Отчет по лабораторной работе Определение содержания азота и сырого протеина методом Кьельдаля и методом Брэдфорда

Отчет по лабораторной работе
Определение содержания азота и сырого протеина методом Кьельдаля и
методом Брэдфорда
Реагенты: катализатор (сернокислая медь), раствор серной кислоты 0.1 н,
раствор борной кислоты (40 г/л), индикатор (0.2г метилового красного, 0.1г
метилового голубого на 100 мл 96% этанола), гидроксид натрия (330 г
NaOH/670 мл H2O); 4% р-р гидроксида натрия, краситель Брэдфорда; шрот
нативный и ферментированный при 37 °С.
Оборудование: Дигестор (минерализатор), аппарат для автоматической
отгонки, весы лабораторные, центрифуга, водяная баня, ультразвуковая камера,
спектрофотометр.
Ход работы:
I. метод Кьельдаля
1. Минерализация проб.
2. Отгонка аммиака в борную кислоту.
Результаты:
Таблица 1. Результаты количественного определения белка методом Кьельдаля
Контроль по Кьельдалю
SBMnative
SBM контроль по гидролизу
FSBM (A. niger)
FSBM (B. subtilis)
FSBM (S. cerevisiae)
FSBM (консорциум)
*H2SO4поправочный к-т
Vобразца, мг
0,7
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,99
V (0.1 н H2SO4), мл
0,50
38,4
27,7
26,4
29,2
27,8
29,4
Азот, %
7,50
9,42
8,99
9,94
9,46
10,01
Протеин, %
0
46,9
58,9
56,2
62,2
59,1
62,6
Вывод 1: наибольшее содержание азота, и, соответственно, сырого протеина
было зафиксировано в пробах, подвергнутых ферментативному воздействию
консорциума микроорганизмов. Несколько меньше протеина обнаружено в
пробе, ферментированной бактериями B. subtilis.
II.метод Брэдфорда
1. Пробоподготовка
К отобранным пробам шрота в размере 0.5 г добавлен 4% раствор
гидроксида натрия с последующей обработкой в ультразвуковой камере (5
мин). После инкубации на водяной бане в течение 20 минут, пробы
центрифугировали 20 минут при 3900 об/мин.
Для спектрофотометрического анализа 2 мкл супернатанта проб
растворяли в 2 мл реактива Брэдфорда.
2. Спектрофотометрический анализ
Анализ пробы проводился при 595 нм. Результаты оценивали по
предварительно полученному калибровочному графику (по БСА, бычья
сыворотка альбумина), приведенному на рис. 1.
Калибровка по БСА
Оптическая плотность
1,4
1,2
1
0,8
0,6
y = 0,0968x + 0,2157
R² = 0,9913
0,4
0,2
0
0
2
4
6
8
10
12
концентрация, мг/мл
Рис. 1. Калибровочный график
Полученные результаты отображены в виде таблицы 2.
Таблица 2. Результаты количественного определения содержания в шроте белка с
использованием реактива Брэдфорда
контроль
FSBM (A. niger)
FSBM (B. subtilis)
FSBM (S. cerevisiae)
FSBM (culturemix)
мг/мл
3,91
3,67
5,13
7,85
6,16
мг/0,5г шрота
39,1
36,7
51,3
78,5
61,60
г/г шрота
0,0391
0,0367
0,0513
0,0785
0,0616
белок, %
3,91
3,67
5,13
7,85
6,16
Вывод 2: при спектрофотеметрическом определении белка с реактивом
Брэдфорда наивысшее содержание белка выявлено в пробе,
ферментированной с использованием дрожжей C. serevisiae.
Общий вывод: для определения содержания белка/протеина в шроте
целесообразнее использовать метод Кьельдаля, т.к. результаты,
полученные на его основе, соотносятся с литературными данными.
Можно предположить, что этап пробоподготовки в методе с реактивом
Брэдфорда слишком «мягкий» для эффективной экстракции белковой
фракции шрота.