Загрузил Петр Великий

Н. А. Войнов "Современные проблемы и методы биотехнологии"

Реклама
УДК 60(075)
ББК 30.16я73
С56
Авторы:
Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова,
С. В. Маркова, Л. А. Франк, Е. И. Шишацкая
Электронный учебно-методический комплекс по дисциплине «Современные проблемы и методы биотехнологии» подготовлен в рамках реализации Программы развития федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет» (СФУ) на 2007–
2010 гг.
Рецензенты:
Красноярский краевой фонд науки;
Экспертная комиссия СФУ по подготовке учебно-методических комплексов дисциплин
С56
Современные проблемы и методы биотехнологии [Электронный ресурс] :
электрон. учеб. пособие / Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова и др. ; под
науч. ред. Т. Г. Воловой. – Электрон. дан. (12 Мб). – Красноярск : ИПК СФУ,
2009. – (Современные проблемы и методы биотехнологии : УМКД № 13232008 / рук. творч. коллектива Т. Г. Волова). – 1 электрон. опт. диск (DVD). –
Систем. требования : Intel Pentium (или аналогичный процессор других производителей) 1 ГГц ; 512 Мб оперативной памяти ; 50 Мб свободного дискового
пространства ; привод DVD ; операционная система Microsoft Windows
XP SP 2 / Vista (32 бит) ; Adobe Reader 7.0 (или аналогичный продукт для чтения файлов формата pdf).
ISBN 978-5-7638-1662-4 (комплекса)
ISBN 978-5-7638-1769-0 (учебного пособия)
Номер гос. регистрации в ФГУП НТЦ «Информрегистр» 0320902481 (комплекса)
Настоящее издание является частью электронного учебно-методического комплекса по дисциплине «Современные проблемы и методы биотехнологии», включающего учебную программу дисциплины, лабораторный практикум, методические
указания по самостоятельной работе, контрольно-измерительные материалы «Современные проблемы и методы биотехнологии. Банк тестовых заданий», наглядное пособие «Современные проблемы и методы биотехнологии. Презентационные материалы».
Рассмотрены новейшие достижения, направления исследования и практической
реализации биотехнологической науки XXI в. Охарактеризованы революционные изменения комплекса наук биологического направления в области генетической инженерии, геномике и протеомике, новейшие достижения молекулярной биотехнологии.
Предназначено для студентов направления подготовки магистров 020200.68
«Биология» укрупненной группы 020000 «Естественные науки».
© Сибирский федеральный университет, 2009
Рекомендовано к изданию
Инновационно-методическим управлением СФУ
Разработка и оформление электронного образовательного ресурса: Центр технологий электронного обучения Информационно-телекоммуникационного комплекса СФУ; лаборатория
по разработке мультимедийных электронных образовательных ресурсов при КрЦНИТ
Содержимое ресурса охраняется законом об авторском праве. Несанкционированное копирование и использование данного продукта запрещается. Встречающиеся названия программного обеспечения, изделий, устройств или систем могут являться зарегистрированными товарными знаками тех или иных фирм.
Подп. к использованию 30.11.2009
Объем 12 Мб
Красноярск: СФУ, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79
Оглавление
ПРЕДИСЛОВИЕ ........................................................... 8
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ
ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» .......... 9
1.1. Роль биотехнологии в современном мире ....................................... 9
1.1.1. Биотехнология – основа научно-технического прогресса и повышения
качества жизни человека ....................................................................................... 10
1.1.2. Особенности развития исследований и коммерциализации
биологических технологий в США, Японии, странах ЕС и России ................ 11
1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов
и продуктов ................................................................................................... 30
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии ........................ 34
1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации
и передачи технологий ............................................................................... 45
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ:
ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ .................................. 51
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов
для биотехнологии ...................................................................................... 51
2.1.1. Рестриктазы и другие ферменты для молекулярного клонирования 52
2.1.2. Полимеразная цепная реакция ................................................................... 54
2.1.3. Общая схема молекулярного клонирования ............................................ 56
2.1.4. основные типы клонирующих векторов ................................................... 58
2.1.5. Общая схема вектора на примере бактериальной экспрессионной
плазмиды.................................................................................................................. 63
2.1.6. Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку ........................................ 66
2.1.7. Проблемы экспрессии чужеродных генов ............................................... 73
2.1.8. Выделение генетически модифицированных организмов и проблема
удаления маркерных генов ................................................................................... 74
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры .............. 76
2.2.1. Рекомбинантные микроорганизмы для получения коммерческих
продуктов ................................................................................................................. 77
2.2.2. Клеточные культуры для продукции белков ........................................... 81
2.2.3. Дрожжевые системы экспрессии ............................................................... 83
2.2.4. Клетки насекомых и бакуловирусы для синтеза белков ....................... 83
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы ................. 84
2.3.1. Конструирование трансгенных растений.................................................. 86
2.3.2. Преимущества и проблемы биопродукции в растительной системе . 91
2.3.3. Области применения генной инженерии растений.................................. 94
2.3.4. Коммерциализация трансгенных растений и биобезопасность .......... 98
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
3
ОГЛАВЛЕНИЕ
2.3.5. Регулирование производства и сертификация генномодифицированного сырья и пищевых продуктов........................................ 102
2.3.6. Трансгенные животные: технологии получения ................................... 103
2.3.7. Применение трансгенных животных ....................................................... 111
2.3.8. Перспективы использования генетически модифицированных
организмов ............................................................................................................. 116
ГЛАВА 3. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ:
ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ТЕРАПИИ
И ДИАГНОСТИКИ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ ....................................................... 119
3.1. Геном человека ................................................................................... 119
3.1.1. Реализация научного проекта «Геном человека» .................................. 120
3.1.2. Построение генетических карт хромосом ............................................... 122
3.1.3. Практическое значение результатов секвенирования генома
человека.................................................................................................................. 127
3.2. Методы молекулярной диагностики ............................................... 130
3.2.1. Методы иммунодиагностики – основные закономерности
и разнообразие ...................................................................................................... 130
3.2.2. Методы диагностики, основанные на ДНК-гибридизации ................... 135
3.3. Основы молекулярной терапии ...................................................... 144
3.3.1. Генная терапия ............................................................................................ 145
3.3.2. Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов....................... 152
3.3.3. Клонирование человека ............................................................................. 157
ГЛАВА 4 КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
И ТКАНЕЙ ................................................................ 159
4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии
растений ....................................................................................................... 159
4.1.1. Тотипотентность растительной клетки ................................................... 159
4.1.2. Исторические этапы развития методов культивирования in vitro .... 160
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro .................. 164
4.2.1. Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов.......... 165
4.2.2. Гормоны и регуляторы роста – необходимые компоненты
питательных сред ................................................................................................. 170
4.2.3. Стерилизация питательных сред ............................................................. 173
4.2.4. Основные требования к условиям культивирования .......................... 175
4.3. Направления и возможности использования культуры
изолированных тканей растений ........................................................... 176
4.3.1. Основные направления использования ................................................. 176
4.3.2. Проблемы культивирования изолированных тканей .......................... 177
4.4. Клональное микроразмножение растений .................................... 179
4.4.1. Этапы и методы клонального микроразмножения растений .............. 180
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
4
ОГЛАВЛЕНИЕ
4.4.2. Оздоровление посадочного материала растений ................................. 186
4.5. Культура каллусных тканей ............................................................. 189
4.5.1. Особенности каллусных клеток................................................................ 191
4.5.2. Генетика каллусных клеток ....................................................................... 192
4.5.3. Морфогенез в каллусных тканях .............................................................. 193
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей .............................. 196
4.6.1. Прямой и непрямой пути органогенеза ................................................... 196
4.6.2. Соматический эмбриогенез ....................................................................... 198
4.6.3. Сомаклональная изменчивость................................................................ 200
4.6.4. Гормоннезависимые растительные ткани ............................................. 203
4.7. Суспензионные культуры................................................................. 205
4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура
одиночных клеток ...................................................................................... 207
4.9. Культура протопластов ..................................................................... 209
4.9.1. Изоляция протопластов ............................................................................. 209
4.9.2. Тотипотентность протопластов ................................................................ 211
4.9.3. Требования к составу сред при культивировании протопластов ..... 212
4.9.4. Использование культуры протопластов ................................................ 213
4.10. Культура гаплоидных тканей ......................................................... 217
4.10.1. Культура пыльников ................................................................................ 218
4.10.2. Использование гаплопродюссеров и отдаленной гибридизации
при получении гаплоидных тканей .................................................................... 220
4.10.3. Возможности гаплоидных технологий .................................................. 222
4.11. Получение растений, устойчивых к различным стрессовым
факторам...................................................................................................... 222
4.11.1. Использование токсинов фитопатогенов в отборе форм растений,
устойчивых к болезням ....................................................................................... 223
4.11.2. Выделение солеустойчивых форм растений путем прямой
и непрямой селекции в культуре ткани ............................................................. 224
4.11.3. Отбор холодоустойчивых форм ............................................................ 225
ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ:
БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ
ПРИМЕНЕНИЯ ......................................................... 227
5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное
направление критических технологий XXI века .................................. 227
5.1.1. Полимеры: определение, виды, области применения ........................ 228
5.1.2. Проблема накопления и пути утилизации полимерных отходов ...... 232
5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических
полимерных отходов ................................................................................ 236
5.2.1. Перспективы получения и утилизации разрушаемых полимеров
на основе возобновляемых природных источников .................................... 237
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
5
ОГЛАВЛЕНИЕ
5.2.2. Придание биоразрушаемости высокомолекулярным синтетическим
полимерам .............................................................................................................. 239
5.2.3. Синтез биоразрушаемых биополимеров ............................................... 241
5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы .................. 243
5.3.1. Биоупаковка – альтернатива синтетическому пластику ...................... 247
5.3.2. Современное состояние и направление работ по разрушаемым
биопластикам ......................................................................................................... 248
5.3.3. Факторы, влияющие на развитие производства разрушаемых
биопластиков ......................................................................................................... 249
5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых
биопластиков .............................................................................................. 253
5.4.1. Природные источники сырья для синтеза разрушаемых
биопластиков ......................................................................................................... 253
5.4.2. Синтез, свойства, области применения разрушаемых биопластиков
на основе молочной кислоты ............................................................................. 258
5.4.3. Полигидроксиалканоаты – биоразрушаемые полимеры
гидроксипроизводстных алкановых кислот: синтез, свойства, области
применения ............................................................................................................ 262
5.5. Перспективы развития индустрии и рынка разрушаемых
биополимеров ............................................................................................ 274
ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ ........... 276
6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул
для получения целевого биотехнологического продукта................ 276
6.1.1. Продукты биотехнологического производства ..................................... 276
6.1.2. Общие принципы разделения веществ ................................................... 280
6.1.3. Методы разрушения клеток ....................................................................... 282
6.1.4. Отделение и очистка продукта.................................................................. 283
6.1.5. Методы тонкой очистки и разделения препаратов .............................. 284
6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная
хроматография для определения количественных и качественных
характеристик целевых продуктов биотехнологии............................ 297
6.2.1. Основные виды хроматографии .............................................................. 298
6.2.2. Основные закономерности хроматографического разделения
в колонке ................................................................................................................ 299
6.2.3. Газовая хроматография ............................................................................. 305
6.2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография............................... 317
6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии ........................................... 327
ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ
В БИОТЕХНОЛОГИИ ............................................... 341
7.1. Специфика реализации биотехнологических процессов ......... 341
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
6
ОГЛАВЛЕНИЕ
7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии ................. 345
7.3. Основы материально-энергетического баланса микробного
роста ............................................................................................................. 354
7.4. Элементный баланс роста микробных культур ........................ 358
7.5. Ферментационное оборудование .................................................... 364
7.5.1. Экспериментальные данные тепломассообмена
при культивировании микроорганизмов .......................................................... 364
7.5.2. Характеристика газожидкостных биореакторов .................................... 368
7.5.3 Приемы и способы стерилизации в биотехнологии ............................. 379
7.6. Оборудование для концентрирования биомассы ...................... 385
7.6.1. Выпарные пленочные аппараты ............................................................. 385
7.6.2. Флотаторы в микробиологической промышленности ........................ 391
7.6.3. Центрифуги и сепараторы ......................................................................... 393
7.6.4. Сушилки в биотехнологической промышленности.............................. 403
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................... 412
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК, ЭЛЕКТРОННЫЕ
И ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ .......................................... 413
К главе 1 ....................................................................................................... 413
К главе 2 ....................................................................................................... 413
К главе 3 ....................................................................................................... 414
К главе 4 ....................................................................................................... 415
К главе 5 ....................................................................................................... 416
К главе 6 ....................................................................................................... 416
К главе 7 ....................................................................................................... 418
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
7
ПРЕДИСЛОВИЕ
Достижения современной биологии, приведшие к формированию физико-химической биологии и комплекса новейших направлений биотехнологии, качественно влияют на многие сферы человеческой деятельности и все в
большей степени становятся востребованными и способными решать ключевые проблемы жизнеобеспечения человека. Многообразие форм живой материи и новые знания о закономерностях функционирования живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации для синтеза широчайшего спектра ценных соединений.
Необходимость повышения качества жизни человека делает все более актуальной разработку новых средств диагностики и лечения, целевых продуктов, в том числе пищевого и технического назначения, экологически чистых
материалов, усовершенствования способов воспроизводства энергоносителей
и минерального сырья, а также утилизации промышленных, сельскохозяйственных и бытовых отходов.
Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое
получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности, базируясь на каталитическом потенциале биологических агентов и систем различной степени организации и сложности. Биотехнология как область
знаний и динамически развиваемая промышленная отрасль способна решать
многие ключевые проблемы современности, обеспечивая при этом сохранение баланса в системе взаимоотношений «человек – природа – общество».
Поэтому освоение новых биотехнологических процессов и подготовка специалистов-биотехнологов занимают важное место в научно-образовательной
деятельности и экономической политике всех развитых стран.
Учебное пособие «Современные проблемы и методы биотехнологии»
предназначено для подготовки в рамках учебной программы «Микробиология и биотехнология» магистров, вооруженных новейшими знаниями в области современной биологии, необходимыми для решения ключевых проблем XXI в., направленных на сохранение и устойчивое развитие биосферы и
повышения качества жизни человека в условиях возрастающего антропогенного воздействия. Данная дисциплина введена в учебный процесс в Институте фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального
университета с 2008 г. в связи с открытием магистратуры и подготовки магистров по направлению «Микробиология и биотехнология». Информация, изложенная в учебном пособии, призвана обеспечить формирование у студентов представлений о революционных изменениях новейших направлений
биотехнологии в области генетической инженерии, геномики и протеомики,
новых технологиях диагностики и терапии, новых материалах и биоинженерии.
Научный редактор, доктор биологических наук, профессор Т. Г. Волова
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
8
Г ЛА В А 1
ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ
«СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ
И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое
получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности, базируясь на использовании каталитического потенциала биологических
агентов и систем различной степени организации и сложности – микроорганизмов, вирусов, растительных и животных клеток и тканей, а также внеклеточных веществ и компонентов клеток. Развитие и преобразование биотехнологии обусловлено глубокими переменами, происшедшими в биологии в
течение последних 25–30 лет. Основу этих событий составили новые представления в области молекулярной биологии и молекулярной генетики. В то
же время нельзя не отметить, что развитие и достижения биотехнологии
теснейшим образом связаны с комплексом знаний не только наук биологического профиля, но также и многих других.
Расширение практической сферы биотехнологии обусловлено также
социально-экономическими потребностями общества. Такие актуальные
проблемы, стоящие перед человечеством на пороге ХХI в., как дефицит чистой воды и пищевых веществ (особенно белковых), загрязнение окружающей
среды, недостаток сырьевых и энергетических ресурсов, необходимость получения новых, экологически чистых материалов, развития новых средств
диагностики и лечения, не могут быть решены традиционными методами.
Поэтому для жизнеобеспечения человека, повышения качества жизни и ее
продолжительности становится все более необходимым освоение принципиально новых методов и технологий.
Развитие научно-технического прогресса, сопровождающееся повышением темпов материальных и энергетических ресурсов, к сожалению, приводит к нарушению баланса в биосферных процессах. Загрязняются водные и
воздушные бассейны городов, сокращается воспроизводительная функция
биосферы, вследствие накопления тупиковых продуктов техносферы нарушаются глобальные круговоротные циклы биосферы.
Стремительность темпов современного научно-технического прогресса
человечества образно описал швейцарский инженер и философ Эйхельберг:
«Полагают, что возраст человечества равен 600 000 лет. Представим себе
движение человечества в виде марафонского бега на 60 км, который где-то
начинаясь, идет по направлению к центру одного из наших городов, как к
финишу… Большая часть дистанции пролегает по весьма трудному пути –
через девственные леса, и мы об этом ничего не знаем, ибо только в самом
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
9
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
конце, на 58–59 км бега, мы находим, наряду с первобытным орудием, пещерные рисунки, как первые признаки культуры, и только на последнем километре появляются признаки земледелия. За 200 м до финиша дорога, покрытая каменными плитами, ведет мимо римских укреплений. За 100 м бегунов обступают средневековые городские строения. До финиша остается 50 м,
где стоит человек, умными и понимающими глазами следящий за бегунами, –
это Леонардо да Винчи. Осталось 10 м! Они начинаются при свете факелов и
скудном освещении масляных ламп. Но при броске на последних 5 м происходит ошеломляющее чудо: свет заливает ночную дорогу, повозки без тяглового скота мчатся мимо, машины шумят в воздухе, и пораженный бегун ослеплен светом прожекторов фото- и телекамер...», т.е. за 1 м человеческий
гений совершает ошеломляющий рывок в области научно-технического прогресса. Продолжая этот образ, можно добавить, что в момент приближения
бегуна к финишной ленточке оказывается прирученным термоядерный синтез, стартуют космические корабли, расшифрован генетически код.
Автор задает вопрос: не окажется ли судьба человечества судьбой бегуна и не путь ли к гибели человечества столь стремительное развитие научно-технического прогресса?
1.1.1. Биотехнология – основа научно-технического прогресса
и повышения качества жизни человека
Биотехнология как область знаний и динамически развиваемая промышленная отрасль призвана решить многие ключевые проблемы современности, обеспечивая при этом сохранение баланса в системе взаимоотношений
«человек – природа – общество», ибо биологические технологии (биотехнологии), базирующиеся на использовании потенциала живого по определению
нацелены на дружественность и гармонию человека с окружающим его миром. В настоящее время биотехнология подразделяется на несколько наиболее значимых сегментов: это «белая», «зеленая», «красная», «серая» и «синяя» биотехнология.
К «белой» биотехнологии относят промышленную биотехнологию,
ориентированную на производство продуктов, ранее производимых химической промышленностью, – спирта, витаминов, аминокислот и др. (с учетом
требований сохранения ресурсов и охраны окружающей среды).
Зеленая биотехнология охватывает область, значимую для сельского
хозяйства. Это исследования и технологии, направленные на создание биотехнологических методов и препаратов для борьбы с вредителями и возбудителями болезней культурных растений и домашних животных, создание биоудобрений, повышение продуктивности растений, в том числе с использованием методов генетической инженерии.
Красная (медицинская) биотехнология – наиболее значимая область
современной биотехнологии. Это производство биотехнологическими методами диагностикумов и лекарственных препаратов с использованием техно Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
10
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
логий клеточной и генетической инженерии (зеленые вакцины, генные диагностикумы, моноклональные антитела, конструкции и продукты тканевой
инженерии и др.).
Серая биотехнология занимается разработкой технологий и препаратов
для защиты окружающей среды; это рекультивация почв, очистка стоков и
газовоздушных выбросов, утилизация промышленных отходов и деградация
токсикантов с использованием биологических агентов и биологических процессов.
Синяя биотехнология в основном ориентирована на эффективное использование ресурсов Мирового океана. Прежде всего, это использование
морской биоты для получения пищевых, технических, биологически активных и лекарственных веществ.
Современная биотехнология – это одно из приоритетных направлений
национальной экономики всех развитых стран. Путь повышения конкурентности биотехнологических продуктов на рынках сбыта является одним из основных в общей стратегии развития биотехнологии промышленно развитых
стран. Стимулирующим фактором выступают специально принимаемые
правительственные программы по ускоренному развитию новых направлений биотехнологии. Госпрограммы предусматривают выдачу инвесторам
безвозмездных ссуд, долгосрочных кредитов, освобождение от уплаты налогов.
В связи с тем что проведение фундаментальных и ориентированных
работ становится все более дорогостоящим, многие страны стремятся вывести значительную часть исследований за пределы национальных границ. Как
известно, вероятность успеха осуществления проектов НИОКР в целом не
превышает 12–20 %, около 60 % проектов достигают стадии технического завершения, 30 % – коммерческого освоения и только 12 % оказываются прибыльными.
1.1.2. Особенности развития исследований
и коммерциализации биологических технологий
в США, Японии, странах ЕС и России
США. Лидирующее положение в биотехнологии по промышленному
производству биотехнологических продуктов, объемам продаж, внешнеторговому обороту, ассигнованиям и масштабам НИОКР занимают США, где
уделяется огромное внимание развитию данного направления. В этом секторе
к 2003 г. было занято свыше 198 300 чел. [1]. Ассигнования в этот сектор
науки и экономики в США значительны и составляют свыше 20 млрд дол.
США ежегодно [2]. Доходы биотехнологической индустрии США выросли с
8 млрд дол. в 1992 г. до 39 млрд дол. в 2003 г. Эта отрасль находится под
пристальным вниманием государства. Так, в период становления новейшей
биотехнологии и возникновения ее направлений, связанных с манипулированием генетическим материалом, в середине 70-х гг. прошлого столетия конгресс США уделял большое внимание вопросам безопасности генетических
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
11
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
исследований. Только в 1977 г. состоялось 25 специальных слушаний и было
принято 16 законопроектов. В начале 90-х гг. акцент сместился на разработку мер по поощрению практического использования биотехнологии для производства новых продуктов. С развитием биотехнологии в США связывают
решение многих ключевых проблем: энергетической, сырьевой, продовольственной и экологической.
Среди биотехнологических направлений, близких к практической реализации или находящихся на стадии промышленного освоения, следующие:
– биоконверсия солнечной энергии;
– применение микроорганизмов для повышения выхода нефти и выщелачивания цветных и редких металлов;
– конструирование штаммов, способных заменить дорогостоящие неорганические катализаторы и изменить условия синтеза для получения принципиально новых соединений;
– применение бактериальных стимуляторов роста растений, изменение
генотипа злаковых и их приспособление к созреванию в экстремальных условиях (без вспашки, полива и удобрений);
– направленный биосинтез эффективного получения целевых продуктов (аминокислот, ферментов, витаминов, антибиотиков, пищевых добавок,
фармакологических препаратов;
– получение новых диагностических и лечебных препаратов на основе
методов клеточной и генетической инженерии.
Роль лидера США обусловлена высокими ассигнованиями государства
и частного капитала на фундаментальные и прикладные исследования. В финансировании биотехнологии ключевую роль играют Национальный научный фонд (ННФ), министерства здравоохранения и социального обеспечения, сельского хозяйства, энергетики, химической и пищевой промышленности, обороны, Национальное управление по аэронавтике и исследованию
космического пространства (НАСА), внутренних дел. Ассигнования выделяются по программно-целевому принципу, т.е. субсидируются и заключаются
контракты на исследовательские проекты. При этом крупные промышленные
компании устанавливают деловые отношения с университетами и научными
центрами. Это способствует формированию комплексов в той или иной сфере, начиная от фундаментальных исследований до серийного выпуска продукта и поставки на рынок. Такая «система участия» предусматривает формирование специализированных фондов с соответствующими экспертными
советами и привлечение наиболее квалифицированных кадров.
При выборе проектов с высокой коммерческой результативностью стало выгодным использовать так называемый «анализ с учетом заданных ограничений». Это позволяет существенно сократить сроки реализации проекта
(в среднем с 7–10 до 2–4 лет) и повысить вероятность успеха до 80 %. Понятие «заданные ограничения» включают потенциальную возможность успешной продажи продукта и получения прибыли, увеличения годового производства, конкурентоспособность продукта, потенциальный риск с позиций сбыта,
возможности перестройки производства с учетом новых достижений и т.д.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
12
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
Ежегодные общие государственные расходы США на генно-инженерные и
биотехнологические исследования составляют миллиарды долларов. Инвестиции частных компаний существенно превосходят эти показатели. Только
на создание диагностических и противоопухолевых препаратов ежегодно
выделяется несколько миллиардов долларов. В основном это следующие направления: методы рекомбинации ДНК, получение гибридов, получение и
применение моноклональных антител, культуры тканей и клеток.
В США стало обычным, когда компании, не связанные ранее с биотехнологией, начинают приобретать пакеты акций действующих компаний и
строить собственные биотехнологические предприятия (табл. 1.1). Это, например, практика таких химических гигантов, как Philips Petrolium,
Monsanto, Dow Chemical. Около 250 химических компаний имеют в настоящее время интересы в области биотехнологии. Так, у гиганта химической индустрии США – компании De Pont есть несколько биотехнологических комплексов стоимостью 85–150 тыс. дол. со штатом 700–1 000 чел. Подобные
комплексы созданы в структуре Monsanto, более того, в настоящее время до
75 % бюджета (свыше 750 млн дол.) направляется в сферу биотехнологии. В
сфере внимания этих компаний – производство генно-инженерного гормона
роста, а также ряда генно-инженерных препаратов для ветеринарии и фармакологии. Кроме этого, фирмы совместно с университетскими исследовательскими центрами подписывают контракты на проведение совместных НИОКР.
Таблица 1.1
Крупнейшие концерны и фармацевтические фирмы США,
производящие медицинские биотехнологические препараты
Фирмы, компании США
GENENTECH
BIOGEN
AMGEN
CETUS
CHIRON
GENETICS INST.
CALIFORNIA
JOHNSON & JOHNSON
MONSANTO
SYNTEX
DU PONT
SMITH KLINE &
FRENCH
АВВОТ
Выпускаемые препараты
Альфа-, бета- и гамма-интерфероны
Фактор опухолевого некроза 1-, 2-, 3- и 4-интерлейкины
Инсулин. Эритропоэтин
Соматотропин. Урокиназа
Лимфотоксин. Тканевой активатор плазминогена
Фактор трансформации роста. Сывороточный альбумин
Вакцина против гепатита В
Супероксиддимутаза
Моноклональные антитела к цитокининам. Фактор роста
нервов. Фактор роста костей
Фактор роста фибробластов
Белок С. Ангиогенин
Тромболитические ферменты
Фактор активации макрофагов
Ингибиторы ренина
Существует мнение, что все необходимые условия для становления и
развития биотехнологии в США подготовил венчурный бизнес. Для крупных
фирм и компаний венчурный бизнес является хорошо отработанным прие Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
13
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
мом, позволяющим за более короткий срок получить новые разработки, привлекая для этого мелкие фирмы и небольшие коллективы, нежели заниматься
этим собственными силами. Например, в 80-е гг. General Electric с помощью
мелких фирм стал осваивать производство биологически активных соединений, только в 1981 г. его рисковые ассигнования в биотехнологии составили
3 млн дол. Риск с участием мелких фирм обеспечивает крупным компаниям и
корпорациям механизм отбора экономически оправданных нововведений с
большими коммерческими перспективами.
Несомненные успехи и лидерство США в биотехнологии обусловлены
также особым вниманием к роли специалистов. Подготовка специалистовбиотехнологов является одним из важнейших элементов образовательной
политики США.
Ф. Хэндер, будучи президентом Национальной академии наук США,
отмечал, что в науке «блестящее» имеет существенно большее значение, чем
просто «очень хорошее» и два средних научных открытия не составляют
вместе одного крупного, а большое число посредственных ученых не может
заменить одного первоклассного.
Таким образом, лидерство США обеспечивается не только большими
вложениями в сферу биотехнологии, но и мощной кооперацией университетской науки с частными фирмами и компаниями, в том числе за счет создания
сети дочерних филиалов как в США, так и за рубежом. Для удержания лидерства необходимо наращивание объемов вложений в эту отрасль, удержание рынков сбыта, а также ликвидация постоянно возникающего дефицита
специалистов в новейших биотехнологических направлениях.
Быстрое развитие биотехнологии в США обусловлено также притоком
капитала из других стран. К концу 2000 г. в США было зарегистрировано
свыше 200 совместных биотехнологических компаний, в том числе 98 с
японскими фирмами и 46 с западно-европейскими. В 2005 г. общее число
биотехнологических фирм в США, по оценке Medаd News, достигло 500,
причем отмечена тенденция к созданию интегрированных крупных биофармацевтических фирм и их отделений. Разработка противоопухолевых лекарственных средств является приоритетным направлением биотехнологических
исследований в США. Около 60 % препаратов из общего количества разрабатываемых биотехнологических средств предназначено для лечения онкологических заболеваний или связанных с ними проблем. Ряд генноинженерных препаратов, находящихся на разных стадиях клинических исследований, являются потенциальными средствами для лечения СПИДа и
профилактики ВИЧ-инфекции. Общий объем инвестиций в биотехнологические компании США составил в 2005 г. около 20 млрд дол. Около 75 % объема инвестиций было получено за счет продажи акций биотехнологических
компаний на бирже, оставшиеся 25 % пришлись на вложения венчурных
фондов и других частных инвесторов. Всего на IPO свои акции в 2005 г. раз-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
14
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
местили 30 биотехнологических компаний. К сожалению, пока почти единственными биотехнологическими компаниями, которым доступно привлечение
средств путем выхода на IPO, являются американские компании. Ситуация
постепенно меняется, но в основном эти сделки носят разовый характер. При
этом инвесторы предъявляют повышенные требования по срокам реализации
проекта и получения прибыли.
Серьезное внимание развитию биотехнологии уделяется в странах Европейского содружества, где в 2005 г. суммарный европейский биотехнологический рынок достиг 100 млрд евро. Очень сильны биотехнологические
позиции Южной Кореи и Японии.
Япония. Опыт нововведений и коммерческий успех Японии в области
биотехнологии интересны и весьма поучительны. Как известно, в конце 70 –
начале 80-х гг. Япония была вынуждена пересмотреть свою научнотехническую стратегию. При сохранении важной роли импортера биотехнологической промышленности резко возросли расходы на научные исследования и опытно-конструкторские разработки. За разработку и реализацию государственных биотехнологических программ в основном отвечает Министерство внешней торговли и промышленности (МВТП), Министерство сельского, лесного хозяйства и рыболовства и Агентство по науке и технике.
Государством совместно с частным сектором была разработана десятилетняя программа (1981–1990 гг.) развития биотехнологии и микробиологии,
на которую было ассигновано свыше 500 млн дол. В сфере обозначенных
приоритетов программы были:
– форсирование работ, связанных с селекцией микробных штаммов;
– разработка методов рекомбинации ДНК и гибридизации клеток, иммобилизации ферментов и клеток;
– разработка технологий и аппаратурного оформления биотехнологических процессов.
Если в 1940 г. в Японии биотехнологии как промышленной отрасли не
существовало, то в 1975 г. объемы производства составили, тыс. т/год: аминокислот – 67; ферментов – 13; витаминов – 7; органических кислот – 24. Если в 1982 г. Япония купила лицензию на производство генно-инженерного
инсулина у США, то уже в 1986 г. внедрила на внутренний рынок собственные препараты инсулина с торговой маркой Humulin®. В 1984 г. был получен генно-инженерный пептидный гормон соматомедин, стимулирующий
рост и способствующий делению клеток хрящевых тканей, а также снижающий уровень сахара в крови. Фирма Santory первой получила рекомбинантные штаммы E.coli – продуценты человеческого гормона аурикулина,
снижающего кровяное давление; налажен также выпуск вакцин против вируса гепатита В. Количество фирм, занятых в области биотехнологии, достигло
в 1981 г. 100; в 1990-х гг. – 300; в настоящее время – около 800 (табл. 1.2).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
15
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
Таблица 1.2
Крупнейшие концерны и фирмы Японии,
производящие биотехнологические препараты
Фирмы, компании Японии
AJINOMOTO
SHIONOGI
DAIICHI SEIYAKU
GREEN CROSS
KYOWA HAKKO
MITSUBISHI CHEM. IND.
MOSHIDA PHARMACEUTICA
TOYZO JOZO
TAKEDA CHEM. IND.
Выпускаемые препараты
Альфа-, бета- и гамма-интерфероны
Фактор опухолевого некроза
1-, 2-интерлейкины
Cупероксидаза. Проинсулин. Инсулин
Эритропоэтин. Соматотропин. Урокиназа
Тканевой активатор плазминогена. Вакцина против
гепатита В. Фактор опухолевого некроза
Лимфотоксин. Сывороточный альбумин
Проурокиназа. Супероксиддимутаза
Моноклональные антитела к цитокининам
Ощутимые преимущества японской биотехнологии связывают, прежде
всего, со сложной и постоянно совершенствующейся научно-технической базой, технической сложностью вырабатываемых продуктов и быстрыми темпами ее обновления и замены. Особо следует подчеркнуть гибкость экономического механизма, обеспечивающего структурную маневренность и адаптивность к меняющимся условиям сбыта на внешних рынках и направленную
политику государства, которое определяет стратегию для частных корпораций, активно поддерживает наукоемкие производства и принимает определенные меры к некоторому сокращению традиционных отраслей микробного
синтеза. Успех реализации биотехнологических программ напрямую связывают с перспективами национального бизнеса и считают индикатором национальной безопасности страны.
Большое внимание в Японии уделяется морской («синей») биотехнологии, включая скрининг полезных морских организмов, исследование их
функций и разработку техники культивирования. В сфере пристального внимая также находятся создание банков клеточных культур и генов морских
организмов, получение биологически активных соединений, синтезируемых
морскими бактериями, адсорбированными на поверхности водорослей; регенерация тяжелых металлов; получение сверхтонких порошков магнетиков с
использованием морских бактерий.
Реализуются проекты получения фотоводорода в биореакторах с морскими фотосинтезирующими бактериями. Ключевыми считаются также проекты, ориентированные на выделение и модификацию микроорганизмовпродуцентов полисахаридов, разрушаемых биопластиков, линолевой и эйкозопентаеновой кислот, фикоцианина, каратиноидов и других пигментов, биоудобрений и биогаза. Активно финансируются проекты, рассматривающие
возможности моделирования сенсорно-физиологических процессов с использованием морских беспозвоночных животных; выделение из рыб генов, контролирующих синтез гормонов и клонирование их в E.coli. Япония стала лидером в области промышленного производства продуктов на основе иммоби-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
16
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
лизованных ферментов (это аминокислоты, глюкозо-фруктозные сиропы, органические кислоты), а также техники культивирования клеток при высоком
давлении для получения углеводов, липидов, белков.
В Японии на государственном уровне поощряется развитие новых технологий. У отдельных зарубежных фирм и компаний государство закупает
лицензии и патенты и на льготных условиях предлагает их внедрять японским компаниям. Так, при освоении и выпуске новых препаратов фирмам
предоставляются налоговые льготы в размере 25 %, по некоторым – до 50 %.
Компаниям, наладившим производство особо важных продуктов, в первый
год выпуска разрешается повышать прямые амортизационные отчисления в
размере до 25 % от общего объема продаж.
Под особым контролем находятся следующие направления развития
биотехнологии:
– методы рекомбинантных ДНК, крупномасштабное производство
культур клеток и тканей, биореакторы, биоэлектроника (биочипы);
– разработка технологий и производство продуктов специального назначения с применением биоты моря;
– обработка и очистка воды с применением биотехнологии;
– технологическая биоэнергетика (производство топливного спирта,
биологическое использование солнечной энергии);
– изучение функций головного мозга с целью применения результатов
в электронике и других отраслях промышленности.
В последние 10–15 лет биотехнология в Японии развивалась настолько
быстро, что бросила серьезный вызов американскому мировому лидерству в
этой области. Расширение производства и рынка биотехнологических препаратов и новых материалов привело к тому, что ежегодно объем промышленной продукции в Японии возрастает на 5–7 %. Следует отметить, что собственно производство продуктов биотехнологии в Японии, выступая как новая
динамичная отрасль, стимулирует процесс структурной перестройки экономики страны в целом. При этом крупные корпорации и компании, не связанные
ранее с биотехнологией, переориентируют свои производства в эту сторону.
Так, из-за падения спроса на сталь самая крупная сталелитейная компания Nippon Steel к 2000 г. планировала выделить около 20 % своего денежного оборота на развитие биотехнологии и электроники. Свыше 300 крупных
фирм повысили к концу столетия свои активы и обороты на 10 % в результате освоения и выпуска биотехнологической продукции. Большие надежды на
биотехнологию возлагает химическая промышленность, особенно в области
получения сверхчистых материалов и реагентов. Существует специальная
программа создания электронных приборов, в основном блоков памяти, с использованием белков. Фирма Hitachi создала специальное подразделение для
разработки биодатчиков и биочипов. Фирма Sharp первой начала фундаментальные исследования, ориентированные на разработку компьютеров с биологическими элементами. Специалисты считают, что переключатели, изготовленные на основе ферментов, могут работать эффективнее по сравнению с
кремниевыми. Другой известный производитель радиоаппаратуры, фирма
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
17
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
Sony, создает на основе собственной разработки высококачественные акустические системы с использованием в качестве мембран бактериальной целлюлозы.
Для реализации своих проектов, требующих больших вложений и времени, японские фирмы привлекают партнеров, ряд фирм сотрудничает с зарубежными университетами и компаниями. В настоящее время среди фирм
резко возросло соперничество за право производства моноклональных антител. Более 50 фирм специализируются на выпуске моноклональных антител
для диагностики онкологических заболеваний. Уже в конце 90-х гг. объем
продаж диагностикумов на основе моноклональных антител достиг 250 млн дол.,
а номенклатура составила 100 препаратов. Проводятся активные исследования, ориентированные на разработку средств диагностики и лечения СПИД.
В настоящее время 36 компаний занято в программе, разрабатывающей лекарства против данного заболевания. Среди разрабатываемых направлений –
создание препаратов, непосредственно убивающих вирус иммунодефицита
человека; против ассоциированных заболеваний; а также реагенты и оборудование для диагностики.
Особое внимание в Японии уделяется поддержанию и развитию коллекций промышленных культур. Японская федерация коллекций культур сохраняет свыше 66 000 штаммов дрожжей, бактерий, микроскопических грибов. Коллекция культур Института ферментации поддерживает около 9 000
микробных культур. Созданы коллекции генов и культур клеток. На создание
центра клеточных культур при биохимическом институте фирмы Hayashibara
затрачено 130 млн дол. При Институте физических и химических соединений
коллекция достигает 10 000 клеточных культур, а банк генов ежегодно увеличивается на 1 000 образцов. На поддержание штаммов и развитие коллекции в начале 90-х гг. было выделено более 3 млн дол.
С учетом национальных интересов в настоящее время цель биотехнологических работ Японии ориентирована не на ликвидацию отставания от
США, а на принципиально новые решения, на разработку новых технологий
и новых видов продуктов. Крупные компании и корпорации скупают акции
виднейших биотехнологических предприятий США. Так, компания Kubota
приобрела 14 % акций американской компании Mycoghen (свыше 1 млн акций по цене 9 долларов за акцию). В настоящее время Япония уже вытесняет
США с рынка биоинсектицидных биопрепаратов.
В ближайшее время биотехнология Японии будет ориентирована на
изучение, создание и расширение технологий на основе рекомбинантных
ДНК с целью получения противоопухолевых и противовирусных диагностикумов и препаратов. Достижения инженерной энзимологии нацелены на создание биодатчиков для электроники. Приоритетная цель – получение генноинженерных микробных штаммов, способных не только продуцировать ферменты, гидроксилдирующие оргсоединения для получения целевых продуктов, но и разлагающие токсические соединения.
В системе национальных приоритетов также обозначены:
– получение новых материалов;
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
18
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
– утилизация целлюлозосодержащих отходов для получения энергии;
– создание систем оборотного водоснабжения, очистки стоков и извлечения из них полезных компонентов;
– создание трансгенных растений с генетическими системами азотфиксации, уничтожения возбудителей заболеваний и вредителей, засухо- и соленоустойчивости.
Страны ЕС. Биотехнология является приоритетом стратегической политики в стран ах ЕС. Первоочередной для стран Европы является принятая
долгосрочная стратегия реализации проектов с высокой коммерческой окупаемостью. При этом усилия стран сосредоточены на недопущении отрыва
темпов роста от уровня биотехнологии США и Японии. В национальных
программах Германии, Франции, Великобритании и других обозначена необходимость усиления фундаментальных и опытно-конструкторских работ в
области биотехнологии и увеличение инвестиций в промышленную сферу.
Германия, наряду с США и Японией, входит в тройку мировых лидеров
в области биотехнологии. Западно-германская биотехнология в 70–80 гг. зарождалась на базе высокоразвитой химической промышленности. В настоящее время в этой области, наряду с острой конкурентной борьбой, наметился
определенный кризис с связи с расширением объемов производства ряда альтернативных экологически чистых биотехнологических препаратов и продуктов. Знаковым в расширении биотехнологической линии в ФРГ был так
называемый «шок Хехста», когда этот крупнейший химический концерн инвестировал 67 млн дол. на биотехнологичские исследования, но не в своей
стране, а в Массачусетский технологический институт США. Крупнейшая
химическая тройка – Hochst, BASE, Bauer, а также фармацевтические компании Boehringer и Schering составляют основной биотехнологический потенциал страны. Руководители этих компаний провозгласили: «Эра массовых
вложений в нефтепереработку миновала, и сегодня главной сферой инвестиций стала биотехнология, которой предстоит сыграть выдающуюся роль».
Основным проводником политики стимулирования биотехнологии в
Германии является Министерство научных исследований и технологий, которое контролирует самые крупные проекты, а также определяет выбор приоритетных направлений в биотехнологии. Финансируются как частные компании, так и различные институты (соотношение примерно 2:1). Крупнейшие
генетические центры функционируют в Кельне (проблемы генетики растений), Гейдельберге (вирусология и онкологические диагностикумы и препараты для лечения) и Мюнхене (синтез наследственного материала и изучение
последовательности генов). Приоритеты в области биотехнологии формируются в соответствии с национальной научно-технической политикой правительства. Среди них можно отметить следующие:
– расширение и повышение эффективности нетрадиционных пищевых
и кормовых добавок;
– производство биоинсектицидов;
– медицинские препараты на основе клеточных культур растений.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
19
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
К концу 90-х гг. были успешно реализованы программы получения интерферона, интерлейкинов, моноклональных антител, ферментных препаратов и др. В биотехнологические программы и проекты активно вовлечены
крупнейшие концерны – автомобильные, машиностроительные, электротехнические. В последние годы все чаще решаются вопросы стимулирования
развития биотехнологических промышленных производств через систему
льготных кредитов и налогооблажений.
Федеральное правительство поддерживает не только национальные, но
и международные проекты, выделяя на это ежегодно значительные средства.
Реализация наиболее важной научно-технической стратегии возложена на
самоуправляемые, полностью или частично финансируемые государством
такие крупные организации, как Общество Макса Планка и Общество биотехнологических исследований. Институты данных обществ совместно с
центрами «большой науки», институтами биохимии в г. Мартинсрид, биологии и вирусологии в г. Тюбинге, биологии клетки в г. Ладенбург, работают в
тесной связи с ведущими университетами страны.
В Германии среди государственных мер содействия развитию биотехнологии следует выделить также косвенное стимулирование. Оно проявляется в регулировании амортизационных и налоговых льгот на капиталовложения в НИОКР. Основная цель косвенного стимулирования – ускорение широкого освоения нововведений, обычно не связанных в госпрограммами.
Столкнувшись с превосходством биотехнологии США и Японии, деловые круги Германии решили усилить свое положение с помощью финансовых и технических связей со своими конкурентами. Так, по соглашению концерна «Хехст» и Гарвардского университета в нем был создан отдел молекулярной генетики. В течение 10 лет (до 1995 г.) концерн оплачивал исследования в области регуляции генов клеток эукариот, генетики микроорганизмов,
иммунологии и молекулярной биологии растений (около 67 млн дол.) и получил права на производство и продажу новых препаратов. Другой пример –
германская фирма Wacker-Chemie в течение ряда лет финансировала разработки американской фирмы Biotechnology Int. в области получения высокоочищенных аминокислот и препаратов для пищевой, химической и фармацевтической промышленности. После завершения исследований немецкая
сторона занимается масштабированием новых технологий, выпуском и продажей новых продуктов на мировом рынке. Концерн «Хехст» основал свой
биотехнологический центр в Японии; первый завод по выпуску генноинженерных лекарственных препаратов был пущен в конце 1990 г. Подобный подход приводит не только к быстрому росту исследовательского потенциала крупных фирм и корпораций, но и содействует ускоренной разработке новых биотехнологических процессов и продуктов, которые после их
освоения поддерживают высокую конкурентоспособность германских компаний на мировом рынке сбыта.
Франция также рассматривает биотехнологию как одно из наиболее
привилегированных направлений научно-технического прогресса. В 1982 г.
Национальным собранием страны были приняты законы по общим исследо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
20
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
ваниям и специальная программа в области биотехнологии. Это не только
увеличило финансирование работ, но и улучшило экономические условия
для внедрения новых разработок. Принятая правительством в 1982 г. «мобилизационная программа» Министерства научных исследований и технологий
предусматривала увеличение к 1990 г. доли биотехнологической продукции
страны на мировом биотехнологическом рынке с 7 до 10 %. На эту программу госсектор выделил 600 млн франков; параллельные вложения исследовательских центров и национальных корпораций при этом составили 1,1 млрд
франков; через год (в 1983 г.) они были доведены до 14 млрд франков. Финансировались исследования и разработки в области генетической инженерии, конструирования биореакторов и строительства установок для получения биогаза, микробного получения пищевых и фармацевтических препаратов, охраны окружающей среды и др.; в 90-х гг. ассигнования государства в
биотехнологию удвоились.
В исследованиях по биотехнологии во Франции главенствуют научные
центры больших компаний, связанные с университетскими лабораториями.
Это фирма Eif Aquitaine, 67 % ее акций принадлежит государственным организациям; национализированные компании Rhone Poulens и Roussel Uclaf, 40 %
акций которых принадлежат госсектору. Для усиления роли биотехнологии
французские фирмы уделяют большое внимание кооперационным связям с
иностранными партнерами в научно-технической и производственной сферах. Это совместные патентно-лицензионные соглашения, совместный сбыт
продукции, приобретение контрольных пакетов акций иностранных партнеров. Так, Институт Пастера совместно с компанией Genetic Systems (США)
учредили совместную организацию для производства и продажи разработанного во Франции диагностикума вируса СПИД; американская сторона контролировала продажу препарата в США и Канаде, Франция – в странах общего рынка. Аналогично США и Японии, во Франции многие компании химической, машиностроительной и прочей направленности, переключаются на
первоочередные вложения в развитие биотехнологических направлений.
Структурные перестройки экономики Великобритании во второй половине 80-х гг. не сократили ее отставание в области биотехнологии от США и
Японии. По уровню расходов на парные исследования Великобритания занимает пятое место после США, Японии, Германии и Франции. Пытаясь ускорить научно-технический прогресс в области биотехнологии в конце 70-х –
начале 80-х гг., государство начало финансировать главным образом промышленные исследования. Созданный при правительстве Комитет содействия развитию биотехнологии наметил на 10–20 лет перспективы развития
биотехнологии. Были определены приоритетные направления и разработан
комплекс исследований, содержащий 39 проектов по развитию биотехнологии в сельском хозяйстве, промышленности, медицине, ветеринарии и других
областях, и выделено для этих целей 10 млн фунтов. Было разработано свыше 100 новых технологий. Далее была принята пятилетняя программа (1990–
1995 гг.), реализуемая в основном через Министерство торговли и промыш-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
21
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
ленности, на которую правительство выделило 30 млн фунтов стерлингов.
Было определено четыре приоритетных направления:
– разработка новых биотехнологических процессов;
– улучшение конструкций ферментеров;
– автоматизация и управление технологическими процессами;
– обеспечение асептических условий при культивировании микроорганизмов.
К выполнению этой программы подключились частные фирмы, в том
числе Croda, Alcan, Wellcame, Scimat, Biotech. Systems, Smith Kline, Netlon и др.
Далее было выделено дополнительное финансирование для развития техники
иммобилизации ферментов, крупномасштабного культивирования клеток
животных и растений, изучения и совершенствования микробиологических
процессов. Намечены пути постановки новейших биотехнологичеких процессов для получения вакцины против СПИДа, создания банка моноклональных антител и продуктов рекомбинантных ДНК, клинические испытания
противоопухолевых дианостикумов и препаратов на основе моноклональных
антител.
В 1983 г. с участием государственного торгового банка Великобритании, ассигновавшего 28,5 млн фунтов, была организована фирма National Enterprise Board. Частные компании создали фирму Celtech с начальным капиталом 12 млн фунтов стерлингов. Эта фирма стала самым крупным экспортером моноклональных антител и уже в 1987 г. поставила на мировой рынок
около 3 кг продукта (при мировой потребности в 15 кг). Объем продаж Великобританией моноклональных антител составил в 1990 г. 2,1 млрд дол., а в
1995 г. – 4,1 млрд дол. Специалисты фирмы Celltech – мирового лидера в
производстве моноклональных антител – ввели в производства мощности для
получения антител, включающие эрлифтные аппараты объемом до 10 000 л,
обеспечивающие длительность стерильной ферметации до 12 сут при концентрации антител в культуральной среде до 500 мг/л, а общий выход продукта составил до 6 кг, т.е. 50 % мирового производства (1 кг стоит 5 млн дол.). Таким образом, в результате этого рывка Великобритания не только существенно сократила отставание от США и Японии, но и обеспечила себе прочные позиции на товарных рынках среди основных конкурентов.
В настоящее время Великобритания, выделяя финансирование на развитие биотехнологии, выполняет роль катализатора, предоставляя частному
бизнесу определять и направления, и объемы перспективных вложений. Госсектор при этом переходит на контрактные формы отношений с частной
промышленностью. Таким образом, делая определенные заказы на НИОКР
фирмам, государство не ориентирует свои исследовательские центры на выполнение заказов промышленных компаний. Эти формы разделения труда в
сфере НИОКР государство стимулирует и осуществляет проведение фундаментальных и прикладных исследований, а сопутствующие разработки проводятся фирмами. На мировом рынке фармацевтические препараты Великобритании отличаются высокой конкурентоспособностью. Этому способствуют большие отчисления фармацевтических фирм на разработку новых пре Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
22
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
паратов и диагностикумов, достигающие 15 % от общего объема продаж
(около 800 млн фунтов).
Существенную поддержку от государства получают университеты и
научно-исследовательские институты. Увеличенные в начале 90-х гг. ассигнования государства позволили создать два новых биотехнологических центра: в Эдинбурге (исследование трансгенных животных, например создание
овец, продуцирующих с молоком необходимые для человека белковые продукты) и в Кембридже (белковая инженерия и молекулярные воздействия,
создание антител с заранее заданными свойствами). Значительные средства
выделяются для изучения организации генома растений и клонирования
растительных генов. Министерством торговли и промышленности ассигновано 500 тыс. фунтов стерлингов на создание национальной коллекции культур клеток животных, которая стала крупнейшим депозитарием подобных
объектов в Европе, в коллекции поддерживается свыше 20 000 клеточных
клонов.
Наряду с продвижением в области новейших биотехнологий, в Англии
активно происходят перестройка и модернизация традиционных микробиологических производств получения продуктов для пищевой сферы и сельского хозяйства. Это глюкозо-фруктозные сиропы, подсластители, ксатан пищевого назначения, знаменитый заменитель мяса – биомасса гриба Fusarium
graminearum, культивируемого на сахаросодержащих субстратах. Созданы
пищевые аналоги свинины, куриного мяса, ветчины и мясных паштетов. Производство пищевого белка на основе данного гриба составляет 60–80 тыс. т/год.
В настоящее время до 40 % мирового рынка ферментных препаратов для
кормов принадлежит Великобритании. Широкое распространение получили
английские биопрепараты для защиты растений – биоинсектициды на основе
грибов, эффективные по отношению к щитовкам и тлям. Большим спросом
пользуется вирусный препарат вирокс, эффективный против соснового
пильщика, а также бактериальные препараты биовит и скитал, эффективные
против гусениц и личинок.
Кроме того, все больший вес приобретают наукоемкие технологии.
К примеру, Великобритания разработала на основе моноклональных антител
метод определения стельности коров. Создано семейство препаратов «аверметкитинов» на основе метаболитов почвенных стрептомицетов, которые в
10 раз эффективнее в отношении почвенных нематод по сравнению с химическими ядохимиками. Великобритания была первой в освоении производства и выпуска биодеградируемого пластика Биопол®.
В Австрии биотехнология считается одной из отраслей, на которую
возлагаются надежды развития экономики. С точки зрения национального
развития Вена обладает самым высоким международным потенциалом. Австрийские предприятия делают основную ставку, прежде всего, на «красную» биотехнологию, т.е. на развитие и выпуск медицинских препаратов.
Среди крупных производителей биотехнологической продукции – Лайф Сайенс Аустриа (LISA), Регион Вены, Аустриан Биотех Индастри, Центр биологии в Иннсбруке, Институт молекулярной биотехнологии (IMBA), Институт
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
23
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
молекулярной биологии растений (GMI) им. Грегора Менделя, Центр инноваций и технологий ГмбХ (ZIT) и др. К самым крупным предприятиям в области биотехнологий в Австрии относятся компания «Бакстер», «Амген» и
«Новартис». Многочисленные специальные высшие учебные заведения активизируют учебные программы для подготовки современных специалистовбиотехнологов. Среди биотехнологических приоритетов Австрии обозначены:
– разработка препаратов для фармацевтической промышленности;
– создание продуктов питания, безопасных консервантов и усилителей
вкуса;
– разработка биотехнологических способов очистки стоков, отходов,
газовых выбросов;
– создание экологически чистых полимерные материалы;
– биоинженерное оформление исследований и производств;
– развитие, сбыт и консультирование в области биотехнологических
приборов и оборудования.
Таким образом, во всех высокоразвитых странах биотехнологии уделяется очень существенное внимание, при этом прогноз и стратегия развития
данной отрасли находятся под пристальным вниманием государства. В настоящее время на мировом рынке стремительными темпами нарастают объемы выпуска и продаж препаратов и продуктов, получаемых на основе клеточной и генетической инженерии.
Из этого краткого анализа видно, сколь значимым для развитых стран
является реализация концепции развития и наращивания биотехнологического потенциала в области науки, образования и промышленной сферы.
Россия. К сожалению, приходится констатировать, что пока биотехнологический потенциал России выглядит весьма скромно. Объем продаж на
рынке биотехнологической продукции в России в целом не превышает
1 млрд дол. США/год, в то время как на мировом рынке он приближается к
100 млрд. Для сравнения, рынок Китая и Индии, который начал стремительно развиваться только в самые последние годы, уже достиг 3,8 млрд дол.
Рынок биотехнологической продукции России представлен в настоящее время следующими направлениями:
– фармацевтические препараты,
– ферменты и ферментные препараты,
– живые культуры микроорганизмов,
– дрожжи,
– биопрепараты для добывающих отраслей промышленности,
– препараты для сельского хозяйства,
– препараты для защиты окружающей среды.
Следует подчеркнуть, что современная биотехнология для реализации
своего потенциала требует значительных материальных и людских затрат.
Развитие биотехнологии, налаживание производств для выпуска высокотехнологичной продукции невозможны без высоких капиталовложений и наличия грамотных специалистов. Период после прекращения существования
СССР, перестроечный процесс производства и экономики нашей страны не Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
24
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
гативно отразились на биотехнологической промышленности в целом. И тому есть объективные причины. Среди таковых – резкое снижение финансирования науки и этой отрасли. Если в СССР на науку тратилось 7 % валового
внутреннего продукта (ВВП), то в России в последние 10 лет только 0,3–0,5 %.
По данным журнала «В мире науки», на биотехнологию Россия тратит в год
40 млн дол., а США – 100 млрд дол. Доля России в мировом производстве
биотехнологической промышленности составляла в 1980 г. 5 %, а в России в
2000 г. – 0,17 % (в абсолютном выражении объемы продаж упали с 1,5 до
0,4 млрд дол.).
Осознание необходимости развития отечественной биотехнологии и
понимание, что без этого невозможен дальнейший научно-технической прогресс страны, приводят к тому, что на уровне лиц, принимающих решения,
начинают предприниматься усилия в этом направлении. Свидетельство тому –
специальные слушания в Государственной думе РФ, а также проект «Развитие биотехнологии в Российской Федерации в 2008–2020 гг., рассмотренный
в преддверии открытия IX Съезда Всероссийской политической партии
«Единая Россия» в рамках Общественного Форума «Стратегия 2020», обсудивший основные направления развития России до 2020 г., а также серия научных и научно-практических конференций, прошедших под патронажем
правительства РФ и правительства Москвы в области биотехнологии. Так, в
октябре 2004 г. в Москве состоялась Вторая Международная конференция
«Биотехнология и бизнес» (очередная прошла также в Москве в мае 2009 г.),
в которой участвовали представители двухсот компаний, в том числе производителей биотехнологической продукции и венчурных фондов. Организация
конференции проходила под патронатом Минпромнауки и технологий РФ
при участии Минсельхоза, Минздрава и Минэкономразвития, среди перспективных направлений в биотехнологии были обозначены:
– создание трансгенных сельскохозяйственных растений с измененным
генотипом;
– применение микроорганизмов для повышения выхода нефти и выщелачивания цветных и редкоземельных металлов;
– конструирование бактериальных штаммов, способных заменить дорогостоящие неорганические катализаторы и изменить условия биосинтеза
для получения принципиально новых соединений;
– применение бактериальных стимуляторов роста растений;
– направленный биосинтез новых биологически активных веществ
(БАВ) – аминокислот, ферментов, витаминов, антибиотиков, различных пищевых добавок и других продуктов;
– изменение фотосинтезирующих характеристик растений;
– создание трансгенных растений и животных с целенаправленными
признаками и свойствами;
– практическое использование генетических конструкций, созданных в
лабораториях;
– культивирование клеток растений и животных;
– гибридизация клеток;
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
25
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
– энзимология и клеточная биология, необходимые для создания возможности получения в промышленных условиях иммобилизованных ферментных и клеточных систем.
На конференции было отмечено, что, несмотря на малую долю биотехнологических препаратов РФ в мировом объеме, уровень отечественных специалистов в области биотехнологий весьма высок и западные биотехнологические гиганты активно пользуются услугами российских лабораторий и отдельных специалистов. Так, около 40 % всего мирового офшорного (т.е. производящегося за пределами страны, в которой расположена компаниязаказчик) синтеза белков и других веществ с помощью биотехнологий осуществляется в России. Генеральный директор РАО «Биопрепарат» Р.У. Хабриев, характеризуя структуру российского биотехнологического рынка, отметил, что за последнее десятилетие четко прослеживается положительная
тенденция по объемам биотехнологической продукции, в целом объемы их
продаж возросли в 3 раза, при этом доля медицинских биотехнологий (от
всего отечественного биотехнологического рынка) составляет около 19 %, а
доля иммунологических биотехнологий – около 10 %. Было акцентировано,
что иммунобиология – это отрасль, где в отличие от традиционной фармацевтики Россия не уступает Западу. Так, если соотношение отечественных и
импортных лекарств на фармрынке РФ составляет 40:60 или 30:70, то по иммунобиологическим препаратам это соотношение равно 70:30 в пользу отечественного производства, а по качеству эта продукция не уступает зарубежным аналогам.
В настоящее время в области («красной») медицинской биотехнологии
в РФ функционируют два сегмента: традиционные препараты и продукты и
современные. Традиционные продукты – это антибиотики, ферменты, стероиды, витамины, вакцины и др. В этой области работают около 50 отечественных предприятий, однако в научном плане традиционная медицинская
биотехнология обеспечена весьма слабо. Современная (или новейшая) медицинская биотехнология, производящая интерфероны, интерлейкины, колонистимулирующие факторы, моноклональные антитела, генно-инженерный инсулин, набирает мощь. С конца 90-х гг. началась активная работа по получению новых биотехнологических препаратов. В 2000 г. было выведено на общемировой рынок около 42 новых активных субстанций, и доля биотехнологических препаратов составляла в нем более 35 %. В 2001 г. всего было выведено на рынок 52 биотехнологических препарата. Доля препаратов современной биотехнологии составляет сегодня около 10 % от общей медицинской биотехнологии России. Это при том, что объемы финансирования биотехнологической отрасли в России в сопоставлении с США и странами ЕС
мизерны.
На биотехнологическом рынке России ситуация такова, что спрос значительно превышает предложение. При этом произошел существенный упадок инфраструктуры, а роль малого и среднего бизнеса пока еще весьма незначительна. Примеров успешного развития биотехнологии в России немного, а основными производителями данного рода продукции по-прежнему ос Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
26
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
таются несколько научно-исследовательских институтов и небольших компаний, родившихся в их недрах. Так, в опытном производстве Института
биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН производят инсулин (препарат инсуран, объем реализации 76 млн руб./год) и соматотропин – гормон роста (объем реализации 18 млн 200 тыс. руб./год).
Из всех синтетических пептидных препаратов, производящихся сейчас
в мире, доля российских составляет более 25 % (11 препаратов из 40). Среди
них – отечественные тимоген и тимодепрессин, регулирующие иммунную
систему. Их производят и продают не только в России, но и за рубежом. Еще
несколько пептидных препаратов находятся на разных стадиях клинических
испытаний. Что нужно для развития этого сектора биотехнологии? Гарантированная доля на рынке для российских производителей, развитие отечественного оборудования для производства, подготовка кадров. Hесмотря на
многочисленные трудности, российские биотехнологические компании и их
разработки привлекают все большее внимание инвесторов. Например, у Международного научно-технического центра (МHТЦ-ISTC) биотехнологии занимают первое место по объему финансирования. В последние годы на их
поддержку выделено 150 млн дол. США; венчурные фонды тоже все активнее инвестируют в биотехнологию; однако к сотрудничеству с ними не всегда готовы руководители малых хайтек-компаний.
В 2005 г. в рамках Третьего съезда Общества биотехнологов России
была обсуждена и принята Программа «Развитие биотехнологии в российской Федерации на 2006–2015 гг.» (источник – www.biorosinfo.ru). От выполнения этой государственной программы зависит, впишется ли Россия в
мировую тенденцию развития биотехнологии. Концепция, структура и механизмы реализации данной программы были представлены и получили одобрение на круглом столе «Законодательное обеспечение развития биотехнологической отрасли промышленности», состоявшемся в Государственной думе
РФ 8 февраля 2005 г. На прошедших в Государственной думе парламентских
слушаниях на тему «Законодательное обеспечение развития биотехнологии»,
организованных Комитетом по промышленности, строительству и наукоемким технологиям, было решено создать при этом комитете специальный экспертный совет по биотехнологии для подготовки рекомендаций, как вывести
отрасль из кризиса. Эти слушания – событие эпохальное для отечественной
биотехнологии. Открывая слушания, вице-спикер Государственной думы
О.В. Морозов признал, что отрасль находится «в отчаянном состоянии и для
своего спасения требует незамедлительного государственного вмешательства».
Целью Программы является развертывание работ в области теоретической и практической биотехнологии в России на базе современных инновационных подходов для производства импортозамещающей отечественной
биотехнологической продукции.
К задачам Программы относятся:
– формирование и реализация национальных приоритетных проектов в
биотехнологии;
– разработка теории и методологии фундаментальной биотехнологии;
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
27
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
– внедрение новейших достижений в сфере геномики, биоинформатики, нанотехнологий в соответствии с наиболее важными приоритетами (генетический паспорт, биочипы и др.);
– создание современных образовательных программ и системы подготовки кадров в области биотехнологии;
– реализация целевых практических проектов по медицинской, сельскохозяйственной, пищевой, экологической, промышленной биотехнологии
с целью обеспечения населения отечественной биотехнологической продукцией;
– создание действенной правовой, экономической, информационной и
организационной базы для развития биотехнологии.
Реализация Программы планируется в три этапа: I этап – 2006–2008 гг.,
II этап – 2009–2011 гг., III этап – 2012–2015 гг. На каждом этапе ставятся
промежуточные цели и задачи, ориентированные на достижение конечного
результата Программы.
В структуру Программы входят 4 раздела:
1. Национальные приоритетные проекты.
2. Федеральные проекты (направления):
– фундаментальная биотехнология;
– медицинская биотехнология;
– сельскохозяйственная биотехнология;
– пищевая биотехнология;
– промышленная биотехнология;
– экологическая биотехнология;
– правовое, экономическое, информационное и организационное обеспечение развития биотехнологии;
– материально-техническая база биотехнологии;
– подготовка кадров для биотехнологии.
3. Региональные (межрегиональные, окружные) проекты
4. Целевые проекты.
Для реализации мероприятий Программы предложено активно использовать творческий потенциал РАН, РАМН, РАСХН, ведущих профильных
научных учреждений страны (ИБХ, ИМБ, Пущинский научный центр РАН,
ИОГЕН, ИБР, ЦИН и др.), крупных вузов, том числе МГУ им. М.В. Ломоносова, Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина,
Тимирязевской сельскохозяйственной академии и др., а также связанных с
ними научно-исследовательских учреждений и организаций. Планируется
взаимодействие с НИИ Министерства образования и науки РФ, Министерства промышленности и энергетики РФ, Министерства здравоохранения и социального развития РФ, РАН, РАМН, РАСХН, выбранными на конкурсной
основе. Будет использован также механизм создания целевых рабочих групп,
временных трудовых коллективов (ВТК) и другие научно-организационные
подходы.
При реализации региональных задач планируется использование такого
базового элемента, как исходное формирование соответствующей областной
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
28
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.1. Роль биотехнологии в современном мире
целевой программы с последующим подключением федеральных ресурсов в
рамках ФЦП или целевого финансирования.
Национальная программа предусматривает широкое международное
сотрудничество с применением механизма грантов и формирования совместных проектов. Поставленные в Программе задачи требуют радикального изменения государственного финансирования биотехнологии. По предварительным подсчетам, только для реализации блока национальных приоритетных проектов потребуется не менее 2 млрд дол. Очевидно, такие объемы
финансирования требуют специальных постановлений Правительства РФ.
В случае целевого выделения средств из федерального бюджета планируется
экономический эффект, значительно превосходящий объем вложений.
Помимо средств федерального бюджета, мероприятия Программы будут реализовываться за счет бюджетов субъектов Российской Федерации и
средств внебюджетных источников. Общий объем финансирования Программы оценен в 150 000 млн руб., в том числе за счет средств федерального
бюджета – 15 000 млн руб. (10 %), за счет средств бюджетов субъектов Российской Федерации – 45 000 млн руб. (30 %) и за счет средств внебюджетных
источников – 90 000 млн руб. (60 %). За счет средств бюджетов субъектов
Российской Федерации предусматривается финансировать реализацию специальных проектов и программ, решающих проблемы того или иного региона.
Основным результатом реализации Программы станет обеспечение населения отечественной биотехнологической продукцией, решение жизненно
важных социальных и экономических задач.
Предполагается, что в результате осуществления Программы будут
решены следующие проблемы:
– формирование статуса России как государства с экономикой нового
типа, основанной на знаниях;
– создание и массовое производство социально значимой отечественной биотехнологической продукции; формирование перспективного, стабильного, импортозамещающего рынка продукции и услуг повышенного
спроса (питание, лекарства, диагностикумы);
– сохранение кадров и решение проблем трудозанятости в ряде субъектов РФ, а также в наукоградах и территориях научно-технического развития
биологического и биотехнологического профиля;
– сохранение и рациональное использование генетических ресурсов
России;
– решение проблем биологической и экологической безопасности.
Социальный эффект от реализации программы при достижении намеченных показателей ожидается значительным, в том числе это решение проблем трудозанятости, сохранение квалифицированных кадров и т.д.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
29
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.2. Рынок новейших биотехнологических
препаратов и продуктов
Многообразие форм живой материи и новые знания в области физики и
химии живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации, продуцирующие широчайший
спектр макромолекул. Фундаментальные знания о молекулярной организации и закономерностях функционирования биосинтетических путей являются основой для метаболической инженерии биосистем суперпродукции макромолекул с заданными свойствами.
На смену ставших рутинными биотехнологическим продуктам (белку
одноклеточных, биоудобрениям и биогазу, органическим кислотам, аминокислотам) приходят новые продукты и препараты, среди которых – средства
диагностики и лечения на основе технологий генетической инженерии и клонирования, вакцины, сыворотки, моноклональные антитела, экологически
чистые материалы, а также биоинженерная аппаратура нового поколения для
реализации биотехнологических процессов.
Ведущие фирмы (табл. 1.3) в области биотехнологии в течение небольшого периода (с 1978 до 1982 гг. – период взрыва мирового рынка генноинженерных продуктов) увеличили свои активы более чем в 30 раз; при этом
их годовой доход возрос при этом с 5 до 67 млн дол.
Таблица 1.3
Динамика мирового рынка продукции биотехнологии, млрд дол.
Области применения
Медицина:
– терапевтические препараты
– диагностикумы
– вакцины
Итого
Кормовые добавки
Приборы и оборудование
Сельское хозяйство
Защита окружающей среды
Материалы
Всего
Годы
1985
1990
1995
2000
0,2
–
0,1
0,3
1,7
0,5
–
–
–
2,5
3,0
1,2
0,3
4,5
2,1
1,0
0,3
0,4
–
8,3
9,5
4,3
1,2
15,0
4,6
2,8
1,2
1,0
0,15
24,7
32,0
10,0
3,0
45,0
9,0
4,8
5,0
2,0
0,3
66,1
Десятки новых препаратов ежегодно проходят различные стадии законодательного утверждения. Среди них – диагностикумы вируса В, СПИДа и др.,
моноклональные антитела, конъюгированные с растительными токсинами,
эффективные противоопухолевые препараты, генные диагностикумы и пр.
К 2000 г. на мировом рынке биотехнологических продуктов доля медицинских препаратов, полученных только в США методами клеточной и генетической инженерии, достигла свыше 30 млрд дол., что составило около 60 %
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
30
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов и продуктов
всех затрат. Перечень медицинских препаратов, прошедших все стадии исследований и допущенных на рынок за период с конца 80-х гг. до 2004 г.,
существенно расширился. Ежегодно в США FDA (Администрация по продуктам питания и препаратам) выдает порядка 30–40 разрешений на серийное производство и применение биотехнологических препаратов и вакцин.
Помимо полученных и выпущенных на рынок в 1981 г. рекомбинантных инсулина, гормона роста, иммунно-глобулинов и эритропоэтина, появились следующие препараты: липосомальная форма противогрибкового препарата, активатор тканевого плазминогена; рекомбинантные факторы свертывания крови; человеческий альбумин; заменитель человеческой кожи, состоящий из коллагена, фибробластов и кератиноцитов; культивированные
аутологичные хондроциты; липосомальная форма химиотерапевтического
агента даунорубицина; вакцины против гепатита В и для лечения хронического гепатита С; рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон для
лечения бесплодия; биоинженерный коллагеновый матрикс для реконструкции мышечной ткани; препараты для диагностики и лечения ВИЧ-инфекции;
костный трансплантат, содержащий рекомбинантный костный морфогенетический протеин (rhBMP-2); гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор при проведении аутологичных трансплантаций костного
мозга; ботулинический токсин типа В и др.
Японский рынок биотехнологических диагностикумов и препаратов в
2000 г. составил свыше 30 млрд дол.; среди них – препараты для лечения
первичных и приобретенных иммунодефицитов, аутоиммунных состояний,
вирусных и микробных инфекций, злокачественных новообразований, иммуноспецифических синдромов при шоке, лучевой и ожоговых болезнях.
Серьезный прорыв был достигнут в области получения трансгенных
сортов культурных растений, это генно-инженерный сорт сладкой («золотой») кукурузы; гибридные сорта кукурузы, рапса, пшеницы и сои с генами
устойчивости к насекомым и гербицидам; трансгенные сорта хлопка, устойчивые к вилту, вредителям и гербицидам; трансгенные сорта папайи с красной и желтой мякотью, устойчивые к вирусу кольцевой пятнистости; а также
генетически модифицированные фрукты и овощи с удлиненным сроком хранения (сорта томатов и клубники, не портящиеся при длительном хранении
за счет снижения синтеза этилена, ускоряющего процесс физиологического
дозревания плодов). В области рыбоводства были получены модифицированные быстрорастущие морепродукты (лосось, камбала), достигающие товарной массы в течение одного–полутора лет, по сравнению с двумя–тремя
годами, требующимися для лососей традиционных пород и др.
Объем рынка биотехнологий в мире к 2005 г. оценивался примерно в
200 млрд дол. США. Ежегодный рост в настоящее время составляет около
7–9 %. Для рынка биотехнологий в мире 2005 г. можно охарактеризовать как
один из самых успешных за всю историю развития этой отрасли. В этот период правительства стран Европы и Азии продолжали демонстрировать энтузиазм по отношению к индустрии биотехнологий и инвестировать миллиар-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
31
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов и продуктов
ды долларов в эту отрасль, считая ее одним из приоритетов экономического
развития своих государств.
В настоящее время компании, связанные с биотехнологией и медициной, начинают выдвигаться на ведущие позиции в рейтингах по различным
приоритетам. Так, журнал Fortune опубликовал ежегодный рейтинг 100 лучших компаний-работодателей. Лучшим местом работы в США признана
компания Google. На втором месте – биотехнологическая компания Genetech.
В рейтинге, проводимом компанией «Делойт», по показателям наиболее быстрого роста названы фирмы Anistoma и Biotage, занимающиеся разработкой
биотехнологических препаратов для лечения онкологических заболеваний,
генетическим анализом и медико-техническими исследованиями, заняли среди стран Европы 3-е и 4-е места, показав рост за 2005 г. на 20 и 13 % соответственно.
Рынок биотехнологий в разных странах имеет свои особенности, обусловленные уровнем развития экономики стран и доходами населения. Наиболее активно в настоящее время ведется разработка лекарственных средств
с использованием современной биотехнологии. В США, Японии и отдельных
странах Западной Европы на эти цели расходуется в среднем 2/3 средств, выделяемых на НИОКР в области биотехнологии. Практически во всех этих государствах существуют правительственные программы поддержки биотехнологических компаний. В США, являющихся лидером в области современной биотехнологии, для проведения фундаментальных и прикладных исследований было образовано много специализированных биотехнологических
фирм, которые, привлекая частный и государственный капитал и лучшие научные кадры, в считанные годы разработали и запатентовали способы получения многих белковых продуктов медицинского назначения. К таким фирмам относятся в первую очередь Genentech, Biogen, Amgen, Genetic Institute,
Cetus, Immunex и ряд других.
Примерно в это же время к финансированию НИОКР в области современной биотехнологии подключились и крупные транснациональные компании, приобретая акции или лицензии на готовые продукты, а впоследствии
создавая собственные исследовательские подразделения. Эти фирмы сыграли
решающую роль в промышленном внедрении первых генно-инженерных медицинских препаратов, таких как инсулин, гормон роста человека, интерферон, эритропоэтин, тканевой активатор плазминогена, вакцина против гепатита В и др. Например, фирма Genentech имеет различные лицензионные соглашения и соглашения о сотрудничестве с Elly Lilly (США), Hoffmann-La
Roshe (Швейцария), Takeda, Daiichy Seiyaky, Toray и Fujisawa (Япония),
Boeringer Ingelheim, Gruenenthal (Германия), Kabi Vitrum (Швеция).
По данным исследовательской компании Abercade, основными сегментами рынка биотехнологических продуктов в РФ являются фармацевтика (66 %),
препараты для сельского хозяйства (18 %), дрожжи (9 %) (рис. 1.1) при весьма низких (порядка 1 %) уровнях остальных продуктов.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
32
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов и продуктов
Рис. 1.1. Долевой анализ рынка биотехнологии РФ (по данным
исследовательской компании Abercade, источник – http://www.abercade.ru/)
Однако нельзя не отметить, что основную долю самого развитого рынка фармацевтических препаратов в РФ (порядка 450 млн дол. США) в настоящее время занимает импортная продукция – это преимущественно инсулины, вакцины, сыворотки. Доля отечественной фармацевтической продукции в совокупном объеме составляет только 60,6 млн дол. США. Более перспективным выглядит рынок отечественной промышленной биотехнологии,
в основном это производство ферментов и средств защиты растений. Объемы
продаж ферментных препаратов отечественного производства составляет
порядка 12,3 млн дол. США, это 38 % от общего объема этого сегмента рынка. Преимущественно это ферменты и ферментные препараты для спиртовой
промышленности и для животноводства. Среди биотехнологических препаратов сельскохозяйственного назначения – средства защиты и стимуляторы
роста растений, пробиотики, вакцины ветеринарные, кормовые антибиотики,
аминокислоты и кормовой белок, витамины, кормовые добавки.
На рынке биотехнологических препаратов для защиты окружающей среды
доминирует отечественное производство продукции в размере 8 млн дол. США,
а доля импортной продукции (бактериальные препараты для ликвидации
нефтяных загрязнений, биосорбенты для очистки воды и донных отложений
от нефтепродуктов) составляет только 800 тыс. дол. США. Объемы отечественного производства дрожжей составляют 58 млн дол. США, импорт этого
вида биотехнологического продукта – в 3,5 раза меньше. Направления более
наукоемких новейших биотехнологий, базирующихся на достижениях генетической инженерии, в России, к сожалению, только вступают в фазу своего
развития. Так, на рынке генетически модифицированных культур, которые
занимают в мире площадь 8,1 млн га и их продажи ежегодно растут на 20 %,
Россия пока не представлена.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
33
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
Несмотря на то что в настоящее время препараты и продукты, получаемые в процессах промышленной («белой») биотехнологии, главенствуют
на рынке биотехнологических продуктов, наиболее впечатляющие успехи и
прорывы в этой области связаны с использованием достижений клеточной и
генетической инженерии.
Геномика – это направление биотехнологии, занимающееся изучением
геномов и ролей, которые играют различные гены, индивидуально и в комплексе, в определении структуры, направлении роста и развития и регуляции
биологических функций. Различают структурную и функциональную геномику.
Предмет структурной геномики – создание и сравнение различных типов геномных карт и крупномасштабное секвенирование ДНК. Проект по
изучению человеческого генома (Human Genome Project) и менее известная
Программа по изучению растительных геномов (Plant Genome Research
Program) являются самыми масштабными исследованиями структурной геномики. В задачи структурной геномики входят также идентификация, локализация и составление характеристик генов. В результате осуществления частных и государственных проектов по структурной геномике созданы карты
геномов и расшифрованы последовательности ДНК большого количества организмов, в том числе сельскохозяйственных растений, болезнетворных бактерий и вирусов, дрожжей, необходимых для приготовления некоторых продуктов питания и производства пива, азотфиксирующих бактерий, малярийного плазмодия и переносящих его комаров, а также микроорганизмов, используемых человеком в самых разнообразных промышленных процессах.
В 2003 г. завершен Проект по изучению генома человека.
Предмет и область функциональной геномики – секвенирование геномов, идентификация и картирование генов, выявление функций генов и механизмов регуляции. Для понимания различий между видами основную роль
играет не знание количества генов, а понимание того, как они различаются
по составу и функциям, знание химических и структурных различий в генах,
которые и лежат в основе различий организмов. Эволюционный анализ постепенно становится главным приемом выяснения функций и взаимодействий генов в пределах генома.
Благодаря тому, что генетический код универсален и все живые организмы способны расшифровывать генетическую информацию других организмов и осуществлять заложенные в ней биологические функции, любой
ген, идентифицированный в ходе того или иного геномного проекта, может
быть использован в широком спектре практических приложений:
– для целенаправленного изменения свойств растений и придания им
желаемых признаков;
– выделения специфических рекомбинантных молекул или микроорганизмов;
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
34
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
– идентификации генов, участвующих в осуществлении сложных процессов, контролируемых множеством генов, а также зависящих от влияния
окружающей среды;
– обнаружения микробных заражений клеточных культур и др.
Протеомика – это наука, занимающаяся изучением структуры, функций, локализации и взаимодействия белков внутри клетки и между клетками.
Набор белков клетки называется ее протеомом. По сравнению с геномикой,
протеомика ставит перед исследователями гораздо более многочисленные и
трудные задачи. Структура белковых молекул гораздо сложнее, чем структура молекул ДНК, которые представляют собой линейные молекулы, состоящие из четырех нерегулярно повторяющихся элементов (нуклеотидов). Форма, которую принимает белковая молекула, зависит от последовательности
аминокислот, однако все механизмы скручивания и складывания аминокислотной цепочки до конца не изучены. Задачей исследователей, работавших
над программой Human Genome Project, была разработка методов, которые
позволили бы добиться поставленных целей. Ученые, занимающиеся протеомикой, и сейчас находятся в подобном положении: им необходимо разработать достаточное количество методов и приемов, которые могли бы обеспечить эффективную работу над огромным количеством вопросов:
– каталогизацию всех белков, синтезируемых различными типами клеток;
– выяснение характера влияния возраста, условий окружающей среды и
заболеваний на синтезируемые клеткой протеины;
– выяснение функций идентифицированных белков;
– изучение взаимодействий различных белков с другими белками внутри клетки и во внеклеточном пространстве.
Потенциал белковой инженерии позволяет улучшать свойства используемых в биотехнологии белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов)
и создавать принципиально новые протеины, пригодные в качестве лекарственных препаратов, для обработки и улучшения питательных и вкусовых качеств пищевых продуктов. Наиболее значительны успехи белковой инженерии в биокатализе. Разработаны новые типы катализаторов, в том числе с
применением техники иммобилизации ферментов, способные функционировать в неводной среде, при значительных сдвигах рН и температуры среды, а
также растворимые в воде и катализирующие биологические реакции при
нейтральном рН и при сравнительно низких температурах. Технологии белковой инженерии позволяют получать новые типы белков биомедицинского
назначения, например способных связываться с вирусами и мутантными онкогенами и обезвреживать их; создавать высокоэффективные вакцины и белки-рецепторы клеточной поверхности, выполняющие функцию мишени для
фармацевтических препаратов, а также связывания вещества, и биологические агенты, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Так, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды, а
их производство, хранение и применение не опасно для окружающей среды и
здоровья людей.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
35
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
Новейшие биотехнологические методы позволяют диагностировать
многие заболевания и патологические состояния экспрессно и с высокой
точностью. Так, для постановки стандартного теста определения присутствия
в крови липопротеидов низкой плотности («плохого» холестерина) требуется
провести три отдельных дорогостоящих анализа: выявление содержания общего холестерина, триглицеридов и липопротеидов высокой плотности.
Кроме этого, в течение 12 ч до проведения теста пациенту рекомендуется
воздержаться от приема пищи. Новый биотехнологический тест состоит из
одного этапа и не требует предварительного голодания. Эти тесты, помимо
быстродействия, существенно снижают стоимость диагностики. К настоящему моменту разработаны и применяются биотехнологические тесты для диагностики некоторых видов опухолевых процессов, требующих для реализации небольшое количество крови, что исключает тотальную биопсию на начальных стадиях диагностики.
Кроме снижения стоимости, повышения точности и скорости диагностики, биотехнология позволяет диагностировать заболевания на гораздо более ранних этапах, чем это было возможно ранее. Это, в свою очередь, обеспечивает гораздо более высокие шансы пациентов на излечение. Новейшие
биотехнологические методы протеомики дают возможность идентифицировать молекулярные маркеры, сигнализирующие о приближающейся болезни,
еще до появления регистрируемых клеточных изменений и симптомов заболевания. Огромное количество информации, ставшее доступным в результате
успешного завершения проекта «Геном человека», должно сыграть особую
роль в разработке методов диагностики наследственных заболеваний, таких
как диабет I типа, муковисцидоз, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Ранее
заболевания этого класса диагностировали только после появления клинических симптомов; новейшие методы позволяют до появления клинических
признаков определить группы риска, предрасположенные к заболеваниям такого рода.
Разработанные с помощью биотехнологии диагностические тесты не
только повышают уровень диагностики заболеваний, но и улучшают качество медицинского обслуживания. Большинство из биотехнологических тестов
портативны, что позволяет врачам проводить тестирование, интерпретировать результаты и назначать соответствующее лечение буквально у постели
больного. Биотехнологические методы выявления патогенов важны не только для диагностики заболеваний. Один из самых наглядных примеров их использования – скрининг донорской крови на наличие ВИЧ-инфекции и вирусов гепатита В и С. Возможно, со временем биотехнологические подходы дадут возможность врачам определять характер инфекционного агента и в каждом конкретном случае подбирать наиболее эффективные антибактериальные препараты не за неделю, как это делается современными методами, а за
считанные часы.
Внедрение биотехнологических подходов со временем позволит врачам
не только улучшить существующие методы терапии, но и разработать принципиально новые, полностью основанные на новых технологиях. На настоя Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
36
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
щий момент целый ряд биотехнологических методов лечения одобрен
Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). В список заболеваний, подлежащих таким методам терапии, входят: анемия, муковисцидоз, задержка роста, ревматоидный
артрит, гемофилия, гепатит, остроконечные кондиломы, отторжение трансплантата, а также лейкемия и ряд других злокачественных заболеваний.
Использование биотехнологических методов позволяет создавать так
называемые «съедобные вакцины», синтезируемые генетически модифицированными растениями и животными. Так, созданы генетически модифицированные козы, молоко которых содержит вакцину от малярии. Получены
обнадеживающие результаты в клинических испытаниях бананов, содержащих вакцину от гепатита, и картофеля, содержащего вакцины против холеры
и патогенных штаммов кишечной палочки. Такие вакцины (например, в виде
сублимированного порошка для изготовления напитков), не требующие замораживания, стерилизации оборудования или закупки одноразовых шприцов, особенно перспективны для применения в развивающихся странах.
В процессе разработки также находятся вакцины-пластыри против
столбняка, сибирской язвы, гриппа и кишечной палочки. Уже получены
трансгенные растения, синтезирующие терапевтические белки (антитела, антигены, факторы роста, гормоны, ферменты, белки крови и коллаген). Эти
белки, производимые с помощью различных сортов растений, в том числе
люцерны, кукурузы, ряски, картофеля, риса, подсолнечника, сои и табака,
являются основными компонентами инновационных методов терапии ряда
онкологических заболеваний, СПИДа, болезней сердца и почек, диабета, болезни Альцгеймера, болезни Крона, муковисцидоза, рассеянного склероз, повреждения спинного мозга, гепатита С, хронических обструктивных заболеваний легких, ожирения, онкологических заболеваний и др.
Клеточные технологии находят все более широкое применение для
селекции, размножения и повышения продуктивности полезных растений, а
также получения биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Особое направление применения клеточных культур и клеточных технологий – тканевая инженерия, связанная с разработкой биоискусственных органов и тканей. В настоящее время на базе накопленных фундаментальных
знаний освоены, включая промышленные масштабы, технологии ведения
клеточных культур различного происхождения (растительных клеток, клеток
насекомых и млекопитающих).
Растительные клетки и культура растительных тканей позволяют
регенерировать целое растение из протопластов и клеток. Особенностью клеточных культур растений является их способность к тотипотенции, т.е.
в определенной среде и определенных условиях можно регенерировать целое
растение из одной клетки. Эта техника обеспечивает за сравнительно короткий срок получение в контролируемых условиях многочисленных популяций
клеток и дает возможность идентифицировать линии растений с повышенной
биологической продуктивностью.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
37
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
Клеточная инженерия растений базируется на использовании культуры
изолированных клеток, тканей, протопластов. Существует несколько направлений использования этих технологий в растениеводстве.
Первое связано со способностью изолированных растительных клеток
продуцировать в культуре ценные биологически активные соединения, в том
числе женьшеня или идиолитов, эфирных масел, алкалоидов, глюкозидов и др.
Второе направление – это использование культуры изолированных
тканей для клонального размножения растений и оздоровления посадочного
материала.
Третье направление – это применение изолированных клеток в селекции растений. Культивируемые на искусственных средах растительные клетки характеризуются большой неоднородностью; при этом возможен отбор
клеток, устойчивых к тем или иным неблагоприятным факторам – засухе,
низкой температуре, фитопатогенам и пр.
Культуры растительных клеток используют для биотрансформации
химических соединений и для эффективного синтеза биологически активных
соединений de novo. В культуре клеток сохраняется способность продуцировать биологически активные соединения, свойственные исходному целому
растению, что позволяет организовать условия, обеспечивающие синтез ценных продуктов, ранее не обнаруженных в исходных интактных растениях.
Например, в культурах растительных клеток стало возможным получать такие ценные соединения, как перицин, перикалин, хинокиол, ферригинол,
акуаммалин и др. Реализованы крупномасштабные культивационные системы растительных клеток для получения различных ценных веществ – ментола, женьшеня, убихинона-10, бетанина, камптотецина (антиканцероген), полипептидов – ингибиторов фитовирусов, агар-агара и др. Например, эффективный и дорогостоящий цитостатический препарат паклитаксель, традиционно получаемый из коры Тиса среднеземноморского (8 т исходного сырья
обеспечивают получение 1 кг препарата), в настоящее время с большей эффективностью получают в культуре клеток.
Еще более эффективными оказались процессы с использованием иммобилизованных растительных клеток. Такие биологические системы более
устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные культивационные условия. После установления способности
апикальной меристемы (небольшой участок недифференцированных клеток
на кончике стебля) к росту с образованием целого растения, эта техника стала применяться для клонирования линий растений. Культура растительных
тканей, аналогично культуре клеток, позволяет достаточно быстро получать
здоровые растительные клоны и на этой основе – перспективный посадочный
материал практически в неограниченных масштабах.
Культуры клеток насекомых дают возможность получать биологические агенты новых типов для борьбы с насекомыми-вредителями без негативного влияния на жизнеспособность полезных видов насекомых, а также
не накапливающихся в окружающей среде. Достоинства биологических ме Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
38
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
тодов борьбы с вредителями известны уже давно, это бактериальные, грибные и вирусные препараты, получение которых требует специализированной
техники и условий. Особенно это характерно для препаратов вирусной группы, производство которых основано на массовом размножении насекомогохозяина на искусственных средах. Вследствие достаточной трудоемкости
производства эти препараты до недавнего времени не находили массового
применения. Использование культур клеток насекомых способно полностью
решить эту проблему. Техника клеточных культур насекомых для размножения вирусов весьма перспективна. Для этого необходимо получение высокопродуктивных линий клеток, оптимизация питательных сред, выбор эффективных систем «вирус – клетка». По этой технологии в США производят
препарат «Элькар». Весьма успешны разработки по рекомбинантным бакуловирусам с генами, кодирующими водный обмен насекомых. После применения такого препарата насекомые погибают в течение 5 дней от обезвоживания либо перенасыщения водой.
Новые методы биотехнологии могут повлиять на цену вирусных препаратов. Кроме того, так же как и растительные клетки, клетки насекомых
могут быть использованы для синтеза лекарственных препаратов. Начата
реализация использования потенциала клеток насекомых для производства
VLP-вакцин (VLP – virus-like particle – вирусоподобные частицы), предназначенных для лечения инфекционных заболеваний, таких как атипичная
пневмония и грипп. Эта методика могла бы сильно снизить затраты и исключить проблемы безопасности, связанные с традиционным методом, использующим куриные яйца.
Культуры клеток животных широко используют в качестве тестобъектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных
препаратов. Кроме этого, клетки млекопитающих пригодны для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком
сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов, а также моноклональных антител и вакцин.
Например, компанией Sanofi Pasteur (США) по заказу Министерства здравоохранения и социальных услуг США разрабатываются методы культивирования клеток млекопитающих с целью эффективного синтеза вакцин против
гриппа. Особое направление применения клеточных культу, в особенности
стволовых клеток, и технологий – терапия и реконструктивная хирургия поврежденных органов и тканей.
Перечень болезней, лечение которых становится возможным благодаря
использованию клеточной терапии и трансплантологии, быстро пополняется.
Наиболее продвинутым в настоящее время является применение клеточных
технологий в кардиологии для лечения инфаркта миокарда, восстановления
кровотока в ишемизированных органах и тканях, повышения насосной функции сердца, а также лечения дислипидемий и атеросклероза. В неврологии
трансплантационные клеточные технологии начали применять для лечения
болезни Паркинсона и болезни Хагинтона. Имеются примеры положительного использования стволовых клеток костного мозга для заживления ожо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
39
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
говых и глубоких кожных ран, лечения системных и местных костных дефектов. В связи с выявленной противоопухолевой активностью низкодифференцированных кроветворных клеток и их способностью прямо супрессировать опухолевый рост проводятся исследования, направленные на клиническое применение стволовых клеток в онкологии.
Поиск новых технологий для восстановления утраченной функции органа или системы привели к появлению на стыке биотехнологии и медицины
тканевой инженерии (регенеративной медицины и органогенеза). Будущее
медицины напрямую связывают с развитием клеточных технологий, которые
позволяют, не меняя поврежденный орган, «обновлять» его клеточный состав. Такое «обновление» структурно-функциональных элементов органа дает возможность решать те же задачи, что и органная трансплантация. Вместе
с тем, эта технология намного расширяет возможности трансплантационного
лечения, делая его доступным для широкого круга разных категорий пациентов. Основой для развития новейших реконструктивных технологий являются функционирующие клетки, способные в зависимости от микроокружения
формировать ткани разных типов.
Список болезней, при лечении которых клеточные технологии уже используются или их применение планируется в ближайшем будущем, быстро
растет. В этот список, по-видимому, войдут все болезни, медикаментозное
лечение которых малоэффективно. Используемый в тканевой инженерии
междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых
биокомпозиционных материалов для восстановления утраченных функций
отдельных тканей или органов в целом. Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградирующихся материалов, которые
используют в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами.
Революционные преобразования традиционных биотехнологических
процессов связаны с применением методов генетической инженерии. Метод рекомбинантных ДНК является краеугольным камнем новейшей биотехнологии. Создание рекомбинантных ДНК означает объединение (рекомбинирование) двух отрезков ДНК разных видов. С помощью генетической инженерии разработаны и используются различные социально значимые технологии и процессы:
– производство новых лекарственных препаратов и безопасных вакцин;
– лечение некоторых генетических заболеваний;
– создание биоконтролирующих агентов для сельского хозяйства;
– повышение урожайности и снижение стоимости продукции;
– снижение аллергенности некоторых продуктов;
– улучшение питательных свойств продуктов;
– разработка биодеградирующих пластмасс;
– снижение уровня загрязненности воды и воздуха;
– замедление скорости порчи пищевых продуктов;
– контроль над вирусными заболеваниями.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
40
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
Молекулярное, или генетическое, клонирование – процесс создания генетически идентичных молекул ДНК – является основой молекулярной биологии, фундаментальным методом биотехнологических исследований, а также основой развития и коммерциализации биотехнологии. Подавляющее
большинство практических приложений биотехнологии, начиная с разработки лекарственных препаратов и заканчивая созданием трансгенных культур,
основывается на методах генетического клонирования. С помощью молекулярного клонирования стали возможными: идентификация, локализация и
описание генов; создание генетических карт и секвенирование целых геномов; проведение параллелей между генами и ассоциированными с ними признаками; установление молекулярной основы проявления признаков. Область
применения клонирования чрезвычайно широка.
К числу перспективных направлений биотехнологии относится модификация генома культурных растений с целью повышения урожайности и
улучшения их устойчивости к вредителям и неблагоприятным условиям
среды. Наибольший интерес вызывает, естественно, возможность трансформации однодольных растений (прежде всего, злаковых).
Трансформация генома высших растений реализуется двумя методами:
баллистическим и с использованием природной системы переноса генетического материала – части Ti-плазмиды (Т-ДНК) – Agrobacterium tumefaciens –
возбудителя бактериального рака или корончатого галла у двудольных растений. В качестве маркерной системы используют гены антибиотикоустойчивости, а также новые системы – Lux-гены или ген бактериальной
β-глюкуронидазы, вызывающий окрашивание селективной среды.
Ti-плазмиды, модифицированные разными генами, переносят в растения.
Перенос генетической информации с помощью Ti-плазмиды осуществлен и
на примере однодольных растений: использовали ткани луковицы гладиолуса с удаленными боковыми частями. Цилиндрические эксплантанты заражали вирулентными штаммами агробактерии, несущими Ti-плазмиду, которая
содержит гены, кодирующие синтез опинов; спустя 24 ч на поверхности зараженного растения появлялись опухоли. Специалисты Карнелского университета (США) предложили новый метод – стрелять по клеткам растений
вольфрамовыми пулями, покрытыми генетическим материалом. «Обстрел»
клеток-хозяина происходит со скоростью свыше 1 000 км/ч миллионом металлических дробинок, покрытых слоем фрагментов ДНК; метод оказался
универсальным.
С помощью генетического конструирования стало возможным получение соле-, гербецидо- и морозоустойчивых растений. По оценкам специалистов, в США ежегодный ущерб от заморозков оценивается в 6 млрд дол. Оказалось, что наиболее активными центрами кристаллизации являются отдельные бактерии (представители Pseudomonas, Erwinia), способные вызывать
образование льда при 0 оС; их назвали INA-бактерии – активные кристаллизаторы воды (Ice-nucleation Active). В этих бактериях идентифицирован специфический мембранный белок, вызывающий кристаллизацию; ice-гены были клонированы и модифицированы. Удаление средней части привело к по Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
41
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
тери способности экскретировать белок кристаллизации. В результате бактерии с модифицированным ice-геном утратили способность кристаллизовать
воду при −1–5 оС. Посев этих генетически модифицированных бактерий на
растения в момент распускания почек препятствует колонизации другими
бактериями, поэтому растения фактически иммунны для заражения INAбактериями дикого типа и им не страшны кратковременные заморозки.
Вторая волна «зеленой революции» ориентирована на получение генетически модифицированных «самоудобряющихся» растений. Установлено,
что в составе генома азотфиксирующих симбиотических бактерий имеется
группа генов, ответственных за симбиоз с растениями и локализованных в
крупных симбиотических плазмидах pSym; процесс формирования клубеньков контролируют nod-гены и, наконец, nif-гены ответственны за синтез нитрогеназы, т.е. азотфиксацию. В настоящее время большие средства в США и
других странах вкладываются в программу получения трансгенных злаковых
с генами азотфиксации. Однако при переносе генов азотфиксации в высшие
растения, помимо трудностей генетического характера, имеются и другие.
Пока не изучена в должной мере регуляция взаимосвязи генов фиксации азота с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и кофакторов, необходимых для функционирования фермента нитрогеназы. Последняя должна быть защищена от ингибирующего воздействия кислорода.
Ведутся также интенсивные исследования генетики растений для подбора
эффективных растений-хозяев, а также исследования, направленные на модификацию генома микроорганизмов для получения организмов, способных
существовать в симбиозе не только с бобовыми растениями (например, хлебными злаками). Фундаментальные исследования по переносу генов азотфиксации в высшие растения, по-видимому, приведут к многообещающим открытиям и коренному перевороту практики азотного питания растений.
Второе, весьма важное направление применения генетической инженерии, – придание культурным растениям устойчивости к заражению листогрызущими насекомыми. Природные фитопатогены, например бактерии
Bacillus thuringiensis (Bt), синтезирующие токсины, эффективные против
листогрызущих насекомых, стали источником генов для придания растениям
устойчивости к этим вредителям. Синтез токсинов Bt контролируется одним
геном, имеющиеся методы позволяют проводить работы, направленные на
улучшение существующих продуцентов и продуктов Bt. Известно, что гены,
контролирующие синтез кристаллов Bt, локализованы на небольшом числе
плазмид значительной молекулярной массы. Токсический белок, синтезируемый Bt, клонирован в E. coli и B. subtilis, его экспрессия получена даже в
течение вегетативной фазы роста. Есть сведения о клонировании белка, токсичного для бабочек, в клетках табака. В выросшем целом растении табака
каждая клетка вырабатывала токсин. Таким образом, растение, приобретшее
токсин, само становится устойчивым к насекомым: поедая листья, гусеница
погибает, не причинив существенного вреда растению.
Американскими компаниями «Монсанто» и «Агроцетус» проведены
полевые испытания и районированы сорта хлопчатника, сои и ряда других
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
42
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
культур с внедренным в хромосому геномом Bt. Резистентность к гусеницам
передается семенам и последующим поколениям растений. Начато получение рассады трансгенного картофеля и томатов с внедренным геном Bt, токсичного для чешуекрылых. Создан трансгенный инсектоустойчивый тополь с
внедренным геном антитрипсиназы в клетки тканей. Фермент снижает усвоение белка насекомыми, что приводит к сокращению популяции.
Клонированы гены устойчивости к гербицидам; их клонирование в
растения призвано обеспечить безопасность применения ядохимикатов в
сельском хозяйстве. Однако клонирование генов в культурные растения сопряжено с определенным риском. Опасения связаны с возможностями выхода генетических векторов и трансгенных растений из-под контроля биотехнологов. Поэтому высказываются опасения превращения генно-инженерных
растений в сорняки, хотя комплекс «сорняковости» (комплекс признаков,
обеспечивающих быстрое распространение в ущерб культурным растениям,
устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, эффективные механизмы рассеивания семян и пр.) едва ли может сформироваться в результате
трансплантации одного или немногих генов. В то же время устойчивость к
гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные проблемы в практике севооборотов. Так, устойчивое к некоторому препарату растение, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене
на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, устойчивый к данному гербициду. Это предусматривает необходимость тщательного тестирования всех генно-инженерных растений перед их переносом
в полевые условия.
Новый путь модификации генома – применение антисмысловых РНК,
т.е. подавление синтеза определенного белка. Введение в клетку комплементарного олигонуклеотида мРНК препятствует считыванию информации. Использование данной технологии позволило получить сорт томатов, сохраняющихся длительное время за счет блокирования функции гена полигалактуроназы (расщепляет углеводы в клетке, стимулируя созревание), или кофе
с низким уровнем кофеина в результате введения гена, подавляющего продукцию; т.е. это путь удаления неприятных горьких и прочих веществ из
сельскохозяйственной продукции, подавления вирусных инфекций и т.д.
Генетическая инженерия животных направлена на выведение животных с высокими эксплуатационными свойствами. Методы генетической инженерии совместно с методом клонирования животных позволяют также получать модели для изучения заболеваний человека, процессов старения и
формирования злокачественных новообразований. В будущем эти приемы
могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств и
оценки эффективности таких методов лечения, как генная и клеточная терапии. Клонирование животных также предоставляет возможность спасения
видов, находящихся под угрозой вымирания.
К биотехнологическим методам репродукции животных относятся искусственное осеменение, индукция родов, трансплантация, регулирование
соотношения особей мужского и женского рода в популяции, это также ран Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
43
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
няя диагностика беременности, применение гормонов для регулирования репродуктивных функций и роста и пр.
Искусственное разделение эмбриона является рутинным методом клонирования. Метод дает возможность получения большого числа копий животных от высокоценных производителей. Возможно получение большого
числа копий однояйцовых близнецов путем разделения зародышей в стадии
бластулы или морулы на части. Эти части зародыша вводятся в пустые оболочки яйцеклеток свиньи, помещают в агаровые цилиндры на несколько
дней, далее вводят в яйцеводы овец. Нормально развившиеся зародыши пересаживают хирургическим путем коровам-реципиентам на 6-7 день полового цикла. Выживаемость у половинок составляет до 75 %, у четвертинок –
ниже, около 40 %. Образующиеся в результате этого эмбрионы внедряются в
матку суррогатной матери, которая обеспечивает их вынашивание и рождение. Так как эмбрионы происходят из одной зиготы, они являются генетически абсолютно идентичными.
Манипуляции на эмбрионах используют для получения эмбрионов различных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и создавать химерных животных. Таким образом получены, например, овцекозлиные химеры. Первые эксперименты показали возможность трансформации генома животных генами человека, в США удалось получить свиней,
несущих ген гормона роста человека. В Эдинбургском центре биотехнологии
получены овцы с перенесенным фактором 9 человека, который секретируется
в составе молока.
Новый метод – перенос ядра соматической клетки (или перепрограммирование яйцеклеток) начинается с выделения из организма соматической
клетки – любой клетки, не участвующей в процессе репродукции (т.е. любой,
кроме половых клеток – сперматозоидов и яйцеклеток). У млекопитающих
любая соматическая клетка содержит полный двойной набор хромосом
(в каждой паре одна хромосома получена от материнской яйцеклетки, вторая –
от отцовского сперматозоида). Геном любой половой клетки состоит только
из одного хромосомного набора.
Для создания овцы Долли исследователи переместили ядро соматической клетки, полученной от взрослой овцы, в яйцеклетку, ядро которой было
предварительно удалено. После проведения определенных химических манипуляций яйцеклетка с подмененным ядром начала вести себя как свежеоплодотворенная яйцеклетка. В результате ее деления сформировался эмбрион,
который был имплантирован суррогатной матери и выношен в течение полного срока беременности. Появление Долли продемонстрировало возможность удаления генетической программы ядра специализированной соматической клетки и его перепрограммирования в лабораторных условиях методом помещения в яйцеклетку.
В течение 5-6 дней яйцеклетка развивается в эмбрион, генетически
идентичный животному-донору. Клетки этого эмбриона могут быть использованы для получения любого типа ткани, которая при пересадке не будет
отторгаться организмом донора ядра. Этот метод вполне может быть исполь Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
44
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии
зован для выращивания клеток и тканей для заместительной терапии. Данный метод клонирования животных весьма активно используют в настоящее
время. Совершенствование биотехнологических методов и средств диагностики и лечения, возможности ускоренными методами создавать эффективные породы сельскохозяйственных животных и сортов культурных растений –
все это способствует повышению качества жизни человека.
Ощутим вклад биотехнологии в увеличение ресурсов минерального
сырья и энергоносителей, а также в охрану окружающей среды. В связи с последним особо значимым становится направление, ориентированное на освоение экологически чистых новых материалов. Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. К настоящему моменту объемы выпуска не разрушаемых в природной среде синтетических пластмасс достигли 180 млн т/год, что
создало глобальную экологическую проблему. Радикальным решением этой
проблемы является освоение полимеров, способных биодеградировать на
безвредные для живой и неживой природы компоненты. В этой связи в последние годы наметился существенный прогресс в области синтеза разрушаемых биополимеров – высокомолекулярных полимерных материалов, способных деградировать в природной среде до безвредных продуктов (диоксида углерода и воды).
1.4. Инновации в биотехнологии: процедура
коммерциализации и передачи технологий
Необходимость повышения качества жизни человека делает все более
актуальной разработку новых средств диагностики и лечения, целевых продуктов, в том числе пищевого и технического назначения, экологически чистых материалов, усовершенствования способов воспроизводства энергоносителей и минерального сырья, а также утилизации промышленных, сельскохозяйственных и бытовых отходов. Все новые продукты биотехнологии, особенно пищевого и медицинского назначения, должны быть проверены на
безопасность прежде, чем они будут допущены в практику. Для получения
законодательного разрешения на применение новых биотехнологических
продуктов, препаратов и технологий необходимо пройти серию этапов. Процесс прохождения всех этапов до промышленного выпуска называется передачей технологии.
На рис. 1.2 в обобщенном виде представлены этапы, обязательные для
успешной передачи технологии производства продуктов биотехнологии биомедицинского назначения. Каждое направление передачи технологии имеет
временные рамки, регулирующие последовательность шагов (этапов) процесса передачи технологии.
Успех продвижения новой технологии зависит от многих составляющих и, прежде всего, от организационного – правового процесса регулирова-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
45
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий
ния всех этапов прохождения разработки, от стадии поисковых научных исследований до маркетинговых исследований и выхода на рынок. В России
еще предстоит создать условия и механизмы для эффективной разработки и
коммерциализации биотехнологических разработок, особенно в области медицинского материаловедения, тканевой инженерии и конструирования биоискусственных органов. В США и странах ЕС это уже сложившийся и регламентированный путь.
Каждый этап передачи технологии дает разный конечный результат и
выдвигает разные требования к бюджету и персоналу. Прибыльность часто
зависит от времени и затрат, вложенных в каждое направление. Финансовые
затраты, связанные с направлениями, суммируются и должны точно прогнозироваться и выполняться, если нужно, чтобы процесс передачи был успешным. Движение к коммерциализации биотехнологической разработки состоит из серии последовательных этапов (рис. 1.3).
Исследовательское направление (2–10 лет) на практике зачастую бывает гораздо продолжительнее вследствие необходимости проведения испытаний новых материалов не только в системах in vitro, но и опытах над животными. Результатами этого этапа могут быть не только научные публикации
и диссертационные работы, но также и патенты.
Практика показывает, что если есть возможность реализовывать одновременно все пять направлений, то суммарное время, необходимое для успешного процесса передачи технологии, может составить 8–10 лет. Однако,
если приходится выполнять этапы последовательно, суммарное время почти
удваивается (до 14–16 лет). Часто это происходит потому, что затраты, связанные с патентной защитой и демонстрацией технологии, обычно значительно больше затрат на исследования. При переходе от уровня исследований к последующим (патентование, маркетинг, демонстрация опытных образцов) в процесс принятия решений вовлекаются новые уровни управления;
количество лиц, принимающих решения, увеличивается. Затраты на реализацию каждого последующего этапа возрастают, и при приближении к завершающим этапам процесса передачи технологии необходимые для этого объемы финансирования превосходят средства, которые выделяются университетами, фондами, мелкими компаниями. Критическим является переход от этапа 3 (маркетинговые исследования и оценка рынка) к этапу 4 (демонстрация
технологии). На этом этапе потребность в финансировании возрастает на
порядок. Помимо существенных финансовых затрат, переход на этот этап
требует дополнительного персонала, управления, мощностей.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
46
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий
Рис. 1.2. Продолжительность и последовательность этапов процесса передачи технологии

Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
47
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий
Как правило, средства, направленные на реализацию этапа демонстрации технологии, выделяются без завершения этапа маркетинга и бизнесисследования. В маркетинге и бизнес-анализе предпринимается попытка
прогноза соотношения затрат/доходов, необходимого капитала, размера рынка, времени выхода на рынок, процента проникновения на рынок, конкурентоспособности новой технологии, времени выполнения заказа по сравнению
с конкурентами и т.д. Университетская и академическая наука не имеют персонала и опыта для проведения такого анализа. Для этого требуется заключить лицензионное соглашение. Зачастую происходят задержки, потому
средства редко выделяются для запуска этапа 3 до тех пор, пока не будут выданы патенты (конечная точка этапа 2) и пока не будут подписаны лицензионные соглашения, но на это нужны время и деньги.
Этап 1
Проведение исследований
Этап 2
Патентование
Этап 3
Маркетинговые исследования
и оценка рынка
Этап 4
Демонстрация технологии
Этап 5
Организация производства
Рис. 1.3. Этапы, необходимые для проведения
полного цикла процесса передачи технологии
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
48
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий
Опыт реализации биологических технологий показывает, что чем современней новая технология, тем труднее бывает провести маркетинговые и
бизнес-оценки. Поэтому чем больше потенциал новой технологии, тем больше риск и дольше время, необходимое для принятия решение о том, что
нужна поддержка для выхода на этап демонстрации технологии и проведения
контроля качества продукта.
Переход от этапа 4 к этапу 5 (наращивание объемов от экспериментального уровня до уровня производства) требует еще более серьезных вложений средств и оценок рынка. При этом важно знание объема производственной базы, необходимой для достижения прогнозируемых небольших доходов. Тем не менее, при этом планируемая производительность производства должна быть сопоставимой с прогнозом продаж. Поэтому выделение прибыльных ниш на рынках в первые годы наращивания производства является
ключевым требованием прогнозирования соотношения прибыли/риска для
новой технологии. Большие корпорации обладают опытом и знаниями, для
того чтобы выполнить такие оценки, но их большие накладные расходы приводят к раздуванию доходности, необходимой для успешной работы предприятия. Маленькие компании, наоборот, имеют низкие накладные расходы,
но часто не обладают способностями точно оценить многочисленные факторы,
действующие при переходе к промышленному этапу производства продукта.
Среди факторов, позитивно влияющих на ускорение процесса передачи
технологии, можно выделить следующие:
– исследователи, отвечающие за создание технологии (этап 1) и патентование (этап 2), должны принимать участие в начальных этапах оценки
рынка (этап 3), а также демонстрации технологии (этап 4);
– переходы между этапами 1-2-3 должны быть быстрыми и эффективными;
– лицензионные соглашения должны быть гибкими, для того чтобы
обеспечивать быструю реализацию этапов 2, 3 и 4 одновременно, даже если
информация по проведению оценки рынка (этап 3) является неполной;
– этапы с конкретными сроками реализации должны быть согласованы
исследовательской командой, управленческой командой, командой маркетинга и разработки продукции, которые отвечают за этапы 3 и 4. Эти сроки
должны быть согласованы вместе с бюджетами, в которые необходимо заложить премиальные стимулы, для того чтобы обеспечить приложение усилий
по своевременному достижению целей;
– для реализации этапов 3 и 4 следует предусмотреть достаточный объем финансовых средств; которые должны предоставляться этапами, соответствующими этапам по выполнению каждого направления; при этом увязыва– это один из путей обеспечения того,
что капитал будет ориентирован на конечные результаты направлений, а не
на то, чтобы его тратили для продолжения исследований.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
49
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»
1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий
Не секрет, что одной из причин задержки процесса передачи технологии является продолжение выполнения исследований на этапе 1 при ограниченных ресурсах вместо перемещения программы на этапы 3 и 4. Это часто
происходит в университетах и академических учреждениях, где продвижение
по службе, поощрения зависят от публикаций, что является основным конечным результатом этапа 1.
Если же технология создается внутри крупной коммерческой компании или корпорации, обычно действует структура управления, принимающая
решения и бюджеты для этапов 2, 3, 4 и 5. Этапы и сроки часто навязываются
как часть требований к выполняемой работе участвующих команд. В отличие
от этого подхода, в условиях, когда технология создается внутри университета или государственной лаборатории, структура управления или бюджет для
этапов 3 и 4 отсутствуют. В этом случае принцип состоит, как правило, в заключении лицензионного соглашения с компанией. Каждый этап процесса
передачи технологии имеет разную степень риска, время и личные капиталовложения, связанные с ним.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
50
Г ЛА В А 2
СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ:
ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования
новых организмов для биотехнологии
Трансгенные, или генетически модифицированные, организмы (ГМО) –
это организмы, постоянный генетический материал которых был изменен методами генной инженерии. Эти методы широко известны, так же как технологии рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование. При использовании данных технологий молекулы ДНК из различных источников комбинируют в одну молекулу, образуя новый генный комплекс. Такая новая
молекула называется рекомбинантной ДНК. Внедрение различными методами рекомбинантной ДНК в живой организм превращает его в генетически
модифицированный. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной
частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему
новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические
свойства. Такая генетическая модификация, проводимая, как правило, в научных или хозяйственных целях для получения желаемых качеств изменяемого организма, отличается целенаправленным изменением генотипа организма, в отличие от случайных изменений, характерных для естественного и
искусственного мутагенеза.
Следует отметить, что, как в любой новой области науки, в молекулярной биотехнологии в настоящее время существует некоторая терминологическая неопределенность. Так, если внедрение рекомбинантной ДНК происходит в хромосому, такой организм, как правило, называют трансгенным. Организмы, несущие рекомбинантную ДНК на внехромосомных элементах, например плазмидах, определяются как рекомбинантные. В то же время некоторые авторы не проводят различий между трансгенными и рекомбинантными организмами, а многие просто используют более общий термин «генетически модифицированные организмы».
Возможность конструировать новые гибридные молекулы ДНК in vitro
возникла благодаря сделанным в середине XX в. открытиям, таким как установление комплементарной структуры ДНК, механизма ее репликации и репарации, расшифровка генетического кода, установление механизма переноса
генетической информации в клетке, механизмов работы и регуляция генов и др.
Одним из наиболее значительных открытий, которые позволили развить генно-инженерные технологии, было идентификация и выделение рестрикционных эндонуклеаз, осуществляющих сайт-специфическое расщепление ДНК.
До этого открытия не существовало воспроизводимого метода фрагментации ДНК.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
51
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Открытие ряда ферментов нуклеинового обмена: ДНК-лигазы, различные ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы (ревертазы), фосфатазы, полинуклеотидкиназы и другие – позволило получить инструменты для проведения различных манипуляций с фрагментами ДНК in vitro. Автоматический
синтез олигонуклеотидов – коротких одноцепочечных ДНК (~10–40 оснований),
используемых в основном как затравки (праймеры) для ДНК-полимераз, и
разработка метода полимеразной цепной реакции существенно упростили
все, сделав возможным клонирование и размножение молекул ДНК в пробирке. Другим важнейшим шагом для молекулярного клонирования было
развитие методов секвенирования – быстрого определения нуклеотидной последовательности.
Основы генной инженерии были заложены в 1972–1973 гг., когда
П. Берг (P. Berg) получил первые рекомбинантные ДНК, а С. Коэн (S. Cohen)
и Г. Бойер (H. Boyer) разработали стратегию переноса функционально активных
гибридных молекул ДНК в бактериальную клетку. Таким образом, был впервые осуществлен перенос функциональной единицы наследственности из одного организма в другой и перед человечеством возникли ошеломляющие
перспективы конструирования новых форм жизни с полезными функциями.
Однако одним из первых откликов научного мира на создание новой
технологии был запрет на некоторые биотехнологические эксперименты,
считавшиеся потенциально опасными. Преобладали опасения, что при конструировании рекомбинантных ДНК случайно возможно создание организма с
опасными свойствами. Группа видных ученых провела в 1975 г. знаменитую
Асиломарскую конференцию по рекомбинантным молекулам ДНК для того,
чтобы определить, как действовать безопасно. Впоследствии, с принятием
инструкций по обеспечению безопасности генно-инженерных работ, многие
ограничения были сняты, но до сих пор дискуссии о потенциальной опасности генетически модифицированных организмов остаются в центре внимания
общества.
Также возникает ряд тревожных вопросов о применении современных
технологий для создания биологического оружия. Например, сегодня ученые
способны синтезировать любые последовательности ДНК. Возникает вопрос:
смогут ли террористы воссоздавать вирусы, подобные оспе, или конструировать вирусы даже более смертоносные, чем птичий грипп и геморрагическая
лихорадка Эбола? Поэтому в настоящее время многие с пониманием относятся к необходимости надлежащего контроля исследований в области биотехнологий.
2.1.1. Рестриктазы и другие ферменты
для молекулярного клонирования
Инструментами в технологии рекомбинантных ДНК являются ферменты нуклеинового обмена и, прежде всего, эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). Конструирование рекомбинантных ДНК стало возможным только
после выделения высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
52
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи в определенном месте. Эти ферменты
называются эндонуклеазами рестрикции (рестриктазы) II типа. Существует
всего три типа эндонуклеаз рестрикции, но другие два не нашли широкого
применения, поскольку не обладают необходимой специфичностью при расщеплении ДНК.
В природе рестриктазы являются компонентом системы рестрикциимодификации (Р-М-системы), которая служит защитным механизмом от чужеродной ДНК у микроорганизмов, например при вирусной (фаговой) инфекции. В Р-М-систему входят два фермента, специфичных для каждого
штамма, – ДНК модифицирующий (метилтрансфераза, или метилаза) и ДНК
расщепляющий (эндонуклеаза рестрикции), иногда обе эти функции объединены в одном белке. Эти два фермента способны специфически связываться
с одной и той же последовательностью ДНК длиной 4–8 пар оснований, называемой сайтом узнавания и характерной для каждого конкретного микроорганизма. При этом метилтрансфераза, метилируя определенный нуклеотид
в пределах сайта узнавания, защищает внутриклеточную ДНК от действия
рестриктазы. В свою очередь, рестриктаза расщепляет фосфодиэфирные связи двухцепочечной ДНК в определенном месте участка узнавания или рядом
с ним при отсутствии специфической модификации.
В настоящее время охарактеризована субстратная специфичность около 3,5 тыс. рестриктаз, из них имеется 238 (прототипы), узнающих уникальные нуклеотидные последовательности. Рестриктазы, узнающие одинаковые
участки ДНК, составляют группу изошизомеров и могут отличаться по свойствам, в том числе по-разному расщеплять двухцепочечную ДНК. Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющиеся палиндромами – обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями нуклеотидов в направлении 5'–>3' на комплементарных цепях ДНК, рис. 2.1).
Рис. 2.1. Нуклеотидная последовательность, содержащая сайты расщепления
для различных рестриктаз до и после обработки рестриктазами. Для рестриктазы Sfi I последовательность из 5 нуклеотидных пар между узнаваемыми фрагментами может быть любой, но расщепляется всегда одинаково с образованием
5'-выступающих концов
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
53
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Различные рестриктазы образуют различную форму концов при расщеплении ДНК, которые могут быть 5'-выступающими одноцепочечными
(рис. 2.1, EcoR I, Sfi I), 3'-выступающими (Pst I) или полностью двухцепочечными – «тупыми» (Sma I). Выступающие одноцепочечные концы, если они
комплементарны, получили название «липких», поскольку такие концы могут гибридизоваться. Молекулы ДНК из разных источников, обработанные
одной и той же рестриктазой, расщепляющей палиндромные последовательности (например, EcoR I и Pst I), будут иметь одинаковые гибридизующиеся
между собой липкие концы. Наличие липких концов у фрагментов ДНК существенно облегчает их ковалентное сшивание специальным ферментом
ДНК-лигазой (см. схему на рис. 2.3), который формирует фосфодиэфирную
связь между соседними нуклеотидами через 5'-фосфатную и 3'-гидроксильную
группы. Сам процесс называется лигированием. ДНК-лигаза в живой клетке
выполняет ту же функцию – сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся
при репликации.
Кроме молекулярного клонирования и физического картирования молекул ДНК (для создания рестрикционных карт ДНК), эндонуклеазы рестрикции также широко применяются в медицинской генодиагностике для выявления различных мутаций и в генетических популяционных исследованиях.
Другими группами ферментов, используемых при конструировании рекомбинантных ДНК, являются ферменты матричного синтеза – ДНК- и
РНК-зависимые ДНК-полимеразы и ферменты, позволяющие осуществить
нужные изменения структуры концов ДНК-фрагментов: полинуклеотидкиназы, фосфатазы, нуклеазы и другие ферменты для различных манипуляций с
фрагментами ДНК.
2.1.2. Полимеразная цепная реакция
Появление метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1983 г. существенно продвинуло, ускорило и удешевило молекулярное клонирование,
сделав возможным быстрый синтез (амплификацию) прямо в пробирке нужных последовательностей из считанных исходных копий. Впоследствии за
изобретение ПЦР американский ученый К. Мюллис (K. Mullis) получил Нобелевскую премию.
ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся
стадий реакции (15–30 циклов по 1–3 мин):
1) тепловая денатурация исходной ДНК при ~94 °С;
2) отжиг ДНК-затравок (праймеров) при ~50–60 °С на получившиеся
одноцепочечные матрицы;
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
54
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
3) синтез двухцепочечных ДНК при 72 °С с каждым из праймеров навстречу друг другу по противоположным цепям ДНК (рис. 2.2).
Реакцию проводят в специальном приборе – термоциклере, или амплификаторе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок. По завершении каждого цикла количество синтезированного продукта
удваивается и происходит увеличение количества исходных копий ДНК в
геометрической прогрессии. В качестве праймеров используются короткие
(15–25 нуклеотидных оснований) одноцепочечные ДНК – олигонуклеотиды,
комплементарные концам целевого фрагмента ДНК. Важнейшим компонентом ПЦР являются термостабильные ДНК-полимеразы, способные сохранять
активность на протяжении всей реакции ПЦР, несмотря на воздействие высоких температур на стадии тепловой денатурации ДНК. В настоящее время
имеется широкий спектр коммерческих полимераз с разнообразными свойствами, но пока наиболее используемой остается Taq-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus с оптимумом активности при 72 °С и ее
смеси с другими ДНК-полимеразами.
В настоящее время ПЦР широко используется в научных и диагностических лабораториях во многих областях. Кроме простого удвоения последовательностей ДНК, метод ПЦР позволяет производить множество других
манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание
фрагментов ДНК), клонирование любых последовательностей в пробирке,
выделение новых генов, секвенирование. Также ПЦР широко используется в
биологической и медицинской практике, в первую очередь, для диагностики
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
55
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Рис. 2.2. Три цикла полимеразной цепной реакции, или амплификации ДНК.
Серым цветом в исходной ДНК выделен целевой фрагмент для синтеза, который
в процессе реакции ограничивается праймерами. В идеальных условиях реакции количество целевого фрагмента удваивается каждый цикл (2n), количество исходных цепей увеличивается на две каждый цикл (n + 2, где n – количество циклов)
заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства,
степени родства, популяционных исследований, в криминалистике – везде,
где нужно установить уникальную последовательность ДНК, опираясь на
минимальное количество исходного ДНК-содержащего материала.
2.1.3. Общая схема молекулярного клонирования
Технологии рекомбинантных ДНК – это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает
работать. Не существует единого универсального набора методик, все зависит от конкретной задачи, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной
ДНК проводят по следующей схеме (рис. 2.3).
1. Получение нужной последовательности – ДНК для клонирования
может быть получена химико-ферментативным синтезом, обратной транскрипцией мРНК и путем непосредственного расщепления геномной ДНК
нужной рестрикционной эндонуклеазой. Но самый распространенный путь
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
56
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
сейчас – синтез ДНК методом ПЦР. В настоящее время, когда секвенирование целых геномов различных организмов идет быстрыми темпами, сложно
найти совсем неизвестный ген. Даже для млекопитающих, включая человека,
секвенированы уже 25 геномов (по публичной базе данных NCBI Genome на
август 2008 г.), из них 9 собраны полностью с установлением генной структуры. И это не считая расшифрованных геномов менее сложных организмов.
Учитывая генетическое родство всех живых организмов на Земле, самая распространенная ситуация в настоящее время – когда целевая последовательность для предполагаемого клонирования известна, хотя бы частично.
После выбора и синтеза праймеров к известной последовательности, ДНК
можно амплифицировать методом ПЦР с использованием в том числе и вырожденных праймеров (с неполной комплементацией). В качестве матрицы
для синтеза используют геномную ДНК или матричную РНК, в этом случае
первым шагом в синтезе целевой последовательности будет синтез комплементарной ДНК (кДНК) обратной транскриптазой (ревертазой – РТ), затем
обычная ПЦР. Иногда эти реакции объединяют в одну РТ-ПЦР (RT-PCR).
Как правило, в концы ПЦР-праймеров вводят сайты рестриктаз для удобства
дпльнейшего клонирования синтезированной последовательности (рис. 2.3).
Рис. 2.3. Общая схема молекулярного клонирования на примере
трансформации бактерий или дрожжей рекомбинантным плазмидным вектором
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
57
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Нужную последовательность ДНК также можно получить химикоферментативным синтезом, при этом производят сборку полноразмерного
гена из отдельных синтетических олигонуклеотидов различными способами.
Химический синтез гена осуществляют, как правило, когда организм-донор
ДНК не доступен или когда нуклеотидная последовательность природного
гена может плохо транслироваться в выбранном организме-рецепиенте
вследствие несовпадения частоты использования кодонов, а также по другим
причинам. Химико-ферментативный синтез гена можно заказать в ряде биотехнологических фирм, в том числе и в России.
2. После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК». Вектор для
клонирования – общий термин, обозначающий молекулу ДНК, способную к
включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, служит инструментом для введения генетической информации в клетку. То есть является
молекулой-носителем, подобно космической ракете-носителю, для клонируемой ДНК.
3. Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень
(рецепиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией (в основном для прокариот и дрожжей) и трансфекцией (в случае эукариот). В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо
встроиться в хромосому клетки-хозяина.
4. Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. Например, высевают трансформированные клетки на селективную среду с антибиотиком, ген устойчивости к которому несет использованный вектор – расти будут только колонии (клоны) рекомбинантных клеток.
5. Получают специфический белковый продукт, синтезированный
клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого
гена.
2.1.4. основные типы клонирующих векторов
Как клонирующие векторы в генной инженерии используются плазмиды, вирусы и искусственные хромосомы. Самыми первыми векторами стали
бактериальные плазмиды – внехромосомные автономно реплицирующиеся
кольцевые молекулы ДНК. Следом для молекулярного клонирования стали
использовать вирусы (фаги), которые в природе также могут захватывать и
передавать ДНК от клетки к следующей клетке (трансдукция ДНК). Появились различного ряда гибридные векторы, например гибриды фагов с плазмидами – фагмиды (phagemid). Для клонирования больших фрагментов ДНК
были сконструированы искусственные хромосомы.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
58
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
С развитием знаний о генетических элементах и совершенствованием
методов генной инженерии новые векторы под конкретные задачи начали
собирать из отдельных блоков – различных хорошо охарактеризованных генетических элементов (см рис. 2.6). В настоящее время имеется огромное количество коммерчески доступных разнообразных синтетических векторов,
сконструированных практически под любые задачи.
Различные типы клонирующих векторов обладают разным лимитом на
размер вставок чужеродной ДНК. Основные типы современных векторов
рассмотрены ниже.
Плазмидные векторы – кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК,
имеющие клонирующий лимит до ~10 тнп (тысяч пар нуклеотидов). Плазмиды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до ~10
видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции.
Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей –
три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как
молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например,
устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать
определенные вещества. В одной клетке могут сосуществовать только плазмиды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида
содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которого определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться
только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры
плазмид варьируют приблизительно от ~1 до 500 тпн. Каждая плазмида имеет постоянную определенную копийность в клетке – количество молекул на
клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных
векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды является небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательностью можно проводить любые манипуляции. Схема типичного плазмидного
вектора рассмотрена более подробно п. 2.1.5 (см. рис. 2.7).
Основным недостатком плазмидных векторов является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным временем репликации.
Вирусные векторы. Рассмотрим основные из них.
Бактериофаг лямбда имеет линейную молекулу ДНК с 48,5 тпн. Емкость клонирующих векторов была существенно повышена с разработкой
векторов на основе фага лямбда. Центральную треть вирусного генома можно заменить чужеродной ДНК без нарушения жизненного цикла фага, клонирующий лимит от 8 до 24 тпн, что составляет половину генома лямбды дикого типа (рис. 2.4). Механизм упаковки бактериофага в зрелые вирионы основан на включении ДНК строго определенного размера, что стабилизирует
ДНК-вставки и позволяет легко освобождаться от нерекомбинантных молекул. Упаковку сконструированных in vitro молекул на основе фага лямбда
производят в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов Е. coli, лизогенных по бактериофагам с разными дефектами. Объединение бесклеточных ли Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
59
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
затов обоих штаммов Е. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций с помощью соответствующих белков дикого типа. Векторы
на основе фага лямбда являются одними из самых распространенных для
создания библиотек генов.
а
б
в
Рис. 2.4. Фаг лямбда под электронным микроскопом (а), схема его строения (б) и
упрощенная генетическая карта (в). Выделенный серым цветом участок соответствует
генам, несущественным для литического пути развития фага (гены, обеспечивающие
существование в виде профага), вместо которых может быть встроена чужеродная ДНК
Космиды – кольцевые молекулы ДНК, объединяющие свойства фага и
плазмиды, содержат ориджин репликации и cos-сайты фага лямбда. Сконструированы для клонирования больших фрагментов ДНК в 35–50 тпн. Для
упаковки ДНК в фаговую головку вирусный аппарат фага лямбда требует
только наличия cos-сайтов на расстоянии 36–51 тпн. Гибридные молекулы
космиды с большими вставками в 35–50 тпн между cos-сайтами упаковываются in vitro в виде инфекционных вирионов при использовании экстрактов
фагов дикого типа. Естественно, такие фаговые частицы нежизнеспособны,
после инфекции космиды существуют в бактериальной клетке как плазмиды.
Нитевидные бактериофаги – М13 (рис. 2.5), fd, f1 бактерии E. coli.
Представляют собой одноцепочечную кольцевую ДНК, упакованную в белковую трубочку из одинаковых белковых субъединиц, двухцепочечная репликативная форма похожа на плазмиду. Вставки чужеродной ДНК до 1 тпн
очень стабильны. Наиболее широко ранее использовались векторы на основе фага М13. До появления метода ПЦР, который позволяет секвенировать сразу
двухцепочечные молекулы ДНК, одноцепочечные матрицы для секвенирования получали клонированием в М13-вектор. В настоящее время клонирование в векторы на основе М13 и fd преимущественно используют в методе фагового дисплея (получение и анализ пептидных библиотек для различных целей, например, для исследования белок-белковых, белок-пептидных, белокДНК взаимодействий, для эволюции белков in vitro, получения иммунологических реагентов нового поколения и др.). При этом чужеродную ДНК
встраивают в гены белков вирусной оболочки, затем клонированные последовательности выявляются на поверхности вирусных частиц в виде гибридных белков (фьюжин-белков).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
60
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
а
б
Рис. 2.5. Нитевидный бактериофаг М13 под электронным микроскопом (а) и упрощенная схема его строения. На геномной карте (б) затемненные области отмечают несущественные для жизнеспособности вируса участки, куда возможна вставка чужеродной ДНК. Удлинение генома рекомбинантного фага при инсерции чужеродной
ДНК приводит к образованию более длинных нитей вирионов, чем у фага дикого типа
Бакуловирусы – большая и разнообразная группа вирусов. Поражают
насекомых и других членистоногих, но абсолютно безвредны для позвоночных. Геном представлен кольцевой двухцепочечной ДНК, варьирующей в
размере от 80 до 180 тпн. Замена несущественной для репликации части вирусного генома позволяет клонировать чужеродную ДНК до 15 тпн. Внедрение чужеродной ДНК происходит путем гомологичной рекомбинации (двойной кроссинговер) бакуловируса с небольшим плазмидным транспортным
вектором, содержащим клонированный ген. Данная система экспрессии позволяет осуществлять большинство посттрансляционных модификаций (гликозилирование, ацилирование, протеолитическое расщепление и др.), недоступных в прокариотической системе. В настоящее время векторы на основе
бакуловирусов широко используются для продукции различных эукариотичеких белков в клетках насекомых. Также бакуловирусы применяются как
биологические инсектициды.
Для клеток высших эукариот эффективные векторы созданы на основе
хромосомной ДНК ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса осповакцины, вируса герпеса и др. Ретровирусные векторы используются особенно часто для переноса генов в клетки животных. Необходимо отметить, что при использовании вирусов в качестве
векторов для животных клеток никогда не сохраняется нативный вирус – используются лишь некоторые регуляторные последовательности вируса для
конструирования вектора.
Особенности молекулярной организации векторов для доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки рассмотрены в п. 2.3.1.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
61
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Искусственные хромосомы. Разработка векторов типа искусственных
хромосом началась для решения задачи клонирования и стабильного наследования больших фрагментов ДНК, например, для физического картирования
генома в проектах расшифровки геномов, для стабильной экспрессии обширных генных комплексов в трансгенных клетках, для внедрения таких комплексов и отдельных генов в клетку-мишень без нарушения ее хромосомных
структур и т.д.
Бактериальные искусственные хромосомы (bacterial artificial chromosomes – BAC) сконструированы на основе полового фактора F E. coli со строгим контролем репликации. Его генетическая система обеспечивает правильное распределение фактора F между делящимися клетками и поддерживает
его копийность в 1-2 молекулы на клетку. BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК в 75–300 тпн.
Дрожжевые искусственные хромосомы (yeast artificial chromosomes –
YAC) – линейная ДНК, которая имеет все необходимое для репликации в
дрожжах: теломеры, несколько сайтов инициации репликации (репликонов),
дрожжевую центромеру (рис. 2.6). Также дополнительно содержит селективный маркер для идентификации и поддержания популяции рекомбинантных
клеток. Клонирующий лимит – 100–1 000 тпн. Бактериальные и дрожжевые
искусственные хромосомы применяют для создания геномных библиотек.
Причем, структурная стабильность протяженных вставок ДНК в BAC-системе
существенно выше, чем в YAC-системе, чем обусловлено широкое использование BAC-системы при физическом картировании генома человека, по которому затем собиралась его полная последовательность.
Рис. 2.6. Основные элементы конструкции дрожжевой искусственной хромосомы
Дальнейшее развитие этого направления привело к созданию векторов
на базе искусственных хромосом млекопитающих (mammalian artificial chromosomes – MAC). Благодаря наличию основных структурных элементов
обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные
регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в
нужной ткани и в должное время.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
62
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
2.1.5. Общая схема вектора на примере
бактериальной экспрессионной плазмиды
Определяющим в выборе вектора для молекулярного клонирования является поставленная цель и предполагаемый организм-хозяин. Даже если в
качестве окончательного хозяина рекомбинантной ДНК планируется совсем
другой организм, генетические конструкции собирают, мутируют и нарабатывают, как правило, в E.coli с использованием специализированных бактериальных векторов, затем субклонируют в вектор для окончательного хозяина.
Иногда удобно использовать челночный, или шаттл-вектор (shuttle vector), с
двумя сайтами инициации (ориджинами) репликации, способный реплицироваться в обоих хозяевах, ориджины которых он содержит. Несмотря на все
имеющееся разнообразие векторов, большинство укладывается в общую
схему бактериального клонирующего вектора (рис. 2.7). Вектор, содержащий
необходимые элементы для трансляции клонируемой ДНК (экспрессионная
кассета с сигналами транскрипции и трансляции, часто репрессор промотора),
называется экспрессионным.
Типичный экспрессионный бактериальный вектор обычно содержит
следующие элементы.
1. Сайт инициации репликации (ориджин) – необходимый элемент,
то, что делает молекулу ДНК вектором и определяет его хозяйскую специфичность. Структура ориджина репликации обуславливает копийность вектора – количество молекул на клетку (1–4 для низкокопийных, 15–20 для
обычных и 150–200 и более для высокопийных векторов), а также его совместимость с другими векторами. В одной клетке могут сосуществовать
только вектора с ориджинами репликации из разных групп совместимости.
Включение в вектор ориджина репликации одноцепочечного фага f1 позволяет получить всю конструкцию в виде одной цепи ДНК, например, для мутагенеза.
2. Селективный ген, предназначенный для отличия содержащих рекомбинантную конструкцию клеток (трансформированных) от исходных.
Чаще всего используют гены устойчивости к различным антибиотикам, например, популярен ген -βлактамазы, придающий устойчивость к ампициллину.
3. Множественный клонирующий сайт (МКС, MCS), состоящий из
близкорасположенных уникальных сайтов нескольких эндонуклеаз рестрикции (единственных в данном векторе) для удобства соединения с клонируемой. Иногда его называют полилинкер. В экспрессионную кассету ген вставляется с сохранением имеющейся рамки считывания или с собственным
стартовым кодоном (AUG) на определенном расстоянии от рибосомсвязывающего сайта (RBS).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
63
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Рис. 2.7. Общая схема типичного экспрессионного бактериального вектора.
Экспрессионная кассета изображена в увеличенном масштабе. МКС – множественный клонирующий сайт, RBS (ribosome binding site) или последовательность
Шайн-Дальгарно (SD) – сайт связывания рибосом, обеспечивает связывание
прокариотической рибосомы за счет комплементарности 3'-концевой части 16S
рибосомальной рРНК с матричной мРНК
4. Сигнальные и регуляторные элементы экспрессии (транскрипции с
последующим синтезом белка), хорошо работающие в клетке-мишени и необходимые для экспрессии клонированного гена. Прокариотические и эукариотические сигнальные и регуляторные элементы сильно различаются, но
среди прокариотических, так же как и среди эукариотических, существуют
универсальные элементы, хорошо работающие в широком круге хозяев, и
специфические, работающие только в конкретной клетке.
Составной частью любого экспрессионного вектора является экспрессионная кассета (рис. 2.7), которая включает все необходимые сигнальные и
регуляторные элементы, позиционированные относительно клонируемого в
МКС гена. Для бактерий это промотор, обычно строго регулируемый, регуляторные элементов транскрипции и трансляции (в том числе энхансеры и
структуры, стабилизирующие мРНК), сайт связывания рибосом, терминаторы трансляции и транскрипции. Использование сильных промоторов и регуляторных элементов позволяет достигать высоких уровней экспрессии целевого продукта. Для E. coli традиционно популярны лактозный lac и триптофановый trp промоторы и их гибрид tac. Одни из самых сильных промоторов, терминаторов и других регуляторных элементов – вирусные – широко
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
64
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
используются для конструирования векторов. Например, в экспрессионных
векторах для E. coli серии pET (Novagen) использованы регуляторные элементы фага Т7, для конструирования серии pQE (Qiagen) – элементы фага T5.
В настоящее время имеется широкий спектр хорошо охарактеризованных
сигнальных и регуляторных элементов, из которых конструируют экспрессионные вектора, и список этот регулярно пополняется.
5. Ген-репрессор транскрипции с векторного индуцибельного промотора, часто вводимый в состав векторов для более сильного ингибирования
синтеза целевого белка в отсутствие индукции. Особенно это актуально при
клонировании токсичных для клетки-хозяина белков. Наличие в составе вектора гена-репрессора транскрипции позволяет строже регулировать синтез
клонированной ДНК и не зависеть от клеточной регуляторной системы.
6. Дополнительные фрагменты для экспрессии целевого гена в виде
фьюжинов. В состав экспрессионной кассеты часто вводят различные эпитопы,
при этом целевой белок синтезируется в виде N- или C-концевого фьюжина
(гибридного белка). Цели могут быть различными – повышение уровня экспрессии целевого белка, его стабильности, улучшение его растворимости и
сворачиваемости в нативную конформацию и другие, но чаще всего такие
эпитопы (таги) вводят для аффинной очистки синтезируемого белка. Например, наличие полигистидиновой последовательности (His-tag) из 6 или 10
аминокислотных остатков позволяет проводить очистку рекомбинантного
белка аффинной хроматографией с использованием иммобилизованных на
твердом носителе ионов металлов (Co2+, Ni2+), фрагмент глутатион-Sтрансферазы может быть использован для очистки на смоле, содержащей
связанный глутатион. Как правило, присоединяют такие белковые фрагменты
через последовательности, содержащие сайты расщепления специфических
протеаз. В этом случае после очистки рекомбинантного белка лишние последовательности можно удалить протеазной обработкой.
7. Редкие кодоны в составе чужеродного гена, приводящие к снижению
скорости его трансляции. Только аминокислота триптофан кодируется всего
одним кодоном (UGG), остальные аминокислоты, из которых состоят белки, –
по крайней мере, двумя, чаще четырьмя, а иногда и шестью кодонами (лейцин, серин, аргинин). При этом живые организмы используют синонимичные
си-кодоны для кодирования белков статистически не пропорционально. Из
четырех кодонов для глицина GGA используется в структурных генах человека в 26 % случаев, а в Escherichia coli – в 9 %. Такая же ситуация наблюдается и для стоп-кодонов. Так, у человека частота использования кодонов
UAA, UAG и UGA составляет 0,22, 0,17 и 0,61 соответственно, а у E. coli —
0,62, 0,09 и 0,30. Для каждого типа организмов существует своя предпочтительная частота использования кодонов (codon usage) и, соответственно,
свой концентрационный набор изоакцепторных транспортных тРНК.
Таким образом, при гетерологичной экспрессии плохая трансляция целевого гена, имеющего в своем составе редкие для клетки-мишени кодоны,
может происходить вследствие низкой внутриклеточной концентрации
тРНК, узнающей такие кодоны. Проблему можно решить химико Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
65
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
ферментативным синтезом целевого гена с соответствующей организмурецепиенту частотой использования кодонов (оптимизация гена). В случае
экспрессии в E. coli сконструированы специальные экспрессионные штаммы,
компенсирующие использование редких кодонов введением дополнительных
генов для дефицитных тРНК. Например, популярная серия штаммов E. coli
BL21-CodonPlus (ее вариант RIL) содержит дополнительные копии генов,
дефицитных для E. coli тРНК, узнающих аргининовые кодоны AGA и AGG,
изолейциновый кодон AUA и лейциновый кодон CUA, для эффективной
трансляции генов из организмов, имеющих АТ-богатые геномы.
2.1.6. Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку
В настоящее время известно около 40 различных способов доставки
рекомбинантной ДНК в клетки, по-разному решающих проблему преодоления плазматической мембраны. Пока не существует единой классификации
методов доставки рекомбинантной ДНК в клетки. Каждый автор обзоров
классифицирует по-своему, возможно, потому, что для многих эмпирически
найденных методов механизм преодоления мембраны не ясен до сих пор, например для трансформации. С терминологией также существует неопределенность, что неудивительно для бурно развивающейся новой области науки
и практики.
Каждый из методов доставки чужеродной ДНК в клетки имеет свои
особенности, преимущества и недостатки в отношении выживаемости клеток, эффективности введения, универсальности, возможностей технического
осуществления. Выбор метода зависит от типа клеток-хозяев и типа использованного вектора, а также от личных предпочтений и возможностей экспериментатора. Ниже подробно рассмотрены некоторые наиболее известные
способы доставки ДНК в клетки-мишени.
Трансформация в самом общем значении – это процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс поглощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурным
фазовым переходом клеточной мембраны. E. coli является самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить внедрение в клетки плазмидной ДНК, клетки выдерживают с ледяным
раствором СаС12 и ДНК, а затем подвергают тепловому шоку при 42 °С в течение ~1 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК,
при этом составляет примерно 105–107. Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются трансформированными,
но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих
быстро идентифицировать нужные клоны.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
66
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Доля этих клеток в популяции обычно очень мала, но ее можно
повысить, используя специальную питательную среду, условия культивирования и химические индукторы компетентности (подобранные, как правило,
эмпирически). Часто используемый этап подготовки компетентных клеток
получение сферопластов – клеток, частично или полностью (протопласты)
лишенных наружной ригидной клеточной стенки. Например, только таким
способом была осуществлена эффективная трансформация многих грамположительных бактерий родов Bacillus, Listeria, Streptommyces и др. Некоторые методики трансформации дрожжей также включают стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз. Для
организмов, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не
обладающих природной компетентностью, применяются другие системы
доставки ДНК.
Конъюгация. Существуют бактериальные плазмиды (конъюгативные
плазмиды), обладающие способностью создавать межклеточные контакты,
через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и рецепиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК – мобилизационными. При
этом конъюгативная плазмида может увлекать за собой обычный плазмидный вектор, находящийся в той же клетке. Таким образом можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. Например, показан мобилизационный перенос челночного
вектора pAT187 с широким кругом хозяев из E. coli в различные грамположительные бактерии (родов Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus и др.), хотя
и с намного меньшей эффективностью, чем для переноса между разными
штаммами E. coli. Более того, недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных. В процессе конъюгации переносится только одна
цепь донорской плазмиды, на которой затем синтезируется вторая цепь. Это
приводит к тому, что конъюгативно передаваемая плазмида не подвергается
атаке хозяйских рестриктаз. Эффективность этого метода для бактерий сопоставима с трансформацией.
Вирусная инфекция. Для внедрения векторов на основе вирусов широко используется природный инфекционный путь заражения клетки-хозяина,
который зависит от типа вируса.
Перфорационные методы. Одним из популярных методов введения
нуклеиновых кислот в клетки-мишени является электропорация – временное
создание пор в бислойной липидной мембране под кратким воздействием
электрического поля. Является универсальным физическим методом трансформации, методика которого разработана практически для всех типов клеток. При работе с E. coli подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и
ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока длительностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами
составляет 1 мм. После такой обработки эффективность трансформации по Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
67
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
вышается до 109–1011 для малых плазмид (~3–6 тпн) и до 106 для больших
(~135 тпн). Аналогичные условия используют для введения в Е. coli вектора
ВАС. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную
липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому
мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно
большей напряженности (12–18 кВ/см), чем крупные животные и растительные
клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см.
Электропорация – наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального прибора электропоратора.
Другие перфорационные методы доставки ДНК в клетку: обработка
клеток ультразвуком, соскабливание клеток с субстрата в присутствии экзогенного материала, центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с
электропорацией, осмотическая перфорация плазматической мембраны, пробой клетки лазерным микролучом, использование порообразующего токсина
стрептолизина-O.
Трансфекция. Первоначально этот термин обозначал введение в клетки вирусной ДНК, сейчас его значение расширилось до обозначения введения любой чужеродной ДНК в клетки эукариот. Термин «трансформация»,
обозначающий процесс введения ДНК в клетку для прокариот и дрожжей,
оказалось, использовать неудобно, поскольку применительно к животным
клеткам трансформация – это превращение нормальных клеток в раковые. В
узком смысле под трансфекцией в основном понимают введение ДНК в эукариотические клетки с помощью различных химических реагентов.
Одним из первых разработанных методов эффективной трансфекции
была инкубация ДНК с ДЕАЕ-декстраном. Полученная эффективность была
сопоставима с трансформацией бактерий и достигала 106 трансфектантов на
мкг ДНК. Механизм действия ДЕАЕ-декстрана окончательно не установлен,
но известно, что он связывается с ДНК и с клеточной мембраной, стимулируя
пиноцитоз (рис. 2.8), хотя сам клетками не захватывается. К недостаткам метода стоит отнести токсичность ДЕАЕ-декстрана для некоторых типов клеток, зависимость эффективности от качества препарата, очень малую частоту
получения стабильных трансфектантов.
Эффективность трансфекции удалось повысить в 10–100 раз инкубацией клеток с осажденной фосфатом кальция ДНК. Плотные частицы кальциевого преципитата ДНК поглощаются клеткой путем фагоцитоза (рис. 2.8), но
при этом только небольшая часть проникших молекул достигает ядра и
встраивается в хромосомную ДНК. Кальций-фосфатный метод более эффективен и дешев, но вызывает разрыв молекул ДНК, что переводит кольцевые молекулы в линейную форму, иногда неинфекционную в случае трансфекции вирусов. Кроме того, условия кальций-фосфатной трансфекции приходится подбирать для каждых клеток-мишеней индивидуально.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
68
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
а
б
Рис. 2.8. Схема введения ДНК в составе различных комплексов в
клетку путем эндоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза (а). Схематичное
изображение частицы из нелипидного поликатиона в дендроформе
со связавшейся ДНК, отрицательный заряд которой компенсируется
катионным полимером (б)
В ходе поисков других трансфецирующих реагентов было выявлено,
что полимерные молекулы, несущие избыточный катионный заряд, могут
существенно повысить эффективность трансфекции. Полимерные катионы
образуют с нуклеиновыми кислотами устойчивые комплексы с нейтрализованными зарядами, которые могут с высокой эффективностью транспортировать ДНК и РНК внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз на пути к
ядру (рис. 2.9). Синтетические нелипидные полимерные катионы в линейной
или разветвленной конформации (дендритная форма) могут конденсировать
ДНК и РНК в относительно малые частицы, которые затем связываются с
клеточной мембраной и проникают в клетку путем неспецифического эндоцитоза. В настоящее время для трансфекции из группы нелипидных поликатионов используются в основном полиэтиленимин, полиамидоамины и дендримеры на их основе, катионные белки типа полилизина, протамина и гистонов, а также различные коммерческие продукты, например PAMAM.
Революцией явилось введение в практику первого низкотоксичного
катионного липида ДОТМА (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан),
синтезированного Фелгнером (Felgner, 1987) с соавторами. Эффективность
трансфекции с использованием катионного липида (рис. 2.10) была приблизительно в 100 раз больше относительно любого другого химического реагента, причем с большой долей стабильных трансгенных клеток. Одновременно был введен в практику новый термин «липофекция», подчеркивающий
высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липид-катионные комплексы к инфекционным вирусным частицам.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
69
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
Рис. 2.9. Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплекса поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем
лиганд-опосредованного эндоцитоза
Рис. 2.10. Структура комплекса с ДНК (а) и общая структура катионного липидного полимера (б). Катионные липидные полимеры (линейные и разветвленные), похожие по своей структуре и свойствам на клеточные мембранные
фосфолипиды формируют комплексы с ДНК в виде многослойных катионных
липосом (а) при простом смешивании реагентов. Такие комплексы проникают в
клетку путем эндоцитоза или слияния с клеточной мембраной через липидную часть
Развивая успех, были разработаны многочисленные вариации этих соединений (липофектин, липофектамин, селлфектин и др.).
Параллельно разрабатывались средства доставки на основе фосфолипидных липосом, начиненных ДНК или РНК. Маленькие сферы из искусственных мембран могут сливаться с плазматическими мембранами клеток или
поглощаться эндоцитозом, высвобождая содержимое внутрь клетки. Небольшую эффективность липосомной трансфекции повысило введение в
структуру липосом фосфолипидов, например, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина, образующих наряду с бислойными мембранами также инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы, способные инициировать слияние мембран. Липосомный метод
достаточно капризен и требует тщательного подбора всех условий для эф-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
70
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
фективной трансфекции конкретных клеток. Кроме того, процедура инкапсулирования, обычно обработка ультразвуком, часто повреждает крупные молекулы ДНК.
Новым этапом в развитии трансфекционных реагентов стала разработка более эффективной и адресной доставки в специфические клетки-мишени
нуклеиновых кислот путем введения в структуру синтетических трансфекционных реагентов и липосом различных лигандов для связывания с мембранными белками-рецепторами. Наличие таких адресных групп (лигандов), узнаваемых клеточными рецепторами, позволяет использовать механизмы лиганд-опосредованного эндоцитоза (см. рис. 2.9). В качестве таких лигандов
используют белки и пептиды, узнаваемые рецепторами; олигосахариды, поскольку на поверхности многих животных клеток присутствуют лектины –
белки-рецепторы, специфически их связывающие; полисахариды. Процессы
взаимодействия с клетками таких адресных комплексов ДНК(РНК)трансфекционный реагент имеют сходство с проникновением в клетку вирусных частиц.
В настоящее время биотехнологические фирмы предлагают широкий
спектр разнообразных трансфекционных реагентов – от самых простых и
дешевых до самых последних разработок, специализированных под разные
типы клеток и задачи. Также интенсивно продолжается создание новых еще
более эффективных трансфецирующих реагентов.
Микроинъекция – клеточная мембрана прокалывается микроиглой и
раствор, содержащий ДНК, вводится в цитоплазму клетки или напрямую в
ядро, если ядро достаточно большое (например, ядро яйцеклетки). Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0,1–0,5 мк и микроманипулятора. Метод очень эффективен, доля клеток со стабильной интеграцией и
экспрессией инъецированных генов может достигать 50 %. Преимущество
описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить
любую ДНК в любые клетки и для сохранения в клетках введенного гена не
требуется никакого селективного давления.
Баллистическая трансфекция, биобаллистика, или биолистика
(бомбардировка микрочастицами), основана на обстреле клеток микросферами размером около 1-2 мкм, покрытых ДНК. Применяются микрочастицы
золота, вольфрама (иногда бывает фитотоксичен), силикона и различные
синтетические наносферы. Микрочастицы, покрытые ДНК, проходят через
клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в
органеллы и ядра клеток. Созданный для этой цели «генный пистолет» (gene
gun), или «генная пушка», который был разработан Д. Сенфордом (J. Sanford)
в 1987 г. для введения ДНК в зерна хлебных злаков, по своему устройству
сходен с пневматическим оружием (рис. 2.11).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
71
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
а
б
Рис. 2.11. Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразового «генного пистолета» фирмы Bio-Rad (а) и его общая схема (б). Гелиевый импульс
выбрасывает микрочастицы, покрытые ДНК или РНК, из капсулы с образцом. Микрочастицы, несущие ДНК, ускоряются и фокусируются для максимального проникновения в клетки, продвигаясь по разгоночному каналу и по стволу пистолета, при этом на
широком выходе поток гелия диффузно расходится в стороны. Фильтр-спейсер поддерживает оптимальную дистанцию для поражения цели с максимальным удалением
гелия, чтобы свести к минимуму повреждающие воздействия на поверхность клеток
Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика – до 1 мм,
однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в
ткань на глубину до 4-5 мм и переносить гены, например, в волокна поперечно-полосатых мышц. Баллистическая трансфекция очень эффективна даже
там, где толстые клеточные стенки (дрожжи, растения) являются препятствием для многих других методов доставки, и применяется в том числе для тканей, органов и даже целых организмов. В настоящее время широко используется в генотерапии, для получения трансгенных животных и растений.
Такое разнообразие средств и методов трансфекции обусловлено различными задачам, широким спектром используемых клеток-мишеней и типов доставляемых в клетки нуклеиновых кислот, а также потребностями общества в получении все более эффективных средств доставки генетической
информации в клетки, ткани и целые организмы. Особое внимание уделяется
развитию трансфекционных реагентов и методов в связи с поразительными
перспективами генной терапии человека, для которой необходимы адресные
высокоэффективные и безопасные средства генной доставки.
Стабильное и транзиентное внедрение чужеродной ДНК в клетку.
После введения рекомбинантной ДНК в эукариотическую клетку, лишь ее
малая часть оказывается в ядре, поскольку ядерная мембрана является труднопреодолимым барьером для чужеродной ДНК. В ядре рекомбинантная
ДНК может быть интегрирована в хромосому или некоторое время существовать во внехромосомном состоянии. Соответственно, различают стабильную трансфекцию, когда рекомбинантные ДНК интегрируются в хромосомы
клеток-реципиентов и становятся их неотъемлемой частью, а также временную, или транзиентную, трансфекцию (transient transfection), при которой мо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
72
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
лекулы рекомбинантной ДНК существуют и транскрибируются в ядрах во
внехромосомном состоянии непродолжительное время. Стабильное наследование внедренной чужеродной ДНК – основное условие получения трансгенных организмов для хозяйственных целей. Поэтому разработке методов введения ДНК в клетки, ведущих к получению большей доли стабильных
трансформантов, уделяется особое внимание. Кроме того, большой процент
стабильных трансформантов, также позволяет отказаться от селективных и
маркерных генов, являющихся балластными при создании трансгенных организмов.
2.1.7. Проблемы экспрессии чужеродных генов
Чем обусловлено такое разнообразие клонирующих векторов и организмов-хозяев, используемых для получения биотехнологической продукции? Основная задача гетерологичной экспрессии в биотехнологии – получение в больших количествах функционально активного белка в природной
конформации с корректными посттрансляционными модификациями. Еще
одним условием биотехнологического производства считается минимизация
затрат на единицу продукции. Чем проще организм, тем проще и дешевле
культивирование его клеток. Самым простым вариантом экспрессии является
бактериальная экспрессия, но в прокариотических организмах невозможны
многие посттрансляционные модификации. Кроме того, часто невозможно
обеспечить правильное сворачивание (правильный фолдинг) многих эукариотических белков. Неспособность прокариот синтезировать аутентичные
варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических посттрансляционных модификаций.
1. Образование дисульфидных связей. Эту реакцию катализирует фермент дисульфидизомераза. Неправильно уложенный белок оказывается нестабильным и неактивным.
2. Протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционально активного белка.
3. Гликозилирование – основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, а в некоторых случаях – особые свойства.
Наиболее распространенная реакция гликолизирования – это присоединение
специфического сахарного остатка либо к серину или треонину
(О-гликозилирование), либо к аспарагину (N-гликолизирование).
4. Модификации аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование, ацилирование, гамма-карбоксилирование, сульфатирование,
миристилирование, пальмитоилирование и др.
Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых могут осуществлять
часть или все посттрансляционные модификации синтезируемых рекомбинантных белков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
73
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков по сравнению с
прокариотическими клетками.
В настоящее время не существует единого алгоритма получения рекомбинантного функционально активного белка в больших количествах.
Имеются только самые общие рекомендации по выбору экспрессионной системы в зависимости от размеров, структуры белка, его свойств и наличия у
него посттрансляционных модификаций. Общей практикой является эмпирический подбор экспрессионной системы для каждого конкретного белка, когда пробуются все имеющиеся в распоряжении исследователя экспрессионные системы от E. coli до клеток млекопитающих (в случае сложных белков).
Уровень экспрессии чужеродного гена также зависит от конструкции
экспрессионной кассеты вектора. Коммерческие векторы обычно содержат в
составе экспрессионной кассеты весь необходимый набор регуляторных элементов для высокоэффективной генной экспрессии в конкретной клеткемишени (или универсальные элементы для нескольких хозяев). Регуляторные
элементы чужеродного гена, если таковые у него имеются, должны хорошо
работать в клетке-хозяине. Помимо этого, для лучшей экспрессии гена на
уровне трансляции мРНК желательно приблизить набор кодонов к типичному для клетки-хозяина. Обычно для этого посредством направленных точечных мутаций заменяют «редкие» кодоны на синонимичные «частые», что не
сказывается на первичной структуре белка. В результате экспрессия гена в
различных системах может быть усилена до 300 раз. Иногда в структурной
части генов могут присутствовать какие-либо нежелательные сигнальные последовательности, например, узнаваемые на уровне мРНК ферментами
сплайсинга или деградации в случае эукариотической экспрессии, или терминаторы транскрипции для прокариотической экспрессии, сигналы, узнаваемые ферментами модификации на уровне белка. Наличие таких скрытых
(«криптических») сигналов ведет к резкому снижению экспрессии гена в
клетке-хозяине, поэтому их обычно удаляют также путем точечных замен
оснований.
2.1.8. Выделение генетически модифицированных организмов
и проблема удаления маркерных генов
Поскольку эффективность введения рекомбинантной ДНК в клетку никогда не бывает 100 %, а эффективность получения стабильных трансгенных
клеток вообще очень мала, всегда используются различные методы селекции
для выделения трансформированных клеток. В состав рекомбинантных генетических конструкций вводят специальные гены селекции, например, гены
устойчивости к антибиотикам и/или репортерные (маркерные) гены, кодирующие какой-либо легко идентифицируемый признак (окраска клеток генами флуоресцентных белков). При низкой эффективности трансфекции очень
удобно использовать гены устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам
и другим веществам, а также различные гены метаболизма, придающие толь Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
74
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
ко трансформированным клеткам способность расти на селективной среде.
Если эффективность трансфекции достаточно высока, можно проводить отбор полученных трансформантов с помощью прямого анализа ДНК (например, методом ПЦР) и в этом случае можно обойтись без генов селекции. Часто репортерный ген необходим наряду с селективным геном, по которому
идет отбор трансформантов, для оценки уровня экспрессии целевого гена.
Полученные в одном эксперименте трансгенные организмы могут сильно
различаться по уровню экспрессии чужеродного гена, вследствие различного
встраивания в геном клетки-хозяина и различного состояния геномов после
такого встраивания.
Задача получения трансгенных организмов для хозяйственных целей
включает в себя также получение коммерциализированных трансгенных организмов без каких-либо селективных и/или маркерных генов. Это обусловлено несколькими причинами:
1. Потребность минимизировать воздействие на уже сформированный в
процессе длительной эволюции генетический аппарат клетки-хозяина и убрать дополнительную метаболическую нагрузку клетки на экспрессию маркерного гена. Все это необходимо для стабилизации самого трансгенного организма и его приобретенного признака, а также для повышения его жизнеспособности.
2. Озабоченность общественного мнения неконтролируемым распространением в окружающей среде селективных и маркерных генов и, прежде
всего, генов устойчивости к антибиотикам. Эти опасения можно считать реальными только в случае трансгенных микроорганизмов, поскольку ни один
факт природной передачи генов от высших растений или животных к микроорганизмам науке не известен. Кроме того, селективные гены взяты из природных популяций микроорганизмов, где они сейчас широко распространены
в результате активного применения антибиотиков в медицинской практике.
Поэтому вероятность попадания гена устойчивости к антибиотику в микрофлору человека из природного резервуара несравнимо реальнее, чем, например, при употреблении трансгенных растений. Однако, учитывая настроения
общественности, разрабатываются подходы для исключения присутствия
«подозрительных» генов в трансгенных формах.
3. Проблемы у потребителей ГМО, вызванные в редких случаях балластным продуктом маркерного гена, например, аллергические реакции на
продукт маркерного гена у животных и человека при потреблении генетически модифицированных растений. Хотя в этом случае возникновения проблемы можно не допустить использованием в качестве маркеров генов из
традиционных пищевых источников.
4. Необходимость удаления маркерного гена, уже использованного для
селекции. Это важно при последовательном введении нескольких генетических конструкций в один организм, поскольку количество эффективных селективных генов ограничено.
Один из экспериментальных подходов к получению безмаркерных эукариотических трансгенных организмов – котрансфекция одного организма
двумя генетическими конструкциями: одна – с целевым геном, другая – с
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
75
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии
маркерным. В этом случае с большой вероятностью (30–80 %) полученный
селекцией трансгенный организм содержит и целевой ген, причем обе рекомбинантные конструкции интегрированы в различные локусы хромосомной ДНК.
Далее маркерный ген можно удалить с помощью обычного скрещивания.
Другой вариант – использование подвижных генетических элементов для
перемещения маркерного гена в другой хромосомный сайт трансгенного организма. Например, при получении трансгенного растения селективный маркер
был встроен между растительными подвижными мобильными Ds-элементами
рядом с геном транспозазы, которая вырезает встроенную между
Ds-элементами ДНК и перемещает ее в другой локус. В процессе встраивания в хромосому растения-хозяина в 50 % случаев маркерный ген находился
далеко от целевого гена. Таким образом, селективный маркер может использоваться для отбора трансгенных растений, а потом удаляться скрещиванием.
Разработка высокоэффективных средств доставки ДНК в клетки позволит, наверное, совсем обойтись без селективных и маркерных генов при получении трансгенных организмов. В настоящее время это практически невозможно, по крайней мере, на первых этапах сборки генетической конструкции для трансфекции, которая обычно проводится в клетках E. coli. Но на
финальном этапе получения трансгенных организмов существующие способы доставки иногда позволяют получать трансгенные организмы без какихлибо маркерных генов, хотя это более дорогой и трудоемкий вариант.
2.2. Трансгенные микроорганизмы
и клеточные культуры
Микроорганизмы с древних времен участвовали в биотехнологических
процессах в различных сферах практической деятельности человека, таких
как хлебопечение, виноделие, приготовление кисломолочных продуктов и т.д.
Эта разнородная группа микроскопических организмов, искусственно объединенная на основании размера, стала базой многочисленных хозяйственных
биотехнологических производств, сложившихся в промышленную микробиологию. Быстрый рост и огромное генетическое разнообразие микроорганизмов позволяют за короткий промежуток времени осуществить синтез
больших количеств целевого продукта в строго контролируемых условиях.
Возникновение генной инженерии в середине 1970-х гг. (перенос чужеродных генов, придающих новые полезные свойства организму хозяина)
придало огромный импульс развитию биотехнологических производств.
Возможность конструировать организмы с заданными свойствами видоизменила структуру и содержание промышленной микробиологии. Во-первых,
существенно повысилась продуктивность промышленных микроорганизмов
– продуцентов классических продуктов посредством усовершенствования
имеющегося метаболического пути (введения дополнительных генов, увеличения их количества или активности). Во-вторых, внедряя в микробную
клетку чужеродные гены, удалось получить микроорганизмы, синтезирую Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
76
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры
щие несвойственные им вещества, например, белки крови человека (интерфероны, интерлейкины, инсулин и др.), что значительно увеличило разнообразие биотехнологической продукции.
Таким образом, стало возможным преобразование клеток бактерий,
дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства антибиотиков, белков, жиров, аминокислот, а также для получения безопасных
и дешевых вакцин. Практически любое современное биотехнологическое
производство основано на использовании трансгенных организмов.
2.2.1. Рекомбинантные микроорганизмы
для получения коммерческих продуктов
Именно бактерии стали первыми ГМО благодаря простоте организации
их генома и манипуляций с клетками. Первый патент на генетически модифицированный штамм микроорганизмов, который был способен разлагать
нефть, был выдан в США в 1980 г. всего через 8 лет после работы Берга по
конструированию рекомбинантной ДНК. Еще через два года был разрешен
для клинического использования синтезированный в бактерии E. coli первый
лекарственный препарат – рекомбинантный человеческий инсулин. Сейчас
промышленная микробиология с использованием ГМ микроорганизмов развивается в основном по следующим направлениям:
1) производство продуктов биосинтеза трансгенных микроорганизмов,
например, антибиотиков, гормонов, ферментов и витаминов;
2) использование биомассы микроорганизмов – производство медицинских вакцин, различных дрожжей, белково-витаминных концентратов и заквасок для получения кисломолочных продуктов и силосования кормов;
3) биотехнологии, основанные на уникальных способностях некоторых
бактерий производить органические кислоты, этанол, углеводы и метан. Сюда же можно отнести и переработку некоторых отходов с возможностью получения полезных соединений, в первую очередь горючих газов (биотипливо).
Использование трансгенных микроорганизмов в медицине. В настоящее время биотехнология на основе использования трансгенных микроорганизмов предлагает новые подходы к разработке и производству фармацевтических препаратов, а также позволяет выпускать в достаточных количествах широкий спектр лекарственных средств, которые раньше были малодоступны. Среди примерно 40–50 новых видов лекарств, вакцин и препаратов для диагностики, появляющихся на рынке ежегодно, 10–15 получены с
помощью генно-инженерных методов, причем многие из них предназначены
для лечения болезней, которые ранее считались неизлечимыми.
К самому большому классу лекарств, получаемых путем микробного
синтеза, относятся антибиотики. По разнообразию и показаниям к применению они занимают первое место среди продукции мировой фармацевтической промышленности. Сегодня известно более 6 000 видов антибиотиков,
более 100 из которых находят применение в медицинской практике, в том числе
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
77
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры
при лечении таких тяжелых заболеваний, как туберкулез, менингит, плеврит,
пневмония. Отдельные антибиотики, такие как блеомицин, применяют при
лечении онкозаболеваний. Объем мирового рынка антибиотиков увеличивается в последнее время на 10–20 %/год и составляет более 23 млрд дол.
Вторым классом лекарственных препаратов, производимых биотехнологическим путем в микроорганизмах, являются гормоны. В медицинских
целях применяются два основных типа гормонов, различающихся по молекулярному строению: стероидные и пептидные. Среди стероидных гормонов
можно выделить кортизон и преднизолон, которые широко используют при
лечении различных аллергических заболеваний, в том числе такого тяжелого,
как бронхиальная астма, а также ревматоидного артрита и других недугов.
Другой обширной группой стероидов являются половые гормоны, такие как
эстроген, широко применяемые для оральной контрацепции и лечения ряда
заболеваний. Пептидные гормоны сейчас практически целиком производятся
путем синтеза с помощью генетически модифицированных микроорганизмов. Сюда можно отнести уже упоминавшийся инсулин, а также такие антивирусные, антиопухолевые и иммуномодулирующие агенты, как интерфероны и интерлейкины.
Особое место среди лекарственных средств занимают ферменты, которые в широком диапазоне могут синтезировать ГМ-микроорганизмы. Ферменты используются – для лечения самых различных патологий: протеазы и
липазы – для коррекции пищеварения; протеазы – для удаления некротических тканей, протеиназы с фибринолитическим действием – для растворения
тромбов, а антикоагулянты, например плазмин, эффективны при лечении
инфаркта миокарда и многие другие.
Важный вклад микробной трансгенной биотехнологии в медицину состоит в получении профилактических препаратов, в первую очередь это производство вакцин против различных инфекций. Необходимый антиген можно
получить с помощью непатогенного (аттенуированного) микроорганизма,
инактивированного генно-инженерными методами, либо экспрессией рекомбинантного антигена и таким образом избежать опасностей, связанных с
применением инактивированных вакцин.
К числу важных практических достижений генной инженерии необходимо отнести и получение диагностических препаратов.
Использование биомассы ГМ-микроорганизмов. Согласно прогнозам,
к 2050 г. население Земли возрастет до 10 млрд чел. и для обеспечения его
потребности в продукции сельского хозяйства нужно будет увеличить объем
производства на 75 %. При этом человеку недостает в первую очередь белка
животного происхождения, который по аминокислотному составу более богат, чем растительный белок. Промышленная микробиология поставляет животноводству, по крайней мере, три вида важных веществ: кормовой белок и
белково-витаминные концентраты (БВК), незаменимые аминокислоты и
кормовые антибиотики. Добавление 1 т БВК в корма обеспечивает экономию
7 т фуражного зерна и дополнительное производство 0,8 т свинины или 5 т
мяса птицы. Включение 1 т ГМ кормовых дрожжей в рацион телят и поросят
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
78
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры
позволяет экономить 6 т цельного молока. Эти ценные продукты получаются
путем переработки ГМ-микроорганизмами подсолнечной лузги, кукурузных
кочерыжек, соломы и других отходов сельского хозяйства, которые содержат
клетчатку.
Второй вид сельскохозяйственной биотехнологической продукции –
незаменимые аминокислоты, производство которых для медицины и пищевой промышленности интенсивно развивается во всем мире. Среди них такие, как лизин и метионин, которые обязательно должны содержаться в готовом виде в пище человека и кормах животных. Метионин производят с помощью химической технологии, а лизин – в основном биотехнологически за
счет ГМ-микроорганизмов. Добавление лизина в корм скоту резко увеличивает объем мясной продукции: на 1 т лизина высвобождается 40–50 т фуражного зерна и получается дополнительно более 10 т мяса.
Помимо этого, в последнее время в животноводстве и растениеводстве
используется около 100 биопрепаратов, таких как стимуляторы роста животных и растений, энтомопатогены и ГМ бактериальные удобрения. Применение таких средств позволяет отказаться от использования или снизить в разы
количество применяемых химических средств защиты и минеральных удобрений, что приводит к повышению качества продукции и созданию экологически чистых технологий.
Использование ферментов и добавок в пищевой и кормовой промышленности, произведенных с помощью ГМ-микроорганизмов, означает,
что ГМ-микроорганизмы инактивированы, разрушены или удалены из конечного продукта. Генетически модифицированные дрожжи, грибки и бактерии используют для этих целей уже более десятилетия. В качестве примеров
можно привести используемую в хлебопечении альфа-амилазу, применяемую
при производстве фруктозы глюкозоамилазу и необходимый для ферментации сыра фермент химозин. Большинство используемых в пищевой промышленности трансгенных микроорганизмов являются производными микроорганизмов, применяемых в традиционной пищевой биотехнологии.
В ряде стран трансгенные микроорганизмы разрешены также для производства микронутриентов, таких как витамины и аминокислоты, используемых в качестве продуктов питания или добавок к рациону. Примером является производство каротиноидов (используемых в качестве пищевых добавок, красителей и добавок к рациону) в ГМ бактериальных системах. В будущем в ГМ-микроорганизмы можно будет интегрировать целые метаболические пути, что позволит синтезировать совершенно новые соединения.
Для нужд животноводства с помощью генной инженерии разработаны
такие ветеринарные продукты, как бычий соматотропин, применяемый для
повышения эффективности производства молока. В некоторых странах бычий соматотропин впервые появился на рынке более 10 лет назад.
Микроорганизмы в качестве продуктов питания. В настоящее время
на рынке нет коммерческих продуктов, содержащих живые генетически модифицированные микроорганизмы. В 1993 г. в Великобритании ГМ-дрожжи
получили официальное одобрение для использования в пивоваренной про Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
79
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры
мышленности, однако попытки коммерциализовать продукт не предпринимались. К другим микроорганизмам, использующимся для производства продуктов питания (находящимся на стадии исследований и разработки), относятся сбраживающие культуры для хлебопечения и пивоварения и молочнокислые бактерии, применяемые при производстве сыра. Целью исследований
и разработки также является минимизация инфицирования патогенными
микроорганизмами и повышение питательной ценности и вкусовых качеств
конечного продукта.
Предпринимаются также попытки генетически модифицировать микроорганизмы пищеварительного тракта крупного рогатого скота с целью защиты животных от отравляющих компонентов корма. Современные методы
биотехнологии используют также для создания пробиотиков – микроорганизмов, употребление определенного количества которых с пищей оказывает
положительное влияние на здоровье.
Биоремедиация. Известно, что основной вред окружающей среде наносят стоки химических предприятий, содержащие различные синтетические
органические соединения, разложение которых в природе происходит крайне
медленно. Многие из таких отходов являются ксенобиотиками – токсичными
веществами, не включающимися в метаболизм живых организмов. Микробиологи изучают пути катоболизма ксенобиотиков, возможности их разложения и детоксикации. Среди огромного разнообразия бактерий можно найти отдельные организмы, использующие самые уникальные варианты путей
метаболизма, включающие необычные химические соединения. Опираясь на
глубокие знания физиологии бактерий, ученые создают ГМ-микроорганизмы
с такой комбинацией метаболических путей, что становится возможна переработка или разложение самых необычных, в том числе токсичных, соединений. На основе этих исследований создают биотехнологические способы
очистки воды от неприродных соединений, а также методы, позволяющие
контролировать загрязнения окружающей среды. В настоящее время ежегодный объем продаж таких препаратов для контроля и мониторинга загрязнений составляет около 10 млн дол., а в ближайшей перспективе эта цифра может достичь 200 млн дол.
Еще одна беда, стоящая перед человечеством, – загрязнение земель и
водоемов нефтью и нефтепродуктами. Подобные загрязнения занимают огромные площади вокруг мест добычи нефти, нефтеперерабатывающих предприятий и портов. Нередко причинами экологических бедствий становятся
аварии на судах, особенно танкерах, когда нефтью загрязняются акватории и
берега рек и морей. Методы генной инженерии активно используются для
разработки штаммов-деструкторов, способных быстро разлагать массивные
скопления нефтепродуктов.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
80
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры
2.2.2. Клеточные культуры для продукции белков
В последнее время все больше растет потребность общества в разнообразных белковых препаратах. Особенно быстрыми темпами увеличивается
применение фармацевтических белковых препаратов в диагностике и терапии заболеваний человека и животных. Это не только антитела и их производные, но многие белки из крови человека (цитокины, ростовые гормоны,
интерлейкины, интерфероны и др.). На современном рынке присутствует
около ста препаратов на основе белков человека, и это количество растет год
от года. Все эти белки произведены in vitro при использовании генетически
модифицированных клеточных культур, полученных генно-инженерными
методами, в основном это бактериальная культура E. coli, дрожжевые
Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris или культуры клеток млекопитающих.
Пока наиболее экономически эффективной и хорошо охарактеризованной системой остается бактериальная. Однако благодаря прокариотическому
типу данной системы эукариотические белки в ней плохо процессируются и
продукция в ней ограничивается простыми структурами (пептиды, небольшие белки), где посттрансляционные модификации отсутствуют или не нужны для биологической функции. Кроме того, высокий уровень синтеза часто
приводит к аггрегациии рекомбинантных белков в виде плохо растворимых
телец включения (inclusion bodies), что делает необходимым этап ренатурации рекомбинантного белка для перевода в биологически активную форму.
Также необходимым этапом является удаление бактериальных токсинов,
присутствующих в данной системе. При этом общая продуктивность бактериальной системы остается довольно низкой – 0,1–1,5 мг/л [1].
Дрожжи как эукариотический организм не имеют этих недостатков, но
практический опыт показывает, что большое количество синтезируемого
продукта теряется вследствие деградации целевого белка в среде. Кроме того, в дрожжах, особенно в Saccharomyces cerevisiae, гликопротеины подвергаются гипергликозилированию, в результате которого формируются N-гликаны
с очень высоким содержанием маннозы, которые кардинально отличаются от
N-гликанов млекопитающих или человека. Ситуация может быть улучшена
использованием метилотрофных дрожжей P. pastoris в качестве экспрессионной системы. Белковая продукция в дрожжах может достигать 6,4 г/л, но
обычно находится в диапазоне 100–200 мг/л. Несмотря на эти ограничения,
43 % рекомбинантных белков, существующих на рынке, продуцируются в
бактериях или дрожжах.
Большинство фармацевтических биотехнологических продуктов, однако, продуцируются в различных культурах клеток млекопитающих, например, NSO, BNK, CHO. Как типы, наиболее близкие человеческим клеткам,
эти системы дают высокий уровень продукции функциональных рекомбинантных белков с корректным N-гликозилированием и другими посттрансляционными модификациями. Уровень продукции культур клеток млекопитающих приблизительно составляет 1–3 г/л. Этот «золотой стандарт» требует
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
81
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры
дорогой инфраструктуры и компонентов сред. Кроме того, существует риск
вирусной или онкогенной контаминации. Все это приводит к сверхвысокой
стоимости конечного продукта, приблизительно варьирующей от 0,3 до
10 тыс. дол. США за грамм в зависимости от количества синтезируемого
белка, и к необходимости искать более дешевые альтернативы продукции
целевого белка, которым могут стать целые трансгенные растения или животные.
Растительные клеточные культуры. Растения всегда были основным источником биопродуктов для человека, снабжая население пищей, волокнами, древесиной и лекарствами. В области фармацевтики растения используют для получения огромного количества вторичных метаболитов с
разнообразными терапевтическими эффектами: ранозаживляющие, антимикробные, противовоспалительные, психоактивные и др. Растения выработали
эти субстанции в процессе эволюции, чтобы защитить себя от патогенов и
хищников или привлекать опылителей. Современные биотехнологические
методы позволяют продуцировать эти продукты предсказуемым образом в
клеточных культурах из соответствующих лекарственных растений. Иногда
это единственный путь производить препараты в промышленных масштабах,
например, когда исходное растение сложно для культивирования или очень
редко встречается в природе. В качестве успешных примеров можно привести алкалоиды, паклитаксел (противоопухолевый препарат) и шиконин (антимикробный и противовоспалительный).
Растительные клетки как эукариотическая система обладают всеми
чертами для продукции биологически активных сложных белков. Как результат, доля биологически активной формы в синтезированном растительными
клетками рекомбинантном тотальном белке бывает очень высока. Так, например, в сравнительном исследовании экспрессии анти-CEA scFv, клетки
табака синтезировали, несомненно, наибольшее количество функционально
активного белка (92 %) от тотального рекомбинантного по сравнению с
E. coli (12 %) и P. pastoris (40 %).
Животные клеточные культуры существуют с 50-х гг. прошлого века, когда были выделены в клеточную культуру HeLa клетки и CHO клеточная линия. Больше пятидесяти лет развития позволило производству на основе животных клеточных культур достигнуть выдающихся успехов. По данным за 2007 г. приблизительно шестая часть наиболее популярных лекарств
являются биотехнологическими продуктами. Девять из десяти наиболее популярных биотехнологических лекарственных препаратов, продающихся в
США, произведены в клеточной культуре клеток млекопитающих и, по крайней мере, продажи 23 белковых препаратов превышают один биллион долларов.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
82
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры
2.2.3. Дрожжевые системы экспрессии
Дрожжи являются очень привлекательный системой экспрессии, позволяющей сочетать дешевизну прокариотического культивирования с эукариотическим процессингом белков. Дрожжевая система экспрессии имеет
следующие преимущества. Во-первых, дрожжи являются одноклеточным организмом, генетика и физиология которого детально изучены и который
можно выращивать как в небольших лабораторных колбах, так и в промышленных культиваторах. Во-вторых, выделены и охарактеризованы несколько
сильных промоторов этих дрожжей, а для систем эндогенных дрожжевых
экспрессирующих векторов могут использоваться природные так называемые 2 µм-плазмиды. В-третьих, в клетках дрожжей осуществляется большое
число посттрансляционных модификаций. В-четвертых, лишь очень немногие из собственных дрожжевых белков секретируются в среду; таким образом, если гетерологичный белок секретируется клеткой, то его очистка не составит большого труда. В-пятых, поскольку дрожжи уже многие годы используют в хлебопечении и пивоварении, Департамент по контролю качества
пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) включил обычные пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae в список «организмов, признанных безопасными». Таким образом, использование этих организмов для получения белков, применяемых в медицине, не требует дополнительных экспериментов, необходимых при работе с неразрешенными к
применению микроорганизмами. Некоторые белки, синтезированные в
S. cerevisiae, уже используются в качестве вакцин и фармацевтических препаратов, а также для диагностики.
В дрожжевых клетках гликозилируются только секретируемые белки,
поэтому для получения рекомбинантных белков, которые для перехода в активную форму должны подвергнуться N- или О-гликозилированию, необходимо использовать системы секреции. Для этого перед кДНК, которая кодирует интересующий исследователя белок, нужно поместить так называемый
пре-про-α-фактор – лидерную (сигнальную) последовательность гена а1 фактора спаривания дрожжей. Синтезируемый рекомбинантный белок сможет в
этом случае эффективно секретироваться дрожжами.
К сожалению, белки млекопитающих подвергаются избыточному гликозилированию в клетках S. cerevisiae, что сильно меняет их иммуногенность. Использование других видов дрожжей, особенно метилотрофных
Pichia pastoris иногда помогает решить данную проблему.
2.2.4. Клетки насекомых и бакуловирусы для синтеза белков
Бакуловирусы инфицируют только беспозвоночных, в том числе многих насекомых. В ходе инфекционного процесса образуются две их формы.
Одна представлена отдельными вирионами, которые высвобождаются из инфицированной клетки хозяина, как правило, клетки средней кишки, и спо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
83
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры
собны инфицировать другие клетки этого органа. Вторая состоит из множества вирионов, заключенных в белковый матрикс. Белок этого матрикса называется полиэдрином, а сама структура – полиэдроном. Синтез полиэдрина
начинается через 36–48 ч после инфекции и продолжается 4-5 сут, пока зараженные клетки не лизируют и хозяйский организм не погибнет. После этого
множество таких частиц высвобождается и попадает в среду, где от инактивации их защищает белковый матрикс. Если восприимчивый хозяйский организм проглатывает такую частицу, то полиэдрин солюбилизируется и высвобождаются вирионы, способные инициировать новый инфекционный цикл.
Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего
генома чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным рекомбинантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к
синтезу большого количества гетерологичного белка, который благодаря
сходству систем внесения посттрансляционных модификаций у насекомых и
млекопитающих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме
целевого рекомбинантного белка. Исходя из этого, на основе бакуловирусов
были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млекопитающих и вирусов животных.
Наиболее широко используется вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). Этот бакуловирус инфицирует более 30 других видов насекомых, а также хорошо растет в культуре многих
клеточных линий. Линии клеток, обычно использующиеся для работы с рекомбинантным AcMNPV, получают из гусениц Spodoptera frugiperda. Промотор полиэдрина в этих клетках чрезвычайно активен, и при их заражении
бакуловирусом дикого типа синтезируются большие количества белка.
Так, полученный в бакуловирусной системе экспрессии поверхностный
белок ВИЧ был первым белком, использовавшимся для создания вакцины
против СПИДа. Но пока данная система не получила широкого распространения, вероятно, вследствие трудоемкости процедуры и высокой стоимости
получаемого продукта.
2.3. Трансгенные растения и животные
как биореакторы
Задачей селекционеров во все времена было получение хозяйственно
ценных растений, животных, микроорганизмов. Основными методами традиционной селекции являются отбор, гибридизация, мутагенез, полиплоидия с
целью получения нужного признака, который кодируется новым геном или
новым комплексом генов. Существенное продвижение в понимании того, как
функционируют гены, расшифровка геномов и развитие методологии генной
инженерии позволили перейти от длительных и трудоемких методов традиционной селекции к прямому генетическому конструированию нужных при Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
84
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
знаков у конкретного организма. При создании трансгенного организма новый генный комплекс конструируется в пробирке и напрямую вводится в организм, фактически таким методом получения нового признака ученые просто ускоряют эволюцию.
Новые методы селекции – это сочетание молекулярных и традиционных методов. Необходимо отметить, что старые методы также остаются широко востребованными при создании новых организмов. Выяснилось, что
трансформированные с идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны,
полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются
по уровню экспрессии введенного гена, поскольку работает эффект положения и копийности гена. И необходимо проводить дальнейший отбор с анализом наследования полученного признака, используя традиционные методы
селекции. Генно-инженерные манипуляции с геномом, сформировавшимся в
процессе длительной эволюции, могут нарушать, в какой-то степени, сбалансированные генные комплексы и, соответственно, жизнеспособность полученных трансгенных организмов. Например, встраивание селективного гена,
нужного только для отбора трансгенных растений, может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что
трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может
перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации. Появляется необходимость
дальнейшего скрещивания и отбора для удаления нежелательных побочных
мутаций у трансгенов. Иногда имеется необходимость удаления маркерных
генов вообще, так что для получения новых организмов применяется сочетание старых и новых методов селекции.
В настоящее время практическая генно-инженерная биотехнология
развивается по двум основным направлениям. Первое направление, получившее не очень удачное название «молекулярное разведение (или селекция)» (molecular breeding), специализируется на решении новыми методами
традиционных селекционно-генетических проблем повышения продуктивности хозяйственно ценных организмов и их защиты от различных биотических
и абиотических стрессовых факторов. Второе направление, названное «молекулярным производством» (molecular farming), специализируется на получении и использовании трансгенных организмов в качестве биореакторов,
продуцирующих ценные для промышленности и медицины органические соединения.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
85
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
2.3.1. Конструирование трансгенных растений
Возможность получения трансгенных растений основана на тотипотентности их некоторых клеток, т.е. способности в определенных условиях под действием фитогормонов дифференцироваться с образованием полноценного
растения. Таким образом, из сконструированных генно-инженерными методами
отдельных клеток можно получить фертильные растения, все клетки которых
несут чужеродный генный комплекс (трансгенные растения). Если такое растение цветет и дает жизнеспособные семена, то желаемый признак передается последующим поколениям. Кроме того, многие растения легко размножаются вегетативно. Существующими приемами микроклонального размножения in vitro из микроскопических кусочков ткани (эксплантов) можно быстро
получить за короткий промежуток времени генетически однородный посадочный материал с высоким коэффициентом размножения, что важно для последующего применения трансгенного организма.
Для создания трансгенного растения необходимо трансформировать
культивируемые клетки, их протопласты или клетки в составе органов, отделить от нетрансформированных клеток и получить из отдельных клеток целые трансгенные растения (рис. 2.12). К настоящему времени для трансформации растений разработано несколько эффективных систем переноса рекомбинантной ДНК в клетки и экспрессирующих векторов, которые работают в ряде растительных клеток.
Векторы на основе Ti-плазмид. Бактерии рода Agrobacterium иногда
называют природными генными инженерами за их способность переносить
свою плазмидную ДНК в клетки зараженных растений, интегрировать ее в
геном организма-хозяина и вызывать стабильную трансформацию этих клеток введенными генами. Все они приводят к образованию у двудольных растений корончатых галлов – трансформация индуцирует образование опухолей, похожих на раковые. Инфекционным агентом является так называемая
Ti-плазмида (tumor-inducing plasmid) в 200–250 тнп (рис. 2.13), которая содержит все гены, необходимые для инфекционного процесса.
Рис. 2.12. Схема получения трансгенного растения трансформацией эксплантов
(кусочки органа растения, например фрагменты тканей семядоли)
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
86
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Рис. 2.13. Схема Ti-плазмиды. Указаны основные гены и их группы. Сайт
инициации репликации (ori) обеспечивает удвоение плазмиды при делении
клетки Agrobacterium. Колечками обозначены левая и правая фланкирующие
последовательности Т-ДНК
После присоединения Agrobacterium, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке, часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (Т-ДНК
(transferred DNA), 12–24 тнп в зависимости от штамма), транспортируется в
клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного конъюгации. При
этом Т-ДНК транспортируется в одноцепочечной форме, и именно в такой
форме она встраивается в хромосомную ДНК растения. С переносимой Т-ДНК
остаются связанными два кодируемых Ti-плазмидой белка, способствующие
ее вырезанию, и третий белок покрывает оболочкой переносимую одноцепочечную ДНК, предохраняя от деградации. Все белки содержат сигнал ядерной локализации (NLS), который обеспечивает перенос Т-комплекса из цитоплазмы в ядро растительной клетки. Введенные гены Agrobacterium активируются в растении, программируя разрастание ткани (формируется галл),
которая начинает синтезировать и секретировать опины. Опины – продукты
конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и сахаров Agrobacterium –
используют как источник углерода и азота, причем другие исследованные почвенные микроорганизмы не способны использовать данные соединения. Таким
образом, Agrobacterium генетически трансформирует растительные клетки в
«биологические фабрики» по производству для себя «продуктов питания».
Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют небольшие векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами из переносимой Т-области, которая ограничена 24-нуклеотидными повторами. Вместо
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
87
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
онкогенов встраивают последовательности клонируемой чужеродной ДНК и
селективный маркер. Наличие сайта инициации репликации E. coli в составе
Ti-вектора позволяет проводить в кишечной палочке все стадии сборки генетической конструкции. В качестве селективного маркера используют гены
устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые дают возможность
отбирать трансформированные клетки растений. После введения целевой
ДНК рекомбинантным Ti-вектором трансформируют клетки агробактерий,
несущих модифицированную Ti-плазмиду-помощницу с удаленной Т-областью,
но содержащую все необходимое для переноса в растительные клетки T-ДНК
части с рекомбинантной плазмиды. Такие вектора получили название бинарных, поскольку только вместе с плазмидой-помощницей они составляют пару из двух элементов для полноценного функционирования системы переноса генов в растительную клетку с помощью агробактерий.
Генетически модифицированные растения получают простой инкубацией
любых частей растения с суспензией рекомбинантных агробактерий. Во всех
случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в
геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно
транскрибируемых генов (эухроматин).
Для внедрения больших фрагментов ДНК в клетки растений путем введения фланкирующих Т-область последовательностей из Ti-плазмиды в состав векторов для клонирования больших фрагментов ДНК получены соответствующие космидные векторы, а также векторы на основе искусственных
бактериальных хромосом (ВАС), получившие название TAC (transformationcompetent bacterial artificial chromosomes). ТАС-векторы могут быть реплицированы как в клетках Е. coli, так и агробактерий, что позволяет с помощью
рекомбинантных агробактерий вводить в клетки растений фрагменты ДНК
длиной более 150 тнп.
Другие векторы для конструирования трансгенных растений c прямым введением чужеродных генов в виде очищенной ДНК в растительные
клетки также разработаны, поскольку эффективные системы переноса генов
в растительный геном с помощью агробактерий работают не для всех видов
растений. Эти векторы в основном предназначены для сборки эффективной
экспрессионной генной конструкции в E. coli с последующим введением в
растительную в клетку очищенной ДНК. Наиболее известные способы доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки приведены в табл. 2.1
(подробно о способах доставки ДНК в клетки см. п. 2.1.6).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
88
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Таблица 2.1
Методы введения рекомбинантной ДНК в растительные клетки
Метод
Использование Ti-плазмид
Комментарий
Высокоэффективная система, но применима не
для всех видов растений
Бомбардировка микрочастицами
Эффективный и дешевый способ для широкого
(биобаллистика)
круга растений (см. п. 2.1.6)
Использование вирусных
Пока неэффективный способ доставки ДНК в
векторов
растительные клетки
Микроинъекции
Имеют ограниченное применение, поскольку
единовременно можно сделать инъекцию лишь в одну клетку
Введение ДНК в протопласты с
Применяются только для введения генов в протрансфекционными реагентами
топласты (клетки с удаленной клеточной стенкой), из
которых могут быть регенерированы жизнеспособЭлектропорация
ные растения
Слияние с липосомами
Растительные векторы отличаются главным образом различными сигнальными и регуляторными последовательностями, которые обеспечивают
эффективную транскрипцию генов в растительных тканях, и различными селективными маркерами. Наиболее важными из регуляторных последовательностей являются проксимальный участок промотора, связывающий РНК-полимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый для связывания с рибосомой и инициации трансляции, и эукариотический сигнал полиаденилирования на 3'-конце мРНК. Среди эукариотических организмов эти
конститутивные сигнальные элементы оказались, к счастью, высококонсервативными и достаточно универсальными, так что растительные клетки в основном правильно экспрессируют чужеродные гены не только растений других видов, но и млекопитающих, дрожжей и других эукариот. Но для обеспечения достаточного уровня работы чужеродного гена необходимы сильные
регуляторные и сигнальные элементы экспрессии, в которых ключевыми являются промоторы, хорошо работающие именно в клетке-мишени. Как и в
других системах, для конструирования растительных векторов популярны
элементы экспрессионной системы вирусов. В настоящее время одним из
наиболее широко используемых промоторов для двудольных является сильный конститутивный 35S-промотор, выделенный из вируса мозаики цветной
капусты (ВМЦК, CaMV) из группы каулимовирусов. Также для двудольных
широко используется nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий, хотя
он намного слабее 35S; для однодольных – промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act).
Во многих векторах для трансформации растений как селективный, так
и целевой гены находятся под контролем все того же классического
35S-промотора. Наличие рядом двух копий 35S-промотора может отрица-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
89
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
тельно сказываться на уровне экспрессии, поскольку множественные копии
этого вирусного промотора в геноме могут быть одной из причин «замолкания» трансгена (явление сайлесинга (gene silencing) в ряду поколений, см.
п. 2.3.3). В этой связи в настоящее время ведется как поиск новых, более эффективных промоторов, так и создание их химерных форм. Особенно нужны
эффективные тканеспецифичные и индуцибельные промоторы для тканеспецифичной и/или индуцированной экспрессии трансгена. Экспрессия под
сильными конститутивными промоторами, с одной стороны, приводит к
большому количеству целевого белка, с другой – к синтезу этого белка во
всех тканях растения, что может отрицательно сказаться на жизнеспособности и стабильности трансгенного растения и часто нежелательно для исследователей.
Векторы для трансформации хлоропластов высших растений
(транспластомные векторы) относятся к интегративным векторам. Хлоропласты содержат полноценную генетическую систему, сходную с прокариотическими, т.е. все компоненты, необходимые для экспрессии генетической информации, включая белоксинтезирующий аппарат. Геном хлоропластов (пластом) размером 130–160 тнп заключает в себе более 100 различных генов.
Векторы для трансформации хлоропластов предназначены для интеграции
чужеродной ДНК в пластом с помощью гомологичной рекомбинации. Представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие кроме обычного векторного набора два участка длиной по 1-2 тнп, гомологичные последовательностям ДНК хлоропластов, в которую и происходит встраивание. Экспрессионная кассета между этими гомологичными последовательностями состоит
из 5'-некодирующей области с промотором, регулирующим транскрипцию
(иногда включает последовательность лидерного пептида перед множественным клонирующим сайтом для целевой ДНК) и 3'-некодирующей регуляторной области с терминатором транскрипции, стабилизирующей структуру
мРНК, что является одним из условий достижения высокого уровня экспрессии трансгена в хлоропластах. Для получения эффективной транскрипции
клонированного гена часто используют сильный Prrn-промотор оперона рибосомальных рРНК (rrn). В зависимости от размера хлопластной ДНК растения данная векторная система позволяет вводить в геном хлоропластов
фрагменты ДНК длиной до 50 тнп, содержащие до 20–30 генов. В геноме
хлоропластов описано, по крайней мере, около 20 сайтов, по которым удалось получить продуктивную интеграцию вектора.
Получение транспластомных растений, содержащих генетически измененные хлоропласты, является одним из перспективных направлений, поскольку хлоропласты не переносятся с пыльцой, а значит, устраняется опасность распространения трансгенов с пыльцой среди перекрестно опыляемых
растений близких видов. Кроме того, сама пыльца трансгенных растений ме-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
90
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
нее токсична для насекомых, которые не являются мишенью ее токсического
воздействия у растений, синтезирующих инсектициды.
Для генома хлоропластов характерен высокий уровень полиплоидии –
10–100 копий на хлоропласт. Учитывая большое число самих хлоропластов
на клетку, каждая отдельная клетка с трансформированными хлоропластами
содержит тысячи копий трансгена, что позволяет получать очень высокий
уровень экспрессии соответствующих рекомбинантных белков (до 25 % от
суммарного растворимого клеточного белка).
Транзиентная «временная» экспрессия в растениях – это еще один
путь для синтеза чужеродных целевых белков. Преимущество транзиентной
экспрессии заключается в том, что этот метод не приводит к возникновению
трансгенного растения с его экологическими и другими ограничения для ГМО.
Чаще всего для этого используются векторы на основе различных фитовирусов, например, вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса мозаики коровьего
гороха (ВМКГ). Заражение растительных тканей производят рекомбинантными вирусами, несущими в своем составе гены целевых белков. Скорость
мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счет чего достигается высокая копийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме зараженных клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений. Иногда такую технологию применяют для масштабного
коммерческого производства.
Для транзиентной продукции в растениях также используют векторы
Ti-системы. При инфицировании целого растения или его части (листья) рекомбинантной Agrobacterium, содержащей целевой ген в составе бинарного
вектора, уровень продукции чужеродного белка может достигать 10–30 % от
общего растворимого белка растения в короткое время (5–10 дней). Такой
способ также используется, когда требуется проверить сконструированную
экспрессионную кассету перед получением стабильных трансформантов или
разово наработать небольшое количество (порядка миллиграмма) рекомбинантного белка, например, для оценки его качества или доклинических испытаний.
2.3.2. Преимущества и проблемы биопродукции
в растительной системе
Биопродукция чужеродных белков в растительных клетках имеет ряд
особенностей и преимуществ. Прежде всего, в клетках высших растений
происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих, но получение трансгенных растений намного проще по
сравнению с животными. Культивирование растений не требует дорогостоя-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
91
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
щего оборудования (ферментеры), культуральных сред и системы стерильности, стоимость выращивания растений несравнимо ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей, насекомых или животных. Сельскохозяйственные масштабы продукции позволяют получать рекомбинантные
белки и метаболиты в достаточных количествах. В отличие от животных,
растительные клетки не содержат в своем составе патогенные для человека
вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных препаратов медицинского назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого белка из растений-продуцентов может
быть сопоставима с таковой для других систем, наработка сырого материала
обходится значительно дешевле. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве «съедобных вакцин» выделение белка в
чистом виде не требуется.
Гликозилирование в клетках высших растений сходно с клетками
млекопитающих, но имеются и отличия, которые могут повлиять на биологическую активность синтезируемых рекомбинантных белков в растительной
системе. У растений гликопротеины имеют два углеводных остатка, не встречающихся у млекопитающих – β(1,2)-ксилозу и α(1,3) -фукозу (рис. 2.14). Эти
олигосахаридные остатки могут стать аллергенами для человека, поскольку в
некоторых экспериментах в крови подопытных животных обнаруживались
специфические иммуноглобулины IgE против растительных углеводных детерминант. Различия в гликозилировании у растений и животных могут быть
особенно важны при использовании в медицине антител, синтезированных в
растениях.
В животных клетках ключевым ферментом, превращающим N-гликаны
растений в N-гликаны млекопитающих, является β(1,4)-галактозилтрансфераза.
Если ввести этот ген в растения, можно получить гликозилирование белков
по типу клеток млекопитающих. Было проведено скрещивание трансгенных
растений табака, синтезирующих этот фермент, с растениями-продуцентами
тяжелой и легкой цепей антител. У полученного потомства, содержащего все
три белка, до 30 % иммуноглобулинов имели галактозилированные N-гликаны.
Таким образом, существует возможность изменить тип гликозилирования
белков человека в трансгенных растениях. Вероятно, эта проблема будет решена тем или иным путем и антитела, синтезированные в растениях, будут
широко использоваться в медицине.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
92
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Рис. 2.14. Общая схема гликозилирования белков
в клетках животных и растений
Уровень синтеза рекомбинантных белков в растительной клетке.
Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки
соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них необходимо
отметить частый низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при
использовании очень сильных промоторов. Например, первые эксперименты
по экспрессии различных человеческих белков в трансгенном табаке дали
очень низкий выход – содержание сывороточного альбумина человека составило приблизительно 0,02 %, эритропоэтина – 0,003 % и b-интерферона –
0,001 % от суммарного белка листьев. Одной из причин этого, по-видимому,
является увеличение скорости деградации мРНК чужеродного гена, когда ее
уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит
одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов. Повысить
продукцию чужеродных белков в растениях в некоторых случаях удалось
введением трансгена в геном хлоропластов, например, в этом случае человеческий сывороточный альбумин составил более 11 % от растворимого белка
клеток, человеческий гормона роста – до 7 %.
Второй причиной низкого уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме растительной клетки. Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляющих
его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз. Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводненных
тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Так, например, уровень синтеза гирудина, слитого с олеозином (белком из масляных телец), в семенах трансгенного рапса достигал 0,3 %. Уро Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
93
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
вень синтеза под глютелиновым промотором энкефалина человека, направленного в компартменты накопления запасных белков сигнальной последовательностью глютелина (запасной белок риса), составил 2,9 % от тотального
белка в семенах арабидопсиса.
Очевидно, что многие проблемы в получении высокоэффективных стабильных трансгенных растений для хозяйственных целей в настоящее время
обусловлены недостатком фундаментальных знаний о функционировании
генома высших растений. В частности, пока нет ясного понимания того, каким образом происходит включение и выключение генов в ДНК растений.
Сайленсинг генов (gene silencing) – явление «замолкания» генов в последующих поколениях – было обнаружено уже через несколько лет после
создания первых трансгенных растений. Было выявлено, что у достаточно
заметной доли трансгенных растений интродуцированный ген через какое-то
время теряет свою активность – «замолкает», хотя физически сохраняется в
геноме. Таким образом, было установлено, что растение обладает способностью активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК. Как правило, перенесенные гены наследуются согласно законам Менделя, однако к настоящему времени накоплено достаточно много примеров отклонений от менделевского наследования, обусловленных инактивированием трансгенов. Несмотря на интенсивные исследования этого явления во многих ведущих биотехнологических центрах мира, причины и молекулярно-генетические механизмы все еще остаются до конца не выясненными.
Проблема замолкания генов имеет большое практическое значение, так
как у генетически трансформированных сельскохозяйственных культур
трансгены должны функционировать стабильно. За последние годы удалось
выяснить механизмы и некоторые условия, способствующие замолканию генов при интеграции в ядерный геном растений. Один из основных факторов –
число идентичных копий гена, встроенных в геном: чем больше таких копий
и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов. Откуда
следуют практические рекомендации генным инженерам: трансгенные культуры должны содержать не более одного встроенного гена на гаплоидный
геном; сигнальные части и регуляторные части чужеродной ДНК (промоторы,
терминаторы и др.) не должны иметь длинных гомологий (более 100–300 нп)
с участками хозяйского генома; фрагменты векторной плазмидной или вирусной ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конструкции перед встраиванием рекомбинантной ДНК в растительные клетки.
2.3.3. Области применения генной инженерии растений
Метаболическая инженерия растений направлена на проведение
трансгенной клеткой новых биохимических реакций путем введения чужеродных генов или модификацией генов клетки-хозяина. Растения представляют один из наиболее привлекательных объектов для метаболической инженерии. Имея одинаковые пути синтеза основных биологических соедине Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
94
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
ний, растения отличаются поразительным разнообразием своих конечных
продуктов: сахаров, ароматических соединений, жирных кислот, стероидных
соединений и других биологически активных веществ. Растения дают человечеству десятки тысяч природных продуктов, многие из которых представляют большую ценность для фармакологии и промышленности.
Иногда такими продуцентами важных лекарственных веществ являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их
агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их
перенос в подобранные соответствующие растения превращают их в новые
продуценты важных биологически активных веществ.
Многие растения содержат
предшественников биосинтеза ценных биологических соединений,
однако они не имеют ферментов для
их превращений в эти соединения.
Часто для метаболической инженерии достаточно переноса в клетку
только одного гена. Примером такого типа метаболической инженерии
является получение новых растенийпродуцентов резвератрола, ценного
лекарственного препарата широкого
Рис. 2.15. Схема синтез резвератрола,
спектра действия, замедляющего
найденного в винограде ценного препастарение. Резвератрол был обнарурата антиоксидантного типа с широким
жен в винограде, где фермент стилспектром действия. Исходные соединения
бенсинтаза катализирует реакцию
присутствуют в клетках любых растений
синтеза резвератрола из трех
молекул малонил-СоА и одной молекулы 4-кумарил-СоА (рис. 2.15). Переносом гена стилбенсинтазы были получены другие растения, синтезирующие резвератрол.
Создание растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами поможет улучшить пищевую ценность растений. Ранее было практически невозможно с помощью селекции вывести растения с повышенным содержанием витаминов. Однако с развитием биохимии растений стало более
ясным, какие метаболические пути являются критическими для биосинтеза
витаминов. Например, для синтезаβ -каротина (провитамина А) в растениях
необходима фитоен-синтетаза. Этот фермент участвует в конденсации двух
молекул геранил-геранил дифосфата. Ген фитоен-синтетазы из нарцисса был
введен в рис и экспрессирован в эндосперме риса. Таким образом, получен
«золотой рис», который может помочь 2 млрд чел., страдающих от дефицита
витамина А, для них рис – основная пища. Получены трансгенные растения
рапса, экспрессирующие ген фитоен-синтетазы, в семенах которых значи Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
95
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
тельно повысилось содержание каротиноидов. Показана экспрессия этого же
фермента в клубнях картофеля, что приводило к повышенному синтезу каротиноидов и лютеина.
Недавно получены трансгенные растения земляники с повышенным
синтезом L-аскорбиновой кислоты. Эти растения отличались суперэкспрессией гена НАДФ-зависимой Д-галактуронат-редуктазы (GalUR). Созданы
растения сои с повышенным в пять раз содержанием витамина Е в семенах.
Получены растения арабидопсиса с повышенным содержанием фолатов за
счет экспрессии в них бактериального гена ГТФ-циклогидролазы-1 (EcGCH).
Уже существует салат с увеличенным содержанием железа, обогащенная лизином кукуруза. Ждет своего запуска в практику сорт сои с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот (омега-3, омега-6 НЖК и др.), которые не синтезируются в организме человека, а попадают по пищевым цепям в основном через морепродукты из водорослей. Гены, встраиваемые в
геном соевых бобов, были выделены из клеток водорослей (разработчик –
компания Monsanto).
Разработаны в лабораториях и другие разнообразные трансгенные
формы растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами.
Самый первый коммерческий успех получили растения, устойчивые
к гербицидам, поскольку позволили очень успешно бороться с сорняками.
Самыми распространенными являются трансгенные растения, устойчивые к
глифосату (Раундап) – самому популярному гербициду, разлагающемуся в
почве на нетоксичные составляющие и потому безопасному для окружающей
среды. Ген был выделен из глифосат-устойчивого штамма E. coli.
Выведение растений, устойчивых к вредителям и болезням, поможет резко сократить применение химических средств защиты растений и
уменьшить стоимость культивирования. Одними из первых в широкую практику вошли инсектицидные хлопок и кукуруза – так называемые Bt-сорта,
которые были получены введением в них гена дельта-эндотоксина из
Bacillus. thuringiensis (Bt или Cry-белок). Bt-белок высокотоксичен для насекомых, но безопасен для других видов животных и человека. Он является
протоксином, который расщепляется в кишечнике личинок насекомых, образуя активированный токсин. Активированный токсин, в свою очередь, специфично связывается с рецепторами в средней кишке насекомых, что приводит к лизису клеток кишечного эпителия. Данный энтомотоксин – смертельный яд для ряда насекомых (в том числе и колорадского жука), но в то же
время вполне безопасен для человека и животных, поскольку в организме
млекопитающих нет ферментов для его расщепления и усвоения. Взаимодействие Bt-токсина с рецепторами насекомых строго специфично. В природе
найдено большое количество штаммов B. thuringiensis, чьи токсины действуют на строго определенные виды насекомых.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
96
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Ранее препараты бактерий B. thuringiensis, содержащие Bt-белок, с успехом применяли для борьбы с насекомыми-вредителями, хотя использование таких препаратов достаточно дорого и не всегда эффективно. Введение
гена протоксина в растения привело к тому, что Bt-растения перестали поедаться насекомыми. Этим путем был получен трансгенный картофель, устойчивый к колорадскому жуку.
Устойчивость к вирусам может обладать исключительной важностью
для повышения сельскохозяйственной продуктивности. В настоящее время в
различных странах мира проводят полевые испытания устойчивых к вирусам
сортов батата (вирус SPFMV, sweet potato feathery mottle virus), кукурузы
(MSV, maize streak virus) и африканской маниоки (мозаичный вирус). Возможно, эти культуры будут коммерциализованы в течение ближайших
3–5 лет. Из-за сложности генома пшеницы, работа над созданием сортов, устойчивых к вирусу желтой карликовости ячменя (barley yellow-dwarf virus),
продвигается очень медленно и до сих пор находится на стадии лабораторных экспериментов. Разработан также устойчивый к нематодам (корневым
червям) ГМ-картофель.
Генно-инженерная биотехнология растений для фармакологии делает
свои первые успешные практические шаги. Растения являются удобной,
безопасной и экономически выгодной альтернативой для получения различных
белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе
микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных.
За последние 20 лет множество ценных белков эффективно экпрессировано в
растениях. Это белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела,
вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Следует отметить перспективность получения ГМ-растений,
синтезирующих новые формы антимикробных пептидов.
Растительные системы имеют все перспективы успешного использования для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе.
Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями, уже производятся западными компаниями или будут выпущены на рынок в ближайшие
годы. Например, авидин, трипсин иβ -глюкуронидаза, выделяемые из трансгенной кукурузы, производятся фирмой Sigma-Aldrich (США). В скором времени должны быть подготовлены к промышленному производству коллаген,
липаза, лактоферрин, лизоцим, синтезируемые трансгенными растениями.
Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях. Выявленно, что при экспрессии различных антигенов в растениях сохраняется их
структурная идентичность и иммуногенность. Антигены, синтезируемые растениями, вызывали иммунный ответ при введении, например, HBs-антиген,
синтезируемый растениями картофеля, вызывал у мышей более сильный иммунный ответ, чем дрожжевой. В настоящее время более пятидесяти различных антигенов были экспрессированы в ГМ-растениях, для некоторых из них
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
97
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
показана иммуногенность при оральном введении. Интенсивно разрабатывается концепция «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи
плоды, листья и семена годятся в пищу. В случае успеха исчезнет потребность в дорогостоящей очистке антигенов, которая необходима при создании
вакцин для парентерального введения. Антигены, экспрессируемые в растениях, защищены растительными клеточными стенками от протеолиза при
прохождении пищеварительного тракта и могут быть легко доставлены к
клеткам слизистой оболочки кишечника, ответственным за мукозную систему иммунитета.
Таким образом, непрерывно разрабатываются все новые виды пищевых
и технических растений с измененными свойствами – с улучшенным составом жиров, повышенным содержанием белков и витаминов, сладкие без сахара и накапливающие меньше вредных для здоровья нитратов, с повышенными декоративными свойствами. Опытные испытания проходят сотни пород деревьев, у которых часть ненужного человеку лигнина заменена полезной целлюлозой. При этом растут ГМ-деревья вдвое быстрее обычных.
Трансгенные растения вырабатывают вакцины и лекарства, очищают почву
от химического и радиоактивного загрязнения, синтезируют биодеградируемые полимеры для производства упаковки и белок паутины, из которого
можно делать колготки и бронежилеты повышенной прочности.
2.3.4. Коммерциализация трансгенных растений
и биобезопасность
С момента публикации в 1983 г. первых работ по получению трансгенных растений табака прошло не очень много времени, но существующее сейчас количество самых разнообразных трансгенных растений уже не поддается учету. И, несмотря на то, что путь от лабораторного получения трансгенного растения до его коммерческого применения довольно долог, в настоящее время в сельскохозяйственном производстве общие площади биотехнологических культур достигли уже 114,3 млн га (рис. 2.16, табл. 2.2). Разрешения на коммерческое использование дожидаются сотни сортов десятков видов пищевых растений и технических растений с самыми разнообразными
новыми свойствами. Новые культуры проходят длительную всестороннюю
тщательную проверку в отношении биобезопасности.
Самыми распространенными из трансгенных сельскохозяйственных
растений является соя (51 %), за ней следуют быстро набирающая объемы
культивирования кукуруза (31 %), хлопок (13 %) и рапс (5 %). Необходимо
отметить, что некоторые генно-модифицированные культуры (например,
ГМ-соя) уже обогнали по захваченной площади свои «традиционные» аналоги.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
98
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Рис. 2.16. Рост общих площадей под посевами биотехнологических культур в
1996–2007 гг. (по данным ISAAA). В 2007 г. по сравнению с 2006 г. произошло увеличение площадей на 12 % или 12,3 млн га (разрешено к публикации
www.isaaa.com)
По рейтингу свойств коммерциализированных трансгенных растений,
составленному Международной службой по использованию агробиотехнологии (ISAAA), на протяжении всего периода культивирования с 1996 по 2007 гг.
первое место занимают гербицидоустойчивые культуры, затем следуют
Bt-культуры, устойчивые к насекомым-вредителям, за ними – комбинированные культуры (оба этих признака), в последние годы появились культуры,
совмещающие три признака. В 2007 г. все устойчивые к гербицидам культуры (соя, кукуруза, рапс, хлопок, люцерна и др.) суммарно занимали 63 %;
Bt-культуры –18 %; комбинированные культуры с двумя или тремя признаками –19 %. В 2007 г. по сравнению с 2006 г. быстрее всего увеличивались
площади посевов комбинированных культур (с двумя и тремя признаками) –
на 66 %; затем идут Bt-культуры – 7 % роста и устойчивые к гербицидам
культуры – 3 % роста.
Начинает увеличиваться доля культивируемых трансгенных растений,
устойчивых к вирусам, грибкам, нематодам и другим вредителям, холоду,
жаре, засухе или долго не портящихся при хранении. Новые сорта способны
не только расти, но и приносить хороший урожай там, где старые сорта просто не могли выжить (слишком холодно или тепло, или сухо). Например,
Северная Дакота, ранее считавшаяся совершенно не пригодной для выращивания соевых бобов, в настоящее время уже стала одним из главных поставщиков этой культуры в США.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
99
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Таблица 2.2
Посевные площади, занятые трансгенными растениями в 2007 г.
(разрешено к публикации www.isaaa.com)
Площадь,
ГМ-растения
млн га
1*
США
57,7
Соя, кукуруза, хлопок, рапс, папайя, бахчевые, люцерна
2*
Аргентина
19,1
Соя, кукуруза, хлопок
3*
Бразилия
15,0
Соя, хлопок
4*
Канада
7,0
Соя, кукуруза, рапс
5*
Индия
3,2
Хлопок
6*
Китай
6,8
Хлопок, томаты, сладкий перец, папайя, тополь, петуния
7*
Парагвай
2,6
Соя
8* Южная Африка
1,8
Соя, кукуруза, хлопок
9*
Уругвай
0,5
Соя, кукуруза
10*
Филиппины
0,3
Кукуруза
11*
Австралия
0,1
Хлопок
12*
Испания
0,1
Кукуруза
13*
Мексика
0,1
Соя, хлопок
14
Колумбия
<0,1
Хлопок, гвоздика
15
Чили
<0,1
Соя, кукуруза, рапс
16
Франция
<0,1
Кукуруза
17
Гондурас
<0,1
Кукуруза
18
Чехия
<0,1
Кукуруза
19
Португалия
<0,1
Кукуруза
20
Германия
<0,1
Кукуруза
21
Словакия
<0,1
Кукуруза
22
Румыния
<0,1
Кукуруза
23
Польша
<0,1
Кукуруза
* Наиболее биотехнологически развитые страны выращивают более 50 тыс. га
трансгенных растений (13 стран).
№
Страна
Широкое распространение сельскохозяйственных трансгенных растений объясняется тем, что их культивирование позволило фермерам резко повысить урожаи, при этом снизить закупки гербицидов (средств борьбы с сорняками) и закупки инсектицидов. Например, проведенные в Индии и Китае в
2007 г. исследования показали, что использование Bt-хлопка дало возможность увеличить урожайность до 50 и 10 % соответственно и сократить использование инсектицидов в обеих странах до 50 % и более. Выращивание
гербицидоустойчивых растений требует в 2–4 раза меньше гербицидных обработок полей. Не случайно за годы использования трансгенных растений
продажи химических средств защиты растений неуклонно снижаются.
Трансгенные посадки продолжают разрастаться по всему миру. В среднем за год они увеличиваются на 10–15 %. Хотя несомненным лидером в
культивировании трансгенных растений по-прежнему остаются США (табл. 2.2),
их доля неуклонно уменьшается, поскольку все больше стран начинают использовать ГМ сорта в сельском хозяйстве.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
100
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Численность населения планеты составляет 6,6 млрд (на 2008 г.), в год
увеличиваясь примерно на 80 млн. По прогнозам ООН, к 2020 г. население
Земли возрастет с нынешних 6,6 до 7,5 млрд чел., а к 2050 г. превысит
9 млрд чел. Уже сейчас продовольствия не хватает (около 800 млн чел. в мире голодают), а в дальнейшем эта проблема только обострится, так как увеличение производства продуктов питания стало отставать от прироста населения. Все возможные территории для землепользования уже освоены, традиционные способы повышения продуктивности сельскохозяйственного
производства себя уже исчерпали, а дефицит продуктов питания продолжает
нарастать. Так что альтернативы применению генно-инженерных сельскохозяйственных культур не видно.
Генетически модифицированные продукты стали одним из достижений
биологии ХХ в. Рост потребления таких продуктов считается одним из способов борьбы с голодом. Ныне во многих странах мира практически невозможно избежать употребления генетически модифицированных растений.
Так, с большой долей вероятности можно сказать, что практически все продукты, произведенные с использованием кукурузного, соевого или хлопкового масла, содержат генетически измененный материал.
Биобезопасность трансгенных растений остается предметов острых
дискуссий в обществе. Как и все принципиально новое в нашей жизни,
трансгенные растения неоднозначно воспринимаются обществом. Противники трансгенных растений утверждают, что возделывание таких растений может быть опасно как для человека, так и для окружающей среды. Большинство этих страхов, скорее всего, порождено недостаточным пониманием сущности трансгенных растений и просто неприязнью ко всему новому. Но некоторые аргументы против ГМ-растений заслуживают подробного рассмотрения. Так, противники ГМ-растений утверждают, что трансгенные растения
способны негативно влиять на окружающую среду: через так называемый
«горизонтальный перенос генов» в микроорганизмы; непредусмотренное
воздействие на организмы, живущие в агроценозе или рядом (нецелевое воздействие); утечку трансгенов с пыльцой к диким родственникам, отрицательно влияющую на биоразнообразие.
Что касается возможности переноса ДНК из ГМ-растений в микроорганизмы, наука пока таких фактов в природе не обнаружила. Если бы это на
самом деле происходило так быстро и просто, как считают оппоненты генной
инженерии растений, то за миллионы лет эволюции гены всех организмов
совершенно перемешались бы.
Преимущество белковых токсинов, продуцируемых ГМ-растениями,
перед синтетическими пестицидами очевидно: большие и нестойкие молекулы белков не накапливаются в природе – быстро распадаются до аминокислот; кроме того, они более специфичны, т.е. уничтожают только определенных вредителей (бактерии, грибы, насекомые). В отличие от этого, маленькие
молекулы химических пестицидов почти не обладают избирательностью, поражая все в зоне применения, и из-за высокой химической стабильности могут проходить по пищевым цепям и накапливаться на их вершине. Ярким
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
101
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
примером является запрещенный ДДТ, который после применения по пищевым
цепям попадает на стол человека в концентрированном и неизмененном виде.
Несостоятельными являются и утверждения, что перенос какого-либо
трансгена с пыльцой придаст дикому виду такое преимущество, что он вытеснит все остальные. Дикие растения, широко используемые селекционерами для выведения новых сортов в качестве донора нужных признаков, не вытесняют окружающие. Все культурные растения не выдерживают конкуренции с дикими, они зависят от человека и способны существовать только с его
помощью. Пока биоразнообразию в первую очередь угрожает не замена одного сорта (или даже десяти сортов) на другой, а превращение природных
ландшафтов в сельскохозяйственные.
Даже гипотетическая опасность заноса трансгенов с пыльцой в дикие
популяции родственных перекрестноопыляемых видов в настоящее время
может быть снята получением трансгенных растений с трансформированными хлоропластами (транспластомные растения), пыльца которых не содержит
трансгенов.
2.3.5. Регулирование производства и сертификация
генно-модифицированного сырья и пищевых продуктов
Практически все развитые страны приняли закон о регулировании генно-инженерной деятельности. США, являясь признанным лидером не только
в создании трансгенных растений, но и в их производстве, имеет жесткое государственное регулирование: от планирования лабораторных экспериментов до международного маркетинга ГМ-растений.
Согласно практике, принятой в США, такое регулирование осуществляется на каждой стадии создания и внедрения ГМ-растений: планирование
генно-инженерных экспериментов → полевые испытания → т оксикологическая оценка продуктов урожая → экотоксикологическая оценка производства
ГМ-растений → …→ выпуск трансгенных продуктов на внутренний и внешний рынок. Основными инстанциями, регулирующими создание и внедрение
ГМ-растений в США, являются: комитеты биобезопасности учреждений,
создающих ГМ-растений (Institutional Biosafety Committee), Служба Инспекции здоровья животных и растений (Animal and Plant Health Inspection Service –
APHIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA), Администрация
пищевых продуктов и лекарственных средств (Food and Drug Administration –
FDA), Агентство охраны окружающей среды (Environmental Protection Agency – EPA).
В России в настоящее время к выращиванию на полях не разрешено ни
одно трансгенное растение, но разрешен экспорт генетически модифицированной продукции. В России разрешены только испытания трансгенных растений, которые проводятся на специальных полигонах под строгим контролем. Основополагающим нормативным документом в сфере производства,
импорта и реализации ГМ-продуктов является Закон РФ «О государственном
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
102
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
регулировании в области генно-инженерной деятельности» от 05.07.1996 г.
№ 86-ФЗ. Статья 11 Закона прямо устанавливает: «Продукция (услуги), полученная с применением методов генно-инженерной деятельности, должна
соответствовать требованиям экологической безопасности, санитарных норм,
фармакопейных статей, обязательным требованиям государственных стандартов РФ».
На данный момент не обнаружено однозначных доказательств, что генетически модифицированные продукты способны принести вред человеку.
Хотя выгода от применения ГМ-растений очевидна, существует много противников трансгенных растений, убежденных в их опасности и использующих в своих аргументах невозможность ученых дать полную гарантию безопасности подобных продуктов. В каждой стране мира вопрос об использовании трансгенных растений решается по-разному местными законодателями.
Примерно в 30 странах мира действует правило, согласно которому
упаковки продуктов, при изготовлении которых использовались достижения
генной инженерии, должны содержать информацию об этом, чтобы потребители самостоятельно делали свой выбор. Однако во многих случаях, например, когда соя используется при производстве мясных полуфабрикатов, производители не сообщают об этом покупателям.
С 1 июня 2004 г. в Российской Федерации установлен новый допустимый порог наличия таких примесей в 0,9 %, который требуется количественно точно детектировать и указывать на упаковке.
2.3.6. Трансгенные животные: технологии получения
В отличие от растений, где существует возможность получения целого
фертильного растения из одной трансформированной соматической клетки и
вегетативное размножение, получение трансгенных животных – очень сложный и длительный процесс. Используемая стратегия состоит в следующем:
1. Клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки.
2. Оплодотворенные яйцеклетки с экзогенной ДНК имплантируют в
рецепиентную женскую особь (поскольку успешное завершение развития
эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно).
3. Отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток,
которые содержат клонированный ген во всех клетках.
4. Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках
зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.
Эксперименты по генетической модификации многоклеточных организмов путем введения в них трансгенов требуют много времени. Тем не менее, трансгеноз стал мощным инструментом для исследования молекулярных
основ экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модельных систем, позволяющих изучать болезни человека, а также для генетической модификации клеток молочных желез животных с целью получения с
молоком важных для медицины белков. Был даже предложен новый термин
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
103
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
«фарминг» (pharming), относящийся к процессу получения из молока трансгенных домашних животных аутентичных белков человека или фармацевтических препаратов. Использование молока целесообразно потому, что оно
образуется в организме животного в большом количестве и его можно надаивать по мере надобности без вреда для животного. Вырабатываемый молочной железой и секретируемый в молоко новый белок не должен при этом
оказывать никаких побочных эффектов на нормальные физиологические
процессы, протекающие в организме трансгенного животного, и подвергаться посттрансляционным изменениям, которые, по крайней мере, близки к таковым в клетках человека. Кроме того, его выделение из молока, которое содержит и другие белки, не должно составлять большого труда.
Несмотря на то, что первые трансгенные сельскохозяйственные животные были получены в 1985 г. введением экзогенной ДНК в пронуклеус зигот,
до настоящего времени не разработано эффективного метода, который бы
мог быть использован для создания генетически модифицированных животных независимо от вида и от целей эксперимента. Разработка новых эффективных методов переноса генов в эмбриональные и соматические клетки животных, а также совершенствование существующих подходов остается актуальной задачей.
Среди большого разнообразия способов внедрения экзогенной ДНК в
геном животного можно выделить следующие, которые нашли широкое применение в практике трансгеноза:
– метод микроинъекции,
– опосредованный ретровирусами перенос генов,
– использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток,
– перенос трансформированных ядер генеративных и соматических
клеток,
– использование спермиев и сперматогониев как переносчиков ДНК.
Среди других способов доставки экзогенной ДНК в организм животных
можно отметить использование липосом, аденовирусных векторов, а также
метод высокоскоростной инъекции. Однако эти методы не нашли широкого
применения вследствие их недостаточной стабильности, а также отсутствия
интеграции трансгена в геном.
Микроинъекции рекомбинантной ДНК в оплодотворенные ооциты
многоклеточных животных пока остаются наиболее популярным способом
введения чужих генов в организм животных. Несмотря на то, что метод требует высокой квалификации и дорогостоящего оборудования, простота и надежность окупают все его недостатки.
Первой и наиболее хорошо разработанной экспериментальной системой
для получения трансгенных животных явилась мышь. Донорных самок мышей с
экспериментальной суперовуляцией скрещивают с самцами-производителями,
через 12 ч выделяют оплодотворенные яйцеклетки и помещают их в культуру. Далее в больший их двух пронуклеусов (обычно мужской) инъецируют
рекомбинантную ДНК (рис. 2.17). Пережившие инъекцию яйцеклетки пересаживают самкам-реципиентам. Только часть трансплантированных ооцитов
продолжает развиваться до рождения детенышей.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
104
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
а
б
Рис. 2.17. Микроинъекция экзогенной ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки
млекопитающих под микроскопом (а) и схема эксперимента (б)
На частоту интеграции экзогенной ДНК при использовании метода
микроинъекции оказывают влияние такие факторы, как чистота вводимого
образца, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции, качество эмбрионов, а также способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопический).
Трансгенных животных в потомстве идентифицируют различными методами, чаще всего ПЦР, и скрещивают для получения трансгенных линий.
Некоторые из трансгенных животных оказываются мозаичными (половые
клетки не содержат экзогенной ДНК), поэтому при скрещивании трансгенным оказывается меньшая часть потомства первого поколения, чем расчетные 50 %. В ряде случаев гомозиготные линии получить не удается, поскольку 5–15 % трансгенных инсерций в гомозиготном состоянии летальны, так
как инсерция иногда нарушает жизненно-важные части генома.
Точный механизм, обеспечивающий интеграцию инъецированной ДНК
в хромосомы клетки-мишени, неизвестен, однако анализ структуры встроенной ДНК позволяет выявить некоторые моменты. Интеграция происходит
случайным образом в один хромосомный локус, который может содержать от
одного до нескольких тысяч тандемных копий интегрированной ДНК. Около
30 % полученных первичных трансгенных животных, как правило, обнаруживают ту или иную степень мозаичности, что может являться следствием
интеграции экзогенной ДНК после завершения первого цикла репликации.
Степень интеграции экзогенной ДНК в геном, т.е. число трансгенных
животных от общего числа родившихся животных, при использовании метода микроинъекции в зависимости от вида животных колеблется в незначительных пределах 5–15 % [4]. Наиболее важным с учетом затрат, требующихся для получения одного трансгенного животного, является показатель
общей эффективности трансгеноза, который рассчитывается как отношение
числа полученных трансгенных животных к общему числу пересаженных
эмбрионов, выраженное в процентах. Величина этого показателя для млеко Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
105
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
питающих также относительно постоянна и составляет в среднем от ~0,5 % у
свиней и коров до ~2 % у мышей.
Ретровирусные векторы также используются для получения трансгенных животных. Инфицирование предимплантационных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами – относительно несложная эффективная
процедура. Восьмиклеточную морулу (рис. 2.18) освобождают от яйцевой
оболочки и помещают в культуральную чашку с фибробластами, продуцирующими рекомбинантный ретровирус. Инфицированные эмбрионы, достигшие стадии бластулы, имплантируют псевдобеременным самкам. В результате формируются трансгенные организмы, мозаичные по числу и локализации встроек рекомбинантной ДНК в геном. Поэтому для получения чистых линий далее необходим масштабный аутбридинг.
Недостатком метода является ограничение вставки экзогенной ДНК
~8 тнп, вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих
регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии, а в некоторых случаях интеграция в исходный локус нестабильна.
Новые лентивирусные векторы (лентивирусы принадлежат семейству
ретровирусов) показали свою очень высокую эффективность при доставке
ДНК в ооциты и зиготы. Инъекция рекомбинантных лентивирусных конструкций в перивителлиновое пространство свиных зигот и коровьих ооцитов
привело к появлению потомства с самой высокой на данный момент долей
трансгенных особей. В то же время лентивирусные векторы обладают всеми
недостатками ретровирусных: малый размер вставки экзогенной ДНК и
множественная интеграция в хозяйский геном, которая может привести к таким нежелательным побочными эффектам, как активация онкогенов и инсерционный мутагенез. Кроме того, для лентивирусных векторов наблюдается
высокая степень мозаичности получаемого трансгенного потомства и отдельные факты сайленсинга (инактивации) лентивирусных рекомбинантных
последовательностей в полученных трансгенных линиях.
Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по
репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в
то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного,
что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта.
И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных,
имеющих коммерческую ценность.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
106
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Рис. 2.18. Схема получения линии трансгенных мышей
с использованием ретровирусных векторов
Модифицированные эмбриональные стволовые клетки могут быть
использованы для получения трансгенных животных. Клетки, выделенные из
мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том
числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты (рис. 2.19). Такие клетки называются плюрипотентными
эмбриональными стволовыми клетками (ES). В ES-клетки в культуре можно
ввести целевой трансген различными методами (трансфекция, электропорация, ретровирусная инфекция и т.д.) без нарушения их плюрипотентности.
Практическое достоинство этой схемы заключается в том, что она дает
большие возможности для проведения селекции клеток по определенному
параметру. Это может быть число копий трансгена, его локализация или характер экспрессии.
Зная последовательности, окружающие конкретный сайт для желаемой
интеграции, можно сконструировать вектор для встраивания целевой ДНК
путем гомологичной рекомбинации. Например, заменить какой-либо ген, кодирующий легко идентифицируемый признак с целью селекции, убрав или
восстановив его функцию в полученной трансгенной клетке. Таким же образом получают так называемых нокаутных мышей (knock out) – мышей с направленно инактивированным определенным клеточным геном для исследования его функций. Для осуществления гомологичной рекомбинации вектор
конструируют из фрагментов целевого гена, который планируется инактивировать, часть целевого гена при этом заменяется каким-либо селективным
маркером для проведения отбора клеток с интегрированной конструкцией.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
107
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Рис. 2.19. Получение трансгенных мышей методом реконструкции эмбрионов с
помощью генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток
(ES-клеток). ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши
Отобранные трансгенные ES-клетки можно культивировать и использовать для получения трансгенных животных. Это позволяет избежать случайного встраивания трансгена, характерного для метода микроинъекций и
ретровирусных векторных систем.
Все получаемые по такой схеме животные являются мозаиками, поэтому необходима селекционная работа по получению чистых линий. Проблему
мозаичности первичных трансгенных животных можно преодолеть пересадкой ядер трансформированных ES-клеток в энуклеированные ооциты, которые затем продолжают свое нормальное развитие. В результате в каждой
клетке полученного животного будет содержаться трансген.
К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные мышиным,
пока не обнаружены у других млекопитающих и птиц, но поиски продолжаются.
Перенос ядер трансформированных генеративных и соматических
клеток в яйцеклетку, или соматический ядерный перенос (somatic nuclear
transfer), еще один способ, используемый в практике трансгеноза. Было показано, что ядра эмбриональных клеток различных животных при переносе в
энуклеированную яйцеклетку иногда способны обеспечивать развитие целого нового организма. После непродолжительного культивирования даже ядра
из некоторых дифференцированных клеток способны обеспечивать развитие
до жизнеспособной особи. Так, например, знаменитая овечка Долли была
клонирована в 1997 г. слиянием культивируемых (3–6 пассажей) клеток эпителия молочной железы (вымени) взрослого шестилетнего животного с лишенной ядра яйцеклеткой (рис. 2.20). Хотя нельзя исключить, что для клонирования случайно была взята недифференцированная клетка, присутствующая в донорском эпителии.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
108
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
Рис. 2.20. Клонирование овцы методом переноса ядра. Эпителиальные клетки молочной железы в культуре индуцируют для перехода в фазу G0 (стадия, на которой
находится яйцеклетка). Затем осуществляют слияние такой клетки с энуклеированной
яйцеклеткой и выращивают эмбрионы до ранних стадий эмбриогенеза. После чего
эмбрионы имплантируют в матку суррогатной матери, где происходит дальнейшее
развитие. В эксперименте Я. Уилмута (I. Wilmut) по клонированию Долли было проведено 277 слияний безъядерных яйцеклеток с клетками молочной железы в фазе G0,
из 29 выживших эмбрионов только один развился до жизнеспособного организма
Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G0), и, возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. В зиготах овец в течение первых
трех делений, занимающих несколько суток, происходит только репликация
ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время
введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных
белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связываются с
инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки.
Хотя технологиям клонирования еще очень далеко до совершенствования – клонированная Долли выявляла многие признаки преждевременного
старения, это очень многообещающая технология получения трансгенных
животных. Даже если имеются различные проблемы с первым поколением,
скорее всего, второе поколение не будет иметь недостатков, приобретенных
вследствие использования «старого» ядра для яйцеклетки.
Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание
любых трансгенных животных с помощью метода переноса ядер стало реальным, – это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. В настоящее время ведутся активные поиски факторов репрограммирования дифференцированных клеток для индукции плюрипотентности. Если это
удастся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных ор Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
109
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
ганизмов путем соматического ядерного переноса станет почти рутинной
процедурой, а пока это единичные удачные эксперименты.
Искусственные хромосомы как трансгенный вектор. Большинство
трансгенов представляют собой кДНК, небольшие гены (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после генамишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в
обычные векторы. Учитывая все это, для трансгеноза стали использовать искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), вмещающие фрагменты геномной ДНК длиной от 100 до > 1 000 тнп и искусственные хромосомы человека
еще большей емкости (об искусственных хромосомах см. п. 2.1.4). Данные
эписомальные векторы имеют еще одно преимущество – позволяют избежать
эффект положения гена при экспрессии экзогенной ДНК. Уровень экспрессии встроенного гена очень зависит от его хромосомной позиции, например,
встраивание в неактивный хроматин (гетерохроматин) интактной хромосомы
приводит к инактивации гена.
С помощью искусственных дрожжевых хромосом (YAC), несущих несколько родственных генов или один большой ген, были получены трансгенные мыши путем микроинъекции в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки
или трансфекцией ES-клеток. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти
функциональных геновβ -глобина человека суммарной длиной примерно
250 тнп, экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время –
точно так же, как это происходит у человека. Такое соответствие обеспечивалось фланкирующими их последовательностями, которые содержат промотор и другие важные регуляторные элементы. С помощью YAC-трансгеноза
были получены мыши, которые синтезировали только человеческие антитела, являющиеся сложной тетрамерной конструкцией из двух пар разных полипептидных цепей.
Искусственные хромосомы человека (human artificial chromosome –
HAC), содержащие целиком иммуноглобулиновый локус человека с тяжелыми и легкими цепями, были внедрены в бычьи фибробласты, которые затем
использовали для соматического ядерного переноса. Полученные трансхромосомальные телята экспрессировали иммуноглобулины человека в своей
крови [5]. Эта система стала важным шагом в направлении животной продукции терапевтических поликлональных антител человека. Дальнейшие наблюдения за трансгенными животными показали, что рекомбинантные HACs
поддерживались в большинстве особей первого поколения в течение нескольких лет. Будут ли полученные искусственные хромосомы соответствующим образом разделяться в процессе мейоза и наследоваться, еще только
предстоит выяснить.
Совсем недавно возникла новая перспективная технология для получения животных с выключенными генами – малые интерферирующие РНК
(миРНК, siRNA), которые используют для прицельного выключения генов
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
110
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
(сайленсинга, см. п. 2.3.2). РНК-интерференция – консервативный посттранскрипционный регуляторный процесс. Двухцепочечные малые интерферирующие миРНК в 19–23 нуклеотида специфически связываются с комплементарной последовательностью своей матричной мРНК-мишени, направляя
ее по пути деградации. РНК-интерференция является составной частью системы генной регуляции, а именно контролирует/супрессирует трансляцию
мРНК из эндогенных и экзогенных вирусных элементов и может быть использована для терапевтических целей. Для транзиентного выключения гена
синтетические миРНК трансфецируют в клетки или ранние эмбрионы. Для
стабильной генной репрессии последовательность миРНК должна быть инкорпорирована в геном в составе экспрессионной генной конструкции. Очень
эффективна комбинация лентивирусных векторов с миРНК для интеграции в
геном. В противоположность классической нокаут-стратегии, которая требует длительного скрещивания для получения чистой линии с инактивированным геном в обоих локусах диплоидного генома, миРНК при интеграции могут легко выключить целевой ген в любой имеющейся линии животных.
Несмотря на разработанный широкий спектр методик получения трансгенных животных, в настоящее время пока отсутствует надежная и эффективная технология трансгеноза животных. Самые большие проблемы связаны с беспорядочным встраиванием экзогенной ДНК в геном при использовании большинства существующих методов. Так что дальнейшие качественные
улучшения технологии необходимы в области разработки прицельной модификации клеточных генов и точного встраивания экзогенной ДНК в геном.
Тем более что геномы большинства хозяйственно важных организмов к настоящему времени полностью секвенированы и можно планировать будущую структуру трансгенного организма. Сочетание полностью расшифрованных последовательностей геномов с методами адресной доставки экзогенной ДНК позволит проводить целенаправленное конструирование трансгенных геномов с заранее заданными свойствами.
2.3.7. Применение трансгенных животных
По применению трансгенных животных можно разделить на пять основных категорий: научные модели, модели для изучения болезней человека,
источники для производства фармацевтических препаратов, источники ксенотрансплантантов и источники пищи. Большинство из обсуждаемых ниже
областей коммерческого применения трансгенных животных в настоящее
время находятся на ранних этапах исследований и разработки, за некоторыми
исключениями. Так, с 2004 г. в зоомагазинах некоторых стран (США, Тайвань, Китай, Малайзия) продаются декоративные трансгенные рыбки, окраска которых обусловлена присутствием флуоресцентных белков из кораллов.
Важной вехой в истории применения трансгенных животных стал 2006 г., когда Европейское медицинское агентство (the European Medicines Agency
(EMEA)) выдало первое разрешение на коммерческое использование первого
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
111
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
рекомбинантного белка из молока трансгенного животного. Им стал рекомбинантный антитромбин III с коммерческим названием ATryn, который
предназначен для профилактического лечения пациентов с врожденной антитромбиновой недостаточностью.
Научные модели. Сложность генома млекопитающих, длительные периоды взросления и размножения, трудности изучения большого числа индивидуальных животных с учетом варьирования признаков делают генетический анализ этих систем затруднительным. Трансгенная технология несет в
себе большие возможности, в первую очередь, для фундаментальных исследований принципов функционирования геномов и отдельных генов. Например,
линии нокаутных мышей, гомозиготных по направленно-инактивированным
генам, позволяют изучать детерминируемые данными генами свойства на
уровне организма. Регулируемые системы экспрессии трансгенов дают возможность исследовать тонкие механизмы воздействия продуктов того или
иного гена на физиологию и эмбриональное развитие животных.
Модельные системы для изучения болезней человека. Используя целых животных, можно моделировать возникновение патологии, исследовать
ее развитие и способы лечения. И хотя данные, полученные на трансгенных
моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в медицинских аспектах, они позволяют выявить ключевые моменты этиологии сложной болезни, ее молекулярные основы и подсказать пути лечения. В настоящее время на мышах смоделированы такие заболевания человека, как СПИД, болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, гипертония, образование
опухолей, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной системы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие. Получена дрозофила с болезнью Паркинсона.
Источники для производства фармацевтических белков. Существующие методы получения в культурах клеток рекомбинантных человеческих протеинов для медицинских целей имеют ряд существенных недостатков и жестких законодательных ограничений. Одной из особенностей таких
медицинских препаратов является их крайне высокая цена, обусловленная в том
числе высокой стоимостью клеточного культивирования. Преодолевая эти ограничения, большое количество белков можно получать из молока трансгенных
животных, несущих человеческие гены, ответственные за выработку определенного протеина, под контролем промоторов, специфичных для молочных желез. Предполагается, что выход может составить до 35 г белка из одного литра
молока при относительно невысокой стоимости производства и очистки.
Человеческие белки, секретируемые в молоко, гликозилируются соответствующим образом и обладают активностью, близкой к нативным белкам
человека. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не
оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на
вскармливаемое потомство. В настоящее время многочисленные белки получены в больших количествах эффективной секрецией в молоко трансгенных
мышей, кроликов, овец, свиней, коз и коров. Часть рекомбинантных белковых препаратов из молока трансгенных животных уже готовится к выходу на
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
112
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
рынок (табл. 2.3). Первым препаратом из молока стал ATryn (человеческий
антитромбин III), который в 2006 г. после 3-й фазы клинических испытаний
был зарегистрирован как лекарство в Европейском союзе.
Таблица 2.3
Терапевтические белки из молока трансгенных животных,
готовящиеся к выпуску на фармацевтический рынок
ЖивотПродукт
Компания
ноеЭтап выхода на рынок*
источник
ATryn, рекомбинантный антиGTC Biotherapeutics Коза
ЕС: выход на рынок
тромбин III человека
США: фаза 3
С1 эстеразный ингибитор
Pharming
Кролик
Фаза 3
MM-093 (AFP), альфа-фетопротеин Merrimack and GTC Коза
Фаза 2
Biotherapeutics
Альфа-глюкозидаза
Pharming
Кролик
Фаза 2, ожидание
Человеческий гормон роста
BioSidus
Корова
Доклинический
Альбумин
GTC Biotherapeutics Корова
Доклинический
Фибриноген
Pharming
Корова
Доклинический
Коллаген
Pharming
Корова
Доклинический
Альфа-1-антитрипсин
Pharming
Корова
Доклинический
Лактоферрин
GTC Biotherapeutics Коза
Доклинический
Малярийная вакцина
GTC Biotherapeutics Коза
Доклинический
CD 137 (4–1BB) MAb, монокло- GTC Biotherapeutics Коза
Доклинический
нальные антитела
* Фазы 2 и 3 – фазы клинических испытаний
Успешная регистрация препарата ATryn продемонстрировала правильность такого подхода к продукции терапевтических белков и облегчила путь
на рынок другим рекомбинантным препаратам из молока трансгенных животных, а также стимулировала научную и коммерческую активность в данной области.
Другим источником продукции рекомбинантных белков является кровь
трансгенных животных. Получены трансгенные бычки, продуцирующие биспецифичные антитела человека в своей крови. Эти антитела после очистки
из сыворотки были очень стабильны и соответствующим образом стимулировали Т-клеточное уничтожение раковых клеток.
Получение трансгенных цыплят открыло возможность использовать
яйца, содержащие немало запасных белков для накопления нужных рекомбинантных белков – активных компонентов лекарственных средств. В этом
случае белки можно получать в больших количествах, и их производство будет дешевым, так как сырьем для этого является всего лишь птичий корм.
В институте Рослин, где была клонирована Долли, разработаны 2 линии
трансгенных кур с перспективой на коммерческое применение. Одна из линий несет яйца с антителами miR24 в яичном белке, с помощью которых
можно будет лечить злокачественную меланому – форму рака кожи, другая
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
113
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
производит человеческий интерферон β-1a, который может быть использован
для остановки внутриклеточного размножения вирусов. Разрешение на клинические испытания препарата против рака на основе куриных яиц уже получено. В настоящее время продолжаются работы по увеличению выхода рекомбинантных белков, как на стадии производства, так и на стадии очистки.
Чтобы обезопасить рекомбинантные продукты, руководство, разработанное в США и Европейском союзе для получения ГМ-животных, требует
контролировать здоровье трансгенных животных, проверять корректность
полученных трансгенных конструкций, характеризовать очищенный рекомбинантный белок, а также провести новую трансгенную линию через несколько поколений.
В России также ведутся разработки в области получения трансгенных
животных для биопродукции важных белков. Например, существует государственная программа, нацеленная на создание фармакологического производства человеческого лактоферрина путем секреции в молоко коз. Сильные
антибактериальные свойства лактоферрина, содержащегося в грудном молоке, защищают новорожденных детей от инфекций, поэтому получение молока с лактоферрином в больших количествах может стать новой отраслью
производства детского питания.
Трансгенные животные как источники ксенотрансплантантов для
человека. Хронический дефицит человеческих органов для трансплантации
вынуждает ученых искать другие альтернативные источники тканей. Только
в США в базе данных United Network for Organ Sharing на 2006 г. зарегистрировано более 80 тыс. чел., нуждающихся в пересадке органов. Решением этой
проблемы могла бы быть пересадка человеку органов животных. Так, например, органы свиньи подходят человеку по своему строению, размеру и многим биохимическим показателям, но такие пересадки невозможны, так как
эти органы будут немедленно отторгнуты иммунной системой пациента.
В настоящее время ряд исследовательских центров работают над выведением генетически модифицированных свиней, органы которых могут быть
использованы для трансплантации. Необходимыми условиями для успешной
ксенотрансплантации являются:
1) преодоление иммунологических барьеров (гистосовместимость),
2) недопущение переноса патогенов от донорного животного человеку,
3) анатомическая и физиологическая совместимость донорного органа
с человеческим.
С помощью соматического ядерного переноса получены животные, у
которых супрессирован пока первый иммунологический барьер – реакция отторжения немедленного типа (гиперактивное отторжение). ГМ-свиньи синтезировали человеческие регуляторы комплемента (RCAs) и/или не имели генов 1,3-α-galactosyltransferase (α-gal), кодирующих фермент, ответственный
за выработку на поверхности клеток свиньи углеводных антигенов, которые
приводят к гиперактивному отторжению. Первые эксперименты по пересадке
свиных трансгенных почек и сердца нечеловекообразным приматам (павиа Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
114
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
ны) с иммунной супрессией показали отсутствие реакции отторжения немедленного типа, но выживаемость пересаженных органов составляла всего 2–6
месяцев. Работы по получению свиней-ксенотрансплантеров с множественными трансгенами, критичными для преодоления других иммунологических
барьеров, продолжаются.
Недавние исследования показали, что риск передачи человеку свиных
ретровирусов чрезвычайно мал, это открывает путь для доклинических испытаний свиных ксенотрансплантантов. Кроме того, этот факт позволяет использовать свиной эндогенный ретровирус (PERV) в качестве вектора для
эффективной доставки экзогенной ДНК в клетки. После селекции такие клетки
могут стать родоначальниками трансгенных свиней-ксенотрансплантеров, полученных соматическим ядерным переносом. Также в рамках программы получения свиней для трансплантации несколько компаний занимаются выведением пород свиней с размерами органов, близкими к человеческим.
Следует отметить, что, несмотря на многолетние исследования, пересадка человеку органов свиньи все еще является отдаленным проектом.
Трансгенные животные, служащие источником пищи, еще очень
далеки от коммерческого использования, хотя очень много различных вариантов уже создано. Например, в геном свиней удалось встроить несколько
ускоряющих рост генов, которые также оказывают влияние на качество мяса,
делая его более постным и нежным. Эта работа начата более 10 лет назад,
однако в силу определенных негативных морфологических и физиологических изменений, наблюдавшихся у животных, этот вариант не был коммерциализован. Скорее всего, негативные изменения в данных трансгенных
свиньях были обусловлены несовершенством использованной генетической
конструкции, так что работы в этом направлении продолжаются.
Предложено также большое количество модификаций молока крупного
рогатого скота, заключающихся в добавлении новых белков либо в манипуляциях над эндогенными протеинами. Например, были созданы животные,
продуцирующие молоко для детского питания, по своему составу максимально приближенное к материнскому молоку человека. Другой пример –
недавно ученые из Новой Зеландии получили коров с повышенным содержанием в молоке казеина. Использование такого молока должно повысить продуктивность сыроваренного производства. Еще несколько групп исследователей работают над снижением содержания в молоке лактозы. Конечной целью является создание молока, пригодного для употребления в пищу людьми
с лактозной непереносимостью.
Пока ближе всех на пути к коммерциализации находятся фитазные
трансгенные свиньи (экосвиньи, enviropigs), целью создания которых было
резкое уменьшение навозного загрязнения окружающей среды. Эта линия
несет ген бактериальной фитазы под транскрипционным контролем тканеспецифичного промотора слюнных желез. Секретируемая рекомбинантная
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
115
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
фитаза позволяет свиньям расщеплять растительные фитаты (инозитол гексафосфат, ИГФ – наиболее распространенная нерастворимая форма органического фосфора почвы), что уменьшает выход загрязняющих окружающую
среду фекальных токсичных соединений фосфора (до 75 %). Ожидается выход этих свиней на рынок в следующие несколько лет.
С учетом предполагаемого повышения потребности в рыбопродуктах
ГМ-рыба может приобрести большое значение как продукт питания. Наиболее вероятно, что первым ГМ-животным на продовольственном рынке станет
быстрорастущая семга (Salmo salar), в геном которой встроен ген гормона
роста чавычи (Oncorhynchus tschawytscha). Такая семга растет в 3-4 раза быстрее нетрансгенных аналогов, что значительно уменьшает время выращивания. Еще, по крайней мере, 8 искусственно выращиваемых видов рыбы генетически модифицированы с целью ускорения роста. Ген гормона роста в порядке опыта встроили в геномы таких рыб, как белый амур, радужная форель, тиляпия и сом. Во всех случаях трансгены выделяли из геномов рыб
других видов.
Трансгенные домашние любимцы. Пока что самым успешным случаем коммерциализации трансгенных животных можно считать декоративных
рыбок. Трансгенная аквариумная рисовая рыбка Oryzias latipes, яркая зеленая
окраска которой обусловлена встроенным геном зеленого флуоресцентного
белка из медуз, продвигается на рынок тайваньской компанией Taikong.
Под торговой маркой GloFish в США продаются (5 дол./шт.) разноцветные рыбки-зебры Danio rerio, окрашенные флуоресцентными белками
кораллов. При соответствующем освещении красные, зеленые и желтые рыбки начинают ярко флуоресцировать, хотя природная окраска D. rerio скромного серого цвета. В Европе, Канаде и Австралии трансгенные рыбки запрещены, видимо, вследствие общих предубеждений против трансгенных животных. Дискуссии сторонников и противников трансгенных животных продолжаются.
2.3.8. Перспективы использования
генетически модифицированных организмов
В течение последних 50 лет достижения генетической и молекулярной
биологии обеспечили возможность создания и коммерческого использования
генетически модифицированных организмов, обладающих новыми свойствами за счет преодоления межвидовых барьеров. Присущие ГМО характеристики могут оказать значительное положительное влияние на производство
продуктов питания, фармакологических препаратов, ценного сырья для промышленности. Наиболее коммерциализованными из ГМО являются растения, поскольку для них процесс трансгеноза осуществляется гораздо легче и
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
116
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
быстрее. Это обусловлено способностью растений регенерировать из единственной клетки и возможностью вегетативного размножения. В настоящее
время ГМ-культуры занимают около 4 % общей площади возделываемых земель в мире. Среди культивируемых ГМ-растений первое место занимает
соя, за которой следуют кукуруза и хлопок. В стадии получения разрешения
на культивирование находятся сотни видов растений с измененной пищевой
ценностью, повышенной продуктивностью, устойчивостью к внешней среде,
с измененным внешним видом и т.д.
С ГМ-растениями связаны надежды на преодоление дефицита продовольствия и сырья, несмотря на растущее население нашей планеты. Традиционные способы повышения продуктивности сельскохозяйственного производства себя уже исчерпали, а дефицит продуктов питания продолжает нарастать. Единственной альтернативой остается совершить качественный скачок в производстве продуктов питания путем конструирования новых видов
растений с резко увеличенной хозяйственной полезностью и устойчивостью
к неблагоприятным факторам культивирования.
В отличие от растений, получение трансгенных животных – очень
сложный и длительный процесс, чрезвычайно тесным образом связанный с
достижениями в области молекулярных и репродуктивных технологий. В настоящее время подавляющее большинство проектов по созданию трансгенных животных находится на ранних этапах исследований и разработки, за
некоторыми исключениями. Необходимость создания таких животных диктуется, в первую очередь, насущными потребностями человека в фармацевтических препаратах из человеческих белков.
Основной платформой для производства таких белков являются клеточные культуры животных и человека. Девять из десяти наиболее популярных биотехнологических лекарственных препаратов, продающихся в США,
произведены в клеточной культуре клеток млекопитающих и, по крайней
мере, продажи 23 белковых препаратов превышают один биллион долларов.
Появляются новые препараты, которые нужно производить в больших
количествах, чтобы удовлетворить растущие потребности общества. Ожидается, что рекомбинантные антитела станут наиболее важным и успешным
продуктом, особенно для применения в онкологии. Однако количество этого
препарата для удовлетворения потребностей мирового рынка просто огромно –
от сотни килограммов до нескольких тонн, что превышает текущие и, вероятно, будущие возможности производства на основе клеточных культур. Установлено, что при индустриальной продукции моноклональных антител в
количестве ~100 кг/год стоимость грамма рекомбинантного препарата при
использовании трансгенной козы будет в 3-4 раза меньше, чем в культуре
CHO-клеток с дальней экономией при увеличении масштабов производства.
Для биоактивности многих человеческих белков требуется соответствующий посттрансляционный процессинг, и это главная причина использо-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
117
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы
вания для биопродукции животных или культивируемых животных клеток, а
не бактерий, дрожжей или растений. Это относится ко многим важным биомедицинским продуктам, таким как факторы свертывания крови и антитела,
которые в настоящее время не имеют другой альтернативы, чем продукция в
животных клетках. Таким образом, создание трансгенных животных может
решить многие проблемы современного общества.
Подтверждением необходимости трансгенных организмов является
бурный рост биотехнологических рынков в последние годы. Так, например,
продажи на рынке биотехнологических медицинских препаратов в 2007 г.
достигли более 75 млрд дол., с общим ростом в 12,5 %, что в два раза больше, чем рост глобального фармацевтического рынка, согласно докладу IMS
Health, из них 56% продаж пришлось на США. В 2006 г. рынок биотехнологических медицинских препаратов вырос на 18,2 % до приблизительно
65 блн дол. (биллионов). Причем основная прибыль в 2007 г. была получена
большей частью за счет продаж 22 биотехнологических продуктов, приблизительно по 1 блн дол. за каждый. Для сравнения, в 2002 г. таких «блокбастеров» было только шесть. Десятку самых популярных терапевтических агентов возглавляют эритропоэтины, далее следуют противоопухолевые, антидиабетические препараты, аутоиммунные агенты и интерфероны, согласно
IMS Health. В будущем ожидается большое количество противоопухолевых препаратов в сочетании со значительной неудовлетворенной потребностью в них.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
118
Г ЛА В А 3
МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ:
ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ТЕРАПИИ
И ДИАГНОСТИКИ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
Существует точка зрения, которую разделяет немалое число специалистов, что все заболевания человека за исключением травм связаны с генетическими дефектами. Очевидно, это крайняя точка зрения, тем не менее она
отражает важность генетических факторов в определении состоянии здоровья людей. Генетические дефекты бывают разной значимости и состояния.
Хотя обычно считают диабет и мышечную дистрофию заболеванием, а расщепление неба или цветовую слепоту – наследственными дефектами – все
это является результатом мутаций в генетическом материале. Показано также, что предрасположенность к заболеванию также зависит от генетической
конституции.
Генетические дефекты или мутации в последовательности ДНК выражаются в замене одного нуклеотида другим, потере целого фрагмента или
его переносе на другое положение в геноме и пр. Такие изменения могут
привести к изменениям структуры (и функции) белка, который кодируется
данным фрагментом ДНК или к изменению регуляторных участков генов,
гибельным для клеток. Говоря о наследственных заболеваниях, мы имеем в
виду мутации, которые появляются в половых клетках и передаются потомству. В соматических клетках на протяжении жизни также накапливаются
мутации, которые могут стать причиной заболевания, но они по наследству
не передаются. Ранее считалось, что все мутации вредны. Это связано с тем,
что именно с таких мутаций, вызывающих заболевания, было начато изучение генетических характеристик человека. Но сейчас, когда прочитан практически весь нуклеотидный текст человека, стало ясно, что большая часть
мутаций является нейтральной. Вредные мутации, приводящие к грубому нарушению развития организма, отсеиваются отбором – их носители не выживают или не дают потомства.
Огромный прорыв в понимании, как унаследованные гены влияют на
физические и психологические особенности человека, произошел за последние десятилетия благодаря открытиям, сделанным при исследовании генома
человека. Установлены и диагностируются как целый ряд генетических заболеваний, так и предрасположенность к ним, причем на самых ранних этапах
развития эмбриона. Большие надежды на расширение возможностей современной медицины связаны с реализацией проекта «Геном человека».
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
119
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
3.1.1. Реализация научного проекта «Геном человека»
Научный проект «Геном человека» – это международная программа,
конечной целью которой являлось определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) всей геномной ДНК человека, а также идентификация генов и их локализация в геноме (картирование). В 1988 г. Министерство энергетики США и Национальный институт здоровья США представили обширный проект, в задачи которого входило секвенирование геномов человека, а также бактерий, дрожжей, нематоды, плодовой мушки и мыши – организмов, которые широко использовались в качестве модельных
систем в изучении генетики человека. На реализацию этого проекта Конгресс
выделил 3 млрд дол. (по одному доллару за каждый нуклеотид человеческого
генома). Директором проекта был назначен лауреат Нобелевской премии
Джеймс Уотсон. К проекту присоединились другие страны – Англия, Франция, Япония и др.
В 1989 г. по инициативе академика А.А. Баева в нашей стране был организован научный совет по программе «Геном человека». В 1990 г. была
создана Международная организация по изучению генома человека (HUGO),
вице-президентом которой в течение нескольких лет был академик А.Д. Мирзабеков. Независимо от вклада и государственной принадлежности отдельных
участников программы с самого ее начала вся получаемая ими в ходе работ информация была открыта и доступна для всех его участников. Двадцать три хромосомы человека были поделены между странами-участницами. Российские
ученые должны были исследовать структуры 3-й и 19-й хромосом. Однако
вскоре финансирование работ по этому проекту было сильно сокращено, и
реального участия в секвенировании наша страна не принимала. Тем не менее работы по геномному проекту в нашей стране не прекратились: программа была пересмотрена и сконцентрирована на развитии биоинформатики –
математических методов, вычислительной техники, программного обеспечения, совершенствовании способов описания и храненеия геномной информации, которые бы помогли понять и осмыслить расшифрованную информацию.
На расшифровку генома человека было отведено 15 лет. Однако постоянное развитие технологии секвенирования позволило завершить проект на
2 года раньше. Немалую роль в интенсификации работ сыграла частная американская компания Celera, возглавляемая Дж. Вентером (в прошлом – биолог Национального института здоровья США). Если в начальные годы осуществления проекта по всему миру секвенировали несколько миллионов
нуклеотидных пар в год, то в конце 1999 г. Celera расшифровывала не менее
10 млн нуклеотидных пар в сутки. Для этого работы велись круглосуточно в
автоматическом режиме 250 роботизированными установками, информация
сразу же передавалась в банки данных, где систематизировалась, аннотировалась и выкладывалась в Интернет.
При проведении работ в 1995 г. Вентер с соавторами разработал и
опубликовал совершенно новый подход к секвенированию генома, назван Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
120
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
ный методом произвольного секвенирования полного генома (более известный
как произвольное секвенирование методом дробления), который позволял собрать полный геном из частично секвенированных фрагментов ДНК при помощи компьютерной модели.
Этим методом впервые был полностью секвенирован геном самореплицирующегося свободно живущего организма – бактерии Haemophilus influenzae Rd. Копии ДНК бактерии были разрезаны на куски произвольной
длины от 200 до 1 600 п.о. Эти фрагменты секвенировали по несколько сот с
каждого конца. Кроме того, были секвенированы и более длинные фрагменты по 15–20 тыс. п.о. Полученные последовательности были внесены в компьютер, который их сравнивал, распределял по группам и по сходству. Первыми идентифицировались неповторяющиеся последовательности, затем –
повторяющиеся последовательности фрагментов. Длинные фрагменты помогали установить порядок часто повторяющихся, почти идентичных последовательностей. Затем заполнялись пробелы между полученными основными
кусками ДНК. Секвенирование генома Haemophilus influenzae заняло один год и
при этом была определена последовательность 1 830 137 п.о. и 1 749 генов,
расположенных на 24 304 фрагментах. Это был несомненный успех, который
доказал, что новая технология может быть применима для быстрого и точного секвенирования целых геномов. В 1996 г. картировали геном первой эукариотической клетки – дрожжевой, а в 1998 впервые секвенировали геном
многоклеточного организма – круглого земляного червя Caenorhabolits
elegans.
В феврале 2001 г. рабочий вариант генома человека (выполненный на
90 %) был одновременно опубликован в журналах «Nature» – результаты
HUGO и «Science» – результаты исследований компании Celera. Анализ полученного варианта генома человека выявил около 25 тыс. генов. Ранее
предполагалось, что это количество должно достигать 140 тыс. (если исходить из постулата «один ген кодирует один белок»). В настоящее время
представляется возможным, что один ген может кодировать 5-6 белков. Многообразие белков, кодируемых одним и тем же геном, обеспечивается несколькими механизмами: с помощью альтернативного сплайсинга, посттрансляционных превращений белков – фосфорилирования, ацетилирования, метилирования, гликозилирования и многих других.
В 2003 г. был опубликован окончательный вариант полной последовательности генома человека. Вся эта информация является доступной и находится в Интернете на нескольких сайтах (см.: http://jbirc.jbic.or.jp/g-compass).
Однако до сих пор некоторые элементы генома не поддаются секвенированию современными технологиями, а наши знания о геноме остаются неполными. Оказалось, что лишь 30 % генома кодируют белки и участвуют в регуляции действия генов. Каковы функции остальных участков генома и есть ли
они вообще, остается совершенно неясным. Около 10 % генома составляют
так называемые Alu-элементы длиной около 300 п.о. Они появились неизвестно откуда в ходе эволюции только у приматов. Попав к человеку, они
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
121
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
размножились до полумиллиона копий и распределились по хромосомам самым причудливым образом. Что касается кодирующих участков ДНК, то при
чисто молекулярно-компьютерном анализе они были названы генами по сугубо формальным критериям: наличию знаков пунктуации, необходимых для
прочтения информации и синтеза конкретного генного продукта. При этом
время и действие большинства потенциальных генов пока неясны, и для определения их функций может потребоваться не меньше ста лет.
3.1.2. Построение генетических карт хромосом
Сиквенс генома – это всего лишь последовательность из одних и тех же
четырех букв в бесконечной вариации. Взглянув на нее, никто не сможет
мгновенно вычислить ее функцию. Однако, вставив последовательность оснований на правильное место в геноме, можно получить ключ к разгадке ее
функции. Карта генома – это графическая схема, позволяющая исследователям ориентироваться в геноме, искать в нем места, которые могут быть важны и интересны. В простейшем виде карта генома представляет собой линию,
по всей длине которой расположены различные ориентиры, помеченные буквами и цифрами, дающие возможность исследователю идентифицировать отдельные признаки. Карта не одно и то же, что и последовательность оснований генома. Расположение генов на карте можно вычислить без определения
последовательности оснований. Приблизительная локализация генов, нарушения в которых связаны с рядом наследственных заболеваний, была установлена задолго до секвенирования генома человека при исследовании наследования различных сцепленных признаков. Методы, которые используются при этом, подробно излагаются в курсе «Генетика». Здесь же мы затронем лишь общие закономерности части из них.
Как проводится построение генетические карты? Предположим, что
необходимо выяснить расположение определенного гена, вызывающего заболевание, которое выражается определенными фенотипическими признаками. Сначала обследуют несколько семей, представленных несколькими поколениями, члены которых страдают этим заболеванием, чтобы узнать, с какими другими генетическими признаками связана эта болезнь. Гены любых
признаков, имеющих тенденцию наследоваться вместе с предрасположенностью к болезни, с большой долей вероятности могут быть локализованы на
одной хромосоме рядом с генами, вызывающими болезнь. Их выбирают в качестве маркеров для искомого гена. Определив несколько маркеров с известным расположением на хромосоме, можно с большой точностью (до нескольких миллионов п.о.) установить расположение гена, вызывающего болезнь. Затем исследования фокусируются на части генома, несущей указанный ген, и поисках гена, который имеет различную последовательность оснований у здоровых и больных людей, или гена, функции которого могут
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
122
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
быть связаны с болезнью. Именно так были идентифицированы гены, связанные с фиброзом мочевого пузыря и болезнью Гантингтона. Однако путь
этот долог и трудоемок, поэтому целью генетиков остается разработка более
детальных карт геномов, которые позволят с точностью находить последовательности, нужные в каждом конкретном случае.
Существует два типа генетических карт – карты генетического сцепления и физические карты.
Карты генетического сцепления показывают порядок расположения
генов на хромосоме и относительные расстояния между ними. Впервые такую карту составили в начале ХХ в. в лаборатории Колумбийского университета, возглавляемой Томасом Г. Морганом (лауреат Нобелевской премии
по физиологии и медицине, 1933 г.). Объектом этих классических генетических исследований были избраны плодовые мушки Drosophila melanogaster,
мелкие размеры и неприхотливость которых позволяли проводить эксперименты с сотнями мух. Кроме того, они быстро размножались и оказались
чрезвычайно плодовитыми – новое поколение появлялось через каждые
12 сут, и самка откладывала до 1 000 яичек. Плодовые мушки имеют 4 пары
хромосом, включая пару половых. Морган заметил, что если самца с белыми
глазами скрестить с красноглазой самкой, то у потомства глаза будут красными; но при скрещивании потомства друг с другом «белоглазость» проявляется вновь, но только у самцов. Морган сделал вывод, что этот признак и
другие «ограниченные полом» признаки, например, дальтонизм у людей, который поражает только мужчин, должны располагаться на Х-хромосоме. Это
была первая мутация, связанная с определенной хромосомой. В течение нескольких последующих лет были идентифицированы более 40 мутаций у
плодовых мушек, часть из которых оказались сцепленными друг с другом.
Сейчас различают четыре основных вида наследования: аутосомнодоминантный, аутосомно-рецессивный (относится к 22-м парам неполовых хромосом), а также Х-сцепленный доминантный и Х-сцепленный рецессивный.
Схема эксперимента Моргана с белоглазыми мушками приведена на
рис. 3.1. Этот эксперимент демонстрирует случай Х-сцепленного рецессивного наследования. Итак, гены сцепленных признаков расположены на одной
хромосоме. Для определения сцепления генов группа Моргана скрещивала мутантов с нормальными мушками и полученное потомство снова и снова, пока
не получали достаточное количество мушек с сохранением мутации на определенной хромосоме. Поскольку их расположение было известно, такие мутации
служили маркерами. Затем самцов с новой мутацией скрещивали с самками,
несущими эти маркерные мутации. Как уже было отмечено, белые глаза были результатом мутации на Х-хромосоме. Если новая мутация постоянно
проявлялась у белоглазых мух, это означало, что и она расположена на
Х-хромосоме.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
123
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
Рис. 3.1. Результаты скрещивания белоглазых мушек с красноглазым самцом. Черными треугольниками помечены Х-хромосомы,
несущие доминирующий признак красных глаз. Белыми перевернутыми треугольниками обозначены Х-хромосомы, несущие рецессивный признак белых глаз. Серые треугольники – Y-хромосомы
Однако встречались признаки, которые передавались вместе, но не всегда, например, признаки белого глаза и рудиментарного крыла. Этот эффект
объясняется происходящим во время мейоза кроссинговером (обменом между генными участками хромосом). Если интересующие нас гены находятся
на одной и той же хромосоме, но располагаются далеко друг от друга, в результате кроссинговера при образовании половых клеток они с большой вероятностью попадут в разные клетки. Близко расположенные гены не будут
разделяться при кроссинговере. Таким образом, можно установить не только
нахождение гена на определенной хромосоме, но и приблизительно определить взаимное расположение генов на ней, если учесть, как часто они проявляются в потомстве в результате скрещиваний. Пользуясь полученными результатами, сотрудники лаборатории Моргана построили первую карту
Х-хромосомы плодовой мушки (рис. 3.2). Позднее были построены первые
генетические карты и других 3 хромосом. По сути, они являются прототипом
современных генетических карт.
Карты Моргана были построены на генетических признаках, физически
видимых у исследуемых мушек. Сегодня гораздо более сложные карты сцепления генов строятся на определении наследования специфических последовательностей ДНК. В частности, для этого используется метод, основанный на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
124
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
Рис. 3.2. Примерный вид первой генетической карты, показывающей
расположение пяти признаков на хромосоме плодовой мушки
Для возникновения аллелей достаточно, чтобы два гомологичных гена
отличались всего одним нуклеотидом. Если вероятность появления такой замены (мутации) больше 1 %, то говорят, что имеет место генетический полиморфизм. Замена всего одного нуклеотида может вызвать значительное изменение свойств кодируемого белка, по сравнению с нормальным. Однако
множество однонуклеотидных замен не приводит к синтезу измененных генных продуктов. Более того, замены, происходящие в некодирующих областях
(а в человеческом геноме они составляют около 90 %), не приводящие ни к
каким изменениям, распределены по всей длине хромосомы и представляют
собой полиморфные сайты, которые используются в качестве маркеров для
генетического маркирования. Но сначала эти полиморфные сайты нужно обнаружить. Метод состоит в следующем. ДНК расщепляют с помощью определенной рестриктазы по специфическим местам. Если в сайте рестрикции
находится однонуклеотидная замена, рестриктаза его не узнает и расщепления не происходит. В то же время она по-прежнему узнает и расщепляет интактный сайт в другой хромосоме. Таким образом, в результате обработки
рестриктазой двух этих аллелей получается набор разных продуктов (фрагментов ДНК разной длины), которые затем опознаются с помощью гибридизации со специфичным зондом (см. пример на рис. 3.8).
Явление встречающегося в популяции измененного сайта рестрикции,
приводящее к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называется полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов. Полиморфные
сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они
присутствуют. В настоящее время идентифицированы тысячи ПДРФ-локусов,
благодаря чему значительно увеличилось число аллелей, которые можно использовать для генетических исследований. Определение аллелей ПДРФлокуса, присутствующих на хромосомах данного индивидуума, называется
генотипированием (ДНК-типированием). Наследование ПДРФ-локусов происходит в соответствии с законами Менделя и можно проследить их передачу в
пределах родословной. Используя сцепление гена того или иного заболевания с маркерным локусом, можно определить хромосомную локализацию
этого гена. С их помощью были изолированы гены таких наследственных заболеваний, как миодистрофия Дюшена и муковисцидоз.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
125
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
Рис. 3.3. Карта генома хромосомы Micobacterium tuberculosis. На внешней окружности показано расположение генов, кодирующих соответствующие белки, общие
для штаммов CDC1551 (клинический) и H37Rv (лабораторный). Каждая из внутренних окружностей отражает различия между этими штаммами. Например, вторая
окружность показывает локализацию синонимных замен, пятая – обнаруженные в
штамме CDC1551 вставки и т.д. [1] (с разрешения American Society for Microbiology)
Другим типом полиморфных локусов являются так называемые короткие тандемные повторы (STR, от англ. short tandem repeats). Дело в том, что
по геному человека равномерно распределены примерно 100 000 блоков динуклеотидных повторов, содержащих до 40 CA/GT-элементов. Любой такой
блок, локализованный в определенном участке хромосомы, передается из поколения в поколение с сохранением числа повторяющихся элементов. В геноме встречаются также повторы (AT)n, (ATG)n, (ATCG)n. Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, проводят скрининг геномной библиотеки человека, содержащий вставки небольшого размера (около 1 000 п.о.),
используя подходящий олигонуклеотидый зонд. Для (CA)n-повторов обычно
используют зонд (CA)15. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы
установить длину повтора и нуклеотидные последовательности фланкирую-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
126
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
щих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийными, проводят гибридизацию с комплементарными
им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются
в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и
осуществляют амлификацию СА-повторов. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученных от большого числа индивидуумов. Длина ПЦР-продуктов (применяют примерно 200 п.о.) определяется с помощью полиакриламидного гель-электрофореза. Если длина амплифицированного таким образом сегмента одинакова для всех исследуемых
образцов ДНК, значит повтор не полиморфен и наоборот, если образуются
ПЦР-продукты разной длины, это указывает на полиморфизм по данному
STR (STR-полиморфизм, STRP).
Различающиеся по длине повторы данного локуса представляют собой
аллели, которые встречаются с частотой 20 % и более. Использование STRPлокусов для картирования геномов, по сравнению с ПДРФ-локусами, имеет
ряд преимуществ:
1) для их идентификации нужна информация о нуклеотидной последовательности только пары праймеров, которая может храниться в компьютерной базе данных;
2) эти локусы равномерно распределены в геноме;
3) их частоты очень высоки, что обеспечивает высокую гетерозиготность;
4) они без труда идентифицируются после ПЦР-амплификации.
Физическая карта целой хромосомы или ее области дает непосредственное представление о расположении генов в ДНК, что облегчает их идентификацию и характеристику. Существующие в настоящее время, после завершения секвенирования генома человека, геномные карты совмещают черты обоих типов карт. Созданы электронные сайты, где специалисты могут
получить информацию о содержании различных хромосомных карт, включая
их полное графическое изображение, о методах исследования генома и программном обеспечении. На рис. 3.3. показана карта хромосомы Micobacterium tuberculosis. Сравнение последовательностей клинического штамма
CDC1551 и лабораторного H37Rv позволило выявить мутации (замены и
вставки), ответственные за патогенность клинического образца, что в свою
очередь позволяет улучшить метод диагностирования, понять механизм возникновения заболевания и предложить соответствующую эффективную терапию [1].
3.1.3. Практическое значение результатов
секвенирования генома человека
С результатами секвенирования генома человека связаны надежды на
возможность лечения генетических заболеваний. К настоящему времени в
мире идентифицировано множество генов, ответственных за болезни человека, в том числе болезнь Альцгеймера, болезнь Гоше, атаксию, муковисцидоз,
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
127
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
мышечную дистрофию Дюшенна, дистонию, гемофилию А и В, фенилкетонурию, серповидно-клеточную анемию, талассемию, синдром хрупкости
Х-хромосомы, наследуемый рак молочных желез и яичников и др. Структуры
этих генов расшифрованы, и сами они клонированы. Это позволяет проводить эффективную раннюю и даже пренатальную диагностику и лечение.
Тестирование будущих родителей на высокий риск генетического заболевания теперь может осуществляться для постоянно растущего числа генов. При этом типичным подходом является использование исследований
при помощи гибридизации или ПЦР-анализа. Можно протестировать здорового человека из семьи, где встречался, например, кистозный фиброз, и определить, есть ли у него копия дефектного гена или нет. Если неблагополучного сочетания генов избежать не удалось и оба потенциальных родителя являются носителями рецессивного дефекта, они должны сами решать, рисковать ли им, чтобы иметь детей. В любом случае раннее начало профилактического лечения ребенка позволит предотвратить начало заболевания или
отодвинуть начало его проявления.
В настоящее время в практику медико-генетического консультирования введены десятки систем для генодиагностики наиболее распространенных наследственных заболеваний. Установленная последовательность генома
поможет идентифицировать новые гены и выявить среди них те, что обусловливают предрасположенность к тем или иным заболеваниям.
Как было отмечено ранее, в ходе выполнения проекта «Геном человека»
были установлены последовательности целого ряда организмов – бактерий,
среди которых немало патогенных, дрожжей, круглого червя Caenorhabolits
elegans (нематоды), дрозофилы, мухи, москита, мыши, крысы, собаки, шимпанзе, рыбы-собаки и растений – арабидопсиса, тополя и двух видов риса.
Полученная информация (большую часть которой еще предстоит осмыслить)
открыла новые возможности для развития сравнительной геномики. Оказалось, к примеру, что из 269 генов человека, мутации которых приводят к болезням, 177 генов имели родственные гены в геноме дрозофилы. Сравнение
мышиного генома с человеческим показало, что около 200 геномных блоков
у человека и мыши содержат одинаковые гены (хотя и в разных хромосомах).
Количество генов у нематоды только в 4-5 раз меньше, чем у человека, и
часть из них также являются общими. Это позволяет изучать функции новых
генов человека и последствия мутаций известных генов, прослеживая изменение свойств организма в опытах с экспериментальными животными и экстраполируя полученные результаты на человека.
В процессе прочтения генома был выявлен еще один механизм генетического разнообразия, так называемый однонуклеотидный полиморфизм
(фактор СНП, по английской транскрипции). СНП – это изменение «буквы»
генетического кода без «последствий для здоровья». Считается, что у человека СНП встречается с частотой 0,1 %, т.е. каждый человек отличается от других одним нуклеотидом на каждую тысячу нуклеотидов. У шимпанзе, представляющей собой более древний вид и к тому же гораздо более гетерогенный, число СНП при сравнении двух разных особей достигает 0,4 %. Но если
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
128
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.1. Геном человека
различия в СНП не сказываются на здоровье особей, то чем они интересны и
важны? Оказалось, что практическое значение СНП велико. Известно, что
самые распространенные лекарства эффективны не более чем для четверти
нуждающегося населения. Минимальные генетические отличия, обусловленные СНП, определяют эффективность лекарств и их переносимость в каждом
конкретном случае.
Например, в одном из генов, кодирующих синтез рецептора адреналина, выявлено 13 СНП, которые могут комбинироватьcя друг с другом, давая
8 192 различных варианта (гаплотипа). Среди астматиков довольно популярно лекарство албутерол, которое взаимодействует с указанным рецептором
адреналина и подавляет приступ удушья. Однако из-за разнообразия гаплотипов людей лекарство действует не на всех, а некоторым больным оно вообще противопоказано. Это обусловлено СНП: люди с последовательностью
букв в одном из генов ТЦТЦЦ (Т – тимин, Ц – цитозин) не реагируют на албутерол, если же концевой цитозин заменен на гуанин (ТЦТЦГ), то реакция
есть, но частичная. Для людей же с тимином вместо концевого цитозина в
этом участке – ТЦТЦТ – лекарство токсично!
Необходимо отметить, что развитие и достижения геномики человека,
в свою очередь, обеспечили новые возможности для развития целого ряда
других научных направлений (рис. 3.4).
Рис. 3.4. Связь геномики человека
с другими научными направлениями
Определение нуклеотидной последовательности человека является событием исторического масштаба, но между тем необходимо знать не только
порядок следования звеньев в цепи ДНК и не только взаимное расположение
генов и их функции. Важно выяснить характер связей между ними, который
определяет, как гены будут работать в конкретных условиях – внешних и
внутренних: ведь многие болезни человека обусловлены не дефектами в самих
генах, а нарушениями их согласованных действий, системы их регуляции.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
129
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
Успехи современной медицины в огромной мере зависят от того, удастся ли вовремя обнаружить специфические инфекционные агенты (вирусы,
бактерии, паразитические микроорганизмы) или изменения в содержании
важных биологически активных белков или низкомолекулярных соединений
в организме. Надо ли говорить, что профилактику и лечение любого заболевания существенно облегчает ранняя и точная диагностика. Современные методы молекулярной диагностики обладают высокой специфичностью и чувствительностью и при этом являются достаточно продуктивными, эффективными и недорогими для рутинного применения.
По оценкам специалистов, объем мирового рынка иммунодиагностических тестов в 1993 г. составил 3,4 млрд дол., в 2000 г. – около 5 млрд дол.
В 1994 г. объем мирового рынка ДНК-диагностических тестов был примерно
80 млн дол., к 2000 г. – 600 млн дол., к 2004 г. – 2 млрд дол.
Любой диагностический тест должен быть высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени, чувствительным для определения малых количеств мишени и достаточно простым и надежным, позволяющим получать
однозначные результаты в условиях обычной медицинской лаборатории.
Различают два основных метода молекулярной диагностики – иммунодиагностика, основанная на сродстве антитела к антигену, и ДНК-диагностика,
основанная на гибридизации нуклеиновых кислот (спаривании комплементарных фрагментов ДНК) и ПЦР.
3.2.1. Методы иммунодиагностики – основные закономерности
и разнообразие
В основе любого иммунодиагностического исследования лежит высоко
специфичное и эффективное взаимодействие антиген – антитело (рис. 3.5).
Таким образом, связывание антитела с антигеном-мишенью (появление в образце комплексов АТ~АГ) свидетельствует о наличии анализируемого антигена
(инфекционного агента или целевого биологически активного соединения).
Задача состоит в том, чтобы о своем наличии такие комплексы «сообщали» каким-либо визуальным сигналом, т.е. необходимо каким-то образом
«пометить» антитело. Долгое время в качестве меток в иммуноанализе использовали радиоактивные изотопы. Они обеспечивали высокую чувствительность анализа, однако обладали рядом недостатков: нестабильностью
(использовали высокоактивные короткоживущие изотопы), невозможностью
автоматизации анализа, опасностью для персонала лабораторий и производства. Альтернативой радиоиммуноанализу стал так называемый иммунофер-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
130
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
ментный анализ, общую схему которого можно представить следующим
уравнением:
АГ (или АТ) + АТ~Е (или АГ~Е) → АГ ~ АТ~Е + S → P,
где Е – это фермент; АТ~Е – антитело, меченное ферментном (химически
синтезированный комплекс); S – субстрат данного фермента; Р – продукт
ферментативной реакции, обладающий каким-либо визуальным признаком
(окраской, флуоресценцией или люминесценцией).
Рис.3.5. Взаимодействие антиген – антитело
По интенсивности полученного от продукта сигнала судят о наличии и
количестве молекулы-мишени. Широко распространенной разновидностью
иммуноферментного анализа является так называемый ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA, по английской транскрипции названия метода).
Схема такого анализа приведена на рис. 3.6.
Поскольку иммуноферментный метод получил весьма широкое распространение, поиск ферментов, как можно более полно удовлетворяющих
всем требованиям, продолжается и в настоящее время. Весьма перспективными оказались биолюминесцентные ферменты – люциферазы – белки, одним из продуктов реакций которых является квант света в видимой области
спектра. Все люциферазы считаются оксигеназами, т.е. катализируют реакции окисления субстрата молекулярным кислородом.
Перспективность аналитического использования люцифераз обусловлена высоким квантовым выходом биолюминесцентной реакции. Например,
для люциферазы, выделенной из светляков, он составляет около 90 %. В настоящее время известно огромное количество различных биолюминесцентных животных, в основном морских, изучены их биолюминесцентные системы, клонированы гены люцифераз, установлены структуры и синтезированы
молекулы субстратов. Особое место среди биолюминесцентных белков занимают Са2+-активируемые фотопротеины морских кишечнополостных. Мо-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
131
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
лекула фотопротеина представляет собой стабильный фермент-субстратный
комплекс, состоящий из односубъединичного полипептида (молекулярная
масса около 20 кДа) и «преактивированного» кислородом субстрата,
2-гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно связанного с белком.
Биолюминесценция инициируется ионами кальция и возникает вследствие
окислительного декарбоксилирования связанного с белком субстрата.
Рис. 3.6. Схема проведения ELISA: Е – репортерный фермент; S, Р – субстрат и визуально определяемый продукт фермента соответственно
В Институте биофизики СО РАН была клонирована кДНК одного из
фотопротеинов – обелина гидроидного полипа Obelia longissima, сконструирован штамм E.coli – суперпродуцент апобелка и разработана высокоэффективная технология его выделения, позволяющая получать 50–70 мг высокоочищенного рекомбинантного обелина. Было показано, что белок стабилен
при хранении в растворе и лиофилизованном виде, а также при проведении
химических и генно-инженерных модификаций. Синтезированные конъюгаты с другими белками (авидином, иммуноглобулинами и др.) и гаптенами
(биотином, тироксином) были использованы в качестве меток для иммуноанализа целого ряда диагностически важных веществ (альфафетопротеинов,
гормонов различной природы, антител на инфекционные агенты) и продемонстрирована их перспективность и преимущества по сравнению с другими
метками.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
132
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
Это высокая чувствительность анализа, сравнимая с изотопной меткой
(благодаря высокому квантовому выходу реакции (25–30 %) определяют
атомолярные количества фотопротеина); практически полное отсутствие фонового сигнала вследствие высокой специфичности фотопротеина к ионам
Са2+; практически неограниченный линейный диапазон зависимости биолюминесцентного сигнала от концентрации фотопротеина (при насыщающей
концентрации Са2+ величина светового потока прямо пропорциональна количеству белка, поскольку он непосредственно участвует в реакции); простота
запуска (надо только добавить раствор Са2+) и высокая скорость реакции (отсутствие дополнительных субстратов или кофакторов, биолюминесцентная
реакция происходит в течение нескольких секунд); отсутствие токсичности.
Наличие коммерчески доступных современных высокочувствительных фотометров, в том числе и планшетного формата, позволяет надеяться, что в
самое ближайшее время биолюминесцентный иммуноанализ найдет широкое
практическое применение в медицинской диагностике.
На рис. 3.7 показан пример использования обелина как репортера в
ИФА тиреотропного (ТТГ) гормона в сыворотке. Можно видеть, что результаты биолюминесцентного определения этого гормона в сыворотках пациентов хорошо коррелируют с результатами РИА. Если чувствительность иммуноферментного анализа обеспечивается ферментативной реакцией репортера
и чувствительностью инструментов для измерения соответствующего сигнала, то его специфичность зависит от аффинности иммуноглобулинов к молекуле-мишени. Для получения иммуноглобулинов к данной мишени его очищенный (в случае белков) или дезактивированный (в случае патогенного организма) препарат используют для иммунизации экспериментальных животных. Антитела, которые при этом образуются в сыворотке (антисыворотке)
животного (мыши, кролика и др.), представляют собой смесь иммуноглобулинов к различным антигенным детерминантам (эпитопам) мишени. Такую
смесь антител называют поликлональными антителами. Их использование
для некоторых методов диагностики имеет два недостатка:
1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может
варьировать от одной партии к другой;
2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, отличающиеся единственной детерминантой.
В настоящее время используются моноклональные антитела, получаемые с помощью технологии гибридом. Эта технология состоит в создании
клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, высокоспецифичные к одному эпитопу антигена-мишени. Известно, что В-лимфоциты, продуцирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. В то же время
клетки миеломы прекрасно пролиферируют и при их слиянии с лимфоцитами
могут образовываться гибридные клетки, обладающие требуемыми свойст-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
133
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
60
100
µU/мл, BLIA
Биолюминесценция
вами. Кратко процедура получения гибридных клеток состоит из следующих
этапов:
1) клетки селезенки иммунизированных антигеном животных смешивают с взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (HGPRT–) в 35 %-м растворе полиэтиленгликоля,
и высевают в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ);
2) на 10–14-е сут в среде остаются только слившиеся клетки селезенкимиеломы (остальные гибриды и исходные клетки погибают);
3) полученные гибриды выращивают на полной среде без ГАТ и идентифицируют с помощью иммунного анализа, затем субкультивируют, чтобы
получить отдельные клоны.
10
50
40
30
20
10
1
0
0.1
1
10
[ ТТГ ], µМЕ/мл
100
0 10 20 30 40 50 60
µU/мл, RIA
Рис. 3.7. Схема (вверху) и результаты (слева) биолюминесцентного иммуноанализа ТТГ сэндвич-типа. Справа – корреляция результатов биолюминесцентного (BLIA) и радиозотопного (RIA) методов определения
содержания ТТГ в сыворотках пациентов (R = 0,96, n = 39)
Применение моноклональных антител позволяет существенно повысить специфичность иммуноанализа. Часто для определения одной мишени
применяют два моноклональных антитела на разные эпитопы (сэндвичанализ): первое антитело используют для первичной сорбции антигена на поверхности, а второе, меченное ферментом, – для обнаружения антигена (см.
пример на рис. 3.7).
Существующий рынок иммунодиагностикумов, поставляемых различными зарубежными и отечественными фирмами, чрезвычайно разнообразен
(табл. 3.1).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
134
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
Таблица 3.1
Важнейшие антигены определяемые
коммерческими иммуноферментными диагностикумами
Полипептидные гормоны
Маркеры опухолей
Цитокины
Лекарственные препараты
Различные соединения
Инфекционные заболевания
Хорионический гонадотропин
Гормон роста
Лютеинезирующий
Фолликулстимулирущий
Тиреотропный гормон
Пролактин
Канцероэмбриальный антиген
Специфичекий антиген предстательной железы
Рецептор интерлейкина-2
Рецептор фактора роста эпидермиса
Альфафетопротеин
Интерлейкины 1–8
Колониестимулирующий фактор
Теофиллин
Гентамицин
Циклоспорин
Тироксин
Витамин В12
Ферритин
Продукты распада фибрина
Tau-белок
Хламидиоз
Герпес
Краснуха
Гепатиты А, В, С, D
Легионеллез
СПИД
Клещевой энцефалит
Рассмотренные нами варианты иммуноанализа представляют собой так
называемые гетерогенные методы, когда иммунокомплекс формируется на
поверхности, а непрореагировавшие и неспецифичные компоненты удаляются с помощью промывок. Существует другая группа методов, не требующих
разделения компонентов (гомогенные методы). В основе гомогенного ИФА
лежит потеря активности маркерного фермента в результате реакции АГ-АТ
либо, наоборот, восстанавление активности фермента в результате реакции
АГ-АТ. Как правило, эти методы не являются количественными и применяются для получения ответа «да» – «нет» (например, диагностирование беременности).
3.2.2. Методы диагностики, основанные на ДНК-гибридизации
Иммуноанализ имеет свои ограничения: в случае диагностирования
инфекционного заболевания с помощью него невозможно различить антитела индуцированные в результате прививки и в ответ на инфицирование; если
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
135
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
речь идет об особо опасных инфекциях, когда антитела не успевают образоваться или не образуются вовсе; если поражается иммунная система (СПИД);
иногда он не в состоянии обеспечить необходимую чувствительность и т.д.
Незаменимыми и весьма эффективными в таких случаях являются методы, основанные на детекции определенных нуклеотидных последовательностей, – ДНК-гибридизационный анализ. Инфекционные агенты (бактерии,
вирусы и пр.) представляют собой живые организмы, их информация заключена в генетическом материале. Фрагмент ДНК, детерминирующий данный
биологический объект, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером. Процедура любого
гибридизационного анализа состоит в следующем:
1) иммобилизация одноцепочечной ДНК-мишени на твердой подложке
(мембранный фильтр, поверхность планшета и т.п.);
2) спаривание меченной комплементарной последовательности (ДНКзондом) с ДНК-мишенью при определенных условиях (температуре и ионной
силе);
3) удаление несвязавшегося ДНК-зонда;
4) детекция гибридных молекул зонд-мишень.
Таким образом, в процедуре ключевыми являются три компонента:
ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции полученных гибридов (рис. 3.8).
Специфичность анализа определяется ДНК-зондами, а чувствительность –
методами детекции. В зависимости от ситуации используют зонды различной
длины (20–100 нуклеотидов). Они представляют собой продукты химического синтеза или клонирования.
Рис. 3.8. Один из вариантов проведения ДНК-гибридизационного анализа. В качестве метки используют изотопы, специфические гаптены, последовательности ДНК, белки
Для получения зондов клонированием проводят следующие процедуры:
1) расщепляют ДНК патогенного микроорганизма эндонуклеазой и клонируют в плазмидном векторе; 2) проводят скрининг рекомбинантных плазмид с
использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штам Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
136
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
мов; 3) плазмиды, гибидизующиеся только с ДНК патогенного штамма, используют для получения видоспецифичных зондов. Эти зонды дополнительно проверяют на отсутствие перекрестной гибридизации с ДНК из различных
организмов и на модельных образцах для определения чувствительности метода.
Химический синтез олигонуклеотидов еще 20 лет назад представлял
собой сложную экспериментальную задачу, связанную с большими затратами времени и реактивов, поэтому олигонуклеотиды были достаточно дороги.
В настоящее время получение олигонуклеотидов осуществляется с помощью
автоматических синтезаторов, и исследователь должен только правильно определить, какая именно нуклеотидная последовательность необходима для
решения поставленной задачи.
Во всех синтезаторах синтез осуществляется твердофазным методом,
т.е. первый нуклеозид иммобилизован на поверхности нерастворимых полимерных частиц, а растущая цепочка экспонирована к реакционной смеси, в
которой находятся все необходимые реагенты. Частицы упакованы в колоночных реакторах, через которые последовательно прокачиваются растворы
веществ, обеспечивающих протекание процессов синтеза. С целью создания
оптимальных гидродинамических параметров колонки частицы имеют сферическую форму и одинаковые размеры. Ключевыми мономерами для синтеза являются четыре производных нуклеозид-фосфорамидита (рис. 3.9), в которых все функциональные группы заблокированы защитными группами.
5'-гидроксильная группа каждого мономера защищена диметокситритильной
группировкой (DMTr), которая легко удаляется при кислотной обработке,
например, трихлоруксусной кислотой (ТХУ). По 3'-положению находится
метилированная фосфитамидная группа.
Рис. 3.9. Мономеры для твердофазного
фосфитамидного синтеза олигонуклеотидов
(синтоны)
Экзоцикличные аминогруппы, находящиеся в составе гетероциклических оснований В (гуанина, аденина и цитидина) заблокированы группировками (ацильные остатки), которые удаляются в щелочных условиях по окончании синтеза. Такие мономеры называются синтонами.
Схема химического синтеза олигонуклеотидов приведена на рис. 3.10.
Рассмотрим несколько примеров проведения гибридизационного анализа (рис. 3.11). На неподвижной матрице в качестве зонда иммобилизовали
20-звенный олигонуклеотид ЗI, комплементарный участку ДНК вируса гепатита С. В качестве неподвижной фазы использовали поверхности планшетов
или полимерных частиц. Иммобилизацию проводили с помощью ковалентной пришивки.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
137
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
Рис.3.10. Схема химического
синтеза олигонуклеотидов: Р –
нерастворимый полимер или
стекло – частицы, на поверхности которых фиксированы
первые нуклеотиды и растущая
олигонуклеотидная
цепь; В1, В2… – нуклеотидные
основания; DMTr –
диметок-ситритил
Рис. 3.11. Схема проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа.
Для выявления гибридов использовали конъюгаты репортерного белка с авидином
или стрептавидином
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
138
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
В качестве ДНК-матрицы использовали синтетический 30-звенный
олигонуклеотид МI*, несущий на 3’-конце остаток биотина (*) (рис. 3.11, вариант А). После гибридизации и удаления непрореагировавших молекул (с
помощью промывок) обнаружение образовавшихся комплексов проводили с
помощью конъюгатов – стрептавидин-щелочная фосфатаза или стрептавидин-обелин. Известно, что стрептавидин из стрептококка или его аналог авидин из белка куриных яиц обладают чрезвычайно высоким сродством к биотину (Кд = 10–15 М). Эти белки состоят из 4 одинаковых субъединиц, каждая
из которых имеет сайт связывания с биотином.
Таким образом, стрептавидин (или авидин) часто используют в качестве стабильного и специфического мостика для формирования межмолекулярных комплексов, в том числе и при иммуноанализе. Образовавшиеся комплексы со щелочной фосфатазой обнаруживали спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность продукта ее реакции с субстратом. Комплексы с
обелином обнаруживали, измеряя интенсивность светового потока, возникающего при добавлении ионов Са2+. На этом же рисунке показан другой вариант обнаружения гибридов (рис. 3.11, вариант Б) с помощью наращивания
дуплекса ферментативным удлинением зонда с помощью Taq-полимеразы в
присутствии биотинилированного производного дезоксиуридинтрифосфата
(dUTP*).
Другой вариант проведения гибридизационного анализа показан на
рис. 3.12. В данном случае при проведении ПЦР были использованы химически синтезированные праймеры, имеющие на концах биотиновые группы. Полученные при этом биотинилированные ампликоны иммобилизовали на поверхности, предварительно активированной стрептавидином. Для обнаружения ампликонов использовали зонд, состоящий из двух частей – химически синтезированного фрагмента, комплементарного определенному участку матрицы,
и поли-А-фрагмента, присоединенного с помощью терминальной трансферазы. После гибридизации полученные дуплексы обнаруживали с помощью
обелиновой метки, представляющей собой химически синтезированный
конъюгат обелина с олигонуклеотидом dT30.
Рис. 3.12. Вариант проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа. Специфический зонд содержит поли-Апоследовательность, метка представляет собой химический
конъюгат репортерного белка обелина с олигонуклеотидом dТ30
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
139
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
Современные методы позволяют проводить диагностику на исходном
материале (клинические образцы крови, кала, мочи, смывах слизистых) без
дополнительной очистки. Если концентрация ДНК-мишени слишком мала, ее
амплифицируют с помощью ПЦР.
Первым сертифицированным методом такого рода был метод определения
Chlamidia и gonococci в 1988 г. Сейчас целый ряд фирм производят диагностические наборы для обеспечения нужд медицинских аналитических лабораторий. Некоторые коммерческие диагностикумы, производимые в США,
представлены в табл. 3.2.
Таблица 3.2
Коммерческие инфекционные диагностикумы, производимые в США
Организм
ЧувствиВремя
Специфичтельность,
ность, %
анализа
%
Chlamydia trachomatis
4ч
96
100
Neisseria gonnorhoeae
Mycobacterium tuberculosis
MRSA
1-2 ч
99,2
99,3
3,5 ч
91
98
1,5 ч
91,7
93,5
Group A Streptococci
24 ч
94,8
100
Group B Streptococci
1,5 ч
94
95,9
82–95
98–100
99
99
Gardnerella, Trichomonas vaginalis, and Can- 45 мин
dida spp.
E. coli O157:H7
8ч
Образец
Производитель
Вагинальный
мазок
Моча
Digene
Слюна
Gen-Probe
Becton Dickinson
Мазок из носа Infectio Diag. Inc
Фаренгиальный
Gen-Probe
мазок
Вагинальный
Infectio Diag. Inc
мазок
Вагинальный
мазок
Becton Dickinson
Вода
Qualicon, Inc
Приведенные данные показывают, что современные диагностикумы
являются высокочувствительными, скоростными и надежными.
В России также существует ряд фирм, производящих аналогичные диагностические наборы, одним из крупнейших является ООО «Вектор-Бест»
(Новосибирск). Однако необходимо отметить, что, к сожалению, удельный
вес импортных диагностикумов на российском рынке значительно выше отечественных.
Помимо обнаружения инфекционных агентов, ДНК-диагностика применяется для выявления генов наследственных заболеваний. ДНК-анализ используют для выявления носителей генов заболеваний, а также для пренатальной и пресимптоматической диагностики генетических нарушений. Ранее для определения специфических мутаций использовали биохимические
методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты
устанавливают мутации непосредственно в последовательности гена без экспрессии и изучения кодируемого белка. В настоящее время разработан целый
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
140
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
ряд различных методов скрининга гензаболеваний. Ранее был рассмотрен
метод, основанный на выявлении измененных сайтов рестрикции (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). Такие мутации приводят к образованию набора рестрикционных фрагментов ДНК, который отличается от
набора фрагментов нормальной ДНК. Этот подход успешно используется для
диагностики тяжелейшего наследственного заболевания – серповидноклеточной анемии.
Серповидноклеточная анемия – заболевание, обусловленное заменой
одного нуклеотида в кодоне, соотвествующем шестой аминокислоте в β-цепи
молекулы гемоглобина. В результате вместо валина на этом месте находится
глутаминовая кислота, что приводит к искажению конформации гемоглобина
и, как следствие, неэффективному переносу кислорода, осуществляемому
этим белком. Индивиды, гомозиготные по мутантному гену (S/S), имеют
эритроциты серповидной формы и страдают тяжелой анемией, приводящей к
поражениям сердца, легких, мозга и других органов. Индивиды, гетерозиготные по данному гену (A/S), являются носителями данного заболевания и
страдают от него только в экстремальных условиях при снижении снабжения
организма кислородом. Оба гетерозиготных родителя с вероятностью 25 %
произведут на свет дитя, гомозиготное по этому признаку, т.е. больного серповидноклеточной анемией. Один из используемых тестов основан на рестрикционном анализе β-глобинового гена (рис. 3.13).
Рис. 3.13. Выявление мутантного гена, ответственного за развитие
серповидноклеточной анемии: Р1, Р2 – праймеры для амплификации; AA – гомозиготность по нормальному β-глобиновому гену;
AS – гетерозиготность; SS – гомозиготность по гену анемии
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
141
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
В нормальном гене интересующий нас участок имеет последовательность CCTGAGG, в мутированном – CCTGTGG . В первом случае последовательность представляет собой сайт для рестрикцирующей эндонуклеазы
Cvn1, а во втором – этот сайт отсутствует. Тестируемую ДНК амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих сайт Cvn1.
Амплифицированный фрагмент обрабатывают Cvn1 и разделяют продукты
рестрикции с помощью гель-электофореза. При этом получают различный
набор полос: нормальный ген содержит 3 сайта рестрикции и гомозиготный
образец (А/А) демонстрирует 4 фрагмента на электрофореграмме. Мутантный ген содержит 2 сайта рестрикции, и гомозиготный образец (S/S) имеет
3 рестрикционных фрагмента, один из которых обладает большой молекулярной массой. Гетерозиготный образец имеет суммарный набор фрагментов
того и другого гена. Таким образом, генетический статус обследуемого устанавливают довольно быстро без гибридизационного анализа продуктов амплификации.
Если однонуклеотидные замены не приводят к изменению сайтов рестрикции известных рестриктаз, их можно устанавливать с помощью других
методов. Один из них сочетает ПЦР и метод лигирования («сшивки») олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ. Схема проведения такого анализа
показана на рис. 3.14. Рассмотрим случай, когда в определенном положении
произошла замена T→ G. Вначале синтезируют короткие олигонуклеотиды,
комплементарные участкам, прилегающим к данному сайту справа и слева и
помеченные разными гаптенами: зонд X помечен биотином, а Y – дигоксигенином (дигоксигенин – стероид, выделенный из наперстянки)). Обе ДНК амплифицируют и проводят отжиг с обоими зондами. Нормальная ДНК-мишень
гибридизуется с обоими зондами полностью и при добавлении ДНК-лигазы
ковалентно сшиваются. В мутантной ДНК зонд Х не образует пару с концевым нуклеотидом и ДНК-лигаза не может сшить эти два фрагмента.
На следующей стадии проводят денатурацию ДНК и переносят полученные смеси в пластиковую лунку, на поверхности которой иммобилизован
стрептавидин. Биотинилированные молекулы ДНК связываются со стрептавидином, а весь несвязавшийся материал удаляют промывкой. Затем в лунку
вносят антитела к дигоксигенину, помеченные каким-либо ферментом, например пероксидазой. При внесении хромогенного субстрата в лунках с нормальной ДНК, где произошло лигирование, произойдет окрашивание субстрата. (Узнаете вариант ELISA?) Если окрашивания не наблюдается, значит,
лигирования не произошло и мы имеем мутированную ДНК. Используя две
пары зондов, комплементарных нормальному и мутированному сайту, можно
определить генетических статус индивида – является ли он гомо- или гетерозиготным носителем данной мутации.
ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным
методом, осуществляемым в автоматизированном режиме. Более простой вариант этого метода – это метод лигазной цепной реакции. Для реакции используют большие избытки обоих индикаторных зондов X и Y и термостабильную ДНК-лигазу. Лигирование проводят при 65 ºС, затем денатурируют
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
142
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
образовавшиеся гибриды при 95 ºС и вновь понижают температуру до 65 ºС
для гибридизации свободных нелигированных зондов с ДНК-мишенью. Цикл
повторяют 20 раз. Если комплементарность мишени и зондов полная, то за
это время накопится достаточное количество продуктов лигирования для обнаружения электрофорезом или ELISA. При неполной комплементарности
продуктов лигирования не будет.
Рис. 3.14. Определение однонуклеотидной замены методом ПЦР-ЛОЗ:
Б – биотин; Д – дигоксигенин S – субстрат; Р – окрашенный продукт
Молекулярная диагностика – это быстро развивающееся направление.
Основные его принципы сформированы, но разработка новых технических
деталей (миниатюризация образцов, высокоэффективный анализ с использо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
143
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.2. Методы молекулярной диагностики
ванием технологий наночипов и пр.) могут существенно повысить его эффективность. Увеличение количества ДНК-мишени с помощью ПЦР позволила на несколько порядков повысить чувствительность анализа и открыла
возможность детектирования, например, нескольких частиц вируса СПИДа,
или проведения ранней пренатальной диагностики наличия дефектного гена
у плода, используя в качестве материала небольшое число клеток околоплодной жидкости.
В заключение необходимо отметить, что возможности, которые предоставляет анализ с помощью ПЦР, предъявляют повышенные требования к условиям его проведения. Существует даже английская поговорка «Garbage in,
garbage out», иными словами, нуклеиновый анализ хорош ровно настолько,
насколько высоко качество реагентов, составляющих реакционную смесь.
Важнейшим условием успешного анализа является устранение возможности
контаминаций. Далее приведены основные правила проведения ДНКанализа:
– обеспечение «чистого» пространства для проведения анализа: помещения с пониженным давлением воздуха; фильтрующие пипетки, блокирующие
аэрозоли наконечники к пипеткам, UV-оборудованный ПЦР-блок;
– использование оборудования для защиты персонала: одноразовые
перчатки и лабораторные костюмы, которые не выносятся из аналитического
блока, для предотвращения попадания примесных ДНК или нуклеаз из
внешней среды;
– использование технологии «горячего старта» для минимизации событий ошибочных праймингов;
– использование контролей в каждом тесте: внешние позитивные и негативные контроли отслеживают правильность условий анализа и контаминации, внутренний контроль отслеживает наличие ингибиторов в реакционной смеси.
3.3. Основы молекулярной терапии
Установление локализации и последовательности гена, мутации которого вызывают конкретные заболевания, а также самой мутации и современные способы ее тестирования позволяют диагностировать заболевание в неои даже пренатальный период развития организма. Это дает возможность
смягчить проявление генетического дефекта с помощью медикаментозного
лечения, диеты, переливания крови и т.д. Однако такой подход не приводит к
исправлению самого дефекта и, как правило, наследственные заболевания не
излечиваются. Ситуация осложняется еще и тем, что мутация одного гена
может давать самые разные последствия на организм. Если мутация гена вызывает изменения активности фермента, который он кодирует, то это может
привести к накоплению токсичного субстрата или, наоборот, к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки. Хорошо известным примером такого заболевания является фенилкетонурия. Его
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
144
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
вызывает мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, катализирующего превращение фенилаланина в тирозин. В результате
повышается уровень эндогенного фенилаланина в крови, что вызывает неправильное формирование миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных
клеток центральной нервной системы и, как следствие, тяжелую умственную
отсталость.
Если мутация затрагивает ген структурного белка, то это может приводить к серьезным нарушениям на уровне клеток, тканей или органов. Примером такого заболевания является кистозный фиброз. Делеция в гене, кодирующем белок, который называется транспортер кистозного фиброза, приводит к синтезу дефектного белка (отсутствие фенилаланина 508) и нарушениям транспорта ионов хлора сквозь клеточные мембраны. Одним из наиболее
вредных последствий этого является то, что слизь, которая выстилает и защищает легкие, становится ненормально густой. Это затрудняет доступ к
клеткам легких и способствует накоплению вредных микроорганизмов.
Клетки, выстилающие воздухоносные пути легких, погибают и заменяются
фиброзной рубцовой тканью (отсюда название болезни). В результате пациент погибает от нарушения дыхания.
Наследственные заболевания отличаются сложными клиническими
проявлениями, и их традицинное лечение имеет в основном симптоматический
характер: для лечения фенилкетонурии назначают безаланиновую диету, дефектные белки заменяют функциональным внутривенным введением, для
компенсации утраченных функций проводят трансплантацию костного мозга
или других органов. Все эти меры, как правило, малоэффективны, дороги,
длительны, и лишь немногие пациенты доживают до старости. Поэтому разработка принципиально новых видов терапии очень актуальна.
3.3.1. Генная терапия
Генной терапией называется генетическая инженерия соматических
клеток человека, направленная на исправление генетического дефекта, вызывающего заболевание. Коррекция специфического заболевания осуществляется путем введения в дефектные соматические клетки нормальных экспрессирующихся генов. К 80-м гг., когда были разработаны методы получения
отдельных генов и созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали рутинными эксперименты по переносу генов на мышах, перспективы генной коррекции стали реальными.
В 1990 г. в США доктором У. Френч Андерсоном (W. French Andrson)
были предпринята первая попытка генотерапии для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) у трехлетней девочки Ашанти де
Силва (Ashanthi da Silva). Это заболевание вызывается мутацией в гене, кодирующем аденозанаденилазу (АДА). Дефицит этого фермента способствует
накоплению в крови аденозина и дезоксиаденозина, токсическое действие
которых приводит к гибели В- и Т-лимфоцитов периферической крови и, как
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
145
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
следствие, иммунодефициту. Дети с таким заболеванием должны быть защищены от любых инфекций (содержаться в специальных стерильных камерах), поскольку любая болезнь может оказаться смертельной. Через 4 года
после начала лечения у ребенка наблюдалась экспрессия нормально функционирующей АДА и облегчение симптомов ТКИД, что позволило ей покинуть стерильную камеру и жить нормальной жизнью.
Таким образом, была продемонстрирована принципиальная возможность
успешной генетической терапии соматических клеток. Начиная с 90-х гг. проходят испытания генной терапии целого ряда генетических заболеваний, среди
которых такие тяжелейшие, как гемофилия, СПИД, разные виды злокачественных новообразований, муковисцидоз и др. На данный момент поддаются
излечению с помощью трансгенеза уже около 10 болезней человека.
Разнообразие генетических заболеваний предопределило развитие
множества подходов генной терапии. При этом решаются 2 главные проблемы: средство доставки терапевтического гена; способ обеспечения адресной
доставки к клеткам, предназначенным для коррекции. К настоящему времени
все подходы к генной терапии соматических клеток можно разделить на две
категории: терапия ex vivo и in vivo (рис. 3.15).
а
б
Рис. 3.15. Схема проведения генной терапии ex vivo (а) и in vivo (а)
Генная терапия ex vivo предполагает генетическое исправление дефектных клеток вне организма с последующим возвращением нормально
функционирующих клеток в организм.
Генная терапия in vivo предусматривает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Рассмотрим эти
подходы подробнее.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
146
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
Генная терапия ex vivo включает следующие этапы:
1) получение дефектных клеток больного и их культивирование;
2) перенос нужного гена в изолированные клетки с помощью трансфекции терапевтической генной конструкции;
3) отбор и наращивание генетически исправленных клеток;
4) трансплантация или трансфузия этих клеток пациенту.
Использование собственных клеток пациента гарантирует, что после их
возвращения у него не разовьется иммунный ответ. Процедура переноса генной конструкции должна быть эффективной, а нормальный ген должен стабильно поддерживаться и непрерывно экспрессироваться.
Средством переноса генов, созданного самой природой, являются вирусы.
С целью получения эффективных векторов для доставки генов в основном
используют две группы вирусов – аденовирусы и ретровирусы (рис. 3.16). В генной терапии применяют варианты генетически обезвреженных вирусов.
Рассмотрим устройство и использование конструкций на основе ретровирусов. Напомним, что геном ретровируса представлен двумя идентичными
одноцепочечными молекулами РНК, каждая из которых состоит из шести
участков: два длинных концевых повтора (LTR) на 5' и 3' концах, некодирующая последовательность Ψ +, необходимая для упаковки РНК в вирусную
частицу, и три участка, кодирующих структурный белок внутреннего капсида (gag), обратную транскриптазу (pol) и белок оболочки (env) (рис. 3.17, а).
Рис. 3.16. Вирусы, применяемые для создания терапевтических векторов
Напомним, что жизненный цикл ретровируса включает следующие
стадии:
1. Инфицирование клеток-мишени.
2. Синтез ДНК копии генома с помощью собственной обратной транскриптазы.
3. Транспорт вирусной ДНК в ядро.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
147
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
4. Встраивание вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина.
5. Транскрипция мРНК с вирусной ДНК под контролем сильного промотора, локализованного на участке 5'-LTR.
6. Трансляция белков Gag, Pol и Env.
7. Образование вирусного капсида и упаковки двух РНК-цепей и молекул обратной транскриптазы.
8. Высвобождение вирионов из клетки.
Ψ+
а
б
Рис. 3.17. Генетическая карта типичного ретровируса (а)
и карта ретровирусного вектора (а)
При получении ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, удаляют большую часть гена gag и полностью гены pol и env, а вместо них встраивают «терапевтический» ген Т и при
необходимости маркерный селективный ген Rg с собственным промотором
(рис. 3.17, б). Транскрипция гена Т будет контролироваться все тем же сильным промотором, локализованным на 5'-LTR участке. На основе этой схемы
созданы различные ретровирусные векторы и максимальный размер ДНКвставки примерно 8 тыс. п.о.
Полученную таким образом конструкцию можно саму по себе использовать для трансформации, но ее эффективность и последующая интеграция
в геном клетки-хозяина крайне низки. Поэтому была разработана методика
упаковки полноразмерной РНК ретровирусного вектора в интактные вирусные частицы, которые с высокой частотой проникают в клетку и гарантированно встраиваются в геном хозяина. Для этого была создана так называемая
«пакующая» клеточная линия. В двух разных участках хромосом этих клеток
вшиты ретровирусные гены gag и pol-env, лишенные способности паковаться
из-за отсутствия последовательностиΨ + (δΨ+) (рис. 3.18). То есть оба эти
фрагмента транскрибируются, но при этом образуются лишенные РНК пустые капсиды. При трансфекции РНК вирусного вектора в такие клетки она
встраивается в хромосомную ДНК и транскрибируется с образованием полноразмерной РНК ретровируса, и в таких условиях в капсидах упаковывается
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
148
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
только РНК вектора (только в ней имеется
Ψ +-последовательность). Образующиеся интактные вирусные частицы используют для эффективной доставки ретровирусного вектора в клетки-мишени.
Рис. 3.18. Схема получения упакованного вирусного вектора
Ретровирусы активно инфицируют только интенсивно делящиеся клетки. Для переноса генов их обрабатывают очищенными частицами упакованного ретровирусного вектора или совместно культивируют с производящей
их клеточной линией, а затем осуществляют селекцию для разделения клеток-мишеней и пакующих клеток. Трансдуцированные клетки тщательно
проверяют на уровень синтеза продукта терапевтического гена, отсутствие
компетентных по репликации ретровирусов, отсутствие изменений способ Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
149
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
ности клеток к росту или функционированию. Наиболее пригодными для
проведения генной терапии являются клетки костного мозга. Это связано с
наличием в нем тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые
могут пролиферировать и дифференцироваться в различные типы клеток –
В- и Т-лимфоциты, макрофаги, эритроциты, тромбоциты и остеокласты. Именно
эти клетки применяют для лечения целого ряда наследственных заболеваний,
среди них уже упомянутый нами тяжелый комбинированный иммунодефицит, болезнь Гоше, серповидноклеточная анемия, талассемия, остеопороз и др.
Помимо тотипотентных стволовых клеток костного мозга, которые
трудно выделять и культивировать, используют стволовые клетки из пуповинной крови (предпочтительное использование для генотерапии новорожденных), а также клетки печени – гепатоциты – для лечения гиперхолестеролемии.
При генной терапии in vivo особенно важно обеспечить доставку терапевтического гена к дефектным клеткам. Такую адресную доставку могут
обеспечить модифицированные векторы, созданные на основе вирусов, способных инфицировать специфические виды клеток. Рассмотрим подход, разработанный для лечения уже упомянутого выше кистозного фиброза. Поскольку
легкие являются открытой полостью, терапевтические гены к ним доставить
относительно легко. Клонированный вариант здорового гена был введен в
инактивированный аденовирус (рис. 3.19). Специфика этого типа вируса заключается в том, что он инфицирует выстилку легких, вызывая простуду.
Сконструированный таким образом вирус испытывали, распыляя его в
нос и легкие экспериментальных животных, а затем людей-пациентов. В некоторых случаях наблюдалось введение и экспрессия здорового гена, и восстановление нормального переноса ионов хлора. Возможно, этот подход
(введение нормального гена с помощью носовых аэрозолей) в ближайшем
будущем будет широко использоваться для лечения симптомов кистозного
фиброза в легких.
Кроме ретро- и аденовирусов в экспериментах по генной терапии используют и другие типы вирусов, например вирус Herpes simplex. Особенностью этого двунитевого (152 тыс. п.о.) ДНК-вируса является его способность
специфически поражать нейроны. Известно множество генетических заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему –
опухоли, метаболические нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Вирус простого герпеса I типа
(HSV) является весьма подходящим вектором для терапии таких заболеваний. Капсид этого вируса сливается с мембраной нейрона, и его ДНК транспортируется в ядро. Предложено несколько способов переноса терапевтического гена с помощью HSV-векторов и проведены успешные испытания на
экспериментальных животных.
Вирусные векторы имеют несколько недостатков: высокая стоимость,
ограниченная клонирующая емкость и возможная воспалительная реакция.
Так, в 1999 г. в результате развившегося необычайно сильного иммунного
ответа на введение аденовирусного вектора погиб 18-летний доброволец,
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
150
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
принимавший участие в испытаниях препарата. В 2002 г. у двух детей во
Франции во время лечения от иммунодефицита (введением терапевтических
генов в стволовые клетки с помощью ретровирусов) развилось состояние,
похожее на лейкемию. Поэтому разрабатываются невирусные системы доставки генов. Самый простой и неэффективный способ – это инъекция плазмидной ДНК в ткани. Второй подход – это бомбардировка тканей микрочастицами золота (1–3 мкм), конъюгированными с ДНК. При этом терапевтические гены экспрессируются в тканях-мишенях и их продукты – терапевтические белки – поступают в кровь. Основным недостатком этого подхода является преждевременная инактивация или разрушение этих белков компонентами крови.
Рис. 3.19. Схема получения вектора на основе аденовируса
Доставку ДНК можно осуществить, упаковав ее в искусственную липидную оболочку. Полученные таким образом сферические частицы-липосомы
легко проникают через клеточную мембрану. Созданы липосомы с самыми
разными свойствами, однако пока эффективность такой доставки невысока,
поскольку большая часть ДНК подвергается лизосомному разрушению. Также для доставки генетической конструкции синтезируют конъюгаты ДНК с
различными молекулами, способными обеспечить ее сохранность, адресную
доставку и проникновение в клетку.
В последние годы проводятся интенсивные эксперименты по созданию
искусственной 47-й хромосомы, которая позволила бы включить большое
количество генетического материала с полным набором регуляторных элементов для одного или нескольких терапевтических генов. Это дало бы возможность использовать геномный вариант терапевтического гена и тем са Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
151
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
мым обеспечить его стабильность и эффективную длительную экспрессию.
Проведенные эксперименты показали, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей терапевтические гены, вполне реально, однако пока непонятно, каким образом вводить такую огромную молекулу в ядро клетки-мишени.
Основными проблемами, которые стоят перед генной терапией, помимо риска тяжелой иммунной реакции, являются трудности длительного хранения и функционирования терапевтической ДНК в организме пациента,
мультигенность многих болезней, делающая их трудной мишенью для генной терапии, а также риск использования вирусов в качестве векторов.
3.3.2. Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов
Помимо рассмотренных нами способов лечения генетических заболеваний с помощью введения в дефектную клетку терапевтических генов, активно разрабатываются лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот: антисмысловые олигонуклеотиды, РНК-ферменты (рибозимы), олигонуклеотиды, корректирующие мутации in vivo. Эти средства направлены
прежде всего на лечение заболеваний, связанных с гиперпродукцией белков
(рак, воспаления, вирусные и паразитные инфекции). Уменьшить продукцию
можно снижением уровня транскрипции или трансляции. Этого можно достичь несколькими способами: гибридизацией соответствующего олигонуклеотида со специфическим геном или мРНК, блокированием фактора транскрипции белка, уменьшением количества мРНК в результате расщепления
РНК-ферментами и т.п. Рассмотрим принципы некоторых из них.
Рибоолигонуклеотид, который связывается с определенной мРНК и тем
самым ингибирует трансляцию кодируемого ею белка, называется «антисмысловой» мРНК. Этот механизм используют некоторые бактерии для регулирования генов (рис. 3.20). На практике применяют искусственно сконструированные гены, у которых ДНК-вставка находится в такой ориентации,
чтобы их транскрипты были антисмысловыми по отношению к мРНКмишени (рис. 3.21). Было показано, что возможно использование синтетических антисмысловых олигонуклеотидов, однако их терапевтический эффект
будет сильно зависеть от их устойчивости к действию клеточных нуклеаз,
системы доставки и специфичности их гибридизации. Для определения наиболее эффективных сайтов-мишеней на специфической мРНК производят
тестирование набора антисмысловых олигонуклеотидов длиной 15–20 оснований с культурой клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Состав синтезированных белков определяют электрофорезом и устанавливают, введение какого олигонуклеотида приводит к снижению синтеза белка-мишени.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
152
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
Рис. 3.20. Регулирование гена бактериоферритина (bfr)
с помощью антисмысловой РНК
Рис. 3.21. Ингибирование трансляции мРНК
синтетическим антисмысловым олигонуклеотидом
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
153
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
Для защиты от нуклеазного расщепления синтезируются модифицированные олигонуклеотиды, при этом не утратившие способность гибридизоваться. На рис. 3.22 приведены структуры модифицированных нуклеотидов, эффективность которых интенсивно изучается. Например, показано, что олигонуклеотиды с заменой свободного кислорода фосфодиэфирной связи на серу
(структура б) эффективно гибридизуются с комплементарной РНК-мишенью
и полученные РНК-ДНК дуплексы активируют внутриклеточную рибонуклеазу Н. Этот эндогенный фермент, гидролизует РНК-последовательность в
таких гибридах. С такими олигонуклеотидами уже проведены многообещающие клинические испытания, в которых мишенями являлись РНК цитомегаловируса, ВИЧ, некоторых РНК, ответственных за развитие рака.
а
б
г
в
д
Рис. 3.22. Модификации олигонуклеотидов: а – нормальная фосфодиэфирная связь;
б – тиофосфатная связь; в – фосфамидная связь; г – 2'-O-метилрибоза;
д – С-5-пропинилцитозин
Для эффективной доставки антисмысловых олигонуклеотидов их часто
пакуют в липосомы, в свою очередь модифицированные специфическими лигандами, обеспечивающими адресную доставку (такой прием мы уже встречали,
когда рассматривали способы невирусной доставки терапевтических генов).
К настоящему времени проведен ряд испытаний и показана высокая терапевтическая эффективность антисмысловых олигонуклеотидов для подавления
нежелательной пролифирации гладкомышечных клеток (осложнения после
ангинопластики, коронарного шунтирования, атеросклероз), для лечения вирусных инфекций и малярии.
Принцип действия и строение рибозимов – природных РНК, обладающих нуклеазной активностью, показан на рис. 3.23.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
154
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
Рис. 3.23. Расщепление мРНК под действием рибозимов.
Стрелкой показан сайт расщепления
Обнаружено, что эти короткоцепочечные РНК способны эффективно
подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов, факторов роста и других
терапевтически важных генов, расщепляя их мРНК [8]. Модифицируя субстрат-связывающую последовательность, можно получать рибозимы, специфичные к определенной мРНК. Рибозимы можно синтезировать непосредственно в клетке транскрипцией синтетического олигодезоксирибонуклеотида,
кодирующего каталитический домен и фланкирующие его гибридизующиеся
участки. Такой олигонуклеотид встраивают в эукариотический экспрессирующий вектор и помещают в клетку. Образующаяся РНК самопроизвольно
приобретает активную конформацию, так называемую форму «головки молотка». Множество рибозимов различной структуры и активности синтезировано химически. Например, в лаборатории нуклеиновых кислот Института
химической биологии и экспериментальной медицины СО РАН (Новосибирск) проводятся многолетние исследования по получению синтетических
рибозимов, обладающих повышенной активностью и стабильностью. Для повышения защиты от преждевременного расщепления внутриклеточными
нуклеазами получают различные производные рибозимов – с метилированными 2'-гидроксильными (см. рис. 3.22, г) группами, бинарные конструкции и т.п. Строение молекулы рибозима существенным образом влияет на
его эффективность. На рис. 3.24 показана кинетика расщепления мРНК гена
множественной лекарственной устойчивости mdr1 с помощью синтезированных рибозимов разной структуры.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
155
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
а
б
Рис. 3.24. Расщепление 190-звенного 5'-концевого фрагмента MDR1 мРНК
модифицированными бинарными (1,3) и полноразмерными (2,4) рибозимами:
а – структура РНК с выделенным специфическим сайтом; б – накопление
продуктов расщепления (материалы предоставлены А.Г. Веньяминовой,
ИБХиФМ, Новосибирск)
Особое место в молекулярной терапии занимают так называемые методы активирования пролекарств. Например, одним из способов генной терапии рака является уничтожение опухолевых клеток с помощью активированного производного ганцикловира (GCV, производное гуанозина), продукта гена тимидинкиназы, из уже упомянутого нами вируса простого герпеса
HSVtk. Опухолевые клетки трансфецируют in vivo геном HSVtk под активным промотором и через несколько дней вводят ганцикловир, который фосфорилируется вирусной тимидинкиназой до монофосфата, а затем киназами
клетки-хозяина до трифосфата. Это производное ингибирует ДНК-полимеразу и
останавливает синтез ДНК, что приводит к гибели пролифилирующих клеток. Через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат проникает в соседние немодифицированные клетки и таким образом уничтожается дополнительно до десятка опухолевых клеток. Ген, приводящей к гибели собственной клетки, называется геном «самоубийства» (в нашем случае это ген
тимидинкиназы), а термин «пролекарство» относится к неактивной форме
лекарственного вещества (в данном случае это ганцикловир). Этот подход
был использован и для создания других вариантов комбинации ген–
активатор–пролекарство, но эффективность системы GCV-HSVtk уже доказана рядом доклинических испытаний.
Генная терапия является новой лечебной дисциплиной, становление
которой происходит на наших глазах. Несмотря на некоторые успехи и многообещающие перспективны, существует ряд проблем, которые еще пред Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
156
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
стоит преодолеть. Часть проблем лежит далеко не в плоскости медицины и
молекулярной биологии. Речь идет о проблемах этических и политических.
Как вы уже заметили, мы рассматривали методы генетической терапии только соматических клеток. Это означает, что произведенные коррекции ограничиваются определенным органом или тканью, «исправленные» гены не
будут передаваться следующему поколению. Изменения генотипа зародышевых клеток (сперматозоидов или яйцеклеток) или оплодотворенных клеток
должны передаваться из поколения в поколение.
В настоящее время генная терапия соматических клеток отнесена к
стандартным методам медицинского вмешательства. В противоположность
этому генная терапия зародышевых клеток является технологически гораздо
более сложной, проблематичной и непредсказуемой. Поэтому эксперименты
в этой области во многих странах запрещены.
В конце 80-х гг. в США были установлены правила, регулирующие испытания в области генетической терапии соматических клеток. Они гарантируют беспристрастный и репрезентативный отбор больных и их информированность (насколько опасно лечение, какова вероятность его успеха и пр.),
конфиденциальность сведений о больных и произведенных исследованиях,
осуществление всех манипуляций должным образом без причинения вреда,
как конкретным больным, так и человеческой популяции в целом.
Поскольку лечение соматических клеток приводит к улучшению состояния и значительному продлению жизни больных с генетическими заболеваниями, но «улучшенный» ген не передается по наследству, существует
мнение, что это приведет к накапливанию генетических заболеваний в человеческой популяции. Однако, по данным популяционной генетики, для существенного повышения частоты вредного гена в результате эффективного лечения требуются тысячи лет.
3.3.3. Клонирование человека
Вряд ли в наше время найдется человек, незнакомый с фантастическими рассказами и фильмами о человеческих клонах, творящих то добро, то
зло, используемых недальновидными политиками или тупыми солдафонами.
Современный уровень знаний и методы манипулирования с генетическим
материалом, получение различных трансгенных животных создают впечатление, что клонирование человека – дело не столь отдаленного будущего.
Привлекательность идеи получения копий животных с улучшенными полезными свойствами или копий гениальных людей, или просто живой копии погибшего дорогого человека подогревает интерес к проблеме. Процедура клонирования млекопитающих в принципе заключается в следующем: в энуклеированную (лишенную ядра) яйцеклетку вводят ядра соматических клеток
донора и развивающиеся яйцеклетки на стадии бластоцист вносят в матку
суррогатной матери. При этом будет получено потомство с тем же генотипом, что и у донора, или, другими словами, его генетический клон. Именно
так была получена клонированная овечка Долли. Однако, как показали многочисленные эксперименты, проблема клонирования не так проста, как пер Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
157
ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ
3.3. Основы молекулярной терапии
воначально думали, имеется множество «подводных камней» и рано строить
рассчитанные под клоны коровники. Разговоры же о клонировании человека
лишены оснований и безответственны.
Нерешенными остаются главные вопросы.
1. Способны ли ядра соматических клеток полностью и эквивалентно
заменить ядра зародышевых клеток в их функции обеспечения нормального
развития зародыша? Соматические клетки – это специализированные клетки,
прошедшие определенный цикл развития, затрагивающий, в том числе, и модификацию ДНК (изменения в некодирующих повторах, укорачивание теломер и пр.). Тщательный молекулярно-генетический анализ функционирования ядер пересаженных соматических клеток показал, что 4 % генов работают неправильно, включаются не в том месте, не в то время или не включаются вовсе. Как возвратить изменившиеся ядра клеток в исходное состояние,
«поймать» такую соматическую клетку, ядро которой не утратило свой потенциал?
2. Какова вероятность полного сходства потомков? Даже если удастся
получить нормально развивающиеся эмбрионы, условия их развития в матке
различных приемных матерей будут различаться. Существующие определенные пределы колебаний проявления данного гена в фенотипическом признаке неизбежно приведут к тому, что одинаковые гены будут проявляться поразному и вероятность получения полного сходства потомков крайне мала.
3. Даже если развивающиеся яйцеклетки трансплантировали сотне приемных матерей и получили хотя бы одну-единственную живую и точную копию индивида (процент успеха крайне низок!), встанет вопрос: а что с остальными зародышами? Часть неизбежно погибнет, а остальные – уроды? И как
поступить с этими искусственно созданными несчастными? Запрет такого
рода исследований как аморальных является вполне естественным. В нашей
стране на манипуляции с человеческими зародышами принят мораторий.
Репродуктивное клонирование человека запрещено, но вопрос о терапевтическом клонировании остается открытым. Суть его заключается в следующем: ядро соматической клетки пациента трансплантируется в яйцеклетку донора, выращивается до стадии бластоцисты, внедряется в стенку матки.
Внутри содержится так называемая внутренняя клеточная масса из эмбриональных стволовых клеток, из которых развиваются органы и ткани зародыша. Предполагается, что благодаря их колоссальному потенциалу к развитию
в разных направлениях, из них можно будет получать «запчасти» для пересадки пациенту – хозяину ядра. Но что это за запчасти, если 4 % генов будут
работать неправильно? Ведь известно, что при пересадке эмбриональных
стволовых клеток приблизительно у 30 % реципиентов развиваются опухоли.
И, кроме того, не надо забывать об этических проблемах, связанных с поисками доноров яйцеклеток и суррогатных матерей. В такой ситуации многие
ученые высказываются в пользу проведения масштабных работ в этом направлении на экспериментальных животных и объявлении хотя бы временного моратория на использование этой техники в клинике и призывают проявлять максимум осторожности и аккуратности при решении проблем, связанных с клонированием человека.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
158
Г ЛА В А 4
КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ
КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.1. Значение и место культуры тканей
в биотехнологии растений
Биотехнология как наука базируется на использовании биологических
процессов в технике и промышленном производстве.
В свете современных представлений биотехнология растений – это
соединение методов культуры клеток и тканей растений с методами молекулярной биологии и техникой рекомбинантных ДНК. Созданная система –
клетки и ткани высших растений, выращиваемые вне организма на искусственных питательных средах в строго контролируемых условиях – позволяет
изучать рост, клеточную дифференцировку и развитие растительного организма, разрабатывать новые клеточные технологии для промышленности и
сельского хозяйства [6].
Вся сфера научной деятельности по реорганизации геномов обычно называется биотехнологией, хотя этот термин включает в себя более широкий
круг понятий, чем культура изолированных тканей, генная и хромосомная
инженерия.
Роль биотехнологии и, в частности, культуры изолированных тканей,
состоит в решении таких глобальных проблем, как обеспечение населения
продовольствием, более эффективная медицина, оптимальная экология.
Несомненно, что в настоящее время наиболее перспективными обсуждаемыми и иногда осуждаемыми направлениями биотехнологии являются
генная и хромосомная инженерии, но вытекали они из культивирования изолированных органов, тканей и клеток и немыслимы без него.
4.1.1. Тотипотентность растительной клетки
Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на использовании важного свойства растительной клетки — тотипотентности [11].
Тотипотентность (лат. Totus – весь, potentia – сила) – это свойство
клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма.
Тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетка растений и
яйцо животных организмов. Что касается дифференцированных клеток, то у
животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнополостных. Так, соматические клетки гидры дают начало новому организму.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
159
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений
У высших животных с ранних этапов эмбриогенеза, с началом специализации клеток, тотипотентность не реализуется. Однако клетки, изолированные
из эмбрионов млекопитающих, в условиях культивирования могут сохранять
плюрипотентность – способность дифференцироваться во все типы клеток
как собственно зародыша, так и экстраэмбриональных тканей. Такие клетки
получили название эмбриональных стволовых клеток.
У растений в природных условиях (in vivo) тотипотентность могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому – вегетативное размножение, в том числе наблюдаемое в результате развития растений из клеток
листьев бегонии, узумбарской фиалки или каланхое.
Тотипотентность у растений реализуется и при заживлении ран. В этом
случае на раневой поверхности растений в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит развитие каллуса (лат. callus – толстая кожа,
мозоль).
Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Впоследствии в каллусе может иметь
место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и
органов.
Однако в природных условиях растения ряда систематических групп
тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие
однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному размножению.
Возможность реализации супрессированной in vivo и активной тотипотентности предоставляется в условиях in vitro при выращивании фрагментов
тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах. Этот переход специализированных клеток к эмбриональным синтезам, последующему делению с образованием недифференцированных клеток, а затем и к повторной дифференциации осуществляется под действием экзогенных фитогормонов.
4.1.2. Исторические этапы развития
методов культивирования in vitro
Образование каллуса впервые описано французским энциклопедистом
Дугамелем (1756), опубликовавшим результаты по изучению циркуляции
клеточного сока и заживлению ран у растений, срастанию тканей при прививках.
Позже выполненный микроскопический анализ срезов каллуса, индуцированного на стеблях декоративных древесных растений, позволил Трекулу (1853) выявить, что образование каллуса может происходить от разных
тканей (камбиальной, флоэмы и очень молодых частей ксилемы).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
160
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений
Тотипотентность теоретически постулирована клеточной теорией,
сформулированной в независимых работах Шлейдена (1838), проведенных на
растительных объектах, и Шванна (1839) – на растительных и животных объектах.
Классические эксперименты были выполнены немецкими ботаниками
Фёхтингом (1878) и Рехингером (1893). Фехтинг выявил наличие полярности
у изолированных (даже очень тонких) фрагментов стеблей, которые во влажных условиях формировали в апикальной части почки, а в базальной – каллус
или корни. Рехингер определил, что даже минимальные размеры эксплантов
способны продуцировать почки и регенерировать целые растения, однако
этот размер ограничен. При культивировании фрагментов из почек тополя и
ясеня, из корней свеклы и турнепса на поверхности сырого песка он показал,
что с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм (не более чем 21-клеточный
слой) способность к регенерации перестает проявляться.
Термин «тотипотентность» как способность растительных клеток к
регенерации был введен Гебелем (1902), подтвердившим своими экспериментами результаты Фёхтинга.
Описанные эксперименты относят к культивированию изолированных
тканей. И первой поддерживающей основой твердой среды был песок, а в качестве питательного компонента использовали воду. Однако для успешного
воспроизводства методов культивирования in vitro необходимо использование многокомпонентных искусственных питательных сред и соблюдение
асептических условий.
Впервые такой подход был применен Габерландтом (1902). В качестве
питательной среды им был взят раствор минеральных солей по Кнопу, используемый с 1865 г. для песчаных культур, с добавлением источника углеводов сахарозы.
Вместе с тем для своих экспериментов Габерландт в качестве эксплантов использовал только высокоспециализированные клетки (тычиночные волоски традесканции, железистые волоски медуницы и крапивы, клетки сердцевины черешков водного гиацинта, замыкающие клетки устьиц лилейных,
палисадные клетки из листьев яснотки). В условиях культивирования такие
клетки оставались живыми в течение месяца, увеличивали размер, изменяли
форму, накапливали крахмал, но их деления не происходило. Это было связано не только с высокой специализацией клеток, но и с отсутствием в питательной среде веществ, способных индуцировать клеточное деление. Габерландт писал, что у изолированных для культивирования тканей отсутствуют
стимулы, исходящие от целого организма или его частей.
Следует отметить, что в начале века успехов добились зоологи, работавшие в области культивирования тканей животных. Благодаря работам
Гаррисона (1907), Карреля (1911) и других исследователей была создана методика выращивания тканей животных на питательных средах природного
происхождения (плазме крови, зародышевой жидкости).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
161
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений
Выполненные в те годы работы по культивированию изолированных
тканей растений на экстрактах из растительных тканей не были продуктивными. Лишь значительно позже, в 40–50-е гг., при использовании жидкого
эндосперма кокосового ореха – кокосового молока, было показано, что растительные экстракты могут оказывать стимулирующее действие на рост изолированных органов и тканей в условиях культивирования, но только при их
добавлении к основному составу синтетических сред.
На фоне временных неудач по культивированию изолированных тканей и клеток растений с начала века получил развитие метод культуры изолированных зародышей, широко используемый в настоящее время для решения многих задач биологии и биотехнологии. В 1904 г. Ханниг провел успешную серию экспериментов по культивированию уже в асептических условиях практически зрелых изолированных зародышей крестоцветных на
растворе минеральных солей и сахарозы. Однако зародыши, изолированные
из незрелых семян, в этих условиях не дифференцировались.
Практическое применение культуры изолированных зародышей для
преодоления несовместимости при отдаленной гибридизации было продемонстрировано работами Лайбаха (1925). Он вычленял зародыши из нежизнеспособных гибридных семян льна, завязавшихся в результате скрещивания
двух видов Linum perenne x Linum austriacum, и культивировал их на фильтровальной бумаге или вате, смоченных раствором сахарозы. В результате
были выращены гибридные растения.
В Германии Котти (1922) и в США Роббинс (1922) постулировали необходимость использования для культивирования меристематических клеток, изолированных из кончиков корней или почек, более сложных по составу культуральных сред с добавлением аминокислот и дрожжевого экстракта.
Эти подходы были удачно реализованы в 30-е гг. в работах американского исследователя Филиппа Уайта и французского исследователя Роже
Готре, которых принято считать родоначальниками современных методов
культивирования изолированных органов и тканей растений. Успех работ
Уайта и Готре был определен оптимальным сочетанием объектов культивирования и состава питательных сред.
Серия работ Уайта (1934) была посвящена выращиванию изолированных корней томатов, которые при периодических пересадках (пассировании)
отрезками кончиков корней на свежую среду могли расти неограниченно
долго.
Другое направление работ Уайта связано с изучением опухолей растений, для чего был использован метод культивирования изолированных тканей.
Большое значение имеют работы Уайта (1939; 1941), посвященные разработке составов питательных сред. Среда Уайта, содержащая наряду со
смесью минеральных солей и витамины, в настоящее время широко используется для выращивания тканей многих культур. При культивировании ткани
табака на этой среде впервые удалось наблюдать спонтанное развитие зачатков стеблевых почек и формирование побегов.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
162
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений
Основные объекты культивирования в работах Готре – камбиальная
ткань стебля древесных и травянистых растений, ткань корнеплодов и клубней. В основе минерального состава среды была использована питательная
смесь Кнопа. Готре заменил жидкую среду на твердую – агаровую и ввел в
состав культуральных сред фитогормон ауксин – индолилуксусную кислоту
(ИУК). Наличие этих компонентов в среде способствует длительной пролиферации культивируемых каллусных тканей. В работах Готре каллусная
ткань, индуцированная из камбия, могла продолжать развитие в течение 18
месяцев.
После появления работ Р. Готре и Ф. Уайта метод культуры изолированных тканей растений начал быстро развиваться во многих странах. Вводили в культуру все новые и новые виды растений.
Ауксины были открыты в 20-е гг. как факторы тропизмов растений.
Природный ауксин в растениях представлен в основном в виде р-индолил-3уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК. Этот фитогормон был открыт в
1926 г. Вентом. В начале 30-х гг. Ф. Кегль выделил его в чистом виде и установил химическое строение. В 60-е гг. был выделен второй представитель
этого класса фитогормонов – фенилуксусная кислота (ФУК).
Другой класс фитогормонов – цитокинины – открыли в 1955 г. Скуг и
Миллер, изучая рост каллуса сердцевинной паренхимы табака. Путем щелочного гидролиза ДНК животного происхождения они получили кинетин,
который оказался способным вместе с ауксином стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы и камбия табака. На среде с
ИУК без кинетина клетки не делились. В дальнейшем различные концентрации и соотношения цитокининов и ауксинов стали использоваться для каллусогенеза и индукции морфогенеза в культуре изолированных тканей растений.
В 1957 г. впервые индуцирован морфогенез в культуре каллусной ткани моркови и получены растения-регенераты. Успех достигнут благодаря работам Бутенко и Стеварда. Огромная заслуга в развитии биотехнологических
работ в нашей стране принадлежит Р.Г. Бутенко из Института физиологии
растений РАН. Вместе со своими сотрудниками она создала мощную школу
по культуральным работам у растений, что значительно расширило возможности по реконструкции, именно генома растений [4, 6].
В 1959 г. Никел и Тулик создали метод выделения и выращивания
больших масс клеточных суспензий, а вслед за этим Джонсон (1960), Павловай и Бутенко (1969) разработали метод культивирования отдельной клетки с
помощью ткани-няньки.
В 1959 г. французский ученый Ж. Морель предложил метод культивирования изолированных меристем, который он использовал для микроразмножения орхидей. Еще ранее этим же методом он получил безвирусные
растения картофеля. В нашей стране работы по микроразмножению меристемным методом на гербере были выполнены в Институте физиологии АН
СССР под руководством Р.Г. Бутенко (1960, 1964).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
163
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений
В 1960 г. английским профессором Коккингом были впервые получены
с использованием ферментов изолированные протопласты и разработаны условия для их культивирования. Через 10 лет, в 1970 г., в той же лаборатории
Пауэр с сотрудниками осуществили искусственное слияние протопластов и
таким образом открыли путь к созданию соматических гибридов.
В 1964 г. индийские ученые Гуха и Магешвари индуцировали андрогенез в культуре пыльников и использовали этот метод для получения гаплоидных растений.
В 1971 г. Загорска и другими впервые получены, изучены и описаны
сомаклональные варианты табака.
Таким образом, открытие самой возможности роста клеток вне организма и регенерации из них растений, а также веществ, стимулирующих этот
процесс (фитогормонов), создало предпосылки для повышения эффективности растениеводства и селекции растений, а также новых возможностей использования растений (промышленное производство БАВ, съедобные вакцины и др.).
Наибольшее распространение в практике в настоящее время имеют результаты исследований по тканевой и клеточной биотехнологии. Клетки и
ткани растений, выращиваемые на искусственных питательных средах в стерильных условиях (в стекле), называют культурой изолированных тканей.
4.2. Условия и методы культивирования
тканей in vitro
Любая ткань растений – это сообщество клеток, и если она изолирована
(выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия
и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей
(клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных
тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения
их полноценного питания и развития. Тогда при строгом соблюдении этих
условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной
мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации
ее генетической информации. Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий),
можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут
быть исходным материалом для селекции.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
164
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
4.2.1. Состав питательных сред
и роль их отдельных компонентов
Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий,
кальций, магний, сера), микроэлементы – в микромолярных (железо, бор,
марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина,
мезоинозит и др.) [12].
В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и
твердые питательные среды.
Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар
(0,7–1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских
водорослей. Обычная его концентрация – 8–10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани.
Вместо агара можно использовать биогели.
Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты
среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН
среды может варьировать от 5,2 до 6,6.
Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей
являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим
ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.
Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10–3 М.
Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера.
Микроэлементы составляют в среде концентрации 10–6 М. Присутствие
их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым
данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 %
в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих
пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы.
Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому
что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.
Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей
подсолнечника, табака, топинамбура и др.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
165
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют
аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина – источник аминокислот.
В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний
вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник
азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты,
гликокол, аспарагин, пролин.
Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы –
токсичны, L-формы – пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную
среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от
самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.
Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом
казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах
табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах.
Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для
культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.
Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении
углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду
кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.
При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы
табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать
себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар.
При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.
Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани,
взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде.
При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную
среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара.
Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие
формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.
Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей
является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2–5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в
концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур
(травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
166
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
глюкозой. На третьем месте по эффективности использования культурами
тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3
культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по
действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные,
отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и
органов растений.
В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на
среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими
ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и
полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от
ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей.
Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования
метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы
обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды.
Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в
среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается
образование веществ, стимулирующих рост тканей.
Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на
свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани,
так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света
также сказываются на углеводном метаболизме тканей.
Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.
В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами.
По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже.
Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности
ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от
состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут
взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
167
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем
сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит
к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в
каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно.
Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически
чистых компонентов среды.
Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные
биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более
сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами.
В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат),
рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании,
поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.
Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в
настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1,
табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов [12, 14].
Таблица 4.1
Примеры составов наиболее употребляемых питательных сред
для культивирования растительных клеток тканей
Составные компоненты
NH4NО3
KNO3
СаС12·2Н2О
СаС12
MgSO4·7 H2О
КН2РО4
(NH4)2SO4
Ca(NO3)2·4 H2О
Na2 SO4
NaH2PO4·H2О
KC1
KI
H3BO3
MnSO4·4 H2О
MnSO4·H2О
Концентрация компонентов в среде, мг/л
Уайта
МС
В5
Нича
N6 (Chu)
–
1 650
–
720
–
80
1 900
2 500
950
2 830
–
440
150
–
166
–
–
–
166
–
750
370
250
185
185
170
68
400
–
134
–
463
300
–
–
–
–
200
–
–
–
–
19
–
150
–
–
65
–
–
–
–
0,75
0,83
0,75
–
0,8
1,5
6,2
3
10
1,6
5
22,3
–
25
–
–
–
10
–
3,3
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
168
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
Продолжение табл. 4.1
Составные компоненты
ZnSO4·7 H2О
NaMoO4·2 H2О
MoO3
CuSО4·5H2О
CoCl2·6H2О
Fe(SO4)3
FeSO4·7 H2О
Nа2ЭДТА·2 H2О
Органические вещества:
Никотиновая кислота
Пиридоксин гидрохлорид
Тиамин гидрохлорид
Биотин
Инозит
Глицин
Фолиевая кислота
Сахароза
pH
Концентрация компонентов в среде, мг/л
Уайта
МС
В5
Нича
N6 (Chu)
3
8,6
2
10
1,5
–
0,25
0,25
0,25
–
0,001
–
–
–
–
0,01
0,025
0,025
0,025
–
–
0,025
0,025
–
–
2,5
–
–
–
–
–
27,8
27,8
27,8
27,8
–
37,3
37,3
37,3
37,3
0,5
0,01
0,01
–
–
3
–
20 000
–
0,5
0,5
0,1
–
100
2
–
30 000
5,8
1
1
10
–
100
–
–
20 000
5,5
5
0,5
0,5
0,05
100
2
0,5
20 000
–
0,5
0,5
1
–
–
–
–
50 000
5,8
В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток.
Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко
известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором
отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и
коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и
российскими фирмами.
Таблица 4.2
Состав среды Мурасиге-Скуга
Компоненты
NH4NО3
KNO3
СаС12·2Н2О
MgSO4·7 H2О
КН2РО4
KI
H3BO3
MnSO4·4 H2О
ZnSO4·7 H2О
NaMoO4·2 H2О
CuSО4·5H2О
CoCl2·6H2О
Конечная концентрация в
среде, М
2,06·10-2
1,88·10-2
3,00·10-3
1,50·10-3
1,25·10-2
5,00·10-6
1,00·10-4
9,99·10-5
2,99·10-5
1,00·10-6
1,00·10-7
1,00·10-7
Концентрация запасного
раствора, мг/л
Объем запасного
раствора на 1 л
среды, мл
33 000
38 000
8 800
7 400
3 400
166
1 246
4 460
1 720
50
5
5
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
50
5
169
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
Продолжение табл. 4.2
Компоненты
FeSO4·7 H2О
Nа2ЭДТА·2 H2О
Мезоинозит
Гидролизат казеина
Витамины:
РР
В6
В1
Аминокислоты:
Глицин
Источник углеводов:
Сахароза
Конечная концентрация в
среде, М
1,00·10-4
1,00·10-4
Концентрация запасного
раствора, мг/л
Объем запасного
раствора на 1 л
среды, мл
5 560
7 460
5
2,06·10-2
10 000
2,06·10-2
2,06·10-2
2,06·10-2
500
500
500
2,06·10-2
2 000
8,80·10-2
Добавление в виде порошка
Предварительный разогрев
в воде до растворения
Агар-агар
П р и м е ч а н и е. pH = 5,8
1
30 г/л
7 г/л
МС – самая универсальная среда, пригодная для образования и роста
каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда
Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта
обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников.
4.2.2. Гормоны и регуляторы роста – необходимые
компоненты питательных сред
Помимо источников углерода, азота и других минеральных компонентов, среда для культивирования тканей многоклеточных организмов, таких
как растения, должна содержать специфические стимуляторы и регуляторы
роста: фитогормоны или их синтетические аналоги [11]. Известно около
5 тыс. соединений, обладающих регуляторной активностью, однако на практике применяется лишь несколько десятков.
Известны три класса фитогормонов, действующих преимущественно
как стимуляторы (ауксины, гибберелины, цитокинины), и два класса фитогормонов, оказывающих главным образом ингибирующее действие (абсцизовая кислота, этилен).
Ауксины – производные аминокислот: ИУК – триптофана, ФУК – фенилаланина. Природный ауксин в растениях встречается в основном в виде
β-индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК, второй представитель этого класса фитогормонов — фенилуксусная кислота, однако его роль в
фиторегуляции значительно меньше ИУК.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
170
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
Ауксин играет важную роль в процессах регенерации при размножении
каллусных клеток; в процессе образования придаточных и боковых корней,
луковиц, при заложении вегетативных почек.
Механизм действия ауксина на рост клетки связывают с активацией
+
Н – выкачивающего насоса в плазмолемме. Происходит подкисление клеточной стенки, что приводит к разрыву целлюлозных и пектиновых полимеров. Это облегчает растяжение растущей клетки под действием тургорного
давления.
Избыток ауксина разрушается ИУК-оксидазой.
Синтетические ауксины. Для практических целей в сельском хозяйстве
часто применяют не ИУК, а синтетические ауксины, так как они в растениях
не разрушаются ИУК-оксидазой. Молекулы синтетических ауксинов имеют
разную структуру, но содержат ароматическое или гетероциклическое кольцо, боковая часть которого представлена остатком алифатической кислоты.
По действию синтетические ауксины относят: к сильным – индолил-3-масляная
кислота (ИМК), а-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д); слабым – фенилуксусная кислота (ФУК), фенилмасляная (ФМК).
Гиббереллины обнаружены в 20-е гг. японскими исследователями в виде продуктов обмена веществ Fusarium moniliforme – конидиальной (споровой) стадии сумчатого гриба (аскомицета) Gibberellafujikuroi.
Гиббереллины – это дитерпеноиды с тетрациклическим гиббереллановым скелетом из 19-20 С-атомов. В тканях растений одновременно встречаются несколько гиббереллинов, а в процессе онтогенеза их набор и соотношение изменяются.
Подобно ауксинам, гиббереллины оказывают множественные действия: стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, камбия), вызывают рост плодов. Рост в фазе растяжения стимулируется одновременно действием гиббереллинов и ауксина. В других случаях гиббереллины могут выступать как антагонисты ауксина, например задерживать рост
придаточных корней. Для практических целей наиболее часто используют
гибберелловую кислоту (А3).
Цитокинины были открыты как фактор, регулирующий деление клеток
в культуре изолированных тканей и названный кинетином (от слова «кинез» –
деление). Другой природный цитокинин назван зеатином, так как был выделен из семян кукурузы в стадии молочной спелости.
Сейчас известно еще 12 цитокининов, их химическое строение близко к
строению зеатина. Показана высокая кининовая активность и у дифенилмочевины и ряда ее производных. В процессе эволюции этот класс фитогормонов, так же как и ауксины, начал формироваться очень рано. Цитокинины
широко распространены в растительном мире: от водорослей до цветковых
растений. Соединения с цитокининовой активностью обнаруживаются уже у
бактерий.
Цитокинины представляют собой N-замещенные производные аденина
и синтезируются в растении из двух главных предшественников — мевало Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
171
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
новой кислоты и 5'-АМФ. Возможен синтез цитокининов из продуктов распада некоторых тРНК, содержащих модифицированный аденозин.
Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК, РНК, белков. Благодаря этому замедляется старение клеток и повышается их устойчивость к неблагоприятным факторам среды. Во многих случаях для проявления действия цитокининов необходимо присутствие ауксина или одновременно и ауксина, и гиббереллинов. Под действием кинетина происходит рост активности
многих ферментов.
Применение фиторегуляторов в культуре изолированных тканей
(табл. 4.3). Фитогормоны в культуре изолированных тканей необходимы для
дедифференцировки клеток и индукции клеточных делений. Поэтому чтобы
получить каллусные ткани, в состав питательных сред обязательно должны
входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они могут быть
полностью исключены из питательной среды.
Таблица 4.3
Фитогормоны и их синтетические аналоги, наиболее часто используемые
в культуре изолированных тканей (данные Н.В. Зобовой)
Ауксины
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
р-хлорфеноксиуксусная кислота
Индол-3-уксусная кислота
Индол-3-ацетилаланин
Индол-3-ацетил-аспарагиновая кислота
Индол-3-ацетилглицин
Индол-3-масляная кислота и ее калиевая соль
ά-нафтилуксусная кислота
Цитокинины
Аденин
6-бензиламинопурин
N-бензил-9(2-тетрагидропиранил)-аденин
6-γ-γ-диметилаллиламинопурин
1 ,3-дифенилмочевина
Кинетин
Зеатин
На безгормональной среде растут опухолевые и «привыкшие» ткани,
Автономность этих клеток по отношению к обоим гормонам или к одному из
них связана со способностью их продуцировать.
Чаще всего в качестве источника ауксинов в питательных средах используется 2,4-Д (2,4-дихлорфенокисиуксусная кислота), ИУК (индолилуксусная кислота), НУК (ά -нафтилуксусная кислота). Для получения рыхлого,
хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д. ИУК почти в 30 раз менее
активна, чем 2,4-Д. В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используется кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании
роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. Смешанными функциями обладают абсцизовая, коричная и гибберел Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
172
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
ловая кислоты, флороглюцинол, 2,2-диметилгидразид янтарной кислоты. Из
гиббереллинов в составе культуральных сред используют гибберелловую кислоту как наиболее доступную для индукции побегообразования у цитрусовых и для поддержания роста суспензионных культур.
Цитокинины в состав сред включают для стимуляции клеточного деления в каллусных и суспензионных культурах, в культурах протопластов, при
регенерации проростков из соматических эмбриоидов или стеблевых почек.
Абсцизовую кислоту применяют при культивировании протопластов.
4.2.3. Стерилизация питательных сред
Богатая питательная среда – прекрасный субстрат для развития в ней
микроорганизмов. Для обеззараживания питательных сред используют химическое воздействие (дезинфекция), воздействие температуры и других физических факторов (ультразвук, ультрафиолетовые лучи, ультрафильтрация).
Каждый из этих методов весьма избирателен для применения.
В биотехнологии широко используют термические методы обеззараживания (автоклавирование, стерилизацию, кипячение, пастеризацию и др.) [1, 8].
Как известно, отдельные компоненты питательных сред также поразному реагируют на термическое воздействие. Особенно термолабильны
органические соединения: витамины, углеводы, гормоны и др. Сложные сахара и полисахариды при автоклавировании частично гидролизуются. Степень гидролиза зависит от источника углерода, температуры и продолжительности автоклавирования. При высоких температурах происходит карамелизация сахаров. Растворы, содержащие аминокислоты и восстанавливающие
сахара, при термическом воздействии приобретают коричневатый цвет
вследствие сахароаминных реакций.
Все эти процессы сильно зависят от рН используемой среды. Существует сложная зависимость между рН среды, содержанием ионов, температурой, продолжительностью автоклавирования, с одной стороны, и степенью
термодеградации питательных сред – с другой.
Во избежание нежелательных деструктивных изменений компонентов
питательных сред (субстратов) применяют по возможности более мягкие режимы стерилизации (табл. 4.4) или раздельную стерилизацию компонентов.
Высокие, но кратковременные температурные режимы инактивируют споры
бактерий, оказывая минимальное влияние на биологически активные компоненты среды. В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и
некоторых других объектов проводят в автоклавах паром под давлением, соблюдая необходимые режимы. В отдельных случаях прибегают к сухожаровой стерилизации.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
173
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
Таблица 4.4
Режимы стерилизации питательных сред
Температура, °С
121
126
134
140
150
160
170
Пар под давлением
Время, мин
Давление, атм
15
1
10
1,4
3
2
–
–
–
–
–
–
–
–
Сухой жар, мин
–
–
–
180
150
120
60
Установлено, однако, что температура выше 121 оС может быть причиной нарушения качества сред и, как следствие, плохого роста культур. К тому же
в принципе желательна стерилизация автоклавированием небольших объемов
питательных сред, что при прочих равных условиях позволяет уменьшать
время стерилизации, так как укорачивается период прогрева проб (табл. 4.5).
В последнее десятилетие широкое распространение для получения стерильных воздуха и различных жидкостей приобрела мембранная фильтрация.
Это разновидность холодной стерилизации, которая эффективна для стерилизации термолабильных веществ [2, 8].
Таблица 4.5
Рекомендуемые интервалы стерилизации разных объемов сред (t = 121 оС) [8]
Объем среды, мл
25
50
100
250
500
1 000
2 000
4 000
Минимальное время стерилизации, мин
20
25
28
31
35
40
48
63
Промышленный выпуск мембранных фильтров был начат с конца
40-х гг. прошлого столетия. Согласно Р.Е. Кестингу (1971), наиболее распространенными процессами являются обычная фильтрация (макрофильтрация –
·10 –2–10 мкм), ультрафильтрация (10–3–
1–103 мкм), микрофильтрация (2
2·10–2 мкм), диализ (10–3мкм–1 нм). Если для макрофильтрации применяются
обычные бумажные или стеклянные фильтры, то для остальных используются нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, поливинильные, полиамид Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
174
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
ные, фторуглеродные мембраны толщиной менее 0,1 мкм с высокой степенью пористости и с диаметром пор в пределах 10–4–10 мкм. Для стерилизации в биотехнологических целях достаточно микрофильтрации.
4.2.4. Основные требования к условиям культивирования
Все манипуляции с культурой изолированных тканей растений проводятся в стерильных условиях. Комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов, включает механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости – и конечного продукта [2, 8]. Асептика предусматривает влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного
воздуха в боксированных помещениях, поступление в ферментатор стерильного воздуха через барботер – от франц. barbotage – перемешивание) и пр.
К механической защите относятся удаление механических примесей,
например, из воздуха, культиваторов; герметизация оборудования, изоляция
узлов и соединений; к физической – обработка воздуха и поверхностей приборов и аппаратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической – обработка рабочих поверхностей и биообъектов химическими антисептиками.
В производственных условиях источниками микробов-контаминантов
могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорообразующие палочки-бациллы,
конидии грибов, актиномицеты; эти же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, из которого они способны проникнуть в среду выращивания
биообъекта или в конечный продукт производства
Культивирование изолированных тканей растений происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты должна составлять в
зависимости от культуры 1 000–10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта.
Влажность в световой комнате должна быть 60–70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, особенно если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации, а
значит, и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в
комнате можно использовать поддоны с водой.
Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей –
25–26 °С, для культуры тканей тропических растений – 29–30 °С. В случае
индукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 °С.
Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеет хлоропластов и питается
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
175
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro
гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани,
такие, например, как ткань мандрагоры. Каллусные ткани получают в темноте или при рассеянном свете, а для успешного морфогенеза их переносят в
помещения с интенсивным освещением 1 000–4 000 лк.
Световой и температурный режимы, как и остальные условия, зависят
от выполняемых задач. Наилучшие их параметры, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер.
4.3. Направления и возможности использования
культуры изолированных тканей растений
Методы культивирования изолированных клеток, органов и тканей находят широкое применение в экспериментальной биологии и используются
во многих биотехнологических процессах, в которые включены высшие растения.
Если биологической основой культуры изолированных тканей является
тотипотентность растительных клеток, то обеспечение этого процесса складывается путем подбора питательных сред определенного состава, регуляторов роста и технических (физических) условий введения в культуру и собственно процесса культивирования (выбор экспланта, стерилизация, освещенность, температура и др.).
4.3.1. Основные направления использования
Культура клеток и тканей растений может использоваться в двух основных направлениях: 1) размножение или поддержание жизни у неизмененных по сравнению с донорами клеток, тканей, растений; 2) целенаправленное
воздействие на изменение генетического статуса клеток и отбор в селективных условиях нужных вариантов.
Возможности культуры изолированных клеток и тканей растений весьма обширны [9–11]:
1) получение вторичных метаболитов, продуцируемых отдельными
клетками и тканями некоторых полезных растений (алкалоидов, глюкозидов,
стероидов и т.д.), используемых для производства лекарств;
2) клеточная и тканевая селекция форм с полезными хозяйственными
свойствами;
3) генетическое улучшение сельскохозяйственных растений;
4) ускоренное (микроразмножение) ценных и уникальных генотипов и
поддержание жизнеспособности ослабленных клеток и тканей;
5) освобождение (оздоровление) посадочного материала от вирусной
инфекции;
6) сохранение генофонда в условиях криоконсервации.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
176
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений
С использованием методов культивирования также решается большое
число теоретических проблем, в том числе:
– особенности старения растительной клетки;
– процессы цитодифференцировки и морфогенеза;
– роль фитогормонов, углеводов, витаминов, минеральных веществ при
каллусогенезе, органогенезе, морфогенезе;
– взаимоотношения клеток высших растений с клубеньковыми бактериями и микоризными грибами;
– механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды: абиотическим (засолению, кислой среде, низким температурам и т.д.),
биотическим (патогенам разного происхождения, вызывающим болезни растений);
– регуляция вторичного обмена;
– механизмы опухолеобразования;
– механизмы сомаклональной изменчивости;
– популяционные взаимоотношения в клеточной культуре.
4.3.2. Проблемы культивирования изолированных тканей
Успех в применении культуры клеток и тканей зависит от оптимизации
физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток,
их дифференциацию и регенерацию из них взрослых растений, что определяется многими факторами, прежде всего используемыми гормонами. Наиболее
сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений, поэтому важнейшее значение имеет
выяснение механизмов морфогенеза in vitro, регенерации и лежащих в их основе процессов.
Высокая способность к образованию растений-регенерантов при культивировании in vitro тканей и клеток растений является необходимым условием эффективного применения многих клеточных технологий.
В старых пересадочных культурах может протекать процесс, получивший название «привыкание». Он связан с усилением клеточной дедифференцировки, приобретением автономности по отношению к гормонам и превращением каллусных клеток в клетки химических опухолей. «Привыкание»
тканей препятствует в большинстве случаев получению растений-регенерантов.
Утрата регенерационной способности наблюдается также при длительном
пассировании у гормонозависимых, т.е. нормальных, каллусных тканей.
Новообразование растений в культивируемых каллусных культурах в
значительной степени определяется генотипом и физиологическим статусом
экспланта. В связи с этим способ отбора генотипов и эксплантов, эффективных к образованию морфогенетических структур в культуре in vitro, представляет собой актуальную задачу. Решение ее сопряжено с разработкой ряда
физиологических проблем, одной из которых является изучение особенно-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
177
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений
стей целого растения, обуславливающих поведение его органов и тканей в
культуре in vitro.
Имеются данные, которые указывают на связь способности к регенерации растений в культуре первичных эксплантов с модификацией клеточного
метаболизма, функционированием меристем и морфогенезом растения, которые, в свою очередь, определяются гормональным балансом.
Есть данные о положительном влиянии кустистости и об отрицательном влиянии скороспелости растений картофеля на число побегов в первичном каллусе клубневых дисков. Склонность к образованию многочисленных
придаточных корней в природе находит отражение в высоком уровне ризогенеза в каллусной культуре. У гороха отмечен высокий коэффициент корреляции между азотфиксацией (нитрогеназная активность, интенсивность образования клубеньков, число клубеньков) и каллусо- и корнеобразованием.
Предполагается, что общая причина формирования клубеньков на корнях
растений и образования каллуса в культуре in vitro заключается в способности генотипа к пролиферации клеток, определяемой балансом фитогормонов.
Показана связь между полиэмбрионией семян in vivo и числом соматических
эмбриоидов в культуре in vitro у ржи. Выявлено большое сходство при формировании эмбриоидов в семени пиона (Paeonia anomala L.) in vivo и в культуре in vitro (образование эмбриоидов из клеток эпидермиса, характер их
развития, форма эмбриоидов и др.). Отмечена отрицательная корреляция между частотой образования нередуцированных пыльцевых зерен и способностью к андрогенезу в культуре пыльников у картофеля. Возможно, это свидетельствует о сцеплении генов, контролирующих формирование эмбриоидов и
первое деление при образовании реституционных ядер.
У раннеспелых сортов в культуре первичного каллуса, полученного из
развивающихся зародышей, уровень множественной регенерации растений
ниже, чем у позднеспелых. Одной из причин низкого уровня множественной
регенерации растений в группе раннеспелых сортов может быть более быстрое развитие зародышей, что определяет более короткий период компетентности их клеток.
В работах, проведенных на злаках, показано влияние на процесс регенерации в культуре in vitro отдельных генов, вовлеченных в контроль гормонального баланса растений. Для пшеницы установлено влияние генов, обуславливающих короткостебельность, и гена, определяющего чувствительность к длине дня на рост каллуса, на соматический эмбриогенез и регенерацию растений. У ячменя выявлена сопряженность высокой регенерационной
способности с числом рядов в колосе.
Известно, что древесные, и особенно хвойные, деревья характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество
вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях активируются, окисляя фенолы растений, различные фенолазы. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют
деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или к
уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентив Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
178
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений
ных почек, которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако несмотря на все трудности, исследователи все чаще привлекают в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных
растений.
В целом исследования влияния отдельных характеристик целого растения
на поведение его частей в культуре in vitro малочисленны и фрагментарны.
4.4. Клональное микроразмножение растений
В природе существует два способа размножения растений: половой
(семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип
материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.
Это обусловлено следующими причинами:
1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);
2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10–15 лет;
3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (существует возможность накопления и передачи инфекции);
4) операции при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок отличаются трудоемкостью и сложностью;
5) разработанные технологии не эффективны для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию
принципиально нового метода вегетативного размножения – клонального
микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым
путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе
метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать
присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий
давать начало целому растительному организму.
Для обозначения растений, полученных бесполым размножением, в
1903 г. Уэббер из Министерства сельского хозяйства США ввел термин клон
от греч. clon – черенок (побег), пригодный для размножения.
Клон – популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем,
все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.
Клональное микроразмножение – получение in vitro неполовым путем
растений, генетически идентичных исходному.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
179
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
4.4.1. Этапы и методы клонального микроразмножения растений
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре
этапа: 1 – выбор растения-донора (донор – растение, часть которого вводится
в культуру), изолирование эксплантов (эксплант – ткань, взятая из своего
оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и
поддержания жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной
культуры; 2 – собственно микроразмножение, когда достигается получение
максимального количества мериклонов (микропобегов); 3 – укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а
при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной
температуре (2–10 оС); 4 – выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле (рис. 4.1) [12, 14].
Рис. 4.1. Схема клонального микроразмножения растений: I путь –
активация развития существующих меристем; II путь – индукция
возникновения адвентивных почек; 1 – выбор исходного экспланта;
2 – получение стерильной культуры; 3 – образование адвентивных
почек на первичном экспланте; 4 – рост почек и формирование микропобегов; 5 – размножение микропобегов; 6 – укоренение микропобегов; 7 – депонирование растений-регенерантов; 8 – акклиматизация
растений к грунту; 9 – высадка регенерантов в поле
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
180
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
Существует много методов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий
культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные
ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания,
что, в свою очередь, способствовало созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения. В литературе предложены следующие
методы микроразмножения растений: активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля);
индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.
Первый метод, используемый при клональном микроразмножении
растений, – это активация развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может
быть достигнуто двумя путями:
1. Удаление верхушечной меристемы стебля (снятие апикального доминирования) и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде. Апикальное доминирование – подавление роста боковых
почек растительного побега или наличие терминальной почки.
2. Добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как
правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП)
или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2-iр) и
зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта (инокулюм (трансплант) – часть суспензионной или каллусной культуры, переносимой в свежую питательную среду) и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более
высоких порядков (рис. 4.2).
Рис. 4.2. Активация развития уже существующих в растении меристем, основывающаяся на снятии апикального доминирования: 1 –
снятие апикального доминирования и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормоналыюй среде; 2 – индуцированное развитие многочисленных пазушных побегов под действием
веществ цитокининового типа действия
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
181
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
В настоящее время этот метод широко используется в производстве
безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур, таких
как технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для
размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема,
роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня,
груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений
(тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.).
Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких как картофель,
технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную
основу (рис. 4.3). Применение метода активации развития существующих в
растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более
105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней – ценного безвирусного семенного материала.
Формирование растения капусты из пазушной почки показано на рис 4.4.
а
б
в
Рис. 4.3. Этапы размножения пробирочных растений картофеля черенкованием:
а – микропобег – объект черенкования (линиями отмечены места разрезов
при черенковании); б – микрочеренок на питательной среде; в – развитие
растения картофеля из черенка (фото Н.В. Зобовой)
а
б
в
Рис. 4.4. Формирование растения капусты из пазушной почки на агаризованной питательной среде (фото Н.В. Зобовой): а – введение в культуру пазушной
почки; б – развитие побега; в – формирование регенеранта
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
182
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
Второй метод – это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно на тканях экспланта. (Адвентивный – добавочный побег.
Развитие растений из необычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот. Этот термин также может
быть использован для описания агентов, загрязняющих клеточные культуры). Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения.
Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если
их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило,
происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1. В качестве
ауксина в этом случае наиболее часто используют β -индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или α-нафтилуксусную кислоту (НУК).
Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших
растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая,
брокколи) – из сегментов гипокотиля, котиледона, листьев; лук, чеснок – из
верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты – из апикальных или
пазушных меристем; салат цикорный – из сегментов листовых пластинок;
петуния – из сегментов корней; глоксиния, сенполия, стрептокарпус, эшинапсус – из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители
древесных растений – из изолированных зрелых и незрелых зародышей.
Несомненный интерес вызывает вопрос, связанный с происхождением
адвентивных почек, в частности, какие клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран
Тан Ван в своих работах с тканями табака установила, что именно эпидермис
является наиболее активной тканью, способной образовывать почки, каллус
или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды. Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов, показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих
к донцу, а для растений глоксинии, сенполии и стрептокарпуса процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных
клеточных слоях листовых пластинок.
Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей,
работающих с древесными растениями. Так, Арнольд и Эрихсон, Джонсон и
Борнмап считают, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной под действием БАП и 2ip происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, по мнению Чин и Ченга, для псевдотсуги – в субэпи Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
183
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
дермальных слоях; а Вилалобос и другие утверждают, что при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин,
этот процесс происходит одновременно в эпидермальном и субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей зародыша. Этот процесс для сосны не зависит от применяемых цитокининов.
Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении,
основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические
зародыши. Этот метод получил название соматический эмбриогенез (рис. 4.5).
Основное отличие образования зародышей in vitro и in vivo (в естественных
условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают
биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном счете имеют тенденцию к развитию в проросток.
Это явление впервые было отмечено в
культуре клеток моркови еще в середине
50-х гг., а в настоящее время используется
для размножения большинства растений из
семейства Orchidaceae и Rutaceae, а также
для некоторых представителей злаковых
(пшеница, ячмень), люцерны, редиса, винограда и некоторых видов древесных пород
(осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная).
Формирование эмбриоидов в культуре
тканей происходит в два этапа. На первом
этапе клетки экспланта дифференцируются
Рис. 4.5. Образование растений путем соматического
за счет добавления в питательную среду ауксиэмбриогенеза на сегментах
нов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной
листовых пластинок сенпокислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриолии (фото Н.В. Зобовой)
нальные. Для формирования эмбриоидов
необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью его исключать
из состава питательной среды. Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной
культуре. Причем последний способ менее пригоден при клональном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Как правило,
соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой
операцией. Однако этот метод размножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения, не требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений, потому что соматические зародыши представ Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
184
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
ляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно
получать искусственные семена.
Четвертый метод клонального микроразмножения – дифференциация
адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Каллус – неорганизованная, пролиферирующая масса дифференцированных растительных
клеток. Дедифференциация – переход специализированных, неделящихся
клеток к пролиферации. Практически он мало используется в целях получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду часто
наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение
плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и
накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками. Наряду с генетическими изменениями наблюдаются
изменения растений и по морфологии: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных,
утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное культивирование каллусных клеток
усугубляет эти изменения, поэтому период неорганизованного роста при
микроразмножении должен быть сведен к минимуму.
Однако несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет свои
положительные стороны и преимущества. Во-первых, он является эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размножения из каждой
индивидуальной каллусной клетки при определенных благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая
начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно
возможным способом размножения растений в культуре тканей. В-третьих,
представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные
данным методом, отличаются генетически и морфологически друг от друга. Это
дает возможность селекционерам проводить отбор растений по хозяйственно
важным признакам и оценивать их поведение в полевых условиях.
Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельность
между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести амариллис, эписции, драцены,
томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены: сахарная свекла, некоторые представители рода Бразика, кукуруза, рис, пшеница и другие злаковые, подсолнечник,
лен. Разработаны условия, способствующие регенерации растений из каллуса
огурца, картофеля, томатов.
В целом методы клонального микроразмножения, несомненно, имеют
ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
– получение генетически однородного посадочного материала;
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
185
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
– освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
– высокий коэффициент размножения (105–106 – для травянистых, цветочных растений, 104–105 – для кустарниковых и древесных, 104 – для хвойных);
– сокращение продолжительности селекционного процесса;
– ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе
развития;
– размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
– возможность проведения работ в течение круглого года и экономия
площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
– возможность автоматизации процесса выращивания.
4.4.2. Оздоровление посадочного материала растений
Одно из преимуществ клонального микроразмножения – получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала растений. Это
можно достичь, используя меристемные ткани апексов и
пазушных почек органов стеблевого происхождения [10,
12, 13]. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий) и является свободной от инфекции (рис. 4.6).
Предположение о возможности отсутствия вирусов
в меристематических тканях растений впервые было высказано Чуигом в 1938 г. и Уайтом в 1943 г. Начиная с
50-х гг. предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки
роста. Авторы этого метода Морель и Мартин полагали,
Рис. 4.6. Схема мест что в больном растении вирус распространяется с отстаформирования растиванием от быстрорастущих молодых органов, особенно в
тельных меристем на
побеге: 1 – верху- молодых недифференцированных тканях, где конценшечные; 2 – боковые; трация вируса может снижаться, вплоть до полного от3 – промежуточные сутствия. Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время.
Строение точки роста растений имеет свою специфику: средний диаметр дистальной ее части, представленной апикальной меристемой, у разных
растений составляет до 200 мкм, высота – от 20 до 150 мкм (рис. 4.6). В более
нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
186
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
Вместе с тем зона, свободная от вирусных частиц, очень различна для
вирусов. Это зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле злаков,
например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, не допускает возможность медленного распространения
через плазмодесмы, соединяющие меристематические клетки.
В принципе, возможно получение безвирусной апикальной меристемы
от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани
должен быть снижен до нуля (рис. 4.7, рис. 4.8). Это может быть достигнуто
путем применения предварительной термотерапии исходных растений или
хемотерапии. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие.
а
б
в
Рис. 4.7. Этапы развития апикальной меристемы картофеля на питательной среде, содержащей активированный уголь: а – меристема после ведения в культуру; б – начало развития адвентивных почек; в – формирование адвентивных побегов (фото Н.В. Зобовой)
Рис 4.8. Последовательность получения
растений, свободных от вирусов через
культуру апикальных меристем: 1 – инфицированное вирусом растение, 2 – сегменты стебля; 3 – вычленение апикальной меристемы из пазушной почки; 4 –
культивирование апикальной меристемы;
5 – растение, развившееся из апикальной
меристемы; 6 – тестирование растений на
присутствие вирусов; 7 – размножение в
культуральных условиях растения, свободного от вирусов; 8 – размножение
свободных от вирусов растений в грунте
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
187
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in
vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы, через их – на
нуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы инфекционности.
Вторая гипотеза состоит в том, что высокая температуре действует на
вирусы через метаболизм растений. Под действием высоких температур нарушается равновесие между синтезом и деградацией вирусных частиц. Если
преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растет и
наоборот.
Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные
термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру от 25 до
37 °С путем ежедневного увеличения параметров температур на 2 °С. Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на протяжении всего
процесса оптимальные режимы: температуру – 37 °С, освещенность лампами дневного света – 5 тыс. лк, фотопериод – 14–16 ч/сут при относительной
влажности воздуха в термокамере 90 %.
Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и
их термостойкости. Если, например, для гвоздики достаточно 10–12-недельного
воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период длится 12 недель и более. Однако существуют растения, например, луковичные культуры, цимбидиум, розы и другие, рост которых угнетается в результате длительной термотерапии in vitro. Для таких растений целесообразно проводить термотерапию растений-регенерантов in vitro.
Помимо положительного действия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлен положительный эффект от воздействия высоких
температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных
культур (гвоздика, хризантема, фрезия) в условиях in vitro. Применение термотерапии позволяет увеличивать коэффициент размножения на 50–60 %,
повысить адаптацию пробирочных растений-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных
растений.
Использование термотерапии в сочетании с меристемной культурой
дает возможность оздоровить более 70 % растений-регенерантов хмеля от
вирусного хлороза, 90 % земляники, 25 % растений черной и красной смородины, 50 % малины, более 80 % картофеля. Растения на наличие вирусов, как
правило, проверяют с помощью иммуноферментного анализа, электронной
микроскопии и травянистых растений-индикаторов.
Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, –
хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой
культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина Д-рибофуранозил1,2,4-триазол-карбоксимида (коммерческое название – вирозол) концентрацией 20–50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
188
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.4. Клональное микроразмножение растений
При использовании вирозола в культуральной среде процент безвирусных меристемных растений увеличивался до 80 % по сравнению с 40 % на контроле.
Положительные результаты получены для сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений.
4.5. Культура каллусных тканей
Каллусная культура – это неорганизованно пролиферирующая ткань,
возникающая из дедифференцированных клеток. «Каллус–мозоль» может
образовываться на растении при поранении. Это естественный процесс, который можно наблюдать в природе. На месте ранения часть ткани утрачивает
прежние связи с организмом, для их восстановления необходимо нарастание
клеточной массы. То же происходит и на изолированных кусочках ткани
(эксплантах) в культуре in vitro [14].
При помещении фрагмента ткани или органа растения на питательную
среду соответствующего состава может происходить дедифференциация соматических клеток с образованием каллусной ткани (рис. 4.9, рис. 4.10).
Рис. 4.9. Получение каллусной ткани из
различных эксплантов: фрагментов
стебля, корня, листа, лепестков, тычинок
а
б
в
Рис. 4.10. Каллус, образованный в культуре незрелых зародышей ячменя (а, б)
и пшеницы (в) (фото Н.В. Зобовой)
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
189
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.5. Культура каллусных тканей
Первый этап дедифференциации клетки связан с ее вхождением в клеточный цикл, что происходит под действием фитогормонов – ауксинов и цитокининов. Три фазы роста клеток: 1 – деление, 2 – растяжение, 3 – дифференцировка (утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря способности к делению). Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки должны как бы возвратиться в меристематическое состояние.
Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань.
Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла
в процессе дифференцировки.
Если дедифференцировка специализированной клетки обуславливается
индукцией деления под влиянием цитогормонов, то дедифференцировка делящейся меристематической клетки связана с остановкой делений, деспециализацией клетки и только после этого – с индукцией делений, приводящей к
каллусообразованию.
Одни цитокинины в среде (сердцевинной паренхимы табака) блокируют клеточный цикл, клетки только старятся, как и без гормонов, но не растут;
а у семядолей подсолнечника в таких же условиях каллус образуется.
Как правило, для индукции каллусной ткани необходимо присутствие
двух гормонов: ауксинов (дедифференцировка и подготовка к делению) и цитокининов (пролиферация – деление).
Но, например, зрелые и незрелые зародыши пшеницы и ячменя дают
каллусообразование только с ауксинами (2,4-Д). Вероятно, это связано с наличием у последних достаточного количества эндогенных цитокининов, о
чем свидетельствует их прорастание на среде МС без гормонов, т.е. идет увеличение массы стебля и корня – процесс, активируемый цитокининами. Есть
достаточно экспериментальных данных о влиянии эндогенных фитогормонов, т.е. гормонального статуса донорного растения, на процесс индукции
каллусов в культуре изолированных тканей растений.
Имеются данные, что не только ауксины и цитокинины вызывают деление клеток, приводящее к образованию каллуса, но и так называемые элиситоры (от англ. Elect – выбирать) – метаболические вещества, индуцирующие защитные системы растений. Элиситоры – это БАВ, дерепрессирующие
гены и, как следствие, активирующие клеточные деления, сравнительно быструю дедифференцировку специализированных клеток, сопровождающуюся
активацией белкового синтеза. Отмечено, что при повреждении растительных тканей продукты деградации клеточных стенок действуют как гормоны,
которые распространяются по растению, связываются со специфическими
рецепторами на клеточных мембранах и инициируют каскад защитных механизмов – такие молекулы называются эндогенными элиситорами.
Эффект, вызываемый действием одних и тех же гормонов, может быть
различным в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
190
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.5. Культура каллусных тканей
Компетентность ее в рассмотренных примерах определяется степенью дифференцировки клеток.
Переход клетки in vitro из дифференцированного состояние к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигенной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток.
В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений процесс репрессии и депрессии генов, лежащий в основе дифференцировки, происходит легче, чем у однодольных.
Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению
и отмиранию каллусных клеток, первичный каллус через 4–6 недель переносят на свежую питательную среду (пассирование). При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.
Культура каллусной ткани моркови, полученная Готре более 50 лет назад, до
сих пор растет в коллекции.
4.5.1. Особенности каллусных клеток
Каллусные клетки имеют как сходства с нормальными клетками, так и
отличия от них [6].
Сохранение свойств оригинальных нормальных клеток:
– синтез вторичных метаболитов;
– морозо- и жаростойкость, устойчивость к низким и высоким температурам;
– фотопериодическая реакция (сохраняется активность фитохрома);
– устойчивость к осмотически активным веществам, к засолению и т.п.
Отличия от нормальных клеток:
– изменение состава белков. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве
белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа;
– физиологическая асинхронность, гетерогенность по возрасту. Присутствуют молодые клетки в G1-фазе, старые – в G2 и в S-фазах цикла клеточных делений;
– более длительный клеточный цикл, чем у растений, произрастающих
в открытом грунте;
– неограниченный, анархический рост;
– слаборазвитые митохондрии, как и в меристематических клетках
(в них мало крист, что влияет на активность аэробного дыхания);
– особенности энергетического обмена. Потребляют меньше кислорода
по сравнению с нормальными (ДК более 1), т.е. в них снижен эффект Пастера
(понижение процесса брожения под действием кислорода). Это роднит кал-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
191
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.5. Культура каллусных тканей
лусные клетки с другими быстро делящимися клетками меристематическими
и раковыми;
– повышенное потребление углеводов (в 19 раз) из-за аэробного гликолиза (бескислородное расщепление углеводов в присутствии кислорода);
– сдвиг в обмене углеводов в направлении пентозофосфатного пути,
который является источником пентоз, необходимых для делящихся клеток.
Перечисленные особенности каллусных клеток позволяют очень эффективно использовать их в получении вторичных метаболитов и селекции
растений.
4.5.2. Генетика каллусных клеток
Однотипно образующиеся каллусные клетки в процессе культивирования формируют каллусную ткань, которую характеризует гетерогенность по
клеточному составу, что выяснено с 60-х гг. прошлого века. Каллусная ткань
может содержать клетки следующих типов: паренхимные, меристематические, некротические, а также отдельные клетки или зоны проводящей системы.
Культура каллусных тканей обладает не только гетерогенностью по
степени дифференцированности клеток, но и гетерогенностью по цитогенетическим характеристикам, которая может быть обусловлена двумя причинами:
1. Клетки исходного экспланта имеют разную плоидность. В условиях
in vitro эти клетки индуцируются к делению и становятся источником отдельных клеточных линий.
2. Клетки исходного экспланта имеют одинаковую плоидность, характерную для меристематических клеток растения, но в условиях культивирования плоидность отдельных клеток может измениться.
Установлено, что примерно у 90 % из числа изученных покрытосеменных растений в процессе дифференцировки клеток происходит их полиплоидизация. Такие растения относят к полисоматическим или миксоплоидным,
т.е. к растениям, которые одновременно содержат диплоидные и полиплоидные клетки. Это, например, бобовые, пасленовые и т.д. Виды растений, клетки которых при дифференцировке сохраняют исходный уровень плоидности,
относят к неполисоматическим, например, Crepis capillaris, Ipomoea batatas
(батат), Ipomea purpurea, a также ряд видов Lilium (лилии).
Выделены и промежуточные виды, такие как подсолнечник и топинамбур, у которых содержание полиплоидных клеток обнаруживают только в
некоторых тканях и не у всех растений.
Следовательно, у большинства растений только в апикальных меристемах, т.е. в кончиках корешков и верхушках побегов, клетки характеризуются нормальным клеточным циклом: за синтезом ДНК происходит деление
ядра, а затем и всей клетки с образованием двух дочерних клеток.
Таким образом, в апикальных меристемах плоидность поддерживается
на одном уровне и характеризует цитотип данного растения.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
192
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.5. Культура каллусных тканей
Клетки с различным уровнем плоидности образуются в результате эндомитоза и эндоредупликации. Оба эти процесса являются такими формами
митоза, при которых не происходит деление ядра и клетки, но содержание
ДНК в ядре увеличивается в геометрической прогрессии.
В условиях культивирования in vitro эндомитоз и эндоредупликация
могут иметь место и у неполисоматических видов растений. Например, после
года культивирования часть диплоидных клеток каллусной ткани Crepis capillaries (крепис) становится полиплоидной.
В условиях культивирования в большей степени, чем у интактных растений, наряду с полиплоидизацией происходит образование анеуплоидных
клеток и клеток со структурными изменениями хромосом.
Индукторами онтогенетической изменчивости клеток в культуре могут
быть различные компоненты питательной среды. Наиболее хорошо изучена
роль фитогормонов. При этом необходимо подчеркнуть, что действие одного
и того же фитогормона в разных культуральных системах может приводить к
неодинаковой реакции клеток. Так, в экспериментах по культивированию
сегментов корня гороха на среде, содержащей синтетический ауксин-2,4-Д,
наблюдалось деление диплоидных клеток. При добавлении в питательную
среду кинетина начинали делиться тетраплоидные клетки.
В других экспериментах показана роль 2,4-Д как фактора полиплоидизации. Так, в суспензионной культуре гаплопаппуса при наличии в питательной среде 2,4-Д в течение шести месяцев культивирования происходило превращение диплоидной культуры в тетраплоидную.
Как правило, увеличение продолжительности культивирования, независимо от состава питательной среды и происхождения культуры, ведет к
повышению цитогенетической нестабильности.
4.5.3. Морфогенез в каллусных тканях
Существует несколько путей, по которым может пойти каллусная клетка после ее дедифференцировки:
1) вторичная регенерация целого растения, возможна дифференцировка
на уровне клеток, тканей, органов;
2) утрата способности к вторичной дифференцировке и регенерации
растений, стойкая дедифференцировка, приобретение способности расти без
гормонов – опухолевая (это явление чаще наблюдается у старых культур);
3) нормальный онтогенез каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и умиранием. Клетка претерпевает вторичную дифференцировку и
прекращает делиться (стационарная фаза). Интереснее регенерация.
В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение
организованных структур из неорганизованной массы клеток. Существуют
различные типы морфогенеза: органогенез – корневой, стеблевой, флоральный, листовой; соматический эмбриогенез (образование зародышеподобных
структур из соматических клеток). В случае органогенеза сначала регенери Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
193
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.5. Культура каллусных тканей
руют отдельные органы, а затем уже из них – целые растения, исключение –
корневой органогенез (рис. 4.11). В отличие от органогенеза при соматическом эмбриогенезе сразу образуется биполярная структура (соматический зародыш), имеющая зачаточный корешок и стеблевую почку, из которой развивается растение.
а
б
в
г
Рис. 4.11. Морфогенез в каллусных тканях, сформированных в культуре незрелых
зародышей ячменя (а–в) и пшеницы (г): а – ризогенез; б, г – стеблегенез; в – стеблеи ризогенез (формирование регенеранта) (фото Н.В. Зобовой)
Тотипотентность – это способность любой клетки воспроизвести целое
растение. Любая растительная клетка содержит весь набор генов и сохраняет
свойственную зиготе программу развития любого органа: лист, лепесток,
сердцевинная паренхима и т.п. Однако возможности разных типов клеток
различны, свойство тотипотентности не всегда реализуется. В некоторых
клетках гены в сильной степени репрессированы.
В организме тотипотентность не проявляется, так как организм подавляет потенциал развития отдельной клетки, изоляция способствует проявлению этих потенций.
Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка. Регенерация растений начинается с вторичной дедифференцировки. При этом
дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и функции
специализированных. Большая роль в этом процессе принадлежит фитогормонам. Они вызывают изменение метаболизма клеток.
Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда заканчивается морфогенезоим и регенерацией растений. Иногда это гистодифференцировка. Таким путем клетка каллуса может превращаться во флоэмные и ксилемные элементы, из активной клетки в старую.
Для управления морфогенезом используются внешние и внутренние
факторы: внутренние – вид растения, генотип, орган, из которого взят эксплант; внешние – состав питательной среды, температура, свет (интенсивность, спектр, длина фотопериода).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
194
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.5. Культура каллусных тканей
Сигналом (импульсом) морфогенеза является изменение соотношения
цитокининов и ауксинов, т.е. они не только регуляторы роста, но и дифференцировки [7, 11].
Эмбриогенез фактически не зависит от гормонов. Обычно эмбриогенные зоны возникают в каллусной ткани на той же питательной среде, на которой шло каллусообразование. Развитие соматических зародышей в каллусной ткани начинается тогда, когда устраняется дедифференцирующий фактор из питательной среды. Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах.
Дополнительные стимулы морфогенеза – азотнокислое серебро, нитрат
аммония, некоторые аминокислоты (пролин, тирозин, иногда серин), полиамины (путресцин и спермидин). В ряде случаев стимулируют морфогенез
маннит и сорбит. Ионы окиси азота влияют на развитие возникающих в каллусной ткани организованных структур, а их индукцию стимулируют ионы
аммония -NH4. Гибберелловая кислота способствует росту зачатков стебля, а
абсцизовая – ускоряет дифференциацию органов соматических зародышей.
Азотнокислое серебро продлевает регенерационную способность в старых пересадочных культурах. Лишь одна из 400–1 000 клеток регенерирует.
Одного стимула недостаточно, необходима еще готовность к нему. Способность воспринимать стимулы морфогенеза определяется как компетентность клетки.
Морфогенез начинается с того, что под влиянием условий среды детерминированная клетка обособляется от каллусных клеток, образуя утолщенную стенку [4].
Клетка-инициаль при соматическом эмбриогенезе дает начало зиготе, а
при органогенезе – меристематическому очагу. От недетерминированных
каллусных клеток инициальная отличается более крупным ядром и меньшими размерами вакуоли. Ядро обычно занимает центральное положение.
В инициальных клетках содержатся большие количества крахмала, иногда
липидов.
Некоторое время инициальная клетка находится в лаг-фазе, что необходимо для переустройства и подготовки к последующим быстрым делениям. Затем эти клетки делятся по типу дробления, образуя сферическую массу
мелких изодиаметрических клеток. При органогенезе эту массу называют
меристематическим очагом, а при соматическом органогенезе – глобулярным
проэмбрио. В дальнейшем в меристематическом очаге дифференцируются
зачатки стебля, корня, листа или цветочной почки и, соответственно, происходит стеблевой, корневой, листовой и флоральный органогенез. В глобулярном проэмбрио развивается биполярная структура. Можно выделить несколько последовательных стадий формирования эмбриоидов из каллусной
ткани – глобулярную, сердечка, торпедовидную, соматического зародыша.
Меристематические очаги или проэмбрио могут возникать на периферии
каллусной ткани или быть погруженными в нее. Обычно не наблюдается определенной закономерности в их локализации, исключение составляет стеблевой органогенез в каллусной ткани, полученной из сердцевидной паренхи Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
195
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.5. Культура каллусных тканей
мы табака. Меристематические очаги здесь локализуются только в нижней
части каллусной ткани.
Некомпетентные клетки делятся, но скорее (чаще) всего становятся
гормононезависимыми. Многие в силу генетических особенностей используют гормоны, но не регенерируют, занимая промежуточное положение между «привыкшими» и свежими каллусами.
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
Манипуляции в культуре изолированных тканей растений (с использованием или без культуры каллусных клеток) чаще всего осуществляют в соматических тканях.
Реализация тотипотентности соматических клеток лежит в основе вегетативного размножения растений. Отрезки стеблей, корней и листья растений
разных таксономических групп способны к регенерации новых побегов и
корней.
При культивировании in vitro эти возможности могут быть значительно
увеличены, а у растений, не проявляющих регенерационной способности в
природных условиях, индуцированы.
4.6.1. Прямой и непрямой пути органогенеза
Если при культивировании развитие корней, стеблевых или цветочных
почек происходит из клеток экспланта без образования каллуса, то такой
путь органогенеза называют прямым. Путь формирования морфологических
структур, приводящих к образованию корней, стеблевых и цветочных почек
в каллусной культуре, называют непрямым органогенезом [11].
Пример прямого органогенеза in vivo и in vitro – образование стеблевых
почек у льна. Так, если у 15-дневных проростков льна удалить верхушку
стебля, то через определенный промежуток времени из эпидермальных клеток гипокотиля происходит образование многочисленных стеблевых почек.
Позже одна из почек доминирует в развитии и дает полноценный стебель.
Если сегмент гипокотиля льна размером примерно 15 мм поместить на агаризованную культуральную среду с фитогормонами, то развитие может получить до 170 проростков, формирующихся как из эпидермальных, так и из субэпидермальных клеток.
Возможные пути преобразования, включая органогенез, при культивировании изолированной ткани представлены на рис. 4.12.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
196
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
ЭКСПЛАНТ
Корни
КАЛЛУС
Стеблевые
почки
Корни
Цветочные
почки
«Привыкшая»
ткань
Эмбриоиды
РАСТЕНИЯ
Эмбриоиды
Рис. 4.12. Возможные пути преобразования при культивировании изолированных тканей
Предрасположенность клеток культивируемой ткани к определенному
пути органогенеза в условиях in vitro может зависеть от многих факторов:
– таксономической принадлежности и генотипа исходного растения;
– онтогенетического возраста растения;
– локализации ткани, использованной в качестве экспланта;
– действия физических факторов при культивировании;
– длительности культивирования;
– состава питательной среды.
Рассмотрим примеры, подтверждающие эти положения.
Зависимость от таксономической принадлежности наиболее хорошо
прослеживается при сравнении особенностей культивирования изолированных органов и тканей у двудольных и однодольных растений.
У двудольных растений каллусную ткань, способную к органогенезу,
можно индуцировать не только из меристематических клеток, но и из вполне
дифференцированных тканей листьев, стебля, корня. У однодольных растений для получения каллусной ткани в качестве эксплантов используют только ткани, содержащие меристематические клетки. Например, у злаков каллус
можно получить из зародышей, гипокотиля, корневых и стеблевых апексов,
сегментов молодых листьев, молодых соцветий. Возможности получения
растений-регенерантов у злаков еще более ограничены. Регенерация растений происходит в основном из каллуса, индуцированного из молодых зародышей и молодых соцветий.
Роль генотипа в проявлении морфогенной способности в культуре тканей хорошо изучена на примере разных сортов, изогенных и мутантных линий табака, моркови, цветной капусты, пшеницы, риса и других растений.
Выявлены соответствующие доноры с высоким морфогенным потенциалом в
культуре in vitro.
Зависимость особенностей органогенеза от онтогенетического состояния растения выявлена, в частности, при изучении культивирования листовых эксплантов эчеверии (семейство Толстянковых) и табака.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
197
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
Такие различия в характере органогенеза при культивировании на средах одинакового состава определяются содержанием эндогенных фитогормонов в тканях исходного экспланта. Уровень эндогенных фитогормонов определяет и зависимость между типом органогенеза и локализацией ткани, использованной в качестве исходного экспланта. Особенности органогенеза
изучены в зависимости от таких физических факторов, как температура, содержание кислорода в культуральной системе, продолжительность и качество освещения. Результаты многих экспериментов однозначно продемонстрировали, что с увеличением продолжительности культивирования тканей утрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочных почек. Гораздо дольше сохраняется способность к ризогенезу – образованию корней.
Что касается факторов питательной среды, определяющих особенности
регенерации в культуре ткани, то в наибольшей степени на индукцию стеблевых почек и корней влияет фитогормональный баланс.
При наличии в среде разного соотношения этих гормонов наблюдаются
следующие особенности:
1. Определенное превышение концентрации кинетина над ауксином в
неорганизованно растущей каллусной культуре приводит к образованию
стеблевых почек и побегов.
2. Увеличение концентрации ауксина способствует развитию корней.
3. Среднее, близкое к равному, соотношение концентраций этих фитогормонов поддерживает неорганизованный рост каллусной ткани.
Процессы органогенеза на клеточном уровне могут носить продолжительный характер и быть асинхронными. В каллусной культуре образование
меристематических зон происходит в основном в базальной ее части, контактирующей с питательной средой. Клетки меристематических зон характеризуются интенсивным синтезом РНК и белка и становятся источником формирующихся зачатков органов. Этот процесс контролируется экзогенными фитогормонами, содержащимися в питательной среде, и эндогенными, синтезируемыми самими клетками.
Возможность индуцирования процессов органогенеза и регенерации
растений из стеблевых почек в культуре in vitro используется для массового
размножения растений.
4.6.2. Соматический эмбриогенез
При культивировании in vitro и из клеток экспланта, и из клеток каллуса могут развиться соматические зародыши, или эмбриоиды, которые, как и
стеблевые почки, при прорастании дают целые растения. В зависимости от
пути образования эмбриоидов (из экспланта или каллуса) по аналогии с органогенезом различают прямой и непрямой путь соматического эмбриогенеза.
Морфологические различия между стеблевыми почками и эмбриоидами заключаются в следующем. Эмбриоиды развиваются из соматических
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
198
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
клеток как автономные структуры. Для соматических зародышей, как и для
зиготических, характерна биполярность [9] (рис. 4.13).
а
б
в
г
Рис. 4.13. Морфологические особенности зиготических (а) и соматических (в) зародышей
по сравнению со стеблевыми почками, развивающимися in vivo (б) и in vitro (г)
Стеблевые почки, развивающиеся и у интактных растений, и в культуре
in vitro, монополярны и не автономны, так как связаны сосудистыми тканями
с органом растения или каллусной тканью.
Пример соматического эмбриогенеза in vivo – адвентивная полиэмбриония у цитрусовых. В одном семени может развиваться до сорока зародышей. Обычно один зародыш зиготический. Он формируется от слияния
половых клеток и несет признаки материнского и отцовского растения. Остальные зародыши – неполовые, развиваются из клеток нуцеллуса, окружающего зародышевый мешок, и несут признаки только материнского растения. Способность к полиэмбрионии у цитрусовых используют для их клонального размножения. Нуцеллус изолируют и культивируют in vitro в условиях, где происходит индукция образования эмбриоидов из отдельных клеток.
Образование структур, подобных зародышевым, впервые описал
Ф. Стюард в 60-е гг. Культивирование клеток корня моркови в жидкой среде
с кокосовым молоком приводило к их быстрому делению и образованию клеточных агрегатов. Внутри этих агрегатов происходила дифференцировка
элементов ксилемы, после чего формировались корневые зачатки. При переносе культуры на агаризованную среду наблюдалось образование из этих
структур побегов, развивающихся в целое растение.
Источником эмбриогенного каллуса у моркови могут быть разные органы: корень, листья, стебель, зиготические зародыши.
Интересной моделью для изучения соматического эмбриогенеза является лютик – Ranunculus sceleratus. На среде, содержащей кокосовое молоко,
в соматических тканях и пыльниках формируется эмбриогенный каллус.
В течение трех недель как внутри каллуса, так и на его поверхности
образуются эмбриоиды, по своему строению напоминающие зиготические
зародыши. Такие же эмбриоиды могут формироваться и из клеток суспензионной культуры. При пассировании соматических зародышей на свежую
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
199
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
среду индуцируется развитие проростков, у которых по всему стеблю из отдельных эпидермальных клеток без дополнительной индукции формируются
многочисленные эмбриоиды.
У злаков в условиях культивирования эмбриогенный каллус может
быть получен из щитков молодых зародышей, помещенных на поверхность
агаризованной среды, содержащей 2,4-Д. Соматический эмбриогенез у злаков
на примере культурного ячменя был впервые описан в 1970 г. Норстогом.
Различают критические стадии в развитии и прорастании эмбриоидов,
индуцированных в каллусной культуре:
1. Дедифференциация клеток экспланта. Этот период связан с активацией генов, контролирующих деление клеток. В культуральную среду необходимо вводить ауксины (например, для злаков) или ауксины в сочетании с
цитокининами (для хвойных), стимулирующие как процесс дедифференциации, так и образования эмбриогенных групп клеток.
2. Развитие эмбриоидов, происходящее в зонах эмбриогенных клеток и
контролируемое генами, последовательно экспрессирующимися на разных
стадиях эмбриоидогенеза. На данном этапе культивирования концентрация
ауксинов в питательной среде или снижается, или полностью исключается.
3. Прорастание эмбриоидов и развитие растений. В этот период требования к среде и условиям культивирования могут быть различными в зависимости от культивируемого объекта. Так, для развития растений из эмбриоидов цитрусовых в культуре нуцеллуса необходим гиббереллин, а у винограда культивирование проводят при пониженной температуре (t = 4 °С). Чтобы
индуцировать прорастание соматических эмбриоидов у злаков и цикламена,
необходимо использовать безгормональную среду или среду с низким содержанием ауксинов [10].
Возможность получения соматических зародышей у растений используют для получения искусственных семян или при клональном размножении
растений.
4.6.3. Сомаклональная изменчивость
Морфогенез и регенерация растений в культуре соматических клеток
достаточно часто сопровождается изменениями регенерантов по сравнению с
растениями, введенными в культуру.
Австралийскими исследователями Ларкиным и Скоукрофтом растениярегенеранты предложено называть сомаклонами (от сома – тело), а проявление генетической изменчивости у растений, регенерировавших в результате
культивирования in vitro, – сомаклональной изменчивостью. По определению
Бутенко [7], сомаклональные варианты – фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органельного геномов растительных клеток, от истинных генных мутаций отличаются большой частотой возникновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
200
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
Сомаклоны, у которых проявляется генетическая изменчивость, относят к сомаклональным вариантам.
Приняты следующие обозначения для растений-регенерантов или, соответственно, для сомаклонов и их самоопыленных потомков:
R – растение-регенерант; R1 R2 и т. д. – первое, второе и последующие
самоопыленные поколения растения-регенеранта;
SC – сомаклон; SC1, SC2 и т. д. – первое, второе и последующие самоопыленные поколения сомаклона.
Сомаклональная изменчивость характеризуется высокой частотой мутирования. По данным корпорации DNA Plant Technology (США), до 15 %
регенерированных в культуре тканей растений томатов имели в потомстве
генетические изменения. При исследовании числа хромосом у растенийрегенерантов различных сортов пшеницы структурные изменения хромосом
обнаружены примерно у 25 % регенерировавших растений.
Сомаклональные изменения наследуются и связаны с простыми генными мутациями. Однако в настоящее время неизвестен конкретный генетический механизм, приводящий к нестабильности культивируемых клеток.
В различных исследованиях обнаружены многочисленные кариологические
нарушения у регенерантов – полиплоидия, анеуплоидия, фрагментирование
хромосом, хромосомные мосты, транслокации, делеции, инверсии, многочисленные хромосомные аберрации.
Условия in vitro являются стрессом для культивируемых клеток и тканей. Это связано с изоляцией от целого организма его фрагментов и помещением их в новые условия.
В процессе культивирования наблюдается цитогенетическая и генетическая гетерогенность клеточных культур, что определяется:
– клеточной гетерогенностью исходных эксплантов, связанной с уровнем их полисоматии (миксоплоидии);
– условиями культивирования, где ведущая роль в индуцировании клеточной изменчивости принадлежит фитогормонам.
Вследствие этого растения, регенерировавшие в условиях in vitro из
развивающихся соматических эмбриоидов или из стеблевых почек, могут характеризоваться фенотипической и генетической изменчивостью.
Так, спектр фенотипического разнообразия у растений-регенерантов
более выражен, чем у их потомков, полученных после самоопыления. Это
связано с физиологическими нарушениями, происходящими в процессе культивирования на искусственной питательной среде и приводящими к подавлению роста и развития растений, снижению их фертильности. Например, у регенерантов ячменя и пшеницы можно наблюдать формирование сдвоенных
колосьев, супротивно расположенных листьев. Такие нарушения, как правило, не наследуются.
На основании изучения сомаклонов выявлены следующие механизмы,
которые могут объяснить сомаклональную изменчивость:
1) грубые кариологические нарушения (изменения числа хромосом –
полиплоидия, анеуплоидия; хромосомные перестройки – транслокации, де Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
201
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
леции, инверсии, дупликации), которые хорошо определяются цитологическими методами анализа;
2) хромосомные перестройки, не выявляемые при цитологическом анализе и квалифицируемые как точковые мутации;
3) соматический (митотический) кроссинговер и обмен сестринских
хроматид (наиболее хорошо изучено у томатов);
4) изменчивость цитоплазматических геномов;
5) амплификация и редукция генов;
6) активация ранее репрессированных (молчащих) генов;
7) активация мобильных элементов (изучено у отдельных моделей –
люцерны, табака, кукурузы) [11].
Таким образом, под термином «сомаклональная изменчивость» понимают разнообразный спектр генетической, цитогенетической, молекулярной
изменчивости, обусловленный изменениями в ядерном или цитоплазматических геномах в результате культивирования in vitro.
Выявлено несколько причин генетической нестабильности культивируемых клеток. В большинстве случаев генетической основой сомаклональной изменчивости являются мутации единичных или небольшой группы генов доминирующего или рецессивного характера в ядерном, пластидном или
митохондриальном геномах [12, 14]. Другой причиной может являться длительное пассирование тканевых и клеточных культур, приводящее к накоплению в них генетических изменений.
Каждый из указанных выше механизмов, обусловливающих изменчивость у сомаклонов, в определенной степени связан с другими и зависит от
нарушений клеточного цикла, которые индуцируются действием фитогормонов, содержащихся в культуральной среде [5, 11, 13].
Экспериментально установлены следующие закономерности:
1. Регенеранты, развившиеся в результате непрямого эмбриогенеза или
органогенеза, характеризуются большей изменчивостью, чем регенеранты,
полученные в результате прямого эмбриогенеза или органогенеза.
2. С длительностью культивирования частота сомаклональной изменчивости у регенировавших растений увеличивается.
3. Степень изменчивости по частоте цитогенетических нарушений у
сомаклонов определяется жизнеспособностью растений.
Для выявления у сомаклонов изменений в виде точковых мутаций производят их скрещивание с исходными линиями и прослеживают расщепление
в ряду поколений.
Значительная часть сомаклональной изменчивости у мягкой пшеницы,
томатов, риса обусловлена стабильными генетическими изменениями следующего характера:
– у сомаклонов мягкой пшеницы и риса, например, выявлены изменения по биохимическим и морфологическим признакам, находящиеся под моногенным (состав глиадинов, цвет зерновок) и полигенным (высота растений,
сроки колошения, урожайность) генетическим контролем;
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
202
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
– сомаклоны могут иметь изменения по ряду признаков, которые в потомстве группируются независимо;
– мутации у сомаклонов могут быть рецессивными, доминантными, кодоминантными;
– мутации, обнаруженные у сомаклонов мягкой пшеницы, могут затрагивать гены, локализованные во всех семи гомеологических группах хромосом мягкой пшеницы;
– у сомаклонов томатов обнаружены новые генные мутации, ранее не
индуцированные в результате химического или радиционного мутагенеза;
– одиночные генные мутации у сомаклонов могут проявляться с относительно высокой частотой (в среднем в одном растении на каждые 20–25
растений-регенерантов).
Изменчивость митохондриального генома обнаружена у сомаклонов
разных растений. Наиболее хорошо это явление изучено у растений кукурузы, регенерировавших из каллусной ткани незрелых зародышей. Анализ митохондриальной ДНК показал, что в структуре мт-ДНК сомаклонов произошли изменения, которые определяли их высокую чувствительность к грибу Helminthosporium maydis и которые не были выявлены у растений семенных поколений.
Примером изменчивости пластидного генома, вызванной его делециями, служат многочисленные данные по получению альбиносов среди сомаклонов пшеницы, риса, ячменя, сорго, кукурузы.
Амплификация (увеличение дозы гена, приводящее к возрастанию количества соответствующего фермента) описана в клетках суспензионной
культуры люцерны. Была выделена клеточная линия, которую по сравнению
с исходной характеризовала более высокая устойчивость к гербициду фосфинотрицину.
Таким образом, сомаклональную изменчивость можно рассматривать
как один из источников увеличения генетического разнообразия растений.
4.6.4. Гормоннезависимые растительные ткани
Ткани, образованные «привыкшими» клетками, которые приобретают
способность расти без гормонов (становятся автономными по отношению к
экзогенным цитокининам и ауксинам), называются гормоннезависимыми.
Еще их называют химическими опухолями. «Привыкшие» ткани, как и опухолевые, в большинстве случаев не способны к нормальной регенерации и
образуют лишь тератомы, хотя в отдельных случаях формируются и регенеранты. В таких тканях, как и в опухолевых, наблюдается интенсивный синтез
собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во внесении их в питательную среду.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
203
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.6. Органогенез в культуре соматических тканей
Кроме «привыкших» тканей существуют опухоли растительного происхождения, вызванные бактериями, вирусами, а также генетические опухоли, возникающие на межвидовых гибридах различных растений. Наиболее
распространенными в природе и представляющими интерес для исследователей являются корончатые галлы-опухоли, индуцированные у двудомный растений агробактериями (Agrobacterium tumefaciens). Часто встречаются еще
два вида истинных опухолей у растений – бородатый корень (Agrobacterium
rhizogenes) и стеблевой галл (Agrobacterium rubi), сходный с корончатым
галлом [3, 8, 12].
Общим свойством химических и природных опухолей растений является их гормоннезависимость. Внешне и те, и другие ткани сходны с каллусными. У «привыкших» тканей гормоннезависмость достигается в результате
изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков, участвующих в построении молекул гормонов, следовательно, в конечном счете
отвечающих за синтез гормонов. Таким образом, изменения в данном случае
носят эпигенный характер, хотя нельзя исключить и возможность мутации.
В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс.
В 40-х гг. Браун показал, что ткани корончато-галловой опухоли даже в
отсутствие агробактерий (например, после гибели под воздействием высоких
температур) сохраняют опухолевые свойства. На искусственной среде эти
ткани продолжают активно пролиферировать. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и продуцируют несколько цитокининов.
В 1977 г. Чилтон показал, что опухоли корончатого галла возникают в
результате включения определенного фрагмента Ти-плазмиды (Т-ДНК) агробактерий в растительную ядерную ДНК. Таким образом, сегмент Типлазмиды интегрируется в хромосому и становится частью наследственного
аппарата трансформированной (опухолевой) растительной клетки. Гормоннезависимость, являющаяся следствием экспрессии генов, контролирующих
синтез ауксинов и цитокининов, приводит к дедифференцировке и пролиферации клеток. Путь синтеза этих гормонов в опухолевых клетках более простой и короткий, чем в нормальных и «привыкших» клетках.
Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует синтез галлами
нового класса веществ, не встречающихся в природе, – опинов. Они содержатся только в тканях корончатых галлов и служат их маркерами. Они являются ростовыми веществами агробактерий, однако опухоли продуцируют их
и в отсутствие микроорганизмов.
Общие свойства «привыкших» и опухолевых клеток: гормоннезависимость и отсутствие регенерации.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
204
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.7. Суспензионные культуры
Суспензию клеток можно получить из каллуса при помещении его в
жидкую питательную среду на качалку или непосредственно из ткани экспланта с помощью пектиназы и встряхивания. Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате образуется клеточная суспензия [11, 14].
Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и
крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной
среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях.
Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры
необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60–100 мл жидкой
питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой
питательной средой на круговых качалках со скоростью 100–120 об/мин.
Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, который легко
фрагментируется на отдельные клетки или небольшие агрегаты и получается
на средах с 2,4-Д. Облегчает суспендирование исключение из питательной
среды ионов кальция, цитокининов или уменьшение их концентрации и увеличение ауксинов. Еще более – добавление в среду пектиназы, которая разрушает пектат кальция, склеивающий между собой отдельные клетки
Основным условием культивирования клеточных суспензий является
постоянное встряхивание или перемешивание среды. Иначе опять формируется каллусная ткань! Деление поддерживается присутствием ауксинов и цитокининов, которые необходимы для индукции и роста каллусной ткани.
Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации.
Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это
зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 сут. Обычно длительность культивирования составляет 14–16 дней. При этом плотность возрастает от 10 000 до 1 000 000 кл/мл. Для субкультивирования суспензия берется в конце экспоненциальной фазы, метаболиты – лучше в стационарной.
Назначение суспензий – получение вторичных метаболитов (лекарства,
парфюмерия, биомасса, селекция и протопласты). Суспензии используют для
получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов,
алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском
хозяйстве [2, 3, 8].
Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и
особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
205
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.7. Суспензионные культуры
Характеристики суспензии – жизнеспособность, плотность в суспензии, степень агрегированности, скорость роста.
По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние
клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора
инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14–16 дней после начала культивирования). При построении
кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2-3 недели культивирования возрастает в 20 раз.
В зависимости от целей исследования условия культивирования и состав питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии преобладала определенная фракция клеток. Обычно в суспензии различают 4 основные
фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты, средние агрегаты, крупные агрегаты.
При работе с суспензиями необходимо учитывать и ее жизнеспособность. О жизнеспособности клеток можно судить по движению цитоплазмы,
по степени проницаемости клеточной стенки для красителей, по активности
ферментов.
Жизнеспособность определяется по окрашиванию метиленовой синью
или синей Эванса (0,5 %-м раствором синей Эванса или 0,01 %-м раствором
флуоресцеинацетата). Прижизненные красители клетки не убивают и через
оболочки живых клеток в цитоплазму не проникают. Жизнеспособность
культуры определяют соотношением количества жизнеспособных клеток к
общему количеству в миллилитре суспензии. Жизнеспособные или живые
культуры характеризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при окрашивании препаратов красителями [11].
Суспензия считается жизнеспособной, если более 70 % клеток не окрашиваются в синий цвет; агрегат жизнеспособен, если более 50 % его клеток не окрасились.
Культивирование суспензий осуществляется в периодическом или непрерывном (проточном) режиме. Клетки не удаляются в закрытой системе,
частично удаляются – в открытой. Для промышленного производства применяют ферментеры.
Во многих случаях изучение особенностей размножения и роста клеток
связано с необходимостью использования синхронизированных клеточных
популяций.
Как правило, клеточная популяция суспензионных культур не только
гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки, различающиеся по
времени вхождения в митоз. Для синхронизации клеточных культур используют методы индукции, когда течение клеточного цикла блокируется в определенном периоде под влиянием или физических факторов, например, пониженной температурой, или химических соединений.
Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых клеток
могут быть ингибиторы синтеза ДНК: тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина. В результате обработки клеток этими веществами клеточный цикл про Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
206
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.7. Суспензионные культуры
должается только до Gi-периода и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу клеток к синтезу ДНК, а затем и делению.
Другой способ синхронизации заключается в создании условий «голодания» по одному из компонентов культуральной среды, например, ауксину,
цитокинину, углеводам, азоту. Клетки накапливаются в Gi- или Ог-периоде
клеточного цикла. Затем пассирование суспензии на среду с недостающим
компонентом приводит к синхронизации клеточного деления. С помощью
индукции синхронизации клеточных делений удается повысить митотический индекс с 2-3 до 30–35 %.
4.8. Культура отдельных изолированных клеток,
или культура одиночных клеток
Получение культуры отдельных изолированных клеток очень ценно
для генетических и физиологических исследований, практического использования в клеточной селекции. Так, получение клона потомства одиночной
клетки помогает установить причины генетической неоднородности каллусных клеток.
Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, тканей растений, из каллусных тканей или культуры протопластов после восстановления
клеточной стенки. Для получения одиночных клеток иногда достаточно отстаивания суспензионной культуры (10–15 мин в колбе) или использования
мацерирующих ферментов, центрифугирования в градиенте сахарозы либо
фильтрования через сито.
Первые работы по изоляции клеток растений и получению изолированных клонов было выполнено в 1954 г. в Висконсинском университете, США.
Отдельные клетки выделяли из рыхлой каллусной ткани табака, культивированной в жидкой питательной среде при постоянном встряхивании на шейкере. Трудности связаны с тем, что отдельные клетки не делятся в тех условиях, при которых растет каллусная ткань. Предварительные эксперименты показали, что при помещении отдельной изолированной клетки в культуральную среду ее деления не происходило.
Однако клоны из таких клеток удалось получить Мьюиру с соавторами
с использованием метода ткани-«няньки». В этом случае изолированную
клетку переносили на фильтровальную бумагу, смоченную питательной средой и помещенную на поверхность хорошо растущей каллусной ткани. Каллусная ткань индуцировала и поддерживала деление клетки, а затем и развитие клеточного клона. В тех же целях используют суспензионные культуры
клеток [12] (рис. 4.14).
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
207
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток
Рис. 4.14. Использование в качестве «няньки»
культуры суспензионных клеток при выращивании одиночных клеток: 1 – колонии клеток;
2 – фильтровальная бумага; 3 – алюминиевая
сетка; 4 – пенополиуретан; 5 – суспензия клеток
Для индукции клеточных делений одиночных клеток можно использовать кормящий слой (активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений), отделенный от культивируемых одиночных клеток полупроницаемой мембраной.
Стимулирует клеточное деление и кондиционирование среды, для чего
в нее добавляют питательную среду интенсивно делящейся культуры клеток.
Кондиционирующий фактор получают при фильтровании клеточной суспензии в экспоненциальной фазе роста через бактериальный фильтр.
Позже был разработан метод массового культивирования отдельных
изолированных клеток – метод плейтинга (от the plate – чашка) [11]. Метод
состоит из следующих процедур:
– получение клеточной суспензии в жидкой питательной среде из хорошо растущей каллусной ткани;
– фильтрование суспензии через сито для удаления крупных клеточных
агрегатов;
– приготовление 0,6–1 %-й агаровой среды того же состава, который
был использован для поддержания роста суспензии;
– нагревание агаровой среды до жидкого состояния и перемешивание
ее с равным количеством суспензии, которую необходимо разлить в чашки
Петри слоем около 1 мм;
– определение местоположения отдельных клеток с использованием
инвертированного микроскопа и нанесение пометок об их наличии на крышках чашек;
– культивирование в темноте при t = 25 °С;
– наблюдения за развитием одноклеточных клонов.
В экспериментах Бергмана около 20 % изолированных каллусных клеток табака делилось и образовывало колонии.
При данном способе культивирования, даже при недостаточно сбалансированном составе питательной среды, может происходить деление отдельных клеток. Это обусловлено тем, что в соседних колониях, образованных из
мелких клеточных агрегатов, синтезируются ростовые вещества, которые
выделяются в среду и стимулируют клеточное деление.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
208
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток
Метод микрокамеры разработан Джонсом в 1960 г., который может
быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной
среды для культивирования отдельной изолированной клетки.
Метод включает следующие процедуры:
– на предметное стекло с помощью парафинового масла на небольшом
расстоянии наклеивают два покровных стекла;
– между покровными стеклами наносят квадрат из парафинового масла;
– в камеру из парафинового масла помещают каплю питательной среды
с изолированной клеткой;
– сверху камеру накрывают третьим покровным стеклом;
– за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом.
Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдебрандту в 1965 г. продемонстрировать возможность получения из изолированной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения растения. Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотентность клетки растения. К указанному методу близок способ Ю.Ю. Глеба – в
микрокаплях.
4.9. Культура протопластов
Протопласт – клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная
цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Протопласт имеет характерную сферическую форму, его
поверхность защищена только плазмолеммой.
4.9.1. Изоляция протопластов
Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ [11]. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее
время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:
– невысокая производительность;
– возможность использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом;
– трудоемкость и длительность.
Другой метод выделения протопластов – энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 г. Салтон с помощью фермента лизоцима впервые
разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 г. Коккинг обработал кончики
корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости
плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
209
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.9. Культура протопластов
По сравнению с механическим энзиматический метод обладает следующими преимуществами:
– одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн
из грамма ткани или клеток);
– клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу;
– клетки не повреждаются;
– метод сравнительно быстрый.
Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.
Выделение протопластов проводят в три этапа:
1) обработка ферментами;
2) выделение протопластов из клеточных стенок;
3) отделение интактных протопластов от клеточных осколков.
В зависимости от происхождения растения и взятой для изоляции протопластов ткани подбирается вид ферментов, их комбинация и концентрация.
Для выделения протопластов используют разные ткани растения, а также
каллусные и суспензионные культуры. С целью получения большого числа однотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев.
Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки.
Когда протопласт «голый», один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды
выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической,
чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти
условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве
осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит,
ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3–0,8 моль/л. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.
Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных
культур [12]. Лучше всего – в поздней стадии логарифмического роста, когда
клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
210
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.9. Культура протопластов
Рис. 4.15. Схема получения и культивирования
протопластов из клеток растений
Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического
стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды – 5,4–5,8, температура – 22–28 оС, невысокая освещенность (не более 2 000 лк).
Общее представление об этапах получения, культивирования in vitro
протопластов и регенерации из них растений дано на рис. 4.15.
4.9.2. Тотипотентность протопластов
Сразу после того, как отмыты ферменты, протопласты начинают регенерировать клеточную стенку. Отмечается появление целлюлозных микрофибрилл, постепенно организующихся в типичную клеточную оболочку. Че Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
211
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.9. Культура протопластов
рез 2–4 дня протопласт может утратить сферическую форму, и произойдет
полное восстановление клеточной стенки. В зависимости от происхождения
протопластов и культуральных условий может отмечаться отсутствие синтеза
клеточной оболочки в течение нескольких недель или месяцев.
Одним из факторов культуральной среды, обусловливающим синтез
клеточной стенки, является сахароза. В ее отсутствие синтеза клеточной
стенки не происходит.
Протопласты, не регенерировавшие клеточную стенку, теряют способность к нормальному митотическому делению и образованию клеточных колоний. Такие протопласты или не приступают к делению, или в результате их
деления формируются многоядерные структуры, так как кариокинез не сопровождается цитокинезом.
Формирование клеточной стенки не всегда является условием, достаточным для перехода клетки к делению. В зависимости от объекта и условий
культивирования к последующему делению может приступить от 0,1 до 80 %
восстановивших клеточную стенку протопластов. Первые деления могут
происходить через 2–10 дней с начала культивирования протопластов. Образовавшиеся клеточные колонии могут стать источником растенийрегенерантов.
Первое сообщение о регенерации растений в культуре протопластов
мезофилла табака было опубликовано в 1971 г. японскими исследователями.
Наиболее хорошо отработаны методы изоляции и культивирования протопластов у представителей семейства Solanaceae и отдельных видов Brassica.
Трудными объектами для получения протопластов, способных к реализации
тотипотентности, являются однодольные растения, в том числе злаки, и хвойные.
4.9.3. Требования к составу сред
при культивировании протопластов
Для культивирования протопластов могут быть использованы модификации сред Мурасиге и Скуга или Гамборга (В-5) с добавлением комплекса
витаминов и фитогормонов. До того как протопласты синтезируют клеточную стенку, необходимо обеспечить в среде соответствующий уровнь осмотического давления для поддержания стабильности протопластов. В качестве
осмотиков используют сахара: глюкозу, маннитол, сорбит, ксилозу, сахарозу
или их разные сочетания. После регенерации клеточной стенки и развития
клеточных колоний осмотики из среды исключают. Другой важный фактор
успешного культивирования протопластов – плотность их высева, которая
может составлять 104–103 протопластов на 1 мм среды.
Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования.
В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на
пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирова-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
212
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.9. Культура протопластов
ние единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл,
предложенное Ю. Глебой в 1978 г.
Во втором – суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки
Петри, добавляют равный объем той же среды с 1 %-м агаром при температуре не выше 45 оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28 оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения.
Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения,
что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки
смешивают с жизнеспособными протопластами, и они поддерживают и стимулируют их рост.
Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений.
Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через
развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого
добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.
На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора: видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани
растения, способ и условия выделения протопластов, плотность высева протопластов, состав питательной среды.
4.9.4. Использование культуры протопластов
Отсутствие клеточной стенки у протопластов обусловливает им свойства, отличные от целых клеток. Благодаря тому, что протопласты способны
поглощать макромолекулы и органеллы, их используют в качестве реципиентов при трансформации, а также в экспериментах по клеточной селекции и
мутагенезу. Изолированные протопласты служат источником для выделения
неповрежденных и функционально активных субклеточных и цитоплазматических структур и органелл (хлоропластов, ядер, хромосом). Способность
протопластов сливаться друг с другом нашла применение для получения соматических гибридов.
И все же проблема соматической гибридизации в норме нескрещивающихся видов растений еще не решена. Даже если будут разработаны удобные
методы отбора соматических клеток, останутся проблемы генетической и
физиологической несбалансированности. Наиболее вероятно, что слиянием
протопластов в практической селекции будут пользоваться только для переноса отдельных хромосом или хромосомных фрагментов, которые удается
сохранить после ряда делений и спонтанной элиминации хромосом одного из
видов.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
213
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.9. Культура протопластов
Слияние протопластов – парасексуальная гибридизация. Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов – своеобразный метод гибридизации,
так называемая парасексуальная, или соматическая, гибридизация [11]. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные
клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства
высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:
– скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов);
– получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного
из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого;
– слияние трех и более клеток;
– получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей;
– перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать
жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение;
– получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.
Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов,
так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков – скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т.д. Наличие косегрегации генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов.
Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей
или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния
протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.
При физическом способе слияния протопластов, разработанном
Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 г., протопласты помещают в камеру
с неоднородным электрополем. На электродах формируются агрегаты из 2-3
протопластов либо цепочки из 5-6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию
пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так
как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и
протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток обуславливает
возвращение сферической формы у слившихся протопластов.
В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле
сжимает мембраны, способствуя их локальному разрушению, а переменное
электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя
свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные
мембраны могут установить контакт.
Чаще для индукции слияния протопластов используют методику ПЭГ –
высокие значения рН – высокая концентрация Са2+, которая дает до 50 %
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
214
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.9. Культура протопластов
слившихся протопластов (рН – 9–11, концентрация Са2+ – 100–300 ммоль/л).
В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция – их слияние.
Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что
связано с их жидкостно-мозаичной структурой.
При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния – АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только
продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки
ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать
поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А,
имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами
В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться
комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.
Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного
растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать
протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной
(RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных
типов клеток, будут иметь оба цвета флуоресценции – желто-зеленый и красный.
Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось
в 1972 г. (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Р.Г. Бутенко в 1975 г.
Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной:
1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и
однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии
сегрегируют в процессе клеточных делений.
2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.
3. Возникают гибридные клетки и растения в результате слияния более
чем двух родительских клеток.
Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию
гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид – продукт
слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматический гибрид) – растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один
из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток про Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
215
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.9. Культура протопластов
водится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК
митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках.
При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные
гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного
из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от
друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом,
в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из
родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная
обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом.
Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.
Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских
клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения-регенеранты.
В результате соматической гибридизации можно получить межвидовые, межродовые, межтрибные, межсемейственные, межцарственные отдаленные гибриды.
Для отдаленных гибридов характерно:
1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не
наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.
2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация
хромосом).
3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.
4. Ограниченная морфогенетическая способность.
Конструирование клеток. Протопласты широко используются в качестве
реципиентов для клеточных органелл. В 1973 г. И. Потрикусс и Ф. Хоффман
успешно трансплантировали изолированные ядра петуньи в протопласты табака. Ввести ядро или другие клеточные органеллы в протопласт можно несколькими методами:
– использованим в трансплантации сэндвич-метода в условиях слабого
деплазмолиза протопласта;
– переносом клеточных органелл посредством липосом;
– слиянием одно- и многоламелльных частиц с мембранами протопластов, в присутствии таких веществ, как фосфатидилсерин, холистерол и т.д.;
– переносом органелл путем микроинъекций.
Кроме ядра трансплантируют и другие органеллы, такие как митохондрии и хлоропласты. Выбор этих органелл объясняется их полуавтономностью, т.е. наличием собственной ДНК и способностью делиться самостоятельно, независимо от деления самой клетки. Кроме того, эти органеллы контролируют важнейшие физиологические процессы растительной клетки, такие как фотосинтез и дыхание. Например, перенос хлоропластов может ис-
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
216
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.9. Культура протопластов
пользоваться для выведения новых форм хозяйственно важных сортов растений. Трансплантация высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растения.
Одним из важных моментов является сохранение клеточных органелл,
поэтому для переноса их в последнее время используются субпротопласты –
фрагменты, полученные из протопластов. Они могут содержать большую
часть цитоплазмы, но без ядра (цитопласты), ядро с небольшим количеством
цитоплазмы (кариопласты), часть хромосом с небольшим количеством цитоплазматического материала (микропротопласты).
Биологическое конструирование на уровне клетки может оказаться полезным и перспективным для создания клеток, клеточных систем и целых
растений, удовлетворяющих потребности человека. Под биологическим конструированием следует понимать не только введение отдельных органелл.
Аналогичным образом в клетку можно вводить и чужеродный генетический
материал, как в виде фрагментов ДНК, так и в виде отдельных хромосом.
Кроме того, в изолированные протопласты можно вводить клетки микроорганизмов, создавая таким образом искусственные ассоциации.
Однако необходимо учитывать и следующее явление (по аналогии с
сомаклональной изменчивостью): у растений, регенерировавших в результате культивирования протопластов, также проявляется изменчивость. Ее называют протоклональной изменчивостью, а регенерировавшие растения –
протоклонами.
Спектр изменчивости у протоклонов выражен в большей степени, чем
у сомаклонов, так как протопласты в большей степени, чем клетки, подвержены воздействиям экзогенных факторов, спектр которых более широк [11].
4.10. Культура гаплоидных тканей
Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором
в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный
набор негомологичных хромосом.
Уровень спонтанного возникновения гаплоидов очень низкий – примерно один гаплоид на 105–106 растений. Для повышения частоты образования гаплоидов используют разные приемы:
– воздействуют на процессы опыления и оплодотворения радиационным излучением или химическими веществами;
– опыляют растения чужеродной пыльцой, индуцирующей к развитию
неоплодотворенную яйцеклетку;
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
217
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.10. Культура гаплоидных тканей
– выполняют отдаленные скрещивания с такими генотипами, когда
обеспечивается двойное оплодотворение, но в процессе развития зародышей
происходит элиминация хромосом опылителя, что приводит к развитию гаплоидного зародыша материнского генотипа (метод гаплопродюссера);
– культивируют изолированные пыльники;
– культивируют неоплодотворенные завязи и семяпочки.
Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. По внешнему виду гаплоиды сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший
размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет.
Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение.
Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из
пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже
получены у 200 видов растений.
Отдаленная гибридизация – важный метод формообразования и улучшения существующих сортов. Основная ее проблема – низкая совместимость
или полная несовместимость скрещиваемых видов. Для ее преодоления эффективны различные модификации методов культуры тканей: своевременное
изолирование и доращивание гибридных зародышей на питательных средах;
каллусогенез при культивировании незрелых гибридных зародышей и регенерация растений из каллусных тканей.
4.10.1. Культура пыльников
Известны несколько методов создания гаплоидов в культуре изолированных тканей растений, имеющих свои преимущества и недостатки:
1) использование (введение в культуру) гаплоидных тканей нативного
растения (пыльники, пыльцевые зерна, семяпочки);
2) гаплопродукции – создание условий для получения гаплоидной ткани на интактном растении (отдаленная гибридизация, приводящая к элиминации (абортированию) одного из родительских генотипов), а затем доращивание недоразвитого семени или зародыша.
Гут и Магешвари, впервые занявшиеся культурой пыльников, вызвали
рост гаплоидных клеток действием кинетина, а рост диплоидных клеток –
включением в среду ауксина, индолилуксусной кислоты (ИУК) с кинетином.
Затем последовали сообщения разных авторов о получении ими гаплоидов риса, рапса, ячменя, паслена черного, томата, эгилопсов, спаржи и
других культур. В 70-х гг. из пыльцевых зерен уже получили гаплоиды
23 видов 5 семейств и 4 межвидовых гибрида.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
218
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.10. Культура гаплоидных тканей
В процессе культивирования пыльников в условиях in vitro имеет место
андрогенез – развитие эмбриоидов, а затем и растений из мужских половых
клеток (микроспор).
Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников
на питательные среды является стадия «средних» или «поздних» одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу.
Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с
1
/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д.
Из цитокининов применяют кинетин и 6-БАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества, неблагоприятно влияющие на развитие
пыльников. Для адсорбции метаболитов, ингибирующих ростовые процессы
в культуре тканей, в питательные среды добавляют активированный уголь.
Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре
о
4–6 С в течение 2–8 сут. Изолированные пыльники культивируют либо в
темноте, либо при слабом освещении при температуре (25+2) оС.
На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидный зародыш (сначала формируется 40–50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение
гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции
и генетики.
В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов) [10] (рис. 4.16),
либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при
пассировании на специальные среды – морфогенный каллус и регенеранты.
Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по ряду морфологических признаков. Это обусловлено гетерогенностью
каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов, и растений-регенерантов.
 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие
219
ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
4.10. Культура гаплоидных тканей
Рис. 4.16. Схема формирования андрогенных эмбриоидов
Как показали опыты, таким способом образуются не только гаплоидные, но и диплоидные и полиплоидные растения. Первые формируются из
микроспор или из каллуса микроспоры, а диплоиды – из спонтанно удвоенных ядер, из клеток гаплоидного каллуса.
Пыльники капусты благоприятно реагируют на смесь кинетина и 2,4-Д,
пыльники риса – на 2,4-Д или 1-нафтилуксусную кислоту (НУК). Исключительно активный рост пыльцы индуцирован у дурмана и рода Brassica кокосовым молоком, а у дурмана – и соком сливы. Эти продукты оказались для
названных растений эффективнее, чем какие-либо синтетические индукторы.
У многих видов наилучший выход микроспор обеспечивается при предобработке культивируемых пыльников низкими температурами. У ячменя,
например, обработка в течение 7–14 дней при 7 оС дает оптимальные результаты.
4.10.2. Использование гаплопродюссеров
и отдаленной гибридизации при получении гаплоидных тканей
Отдаленная гибридизация – важный метод формообразования и улучшения существующих сортов. Основная его проблем