Лабораторная диагностика нарушений гемостаза Под термином «гемостаз» подразумевается комплекс реакций, направленных на остановку кровотечения при травме сосудов. Но значение системы гемостаза намного сложнее и шире. Причины, которые могут приводить к травме сосудов разнообразны: 1) Экзогенные факторы – механические повреждения, лучевое воздействие, гипер- и гипотермия, токсические вещества, в т.ч. лекарственные препараты. 2) Эндогенные факторы – биологически активные вещества: тромбин, циклические нуклеотиды, ряд цитокинов, способные при определенных условиях проявлять мембраноагрессивные свойства. Система гемостаза — это биологическая система, которая обеспечивает сохранение крови в жидком состоянии, а также предупреждает и останавливает кровотечение путем образования пробки в месте повреждения сосуда. Физиологическая роль системы гемостаза заключается в поддержании необходимого объема циркулирующей крови в кровеносном русле, что обеспечивает нормальное кровоснабжение органов. По современным представлениям в остановке кровотечения участвуют 2 м-ма: Клеточный (сосудисто-тромбоцитарный) Плазменный (коагуляционный) Важно отметить, что деление на клеточные и плазменные является условным, в организме эти два звена свертывающей системы крови тесно связаны и не могут существовать раздельно. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз. В нем участвуют сосуды и ткань, окружающая сосуды и форменные элементы крови (главная роль у тромбоцитов) Свойства эндотелия Он участвует в гемостазе не как отдельная клетка, а как единый тканевой пласт. Со стороны просвета сосуда на поверхности эндотелиальных клеток сформирован слой гликокаликса, состоящий из протеогликанов (среди них важнейшие – сиаловые кислоты), гликопротеидов и гликолипидов. Эти соединения защищают эндотелий от повреждений и обладает антикоагулянтной активностью. Неповрежденный эндотелий имеет отрицательный заряд за счет сиаловых кислот. Клетки крови также на своей поверхности имеют сиаловые кислоты, то есть заряжены отрицательно. Поэтому между эндотелием и клетками крови формируются силы электростатического отталкивания – дзета-потенциал. В результате клетки крови не могут прилипать к сосудистой стенке. Когда происходит повреждение, то вышележащий слой уже заряжен положительно и начинает происходить налипание клеток. В эндотелии синтезируются антиагреганты – простациклин и оксид азота, которые препятствуют адгезии и агрегации тромбоцитов. Структура тромбоцитов Имеют сложное строение, внутри содержат много гранул, выделяют факторы роста, в т.ч. эндотелия сосудов. Тромбоциты способны: Поддерживать нормальную структуру микрососудов (ангиотрофическая функция) Высвобождать вазоактивные вещества (серотонин, гистамин, катехоламины) Образовывать первичную пробку за счет способности присоединяться к сосудистой стенке (адгезия) и склеиваться между собой (агрегация). От тромбоцитов зависит начальный и конечный этап тромбообразования. При повреждении сосуда тромбоциты прикрепляются к месту разрыва, распластываются по поврежденной поверхности, склеиваются друг с другом, образуя первичную гемостатическую пробку (рис.1). Рис. 1. Белый тромб в месте повреждения Агрегация происходит за счет участия фактора Виллебрандта, который функционирует подобно мостикам между тромбоцитами и волокнами коллагена (рис.2). Потом сама сосудистая стенка начинает вырабатывать активные соединения: АДФ, катехоламины, серотонин, которые вызывают спазм сосудов и агрегацию тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов определяют в лаборатории с помощью этих соединений. Рис. 2. Агрегация тромбоцита Начинается все с тромбоцитов, но мгновенно запускаются и коагуляционные процессы. В итоге образуется белый тромб. Белый тромб состоит только из тромбоцитов, два процесса: адгезия и агрегация. Вторичный гемостаз. Плазменно-коагуляционная система Включает 15 факторов свертывания крови, которые обеспечивают активацию тромбоцитов и превращение растворенного в плазме белка фибриногена в нити фибрина, которые опутывают и фиксируют тромбоциты и другие клетки крови (в частности эритроциты), обеспечивая плотную закупорку поврежденных сосудов тромбом – красным тромбом. Факторы коагулационной системы обозначается римскими цифрами в порядке их хронологического открытия. Некоторые из них имеют названия (рис.3). Рис. 3. Плазменные факторы 6 фактора нет!! Есть еще два белка – кининоген и прекалликреин, которые воздействуют на 12 фактор. Потом из тромбоцитов выделяются ростовые факторы, и рана регенерирует. Схема активации при повреждении извне: Контакт с поверхностью -> калликреин-кининовая система -> каскад расщеплений, приводящий к активации 10 активного фактора. Есть другой вариант, когда повреждение снаружи, например, в ходе операции – тканевый фактор, от него идет активация 7-го фактора, он активирует 10 активный и пути сходятся (рис. 4). Рис. 4. Каскадная схема свертывания крови Антикоагуляционная система Предотвращает самопроизвольное тромбообразование, в нее входят белки, синтезирующиеся в организме и постоянно циркулирующие в крови – антитромбин III (АТIII), протеин S и С, гепарин. На долю антитромбина III приходится около 80% всей антикоагулянтной активности плазмы. Фибринолитическая система Включает протеазы (ферменты, разрушающие белки), и их активаторы, например, плазмин. Обеспечивает расщепление (деградацию) и удаление фибрина из кровотока. При этом образуются продукты деградации фибрин (ПДФ). Фибринолитическое звено – внешняя активация и внутренняя активация – из них плазминоген и потом плазмин (рис.5.) (он тут активный белок, он не циркулирует в крови, так как в нативном состоянии он будет расщеплять фибрин и фибриноген, поэтому он циркулирует в неактивном состоянии). Рис. 5. Фибринолитическое звено На плазминоген действует множество соединений, чтобы он превратился в плазмин (рис. 6.) Рис. 6. Схема превращения плазминогена в плазмин Компоненты системы гемостаза Костный мозг, печень, селезенка тоже могут рассматриваться как компоненты системы гемостаза, поскольку в них синтезируются и накапливаются тромбоциты и плазменные компоненты системы гемостаза. Тестирование системы гемостаза необходимо: Выявление нарушений в системе гемостаза. Выявление допустимости оперативного вмешательства при выявленных нарушениях. Проведение контроля за терапией антикоагулянтами прямого и непрямого действия, а также тромболитической терапией. Нарушение гемостаза или коагулопатия – нарушение функции свертывающей и противосвертывающей систем крови. Гиперкоагуляционно-тромботическое состояние - патологический процесс усиления свертываемости крови вследствие повышенной агрегации тромбоцитов, активации плазменных и тканевых факторов свертвыания с образованием кровоточивости и кровотечений. ДВС-синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови – патологический процесс нарушения гемостаза в результате последовательно протекающих реакций свертывания крови: 1. Гиперкоагуляции (образование тромбов в микроциркуляторной сосудистой сети) 2. Гипокоагуляции (истощение тромбогенных факторов и усиление фибринолиза), сопровождающихся массивным кровотечением, тяжелым гиперкоагуляционным шоком, острой дистрофией внутренних органов. Рис.7. Причины ДВС-синдрома Гипокоагуляционное состояние – это наследственное заболевание, связанное с нарущением коагуляции, при этом заболевании возникают кровоизлияния в суставы, мышцы и внутренние органы, как спонтанные, так и в результате травмы или хирургического вмешательства. При гемофилии резко возрастает опасность гибели пациента от кровоизлияния в мозг и другие жизненно важные органы даже при незначительной травме. Больные с тяжелой формой гемофилии подвергаются инвалидизации из-за кровоизлияний в суставы – гемартрозы – и мышечные ткани – гематомы. 1. Гемофилия А (рецессивная мутация в Х-хромосоме) вызвана отсутствием в крови необходимого белка – фактора 8. Такая гемофилия считается классической, она у 80-85% больных гемофилией. Характерно тяжелое кровотечение при травмах, операциях наблюдается при уровне 8 фактора – 5-20% 2. Гемофилия В (болезнь Кристмаса) вызвана дефектным фактором крови 9 (рецессивная мутация в Х-хромосоме), нарушено образование вторичной коагуляционной пробки. 3. Гемофилия С вызвана дефектным фактором крови 11 (аутосомная рецессивная мутация). Не буду писать про евреев 4. Гемофилия D отсутствие фактора 12. В плазме он находится в нативном состоянии, блокируясь ингибитором. При соприкосновении с чужеродной поверхностью ингибитор отщепляется, фактор 12 активируется. Он участвует в образовании активного тромбопластина. Под его воздействием активизируется фибринолиз. Метод оценки тромбоцитарного гемостаза Количество тромбоцитов определяется в камере Горяева или на современных гематологических анализаторах. Показатели функциональной активности тромбоцитов (индуцированная агрегация) – исследование проводят в плазме, обогащенной тромбоцитами. Методика определение агрегации основывается на светопропускании волн через плазму крови перед и после свертываемости. Нормы показателей тромбоцитарного звена гемостаза Количество тромбоцитов, 10*9/л Взрослые: 180-320 Новорожденные: 99-421 Степень АДФ-индуцированной агрегации 25-35 тромбоцитов, % Степень адреналин-индуцированной 25-35 агрегации тромбоцитов, % Степень ристомицин-индуцированной 30-40 агрегации тромбоцитов, % Агрегация тромбоцитов АДФ-индуцированная агрегация отсутствует при: тромбастении Гланцманна (генетический дефект структурных белков тромбоцитов) при передозировке блокаторов АДФ -рецепторов (клопидогрел, прасугрел, тикагрелор) АДФ-индуцированная агрегация снижена при: использовании аспирина в высоких дозах как противовоспалительного средства дефекте рецепторов АДФ использовании антиагрегантов, средств для наркоза, алкоголя приобретенных тромбоцитопатиях при генетических заболеваниях Адреналин-индуцированная агрегация повышена при: Курении Стрессе Кардиогенном шоке Адреналин-индуцированная агрегация снижена при: При использовании аспирина Нарушении секреции адреналина Дефекте рецепторов тромбоцитов Дефиците плотных гранул в тромбоцитах Ристомицин — индуцированная агрегация отсутствует при: При синдроме Бернара-Сулье При болезни Виллебранда Ристомицин- индуцированная агрегация снижена при: Дефиците плотных гранул Нарушении секреции тромбоцитов Определение ристомицин — индуцированной агрегации применяют для количественной оценки фактора Виллебранда Лекция 2. Тесты оценки плазменного гемостаза В настоящее время есть наиболее распространенные методы – клоттинговые или коагуляционные. Клоттинговые методы основаны на определении промежутка времени от добавления реактива, запускающего каскад свертывания плазмы, до момента образования сгустка (выпадение фибрина). Клоттинговые методы являются скрининговыми. Норма показателей плазменно-коагуляционного звена гомеостаза Активированное частично тромбопластиновое время (АЧТВ), с Время свертывания крови (по Ли-Уайту), мин Протромбиновое время, с Нормальное МНО: Близко 1.0, но меньше 1.4 Тромбиновое время, с Концентрация Фибриногена в плазме, г/л 25-35 3-8 Взрослые: 11-15 Новорожденные: 13-18 12-16 Взрослые: 2.00 – 4.00 Новорожденные: 1.25 – 3.00 Показатели, характеризующие коагуляционный гемостаз: АЧТВ (АПТВ) – активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время, Эта коагуляцонная проба, чувствительна к дефициту всех плазменных факторое свертывания, кроме фактора VII. Удлинение АЧТВ наблюдается при: врожденном или приобретенном дефиците факторов II, V, VIII, IX, X, XI, XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (вмк) лечении гепарином и прямыми ингибиторами тромбина наличии в крови волчаночного антикоагулянта и высоких концентраций продуктов деградации фибрина (ПДФ) дефиците фактора Виллебранда синдроме ДВС гипофибриногенемии (менее 1 г/л) Укорочение теста АЧТВ часто бывает связано с нарушением преаналитического этапа (например,травматичное взятие крови ). Может быть ассоциировано с развитием острых сосудистых событий. Протромбиновый тест или протромбиновое время (ПВ) характеризует фактор ІІ -протромбин, который синтезируется в печени при участии витамина К. Характеризует первую и вторую фазы плазменного гемостаза, а также активность факторов V ІІ, V, X. Используют для контроля терапии непрямыми антикоагулянтами, т.к. они являются антагонистами витамина К. Протромбиновое время принято выражать в секундах и в виде МНО (международного нормализованного отношения) в случае контроля за терапией антикоагулянтами непрямого действия (варфарином) Рис.8. Расчёт значений МНО Для эффективности антикоагулянтной терапии необходимо: Диапазон МНО МНО 2.0-3.0 МНО 2.5-3.5 Показания для лечения Профилактика и лечение венозных тромбозов и тромбоэмболий Лечение рецидивирующих тяжелых тромбозов магистральных вен, эмболий в бассейне легочной артерии (ТЭЛА), имплантация искусственных клапанов сердца Удлинение ПВ (повышение МНО) наблюдается при: заболеваниях печени с нарушением белкового-синтетической функции лечении антагонистами витамина К дефиците витамина К (холестаз, мальабсорбция, дисбактериоз) присутствии ингибиторов свертывания (гепарин в высокой дозе, иногда ПДФ) врожденном дефиците факторов II, V, VII, X гипофибриногенемии, синдроме ДВС Укорочение и снижение МНО наблюдается при гиперкоагуляционном синдроме и применении гемостатических препаратов. Тромбиновое время (ТВ) – характеризует конечный этап свертывания и превращения фибриногена в фибрин. Удлинение ТВ наблюдается при: Действие медикаментозных ингибиторов тромбина (гепарины), патологически ингибиторов тромбино- и фибринообрзования ПДФ, парапротеины Снижение концентрации фибриногена с высоким риском кровотечений Уремии Укорочение ТВ наблюдается при: гиперфибриногенемии Фибриноген Фибриноген (фактор I) – белок, синтизирующийся в печени и под действием фактора XII превращается в нерастворимый фибрин. Увеличение уровня фибриногена наблюдается при: бактериальных инфекциях травмах заболевания почек коллагенозах новообразованиях атеросклерозе сердечно-сосудистых заболеваниях курении Снижение концентрации фибриногена наблюдается при: врожденном дефиците печеночной недостаточности синдроме ДВС острых фибринолитических состояниях инфекционном мононуклеозе значительной физической нагрузке ряде лекарственных препаратов Если у мужчин повышенное тромбообразование – это ранние инсульты, если у женщин – бесплодие. Мутация Лейдена приводит к бесплодию у 3.5% женщин репродуктивного возраста. Рис.9. Плазменный гемостаз Нормы показателей системы фибринолиза и антикоагулянтного звена гемостаза Фибринолитическая активность, мин 180-360 Активность антитромбина III, % 80-120 Протеин С, % Протеин S, % 70-130 60-140 Антитромбин III – гликопротеин, образующийся в сосудистом эндотелии. Оказывает основное угнетающее влияние на процессы свертывания. Главный ингибитор тромбина и фактора Х. Гепарин синтезируется тучными клетками и гранулоцитами, его особенно много в печени, лёгких, сердце и мышцах. Образует с АТ IІ комплекс, называемый антитромбином І (АТ І), повышая тем самым эффективность АТ ІІІ и подавляя образование и действие тромбина. Кроме того, гепарин служит активатором фибринолиза, способствуя растворению сгустков крови. Протеин С - синтезируемый в гепатоцитах витамин К- зависимый гликопротеин, циркулирующий в крови в виде неактивного фермента. Действует как антикоагулянт, вызывая расщепление и инактивирование факторов Va u Vllla в присутствии своего кофактора - протеина Sи фосфолипидов. Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК), отн.ед. Продукты деградации фибрина/фибриногена (ПДФ), мг/мл D-димер, мкг/мп 0,26 – 0, 48 Кач.- отр. Меньше 10 Меньше 0,5 Показатели, характеризующие фибринолитический гемостаз Фибринолитическая активность (эуглобулиновый лизис) – тест используется для оценки времени от момента образования сгустка фибрина до его растворения. Этаноловый тест паракоагуляционный тест, служащий для быстрого выявления продуктов деградации фибрина (ПДФ). Анализ на наличие Д-димеров дает врачам возможность оценить процесс свертываемости крови и обнаружить склонность к тромбозу. Рис.10. Фактор времени в оценке гемостаза Технология взятия крови из вены для исследования крови на коагулограмму Забор крови для исследования производят утром строго натощак. Кровь берется в пластиковые центрифужные пробирки (с цитратом) до метки (соотношение цельной крови к антикоагулянту составляло 9:1), из вены острой сухой (во избежание гемолиза) иглой с широким просветом без шприца. Интенсивное встряхивание и вспениваине усиливют гемолиз эритроцитов, что искажает многие параметры коагулограммы. Время между взятием крови и ее обработкой в лаборатории (центрифугирование и отделение плазмы) не должно превышать 30 минут. Центрифугирование: Богатая тромбоцитами плазма 5-10 минут, 1500 об/мин Бедная тромбоцитами плазма 15-20 минут, 3000-4000 об/мин Кровь должна быть проанализирована в период не позднее 2-х часов после забора. При температуре -18-20°С плазма может храниться в течение 30 суток, без значимых потерь, при однократном размораживании. Одним из наиболее доступных общеоценочных тестов является тромбоэластография (ТЭГ), на основании которой можно интегрально судить о функционировании всех звеньев гемостаза ТЭГ позволяет дифференцировать подострые и острые формы синдрома ДВС, тромбоцитопении и тромбоцитопатии, адекватность противотромботической и гемостатической терапии. RОТЕМ — анализ основан на методах тромбоэластометрии усовершенствованной и переработанной формы классической тромбоэластографии (рис. 11). Рис. 11. Параметры RОТЕМ Рис. 12. Активированная тромбоэластометрия и компьютерный анализ Тромбодинамика — глобальный тест свертывающей системы крови. Позволяет выявлять гипо- и гиперкоагуляцию. Подходит для ранней диагностики склонности к тромбообразованию. Тест тромбодинамики — исследование in vitro пространственно -временной динамики свертывания крови, инициировазованным активатором свертывания в условиях близких к условиям in vivo. Образцы плазмы крови вводятся в каналы прозрачной кюветы. Активатормоделирует поврежденную стенку. Процесс возникновения и рост фибринового сгустка регистрируется световой видеокамерой. Полученные кадры дают информацию о динамике свертывания крови во времени и пространстве. На основе данных рассчитываются численные параметры динамики роста фибринового сгустка: время задержки роста, скорость роста, наличие спонтанного тромбообразования. Основные параметры тромбодинамики: Tlag (0.6-1.5 мин) лаг-тайм – время задержки начала образования сгустка после контакта плазмы со вставкой активатором. V (20-29 мкм/мин) скорость роста сгустка – рассчитанная на интервале 15-25 мин после начала роста. Tsp (>30 мин) время появлени спонтанных сгустков в объеме плазмы изначально не контактирующем со вставкой-активатором. Применение: Диагностика склонности свертывающей системы к тромбозам в послеоперационном периоде (в том числе после травм и обширных ортопедических вмешательств) при обширных травмах при ожоговых болезнях при онкологических заболеваниях Мониторинг эффективности антикоагулянтной терапии в послеоперационном периоде (в том числе после травм и обширных ортопедических вмешательств) при лечении глубоких вен нижних конечностей при длительном периоде ограниченной подвижности неврологические нарушения при хирургическом или химиотерапевтическом лечении онкологических больных Мониторинг заместительной терапии контроль эффективности трансфузии свежезамороженной плазмы (СЗП) контроль заместительной терапии VІІІ и ІХ факторов Вопросы к ПН. Что такое гемостаз в целом? Первичный гемостаз. Как его оцениваем (активность тромбоцитов, по тромбоцитам)? Вторичный, как оцениваем? Современные глобальные тесты.
