Методы лабораторного исследования гемостаза

“Методы лабораторного
исследования гемостаза”
1. Скрининговые исследования
2. Исследование сосудистотромбоцитарного звена
гемостаза
Лабораторные методы, используемые
в исследовании гемостаза:
•
•
•
•
•
•
Клоттинговые: (ВСК, ПВ, АПТВ, ТВ …)
Хромогенные: (активность ATIII, PC, Pl)
Иммунологические:(количество отдельных факторов)
ПЦР: (ДНК-диагностика наследственных гемофилий и
тромбофилий: аномалия Лейдена, гомоцистеинемия, дефицит
AT)
Проточная цитофлуориметрия: (определение рецепторов
тромбоцитов)
Нефелометрия: (исследование функции тромбоцитов по
методу Born)
Клоттинговые методы:
- основаны на определении
времени образования,
а также растворения сгустка
в стандартных условиях;
- определяется активность
отдельных звеньев
системы свертывания
и фибринолиза.
Хромогенные методы:
- это хромогенное (оптическое) определение
хромогенных (окрашенных) веществ
(нитроанилина) связанных с субстратами (белками)
специфических реакций;
- так определяется активность отдельных
компонентов свертывающей, антитромбиновой или
фибринолитической системы.
Пример: Стрептокиназа + плазминоген** =
плазмин + свободный
нитроанилин**(желтая окраска)
Скрининговые тесты гемостаза:
1) Определение резистентности микрососудов:
- манжеточная проба;
-баночная проба;
-проба щипка
2) Определение времени кровотечения:
- по Дьюка;
- по Айви;
- по Шитиковой
3) Определение времени свертывания крови:
- по Ли и Уайту
Манжеточная проба
Выполнение:
Создают венозный стаз путем дозированного сжатия плеча
манжеткой тонометра (90 мм на 5 минут) и подсчитывают
количество петехий в в верхней ладонной поверхности
предплечья и локтевого сгиба.
Клиническое значение:
Положительная проба возможна при врожденной ломкости
капиляров, тромбоцитопении, значительной
тромбоцитопатии, гиповитаминозе С, болезни Виллебранда,
приеме непрямых антикоагулянтов, гормональном сдвиге у
женщин, ДВС-синдроме.
Время кровотечения
- тест общего состояния сосудистотромбоцитарного звена гемостаза
Выполнение:
Определяют длительность кровотечения из микрососудов
кожи после дозированного (3 мм) прокола ее ланцетом.
Клиническое значение:
Удлинение времени кровотечения возможна при
значительной тромбоцитопении, тяжелых формах
тромбоцитопатии (тробастения Гланцмана), болезни
Виллебранда, приеме непрямых антикоагулянтов,
гормональном сдвиге у женщин, ДВС-синдроме.
Оценка работы
первичного гемостаза
Оценка работы
первичного гемостаза
Прибор для
количественной
оценки
гемостатической
функции
тромбоцитов
Platelet Function аnalyzer-100
Определение количества
тромбоцитов: (170-350х10/л)
1) В мазке по Фонио: не может быть
рекомендован из-за малой точности.
2) Подсчет в камере Горяева после гемолиза
эритроцитов оксалатом аммония.
3) С помощью автоматического счетчика в
венозной крови, стабилизированной ЭДТА.
Исследование функции
тромбоцитов
Выполняется из венозной крови, стабилизированной
цитратом натрия в соотношении 1/9; в течении 1 часа
после забора крови.
Богатая тромбоцитами плазма - отбирают
после центрифугирования крови при 1000 оборотов
/6 минут
Бедная тромбоцитами плазма - отбирают
после центрифугирования крови при 3000
оборотов/ 15 минут
Исследование функции
тромбоцитов:
РЕТРАКЦИЯ В ПЛАЗМЕ (богатой тромбоцитами)
Пробирка полистироловая мерная:
2,5 мл забуференного физ.раствора
0,2 мл тромбина
0,2 мл Ca Cl2 (0,277%)
Добавить 0,2 плазмы, богатой тромбоцитами
Перемешать, вылить в пластиковый шприц на 5,0 мл
инкубировать 60 минут при 370С
Вынуть сгусток
Замерить объем
Расчет: Vост/ Vобщ . 100%
Исследование агрегации
тромбоцитов
• ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД Борна основан на регистрации изменений
светопропускания богатой тромбоцитами
плазмы после активации индукторами.
• Индукторы агрегации - естественные
или искуственные активаторы:
•
•
•
•
АДФ;
Адреналин;
Коллаген;
Ристоцетин и др.
Агрегометр HELENA PACKS-4
• СПИСОК МЕТОДИК:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Агрегация с АДФ
Агрегация с эпинефрином
Агрегация с коллагеном
Агрегация с ристоцетином
Агрегация с арахидонатом
Активность фактора фон
Виллебранда (по
ристоцетин-кофакторной
активности)
Хромогенное определение:
Антитромбина III
Плазминогена
Протеина С
Гепарина
Активности фактора VIII
Агрегометры
AP 2110
Анализатор агрегации
тромбоцитов предназначен для
исследования in vitro
агрегационных свойств
тромбоцитов
турбидиметрическим методом.
Анализатор агрегации
тромбоцитов АMS 600
Агрегометры
Агрегометр LA230
( " БИОЛА" Россия)
Агрегометр тромбоцитарный
"CHRONOLOG CORP." (США)
Двухканальный анализатор агрегации
тромбоцитов
Агрегометр 430 (одноканальный)
Агрегометр 440VS(двухканальный)
Агрегометр 470VS(четырехканальный)
Оптический анализатор агрегации
тромбоцитов служит для исследования
агрегационных свойств тромбоцитов в
Прибор позволяет проводить в каждом
канале исследования агрегации
тромбоцитов методом светопропускания и
определения среднего радиуса
тромбоцитарных агрегатов.
плазме.
Оптическая агрегометрия используется для исследования
процессов агрегации на плазме обогащенной тромбоцитами
(PRP), а также для измерения агглютинации латексных частиц и
для исследования изменения формы взвешенных частиц.
Оптические агрегометры «Хроно-лог» с успехом используются
во всем мире уже многие годы, начиная с 1967 г и являются
«золотым» стандартом в оптической агрегометрии.
Двойной инфра-красный луч и чувствительный
фотодетекторный модуль используется для определения
разницы в световом прохождении между плазмой обогащенной
и обедненной тромбоцитами.
Цельная кровь, разведенная кровь, плазма
обогащенная тромбоцитами, отмытые тромбоциты,
отмытые лейкоциты – все эти образцы могут быть
измерены с помощью импедансной технологии.
Корпорация «Хроно-лог» обладает патентом на
применение этого метода.
Широкий спектр люминисцентных реакций (выброс АДФ,
уровень ионизированного кальция, генерация
супероксидов и др.) может быть измерен при помощи
ультра-чувствительной фотоумножительной трубки,
которая испльзуется в люми-агрегометрах корпорации
“Хроно-лог”. Люминисценция используется для детекции
всех дефектов накопления и секреции. Этот метод также
достаточно чувствительный для детекции гепарининдуцированной тромбопении.
Тромбоэластограф
Гематокоагулограф
ГКГМ4-02
тромбоэластограф
роТЭГ "
Анализатор гемостаза роТЭГ " это современный 4-х канальный
компьютерный
тромбоэластограф.
ОСНОВНЫЕ ИЗМЕРЯЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ
CT (время коагуляции) - общая активность коагуляционной
системы
CFT (время образования сгустка) и a-угол (начальная скорость
оборазования сгустка) – оценка функции тромбоцитов,
действия фактора XIII, полимеризации фибрина, активности
гепарина
MA (или MCF) – качество сгустка, оценка его механических
свойств
LOT (время наступления фибринолиза) – оценка
фибринолитической активности l-угол – скорость фибринолиза
ПРИМЕРЫ
ГРАФИКОВ
ИДЦ 2008-2011г.г.
Автоматический
коагулометр
STA-R Evolution
Roche Diagnostics,
Франция
Гемостаз в ИДЦ
Структура исследований отдела лабораторной
диагностики по лабораториям
40%
41%
Гемостаз
6%
8%
5%
Биохимическая лаборатория
Гематологическая лаборатория
Молекулярно-биологическая лаборатория
Лаборатория общеклинических исследований
Иммунологическая лаборатория
Гематология
Спектр анализов лаборатории гематологии ИДЦ с учетом
гомеостатических методов
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Полный гематологический анализ
Миелограмма
Протромбиновое время и фибриноген
Коагулограмма стандартная
Ретикулоциты
Цитограмма (мазок из носа или глаза)
LE-клетки
Осмотическая резистентность эритроцитов
Ретракция плазменного сгустка
Агрегация тромбоцитов с АДФ
Агрегация тромбоцитов с ристоцетином
Агрегация тромбоцитов с арахидоновой
кислотой
Агрегация тромбоцитов с коллагеном
Агрегация тромбоцитов с адреналином
Определение фактора Виллебранда
Активность фактора свертывания крови XII
Активность фактора свертывания крови
VIIIАктивность фактора свертывания крови
IXАктивность фактора свертывания крови XI
Активность комплекса протеина С (скрининг)
Активность антитромбина III
Активность протеина С
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Активность плазминогена
Активность альфа-2-антиплазмина
АПТВ с люпус-чувствительным кефалином
Время кровотечения
Коррекционно-ингибиторная проба по АПТВ
Коррекционно-ингибиторная проба по ПТИ
Определение групповой принадлежности по
АВО
Определение резус-антигенов
Фибринолиз
Активность фактора свертывания крови II
Активность фактора свертывания крови V
Активность фактора свертывания крови VII
Активность фактора свертывания крови X
Активность фибриназы (фактор XIII)
Коагулограмма (тромбогенный риск)
Протромбиновое время (с МНО)
Фибриноген
Активированное время рекальциф
Активированное парциальное тро
Тромбиновое время
Растворимые фибрин-мономерные
Содержание Д-димера
TGA-анализ – универсальный метод оценки
тромбогенного потенциала гемостаза
- Диагностика тромбофилий
- Диагностика гемофилий
- Мониторинг противо-гемофилийной
терапии для пациентов с наличием
ингибитора фактора VIII
- Мониторинг антикоагулянтной терапии,
направленной на ингибирование
тромбина и фактора Xa (гепарин)
• Автомат CEVERONALPHA TGA позволяет
проводить уникальный
флуориметрический
TGA-анализ
• 360/430 нм
• CEVERON-ALPHA
для 4 методов анализа:
• - коагулометрия
АЧТВ, ПВ, ТВ, Фибриноген,
Протеин С, ВА, дефицит
факторов свертывания,
мутация Лейдена и другие.
• - фотометрия
С1-ингибитор, FVIII,
Протеин С, АТ-III и другие.
• - турбидиметрия
Д-димер, ВА, Среактивный белок и
другие.
• - флуориметрия
кинетика образования
эндогенного тромбина
(для модификации Ceveron
TGA)
•
Длины волн фотометрического блока:
405, 570, 630 и 740 нм
•
Скорость проведения анализов на CEVERONALPHA до 70 образцов/час (ПВ)
(Стационар на 300-400 больных)
Спасибо за внимание!