Занятие № Тема: «Лабораторная диагностика брюшного тифа и сальмонеллезов». 1. Актуальность темы: Кишечные инфекции занимают важное место в инфекционной патологии человека. Возбудители кишечных инфекций относятся к семействам энтеробактерий, иерсиний и вибрионов. Среди них есть патогенные и условно-патогенные представители. В семействе энтеробактерий важнейшими представителями являются бактерии из родов Escherichia, Salmonella и Shigella (патогенные виды). В последние годы в этиологии кишечных инфекций увеличивается роль условно-патогенных бактерий других родов энтеробактерий. Основным методом микробиологической диагностики кишечных инфекций является бактериологический метод. Выделение чистой культуры и идентификация возбудителя позволяет наиболее достоверно диагностировать кишечные инфекции, так как клиническое течение кишечных заболеваний не всегда позволяет поставить правильный диагноз. 2. Учебные цели занятия: Знать: 1. Поставить реакцию непрямой (пассивной) гемагглютинации для диагностики сальмонеллезов, брюшного тифа и паратифов, учесть её результат и интерпретировать полученные данные. 2. Производить посев для выделения гемокультуры. 3. Производить посев испражнений для выявления брюшнотифозного бактерионосительства. Уметь: 1. Проводить диагностику пищевых токсикоинфекций сальмонеллёзной этиологии у человека. 2. Ставить реакцию непрямой (пассивной) гемагглютинации для диагностики сальмонеллезов, брюшного тифа и паратифов, учесть её результат и интерпретировать полученные данные. 3. Производить посев для выделения гемокультуры. 4. Производить посев испражнений для выявления брюшнотифозного бактерионосительства. 5. Цели развития личности (деонтологические, экологические, правовые, профессиональные, психологические, патриотические и др. аспекты) 6. Оснащение: дидактический материал и технические средства обучения (тематический пациент; кино- и видеофильмы, тренинговые и контролирующие компьютерные программмы, мультимедийные атласы, альбомы, ситуационные задачи, деловые игры, фантомы, тренажеры и др.) 7. Материалы для самоподготовки: 7.1. Вспомогательный учебный материал Род Salmonella состоит из бактерий, которые паразитируют в кишечнике многих видов позвоночных животных и инфицируют людей, приводя к развитию брюшного тифа, паратифов, гастроэнтеритов и септицемии без локальных нагноений, а также могут вызывать состояние носительства. Наиболее важным членом рода является Salmonella typhi - этиологический агент брюшного тифа, который был открыт К. Эбертом в 1880 г., выделен в чистой культуре Г. Гаффки в 1884 г. (поэтому сначала порах его называли “бактерия Эберта-Гаффки” или Eberthella typhi). В 1885 г. Д. Салмон и Смит описали бактерию, которая вызывала развитие холеры у свиней, этот возбудитель, которые позднее назвали S. cholerae-suis, был первым представителем рода Salmonella, изолированным от людей и животных. Поскольку было доказано, что возбудитель брюшного тифа также относится к этой группе, его переименовали в S. typhi, а род Eberthella - исключили из классификации. В настоящее время существует около 2000 серотипов или видов сальмонелл, все они являются потенциально патогенными. Для практических целей их разделяют на две группы: (1) группу возбудителей тифов, включающую сальмонеллы брюшного тифа и паратифов, которые поражают только людей; и (2) группу пищевых отравлений, представители которой являются паразитами животных, но могут также инфицировать людей, вызывая развитие гастроэнтерита, септицемии или локальных инфекций. Характеристика рода и группы возбудителей тифов. Морфология. Сальмонеллы являются грамотрицательными палочками шириной 0,5-0,8 мкм и длиной 1-3 мкм. Спор и капсул на образуют; подвижные, имеют от 8 до 20 перитрихеально расположенных жгутиков (исключение составляют S. gallinarum-pullorum, которые всегда неподвижны); могут иметь фимбрии. Бактерии хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красителями. Культивирование. Брюшнотифозные и паратифозные бактерии - факультативные анаэробы, нетребовательные к питательным средам, оптимальная температура культивирования – 37ºС (1541ºC), рН - 6,0-8,0. На мясо-пептонном агаре образуют нежные, круглые (2-3 мм в диаметре), почти прозрачные колонии, с гладкой, слегка выпуклой поверхностью и чётко очерченным краем, на висмут-сульфитном агаре - колонии чёрного цвета с металлическим блеском вследствие продукции сероводорода. S. paratyphi A и другие виды, которые не продуцируют сероводород, образуют зелёные колонии. На средах Эндо и МакКонки сальмонеллы - возбудители тифов образуют полупрозрачные, бесцветные колонии, поскольку не разлагают лактозу, входящую в состав этих сред. Ферментативные свойства. Ферментативная активность брюшнотифозных бактерий несколько меньше, чем у других сальмонелл, но очень стабильная. Они разлагают глюкозу, маннитол и мальтозу до кислоты, не ферментируют лактозу, сахарозу и салицин, образуют сероводород и не выделяют индол. Тест с метиленовым красным положительный, тест Фогеса-Проскауэра - отрицательный. Паратифозные бактерии разлагают глюкозу и маннитол до кислоты и газа, индол не выделяют, образуют сероводород (исключение составляют S. paratyphi A, S. cholerae-suis и некоторые другие виды). Биохимическую активность брюшнотифозных и паратифозных бактерий определяют в лабораториях для их идентификации (таблица 1). Таблица 1 Биохимическая характеристика возбудителей брюшного тифа и паратифов Вид Расщепление глюкозы ксилозы d-тартрата муката S. typhi Образование Варьирует Образование кислоты Варьирует кислоты S. Образование paratyphi кислоты и газа A S. Образование Образование Образован paratyphi кислоты и газа кислоты и ие B газа кислоты и газа S. Образование Образование Образование кислоты paratyphi кислоты и газа кислоты и и газа C газа Токсинообразование. Соматический О-антиген идентичен эндотоксину, его можно экстрагировать из клеточной стенки бактерий путём обработки трихлоруксусной кислотой. Кипячение, действие спиртов или слабых растворов кислот не разрушают Оантиген. Антигенная структура. Возбудители брюшного тифа и паратифов содержат О-, К- и Нантигены, имеющие индивидуальные особенности у различных видов. Кроме того, свежевыделенные культуры имеют ещё и Vi-антиген, который определяет их вирулентность. По антигенной структуре в реакции агглютинации проводят идентификацию возбудителей. Viантигены являются специфическим рецептором для тифозных бактериофагов. Антигены сальмонелл подвергаются фенотипическим и генотипическим вариациям (Н-О-вариации при потере жгутиков, фазовой вариации, V-Wi-вариации, когда сальмонеллы агглютинируются одновременно Vi- и О-антисыворотками, S-R-вариации, а также вариациям в О-антигене). Классификация. Классификация и номенклатура сальмонелл несколько раз изменялись в течение определённого времени. Отнесение в род основано на сходстве биохимических свойств. Классификация внутри рода базируется на антигенных свойствах, в её основу положена схема Кауфмана-Вайта (таблица 2). Таблица 2 Пример классификации Кауфмана-Вайта Серог Серотип Антиген рупп О Н ы Фаза I Фаза II 2-A S. paratyphi A 1, 2, 12 a 4-B S. paratyphi B 1, 4, 5, 12 b 1, 2 7-C1 S. paratyphi C 6, 7, (Vi) c 1, 5 9-D S. typhi 9, 12, (Vi) d S. gallinarum 1, 9, 12 Дифференциация сальмонелл внутри группы проводится на основании особенностей фаз Нантигена (фазы I и ИИ) и фракций О-антигена. Сальмонеллы разных серовариантов одной О-группы имеют различную фазу I Н-антигена, которую обозначают строчными буквами латинского алфавита: a, b, c, d и т.д. Вторую фазу Н-антигена и фракции О-антигена обычно обозначают арабскими цифрами 1, 2, 3 и т.д. Сочетание О- и Н-антигенов определяет и антигенную структуру, и принадлежность к определённому виду. Резистентность. Сальмонеллы хорошо переносят низкую температуру. В чистой воде их жизнеспособность сохраняется несколько месяцев, в копчёном и солёном мясе до двух месяцев. Продолжительное время сохраняются в пыли, стойкие к высушиванию. Не выдерживают конкуренции с молочнокислыми бактериями. При 60-70ºС гибнут через 15 минут, при 100ºС - немедленно. Чувствительны к дезинфицирующим растворам (фенолу, хлориду ртути). Патогенность для животных. Брюшной тиф и паратифы являются антропонозами. Патогенез и заболевания человека. Источником тифо-паратифозных инфекций в природе являются больные брюшным тифом и паратифами, а также бактерионосители. Механизм заражения - фекально-оральный, алиментарный. Брюшной тиф - это острая инфекционная болезнь, которая характеризуется лихорадкой, циклическим течением, бактериемией, интоксикацией, сыпью на коже, язвенным поражением лимфатического аппарата тонкой кишки. Инкубационный период длится от 5 до 25 дней. Возбудители попадают в организм через рот. Часть из них гибнет в желудке, а те, которые выживают, попадают в тонкий кишечник, где благодаря адгезинам прикрепляются к микроворсинкам эпителия и проникают в лимфатические фолликулы. С током лимфы они заносятся в лимфатические узлы брыжейки, где интенсивно размножаются и в конце инкубационного периода проникают в кровь; возникает бактериемия. С током крови они попадают в печень, селезёнку, костный мозг, лимфатические узлы. Эта фаза болезни длится около одной недели, хоть бактериемия сохраняется в течение всего лихорадочного периода. В это время с диагностической целью засевают кровь или костный мозг для выделения возбудителей (метод гемокультуры и миелокультуры). На второй неделе болезни в лимфатических образованиях тонкой кишки накапливаются бактерии и эндотоксины, которые всасываются в кровь и обусловливают тяжёлую картину интоксикации (потеря сознания, так называемый status typhosus). В желчном пузыре и желчных протоках сальмонеллы размножаются, их можно выделить из желчи (метод биликультуры). На третьей неделе болезни бактерии с током желчи в большом количестве попадают в тонкую кишку и сенсибилизированные лимфатические фолликулы. Здесь развивается воспалительный процесс с некрозом и образованием тифозных язв. Возможна перфорация (прорыв) стенки кишки, в результате чего развивается перитонит. Если повреждаются сосуды - возможно смертельное кровотечение. В этот период имеет место массивное выделение бактерий с испражнениями и мочой, где их легко проявить (метод копро- и уринокультуры). Начиная с 8-10 дня от начала болезни, в крови накапливаются антитела, которые выявляют с помощью реакции агглютинации Видаля. Выздоровление больного далеко не всегда сопровождается полным освобождением организма от возбудителей. В течение первой недели после болезни многие реконвалесценты остаются бактерионосителями, а у 3-5 % из них носительство может длиться годами, иногда всю жизнь. Такие носители являются источником инфекции, за ними эпидемиологи устанавливают длительное наблюдение, учёт, проводят периодические бактериологические исследования. Особенно это касается переболевших работников предприятий общественного питания, службы водоснабжения, детских учреждений и т.п. Течение и клиническая картина паратифов очень сходны с брюшным тифом. Окончательный диагноз устанавливают лишь после выделения и идентификации возбудителя. В последнее время брюшной тиф и паратифы из эпидемических заболеваний стали одиночными, имеют более лёгкое течение и редко заканчиваются смертью. Иммунитет. После перенесенной болезни вырабатывается стойкий, напряженный, часто пожизненный иммунитет. Повторные случаи заболеваний почти не встречаются. В сыворотке крови реконвалесцентов накапливаются иммуноглобулины, бактериолизины, повышается фагоцитарная реакция организма. Лабораторная диагностика. Основа диагностики - выделение возбудителей и выявления антител. В первые дни болезни и позже, пока есть лихорадка, применяют метод гемокультуры. Для её выделения сеют 10 мл крови в среду Раппопорт или желчный бульон в соотношении 1:10. Посевы инкубируют при 37ºС, делают пересев на среду Эндо. Типичные колонии отсеивают на скошенный агар Олькеницкого. Выделенную чистую культуру идентифицируют по ферментативным свойствам и в реакции агглютинации со специфическими сыворотками. Метод гемокультуры является ранним и достоверным методом диагностики, он имеет абсолютное диагностическое значение. На второй неделе болезни ставят реакцию агглютинации Видаля для выявления антител. Она имеет ограниченную диагностическую ценность, так как может быть положительной и у привитых лиц, и у переболевших. Лучшие результаты дают реакция непрямой гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами, радиоиммунный метод и иммуноферментный анализ. В последующие недели болезни выделяют били-, копро- и уринокультуры, для этого сеют желчь, испражнения и мочу на селенитовый бульон и дифференциальнодиагностические среды. Выделяют чистые культуры, идентифицируют их так же, как и гемокультуру. Эти методы имеют меньшую диагностическую ценность, так как их можно применить значительно позднее (к этому времени диагноз должен уже быть поставлен). Но их широко используют для диагностики брюшнотифозного бактерионосительства. Для выявления источника инфекции и путей её передачи проводят фаготипирование брюшнотифозных бактерий. Лечение. Для лечения используют амоксициллин, рифампицин, ампициллин и нитрофурановые препараты. Для лечения тифов, вызванных мультирезистентными к антибиотикам сальмонеллами, используют фторхинолоны (ципрофлоксацин, пефлоксацин) и цефалоспорины (цефтазидим, цефтриоксон, цефотаксим). Для элиминации носительства в определённых случаях проводят оперативные вмешательства (удаление желчного пузыря, почки). Профилактика. Важную роль играют своевременная диагностика, госпитализация и лечение больных, дезинфекция в очаге, выявление и санация носителей. Все это способствует ликвидации очагов заболевания. Имеет значение обеззараживание воды, охрана источников водоснабжения, борьба с мухами, защита пищевых продуктов от контаминации возбудителями, особенно на предприятиях общественного питания, проверка на носительство работников пищевых блоков, соблюдение санитарногигиенических требований и личной гигиены. Специфическая профилактика проводится путём вакцинации. ТАВ-вакцина содержит 1000 миллионов бактериальных тел S. typhi, по 750 миллионов S. paratyphi A и В, убитых нагреванием до 50-60ºC и законсервированных 0,5 % раствором фенола. Вакцинацию проводят двукратно, вводя подкожно по 0,5 мл вакцины с интервалом 4-6 недель. Вакцинации подлежат: в неэндемических районах - военнослужащие и медицинские работники; в эндемических районах - все дети. Живая вакцина (typhoral) содержит 109 живых лиофилизированных стабильных мутантов S. typhi, штамм Ty2 la, в виде капсулы, оболочка которой растворяется только в тонкой кишке. При приеме внутрь она вызывает развитие инфекции, но “самоуничтожается” через 4-5 бинарных делений сальмонелл, поэтому не может вызывать системное заболевание. Вакцинацию проводят путем приема внутрь одной капсулы за один час до еды, запивая её стаканом воды или молока, на 1, 3 и 5 дни. Нужно избегать употребления антибиотиков в этот период. Вакцина для инъекций (typhim-Vi) содержит очищенный Vi-полисахаридний антиген (25 мкг в одной дозе) S. typhi штамма Ty2. Вакцинацию проводят путем однократного подкожного или внутримышечного введения. Две последние вакцины рекомендуются для вакцинации взрослых и детей старше 5 лет. Поствакцинальный иммунитет возникает через 2-3 недели после вакцинации и длится в течение 1-3 лет. 2. Возбудители сальмонеллёзов. Сальмонеллёзы - это острые инфекционные зоонозные заболевания, которые вызывают сальмонеллы, и характеризуются преобладающим поражением кишок и интоксикацией. Чаще всего заболевание вызывают S. typhimurium, S. haldar, S. enteritidis, S. heidelberg, S. agona, S. virchow, S. seftenberg, S. indiana, S. newport и S. anatum. Антигенная структура. Возбудители сальмонеллёзов выделяют энтеротоксины и имеют эндотоксины, которые обусловливают клиническую симптоматику заболеваний и явления интоксикации организма. Резистентность. В различных объектах окружающей среды сальмонеллы сохраняются достаточно долго. В колбасах они выживают от 6 до 13 дней, в яйцах и замороженном мясе - до одного года. Кипячение вызывает их гибель в первые секунды, но при низких температурах они долго остаются живыми. Токсины сальмонелл долго сохраняются и после варки мяса, особенно большими кусками, или в котлетах при недостаточном их прожаривании. Присутствие сальмонелл и их токсинов не изменяет органолептических качеств продуктов. Патогенность для животных. Большинство сальмонелл патогенно как для человека, так и для разных животных и птиц. Исключением являются сальмонеллы брюшного тифа и паратифов, которые патогенны только для человека и вызывают совсем другие клинические формы заболеваний. Патогенез и заболевания человека. Источником инфекции в природе могут быть животные (коровы, телята, овцы, свиньи, лошади), домашняя водоплавающая птица, куры, в кишках которых находятся различные серовары сальмонелл. Животные выделяют их с мочой, испражнениями, молоком, слюной. Бактерионосительство может длиться несколько месяцев и даже лет. Источником инфекции бывают и люди, больные сальмонеллёзом, или бактерионосители. Наибольшую опасность представляют лица с лёгкими и стертыми формами заболевания. Заражение происходит преимущественно алиментарным, реже - контактнобытовым путем. В 96-98 % случаев оно связано с употреблением пищевых продуктов, контаминированных сальмонеллами, прежде всего, мяса животных и птицы. Возможно прижизненное заражение мяса (когда забивают больных животных), или во время обработки туш, их транспортировки, переработки и хранения. Заражение может произойти через рыбу и рыбные продукты, молоко, яйца, салаты, кондитерские изделия и т.п. Особенностью заболеваний являются их внезапность и массовость, преимущественно в летний период. Однако чаще встречаются одиночные случаи. Инкубационный период колеблется от 2-6 часов до 2-3 дней. Основные клинические симптомы (тошнота, рвота, понос, боль в животе, повышение температуры) обусловлены действием энтеротоксина и эндотоксина, которые высвобождаются при разрушении сальмонелл в кишках. Токсины действуют на сосудистую и нервную сети слизистой оболочки. Сальмонеллам присуща и высокая инвазивность, благодаря которой в первые часы заболевания возникает бактериемия. Кроме желудочно-кишечных клинических форм сальмонеллеза, встречаются также тифоподобные и септические варианты. Около 2-3 % переболевших становятся носителями сальмонелл, бактерионосительство может быть острым (до 3 месяцев) и хроническим (свыше 3 месяцев). Прогноз, как правило, благоприятный, летальность представляет 0,1-0,4 % преимущественно при тифоподобных и септических формах. Иммунитет. У переболевших сальмонеллезом возникает лишь кратковременный и малонапряжённый иммунитет. В небольших титрах выявляют агглютинины, преципитины, опсонины и бактериолизины. Перекрестный иммунитет к различным сероварам сальмонелл не возникает, поэтому возможны повторные заболевания, вызванные другими сероварами. Лабораторная диагностика. Для подтверждения клинического диагноза используют бактериологический и серологический методы. Материалом для исследования являются испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, моча. Одновременно проводят исследования остатков пищи как возможных факторов передачи возбудителей. Материалы нужно забирать до начала лечения. Посевы делают на среды Эндо, Плоскирева, МакКонки, висмут-сульфитовый агар, выделяют чистые культуры, которые идентифицируют в реакции агглютинации с групповыми и монорецепторными сыворотками. Целесообразно поставить биологическую пробу на мышах не только с выделенными культурами, а и с остатками подозрительной пищи. Для ретроспективной диагностики используют реакции агглютинации и непрямой гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике при использовании парных сывороток. При очаговых вспышках заболеваний как экспресс-метод применяют реакцию иммунофлуоресценции. Лечение симптоматическое, антибиотики применять не рекомендуется. Профилактика. Для предупреждения возникновения сальмонеллёзов большое значение имеет строгий ветеринарный контроль забоя скота и птицы и медикосанитарный надзор за пищевыми предприятиями. Последний предусматривает систематический контроль изготовления, хранения, транспортировки и реализации продуктов в торговой сети. Важно достичь максимальной автоматизации технологических процессов, достаточной термической обработки, использовать холодильники для хранения продуктов. На предприятиях общественного питания и в торговле запрещается реализация утиных и гусиных яиц, которые часто содержат сальмонеллы. Переболевших выписывают из стационара после отрицательных контрольных бактериологических исследований испражнений, мочи, желчи. Проводят также плановые исследования на бактерионосительство всех работающих на пищевых предприятиях, в столовых, ресторанах, детских садах. Специфическая профилактика не разработана. 7.2. Материал для самоподготовки Вопросы для самоподготовки студентов: 1. Род сальмонелл, серологическая классификация Кауфманна-Уайта. Вибрионы, спириллы как извитые формы бактерий. 2. Возбудители брюшного тифа и паратифов: морфология, культуральные и ферментативные свойства, антигенная структура, факторы вирулентности. 3. Брюшной тиф и паратифы: источник инфекции, механизм заражения, пути распространения. 4. Патогенез брюшного тифа. Лабораторная диагностика: бактериологический метод, гемо-, копро- и уринокультура; серологический метод (реакция Видаля, РНГА, иммунофлюоресцентный). 5. Бактерионосительство. Выделение. Профилактика и лечение брюшного тифа и паратифов. 6. Сальмонеллы – возбудители госпитальных гастроэнтеритов: основные виды, их морфология, культуральные, ферментативные и антигенные свойства. 7. Заболевания у человека: источник инфекции (основные виды животных и птиц), механизм заражения (эндогенное и экзогенное инфицирование мясных и других продуктов.) 8. Патогенез, клиника сальмонеллезов, иммунитет. Лабораторная диагностика: гемокультура, копрокультура, исследование других материалов; реакция агглютинации, РНГА. Лечение и профилактика. 9. Сальмонеллы – возбудители госпитальных сальмонеллезов. Острые пищевые гастроэнетеритов другой этиологии. Тесты для самоподготовки: Тест № 1. В реакции пассивной гемагглютинации, поставленной с эритроцитарным брюшнотифозным Vi-диагностикумом, выявлены антитела в разведении сыворотки обследуемого до 1:80, что выше диагностического титра. Такой результат свидетельствует о: A *О возможном носительстве палочек брюшного тифа B Об остром заболевании брюшным тифом C О рецидиве брюшного тифа D Об инкубационном периоде брюшного тифа E О реконвалесценции больного брюшным тифом Тест № 2. При повторной постановке реакции агглютинации Видаля выявлено нарастание титров антител к О-антигенам S.typhi в сыворотке больного с 1:100 до 1:400. Как можно трактовать полученные результаты? A *Болеет брюшным тифом B Является острым носителем брюшнотифозных микробов C Является хроническим носителем брюшнотифозных микробов D Ранее переболел брюшным тифом E Ранее прививался против брюшного тифа Тест № 3. В аннотации к препарату указано, что он содержит антигены возбудители брюшного тифа, адсорбированной на стабилизированных эритроцитах барана. С какой целью используется этот препарат? A *Для выявления антител в реакции непрямой гемагглютинации B Для выявления антител в реакции связывания комплемента. C Для выявления антител в реакции Видаля D Для выявления антител в реакции задержки гемагглютинации E Для серологической идентификации возбудителя брюшного тифа. Тест № 4. Эффективная диагностика носительства возбудителей кишечных инфекций основывается на выявлении антител к явным антигенам бактерий в реакции непрямой гемагглютинации. Какой стандартный препарат необходимо применять в этой реакции? A *Эритроцитарный диагностикум с адсорбованными антигенами бактерий B Антитела против иммуноглобулинов основных классов C Моноклональные антитела D Монорецепторные диагностические сыворотки E Эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Тест № 5. При бактериологическом исследовании выделений больного на кишечную инфекцию была выделена Shigella sonnei. Какую из перечисленных серологических реакций было использовано для идентификации выделенной чистой культуры? A *Реакция агглютинации B Реакция преципитации C Реакция связывания комплемента D Реакция нейтрализации E Реакция лизису ЗАДАЧА 1. Через 3 месяца после выздоровления от брюшного тифа реконвалесцента пригласили в инфекционный кабинет для исследования на бактерионосительство. Какие материалы нужно взять, и какие методы исследования применить? ЗАДАЧА 2. Какие будут результаты реакции Vi-гемагглютинации (положительные или отрицательные) через 3 месяца: после выздоровления от брюшного тифа с полным освобождением от возбудителей брюшного тифа; после прививки брюшнотифозной вакциной; у носителя брюшнотифозных палочек? Практическая часть для самоподготовки: 1. Постановка реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации. Цель: определить наличие антител и их титр к антигенам возбудителей брюшного тифа и паратифов. Каждый студент ставит реакцию с одним из двух диагностикумов – брюшного тифа и паратифа В. В лунках пластмассовых планшетов приготовьте последовательные двукратные разведения сыворотки больного (исходное разведение 1:50) от 1:100 до 1:1600 в объёме 0,5 мл. В последнюю (контрольную) лунку сыворотка не вносится. Затем в каждую лунку (включая контрольную) добавьте по 0,25 мл соответствующего эритроцитарного диагностикума. Планшеты поставьте в термостат на 2 часа. Сопроводительную записку перепишите в журнал. Через 2 часа проведите учёт результатов. Посмотрите планшеты РНГА, определите титр антител с каждым из диагностикумов и сделайте вывод: с каким из диагностикумов РНГА идёт до диагностического титра. Результат запишите в виде таблицы: Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 Конт роль Разведения 1:10 1: 1: 1:8 1: 1: 1: 1: сыворотки 20 40 0 160 320 540 1280 Диагностикум: брюшнотифозный паратифозный В Результат реакции Положительный результат обозначьте знаком «+», отрицательный «-». В графе «Результат» укажите: с каким диагностикумом и до какого титра оказалась положительной РНГА. 2. Изучение морфологии возбудителей брюшного тифа и паратифов. Промикроскопируйте и зарисуйте окрашенные по Граму препараты из чистых культур возбудителей брюшного тифа и паратифов. Рисунки подпишите по-латыни. 3. Изучение ферментативных свойств возбудителей брюшного тифа и паратифов. Посмотрите таблицу «Ферментативные свойства бактерий кишечной группы» и демонстрационные «цветные» ряды. Найдите различия ферментативных свойств у разных видов и опишите их в дневнике. 4. Усвоение методов микробиологической диагностики брюшного тифа и паратифов. Разобрать устно, а затем написать в рабочей тетради схему микробиологической диагностики брюшного тифа и паратифов в зависимости от сроков заболевания. 5. Ранняя диагностика. Посеять кровь больного на гемокультуру. Ознакомьтесь с сопроводительной запиской и внесите её в рабочую тетрадь. Сделайте посев 10 мл крови из шприца во флакон со 100 мл среды Раппопорт с соблюдением правил асептики. Флакон с посевом поместите в термостат. В графе «Ход исследования» отметьте 1-й день и опишите проделанную работу. 6. Для исследования на бактерионосительство посеять испражнения обследуемого на копрокультуру. Ознакомьтесь с сопроводительной запиской и перепишите её в рабочую тетрадь. Произведите посев испражнений на чашку со средой Левина петлёй штрихами для получения изолированных колоний. Чашки поставьте в термостат. Запишите проделанную работу в графе «Ход исследования». РАБОТА СТУДЕНТА НА ПРАКТИЧЕСКОМ ЗАНЯТИИ 1. Продолжение исследования на гемокультуру. Отметьте изменения на среде Раппопорт: наличие роста, кислото- и газообразование. Приготовьте мазок со среды Раппопорт, окрасьте по Граму, промикроскопируйте. Сделайте пересев на чашку Петри со средой Эндо. Запишите в рабочую тетрадь изменения на среде Раппопорт, результаты микроскопии мазка и выполненную работу. 2. Продолжение исследования на копрокультуру. Изучите колонии, выросшие на среде Левина. Отберите подозрительную (бесцветную) колонию, приготовьте из неё мазок, окрасьте по Граму, промикроскопируйте. Остаток этой же колонии посейте на среду Олькеницкого. Наблюдения и проделанную работу запишите в рабочую тетрадь. 3. Изучение методов диагностики брюшнотифозного бактерионосительства. Запишите в рабочей тетради методы. Учтите результат демонстрационной реакции непрямой Vi– гемагглютинации. Ознакомьтесь с образцами эритроцитарных диагностикумов. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ К ЗАНЯТИЮ Идентификация культур сальмонелл при помощи монорецепторных агглютинирующих сывороток После изучения морфологии и ферментативной активности культуры, выделенной от больного, для окончательной идентификации необходимо изучение её антигенных свойств путём постановки реакции агглютинации с монорецепторными сальмонеллёзными сыворотками. Монорецепторной агглютинирующей сывороткой называется сыворотка, содержащая антитело (рецептор) по отношению к одному антигену. О-сыворотка, рецептор «4» содержит антитело к соматическому антигену сальмонелл 4; H-сыворотка «в» содержит антитело к жгутиковому антигену «в» (см. схему Кауфмана–Уайта). Для идентификации культуры сначала ставят реакцию агглютинации на стекле со смесью нескольких О-сывороток и при положительном результате агглютинации устанавливают принадлежность культуры к роду сальмонелл. После этого ставят реакцию агглютинации отдельно с каждой О-сывороткой, входившей в смесь, чтобы установить серологическую группу. Определив групповую принадлежность культуры, ставят реакцию агглютинации с видовыми Н-сыворотками и, таким образом, определяют вид выделенной культуры сальмонелл. РАБОТА СТУДЕНТА НА ПРАКТИЧЕСКОМ ЗАНЯТИИ 1. Продолжение исследования на гемокультуру. Отберите изолированную лактозоотрицательную колонию на среде Эндо и пересейте её на среду Олькеницкого (демонстрация). Запишите в рабочую тетрадь проделанную работу. 2. Продолжение исследования на копрокультуру. Учтите результат посева на среду Олькеницкого: сбраживание лактозы, глюкозы, газообразование, сероводород. Поставьте реакцию агглютинации на стекле выросшей культуры с монорецепторными сыворотками. Сформулируйте ответ. Опишите результаты проделанной работы в графе «Ход исследования», а окончательный ответ – в графе «Результат». Изучите демонстрационный набор агглютинирующих сывороток. 3. По таблицам разберите схему исследования при пищевой токсикоинфекции сальмонеллёзной этиологии. 4. Продолжение исследования на бактериальную дизентерию. Изучите колонии, выросшие на среде Плоскирева, отберите изолированную лактозонегативную колонию и проведите реакцию агглютинации на стекле с сыворотками Флекснер и Зонне. Запишите в рабочую тетрадь проделанную работу, а в графе «Результат» - предварительный результат, в графе «Примечания» - что необходимо сделать для получения окончательного ответа. 5. Продолжение исследования на коли–инфекцию. Изучите колонии, выросшие на среде Эндо. Отберите изолированные лактозоположительные колонии, поставьте реакцию агглютинации на стекле с комплексной сывороткой материала из нескольких колоний до положительного результата (до 10 колоний). Колонию, давшую положительный результат, пересейте на скошенный агар. Запишите в рабочую тетрадь проделанную работу. Изучите демонстрационные препараты агглютинирующих сывороток для диагностики коли–инфекции. 5. Изучите ферментативные свойства энтеробактерий по демонстрационным микротестсистемам для биохимической идентификации энтеробактерий. ПОСЛЕ ИЗУЧЕНИЯ ТЕМЫ СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ 1. Провести идентификацию исследуемой гемокультуры с учётом морфо-тинкториальных, биохимических, антигенных свойств. 2. Провести идентификацию исследуемой копрокультуры при диагностике кишечной коли-инфекции с учётом морфо-тинкториальных, биохимических, антигенных свойств. 3. Проводить исследования для выделения возбудителей холеры. 4. Выбирать биологические препараты для диагностики, профилактики и терапии кишечных инфекций. 8. Материалы для разбора с преподавателем и контроля его усвоения: 8.1. Разбор с преподавателем узловых вопросов для освоения темы занятия. 8.2. Демонстрация преподавателем методик практических приемов по теме. 8.3. Материал для контроля усвоения материала: Вопросы для решения с преподавателем: 1. Род сальмонелл, серологическая классификация Кауфманна-Уайта. Вибрионы, спириллы как извитые формы бактерий. 2. Возбудители брюшного тифа и паратифов: морфология, культуральные и ферментативные свойства, антигенная структура, факторы вирулентности. 3. Брюшной тиф и паратифы: источник инфекции, механизм заражения, пути распространения. 4. Патогенез брюшного тифа. Лабораторная диагностика: бактериологический метод, гемо-, копро- и уринокультура; серологический метод (реакция Видаля, РНГА, иммунофлюоресцентный). 5. Бактерионосительство. Выделение. Профилактика и лечение брюшного тифа и паратифов. 6. Сальмонеллы – возбудители госпитальных гастроэнтеритов: основные виды, их морфология, культуральные, ферментативные и антигенные свойства. 7. Заболевания у человека: источник инфекции (основные виды животных и птиц), механизм заражения (эндогенное и экзогенное инфицирование мясных и других продуктов.) 8. Патогенез, клиника сальмонеллезов, иммунитет. Лабораторная диагностика: гемокультура, копрокультура, исследование других материалов; реакция агглютинации, РНГА. Лечение и профилактика. 9. Сальмонеллы – возбудители госпитальных сальмонеллезов. Острые пищевые гастроэнетеритов другой этиологии. Тесты для решения с преподавателем: Тест № 1. При бактериологическом исследовании выделений больного на кишечную инфекцию была выделена Shigella sonnei. Какую из перечисленных серологических реакций было использовано для идентификации выделенной чистой культуры? A *Реакция агглютинации B Реакция преципитации C Реакция связывания комплемента D Реакция нейтрализации E Реакция лизису Тест № 2. Больной А. длительное время лечился по поводу пневмонии не выясненной этиологии, устойчивой к стандартной терапии. Из анамнеза установлено, что он длительное время находился в служебной командировке в США. Находясь в командировке получил травму, лечился в госпитале. после выздоровления возвратился на родину. Оценивая анамнез, клиническую картину заболевания, врач заподозрил у больного СПИД. Результаты какого метода лабораторной диагностики позволяют подтвердить предварительно поставленный диагноз у данного пациента A *Иммуноферментный анализ B Реакция Видаля C Реакция связывания комплемента D Электронная микроскопия Тест № 3. Студент стоматологического факультета был госпитализирован на 3 сутки от начала заболевания с предварительным диагнозом – “брюшной тиф”. Какой метод лабораторной диагностики позволяет поставить микробиологический диагноз? A *Бактериологический B Микроскопический C Серологический D Биологический E Аллергический 9. Перечень вопросов, рекомендованных для УИРС: 1. Внутрибольничный сальмонеллѐз 2. «Современные особенности бактериальной дизентерии 10. Литература: - Основная: 1. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология : учеб. для студентов мед. вузов/ под ред. А.А. Воробьева. – 2-е изд., испр. и доп. – М.: МИА, 2012. -410 с.: ил. 2. Микробиология, вирусология, иммунология: рук. к лаб. занятиям /В.Б.Сбойчаков [ и др.]; под. ред. В.Б. Сбойчакова, М.М. Карапаца. – М.: ГЭОТАР Медиа, 2012.- 320 с.: ил. 3. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: учеб. пособие для студентов мед. вузов/ под ред. А.С. Быкова, А.А. Воробьева, В.В. Зверева. – 2-е изд., доп. и перераб. – М.: МИА, 2008. – 271 с.: ил. 4. Общая медицинская вирусология : учеб. пособие для студентов мед. вузов России / под ред. Н.С. Горячкиной, Л.И. Кафарской. – Ростов н/Д. : Феникс; М. : РГМУ, 2007. – 138 с. 5. Поздеев, O.K. Медицинская микробиология : учеб. пособие для студентов мед. вузов / O.K. Поздеев ; под ред. В. И. Покровского. – М. : ГЭОТАР-Мед, 2006, 2004. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии : учеб. пособие для студентов мед. вузов / под ред. В. В.Теца. – 2-е изд., перераб. и доп. – М. : Медицина, 2002. – 352 с. 6. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология : учебник для мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - СПб. : СпецЛит, 2010. - 5-е изд., испр. и доп. - 760 с.: ил. 7. Лекционный материал. - Дополнительная: 1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учеб. по дисциплине «Микробиология, вирусология и иммунология» для студентов, обучающихся по специальностям: 060101. 65 «Лечебное дело», 060103. 65 «Педиатрия», 060104. 65 «Медико-профилактическое дело» : в 2 т./ под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – Т. 2. – 477 с.: ил. + 1 электрон, опт. диск (CD-ROM). 2. Микробиология, вирусология и иммунология : учеб. пособие для студентов мед. вузов / под ред. В.Н. Царева. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 540 с. : ил. 3. Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учеб. для мед. вузов/ А.И. Коротяев, С.А. Бабичев ; под ред. А.И. Коротяева. – 3-е изд., испр. и доп. – СПб. : СпецЛит., 2002. – 580 с. :ил
