рабочей дозе+ комплемент в рабочей дозе- инкубация при t 370 С- 40 минут Контроли: 1) контроль Аг- неспецифический Аг в рабочей дозе+ комплемент в рабочей дозе+ физраствор - инкубация при t 370 С- 40 минут 2) контроль Ат- исследуемую сыворотку (1:5) + комплемент в рабочей дозе+ физраствор - инкубация при t 370 С- 40 минут II фаза- во все пробирки (опыт и контроли Аг и Ат) добавляют гемолитическую систему - инкубация при t 370 С- 40 минут III Учет результатов- учитывают степень задержки гемолиза Полное отсутствие гемолизарезкоположительная реакция при наличии в контрольных пробирках полного гемолиза II. Диагностические специфические (трепонемальные) тесты используются для подтверждения диагноза и применяют РИФ (непрямой метод), РИТ ( реакция иммобилизации трепонем), ИФА, микрогемагглютинации со специфическим трепонемальным антигеном. В качестве антигена используются: ТРЕПОНЕМЫ РЕЙТЕРА- культуральные спирохеты, выращенные на искусственной питательной среде и не обладающие вирулентностью ТРЕПОНЕМЫ НИКОЛЬСА ИЛИ ТКАНЕВЫЕ ТРЕПОНЕМЫ- патогенные трепонемы, полученные при заражении кролика в яички бледной трепонемой ЭКСТРАКТ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ТКАНЕВЫХ ТРЕПОНЕМ Все специфические тесты ставятся после предварительной обработки сыворотки больного трепонемами Рейтера для удаления антител к общим для всех видов спирохет антигенам. Схема постановки реакции иммуннофлюоресценции ( непрямой метод) Из штамма Никольса готовят мазок, высушивают и фиксируют 5 мин. в ацетоне и на него наносят сыворотку больного, через 30 мин. промывают и высушивают. Затем обрабатывают препарат флюоресцирующей сывороткой против иммуноглобулинов человека (антиглобулиновая) Изучают в люминесцентном микроскопе, отмечая степень свечения трепонем. Если Ат в сыворотке есть, то они соединяться со спирохетами и образуется комплекс Аг-Ат, а к этому комплексу присоединятся антитела против иммуноглобулинов человека, меченные флюорохромом. Антиглобулиновую сыворотку получают путем иммунизации кролика сывороткой человека. Схема постановки реакции иммобилизации трепонем Принцип реакции заключается в угнетении движения трепонем (иммобилизация) антителами сыворотки крови пациента в присутствии комплемента. Взвесь тканевых (подвижных) трепонем смешивают в пробирке с исследуемой сывороткой и добавляют свежий комплемент. В 1 контроль вместо исслед. Сыворотки добавляют сыворотку здорового человека, во 2 контроль вместо свежего комплемента добавляют инактивированный. Инкубируют при 350 С в анаэробных условиях, готовят из всех пробирок препарат «раздавленная капля» и в темном поле определяют количество подвижных и неподвижных трепонем. Неспецифические (реагиновые) тесты ставят в обычных лабораториях, а специфические (трепонемальные) применяют для уточнения диагноза и ставят в специализированных лабораториях. 3. Боррелиозы Спирохетты рода Borrelia вызывают антропонозные (возвратный тиф) и зоонозные (болезнь Лайма) инфекции с трансмиссивным механизмом передачи. Боррелии – это тонкие спирохеты с 3-10 крупными завитками, 15- 20 фиброилл, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Боррелии обладают уникальным генетическим аппаратом ( линейная хромосома и набор циркулярных плазмид). Могут культивироваться на сложных питательных средах с добавлением сыворотки, тканевых экстрактов, асцитической жидкости при 28-350 С в атмосфере с 510% СО2 и в куриных эмбрионах при заражении в желточный мешок. Возбудители возвратных тифов Различают эпидемический- возбудитель B.recurentis и эндемический возвратные тифывозбудители африканская B.duttoni и азиатская B.persica. Эндемические возвратные тифы- зоонозные природно-очаговые заболевания, резервуаром являются грызуны и аргасовые клещи, человек заражается через укусы клещей. Эпидемический возвратный тиф (Typhus recurrens)- антропонозная инфекциявозбудитель B.recurrentis, описанная в 1868 г. О.Обермейером. Источник- лихорадящий больной, в периферической крови которого находятся боррелии. Механизм заражения- трансмиссивный. Специфический переносчик- платяная, головная и лобковая вши, они наиболее заразны с 6 по 28 день после инфицирующего кровососания. Заражение при втирании гемолимфы раздавленных вшей в кожу при расчесывании места укуса. Заболевание встречается во время социальных бедствий и войн. Патогенез, клиника, иммунитет: Инкуб. Период – 7-8 суток. Боррелии захватываются макрофагами и лимфоидными клетками и по мере размножения поступают в кровь, вызывая приступообразную лихорадку (39-400 ), головную боль, озноб, общую интоксикацию. Каждая атака заканчивается подъемом титра Ат. С Ат боррелии образуют агрегаты, которые нагружаются тромбоцитами, вызывая закупорку капилляров и нарушение кровообращения в органах. В течение инфекции Аг боррелий подвергаются вариациям, что связано с наличием большого набора Аг, синтез которых кодируется разными генами, периодически находящимися в неактивной форме. В результате перегруппировок в хромосоме активируется «молчащий» ген и появляется новый Аг вариант. Новые Аг варианты вызывают рецидив заболевания ( от 3 до 20 раз) Иммунитет гуморальный, непродолжительный. Лечение и профилактика: лечение антибиотиками, специф. Профилактика не разработана Микробиологическая диагностика: Бактериоскопический метод- основной. Обнаружение боррелий в толстой капле крови, взятой на высоте лихорадки, окрашенной по Роман.-Гимзе. Нативные препараты - в «темном» поле; серебрение боррелий в мазках крови или мазках-отпечатках из органов. Биологический метод – для дифференц. диагностики эпидемического возвратного тифа от эндемического (клещевого). Морские свинки легко заражаются возбудителями клещевого тифа, а белые мыши и крысы- B.recurrentis Серологический метод – РСК в качестве вспомогательного метода. Возбудители болезни Лайма Болезнь Лайма ( хроническая мигрирующая эритема, клещевой иксодовый боррелиоз)хроническая инфекция с поражением кожи, сердечной и нервной систем, суставов. Возбудители: B.burgdorferi, B.garini, B.afzelii. – хорошо культивируются на пит. Средах при выделении из клещей, выделить возбудитель из материала от больного удается редко. Сложная антигенная структура: белковые Аг фибриллярного аппарата (р 41) и цитоплазматического цилиндра (р93)- к ним Ат появляются рано, но не обладают защитными свойствами; белки наружной мембраны –osp A,B,C,D,E,F- Ат к ним обладают защитными свойствами. Аг состав меняется в процессе жизненного цикла: на пит. Средах и в организме человека на поздних стадиях заболевания преобладает osp A- Аг, в клеще и на ранних стадиях у человека- osp С-Аг. Факторы патогенности: белки наружной мембраны обеспечивают прикрепление и проникновение в клетку хозяина, osp A- участвует в иммунопатологических процессах, приводящих к развитию артритов, при температуре 370 боррелии синтезируют белок теплового шока. Эпидемиология: Резервуар возбудителя- мелкие млекопитающие, лесные мыши Механизм заражения- трансмиссивный- через укусы иксодовых клещей. Характерна сезонность- весеннее-летне-осенняя. Патогенез и клиника: инкуб. Период- 3-32 дня с момента укуса клеща. На месте укуса появляется красная папула. 3 стадии в клинике: 1) Мигрирующая эритема- гриппоподобный симптомокомплекс, лимфаденит и появление в месте укуса кольцевидной эритемы, которая быстро увеличивается в размерах 2) Доброкачественное поражение сердца и ЦНС в виде миокардита и асептического менингита на 4-5 неделе заболевания 3) Развитие артритов крупных суставов через 6 и более недель Иммунитет: гуморальный, видоспецифический Лечение: антибиотикотерапия фторхинолонами, тетрациклином Профилактика: специфической нет. Микробиологическая диагностика: Бактериосопический метод: на 1 стадии- биоптаты кожи из эритемы- метод серебрения, по Романовскоме-Гимзе. Серологический метод: со 2 стадии- определение Ig M, или нарастание титра IgG в ИФА или РИФ (непрямой метод) Генетический метод: ПЦР- определение ДНК боррелий в ликворе, суставной жидкости, крови, клещах. 4. Лептоспирозы Таксономия: семейство Leptospiraceae, род Leptospira, вид L. Interrhogans, включает более 200 сероваров, объединенных в серогруппы.(более 25 групп) Морфология: тонкие спирохеты с изогнутыми крючкообразными концами, придающими S-образную форму, имеют по одной фибрилле с каждого полюса клетки, число завитков 30-40, по Романовскому-Гимзе окрашиваются плохо, определяют в темнопольной и фазово-контрастной микроскопии. Культуральные и биохимические свойства: Аэробы. Каталаза+, оксидаза+. Культивируются на средах с сывороткой или сывороточным альбумином при 28-300 С, растут медленно, на жидких средах- отсутствие признаков роста (помутнения, пленки, осадка и т.д.) Антигенная структура: Белковый общеродовой Аг, выявляемый в РСК; Липополисахаридный поверхностный Аг видоспецифический, выявляемый в РА Эпидемиология: широко распространены в природе, чувствительны к высыханию, нагреванию, дезинфектантам. Резервуар и источник инфекции – домовые и полевые грызуны, а также домашние животные (крупный рогатый скот, свиньи, собаки) Возбудитель животными выделяется с мочой, загрязняя водоемы и почву. Механизм передачи- фекально-оральный; пути передачи- водный, алиментарный, контактный. Сезонность: летнее-осенняя Восприимчивость человека- высокая. Факторы патогенности: плазмокоагулаза, фибринолизин, цитотоксины, гемолизин, липазы Патогенез и клиника: Инкуб. Период- 7-10 дней. Входные ворота- слизистые оболочки пищеварительного тракта, поврежденная кожа. С кровью разносится к печени и почкам, где размножается и вторично попадает в кровь, что совпадает с началом болезни. Поражает капилляры печени, почек, ЦНС. Симптомы: волнообразная лихорадка, желтуха, почечная недостаточность, асептический менингит. Летальность – от 3 до 25-40%. Иммунитет: стойкий, гуморальный саровароспецифический. Лечение: антибиотики (пенициллин, тетрациклин ) в сочетании с лептоспирозным иммуноглобулином, получаемом из крови иммунизированных волов Профилактика: специфическая- вакцинация по эпидпоказаниям убитой корпускулярной вакциной, содержащей 4 основных серогруппы возбудителя.( grippotyphosa , pomona, canicola, icterohaemorragiae) Микробиологическая диагностика: материал: кровь, ликвор, моча. Бактериоскопический метод: из материала готовят препарат «раздавленная» капля и микроскопируют в темном поле. Кровь, ликвор- первые 5 дней, моча- с 10 дня болезни. Бактериологическое исследование. Кровь, мочу, спинномозговую жидкость асептически засевают в количестве 5 — 20 капель в 3—5 пробирок с водно-сывороточной средой, средой Флетчера, Картофа или другой жидкой (полужидкой) специальной средой, заливают стерильным вазелиновым маслом. Кроличья сыворотка или другие субстраты, добавляемые в среду, служат источником жирных кислот, необходимых для роста лептоспир. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры, что особенно важно при культивировании лептоспир, в состав сред вводят неомицин. Посевы инкубируют до 30 сут при 28 — 30 °С Лептоспиры размножаются в питательной среде, не изменяя ее внешнего вида (среда остается прозрачной в течение всего периода наблюдения). Для выявления роста лептоспир через 10 дней после посева из каждой пробирки берут материал, готовят препарат раздавленной капли и изучают в темнопольном микроскопе. Из пробирки, где обнаружен рост лептоспир, пересевают по 0,5 мл в 3 пробирки с 5 мл свежей питательной среды, которые инкубируют 7—10 дней при той же температуре. Для дифференциации патогенных (вид L. interrogans) и сапрофитических (вид L. biflexa) лептоспир изучают их культуральные и биохимические свойства. Наиболее показательным является: бикарбонатный тест (гидрокарбонат, добавленный к питательной среде, подавляет рост патогенных лептоспир); определение гемолитической активности (патогенные лептоспиры в отличие от сапрофитических не вызывают гемолиз эритроцитов кролика и белых крыс); определение фосфолипазной активности (патогенные лептоспиры не обладают фосфолипазной активностью). Выделенные лептоспиры идентифицируют по антигенной структуре — с помощью набора агглютинирующих сывороток определяют их принадлежность к одной из 25 известных серогрупп. Можно использовать метод ПЦР для идентификации. Лептоспироз в нашей стране чаще вызывают представители сероваров grippotyphosa , pomona, canicola, icterohaemorragiae. Биологический метод: заражают морских свинок, крольчат. При заболевании или гибели животного готовят препараты из крови, мочи, микроскопируют их, делают посевы для выделения чистой культуры. Серологический метод: Ат обнаруживаются с конца 1 недели заболевания. Используют реакцию микроагглютинации-лизиса (РМАЛ) с живыми эталонными культурами лептоспир разных серогрупп и сероваров. Учет реакции проводят методом темнопольной микроскопии в препаратах «раздавленная» капля. При «+» результате отмечают лизис и агглютинацию лептоспир. В первых разведениях сыворотки наблюдается полное растворение лептоспир, частичный лизис или зернистое набухание, а в последующих разведениях - агглютинация лептоспир и появление агломератов в виде паучков. Диагностический титр 1:100. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в парных сыворотках. Молекулярно-генетический метод: ПЦР для обнаружения ДНК возбудителя в качестве экспресс-метода.
