На правах рукописи Моханад Абдулилах Кассим СОСУДИСТЫЕ ЭФФЕКТЫ АНДРОГЕНОВ И ИХ РОЛЬ В МЕХАНИЗМАХ СТРЕССА И АДАПТАЦИИ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань – 2015 1 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Семячкина-Глушковская Оксана Валерьевна Официальные оппоненты: Мулик Александр Борисович, доктор биологических наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Волгоградский государственный университет», институт естественных наук, директор Клочков Виктор Александрович, доктор медицинских профессор, ФГБУ естественных наукнаук, «Саратовский научно-исследовательский институт кардиологии» Минздрава России, лаборатория артериальной гипертензии, заведующий Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России Защита состоится « 25 » декабря 2015 года в 14:00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет» по адрес: 414000, г.Астрахань, пл. Шаумяна,1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет» по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а, и на сайте: http://www.asu.edu.ru Автореферат разослан « » 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета Курьянова Евгения Владимировна 2 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Тесная взаимосвязь между уровнем половых гормонов и стрессом показана во многих исследованиях (King et al., 2005; Шерстюк, 2007; Oskui et al., 2013; Semyachkina-Glushkovskaya et al., 2014). Известно также, что половые гормоны оказывают мощное управляющее и модулирующее влияние на стресс-реактивность и стресс- устойчивость организма (Анищенко, 1993, Игошева, 2009, Семячкина-Глушковская, 2010, Семенова, 2005). При этом женским половым гормонам отводят защитную роль в отношении развития многих стресс-индуцированных сосудистых заболеваний, в то время как мужские половые гормоны остаются вне поля зрения ученых (Мамбетова, 2000; Dubey et al., 2001; Deschams et al., 2010). Кардиопроекторные эффекты андрогенов были впервые показаны в 1977 г. Профессором Jaffe (1977), который первым предложил лечить миокардиальную ишемию у мужчин с помощью тестостерона. Впоследствии применение тестостерона в кардиологической практике стало одним из направлений в терапии различных коронарных нарушений. Антиишемические эффекты андрогенов в миокарде были выявлены в исследованиях как с хроническим применением их синтетических аналогов pes оs в больших дозах (Wu, 1993) и подкожно (English, 2000б), так и при экстренной помощи с использованием внутривенных и внутрикоронарных инъекций (Webb, 1999а, 1999б). В экспериментах на приматах и кроликах, получающих в течение длительного времени дегидроэпиандростерон, была выявлена защитная роль андрогенов в устойчивости к развитию атеросклероза (Gordon, 1988; Eich, 1993; Christopher-Hennings, 1995). Тот факт, что низкий уровень тестостерона сочетается с высокой смертностью от многих стресс-индуцированных заболеваний, таких как коронарные болезни, диабет, сердечная недостаточность (Araujo, 2011; Haring, 2010; Szulc, 2009; Laughlin, 2008; Khaw, 2007; Araujo, 2007; Shores, 2006; Smith, 2005), говорит о том, что нормальное содержание андрогенов критически необходимо для поддержания гомеостаза и сохранения резервных возможностей организма. Предполагается, что в основе кардиопротективных эффектов андрогенов лежат их вазорелаксирующие эффекты, обнаруженные в многочисленных опытах in vitro на коронарных артериях, взятых у разных видов животных (Yue, 1995; Crews, 1999; Murphy, 1999; Deenadayalu, 2001). Кроме коронарных артерий, релаксирующие воздействия тестостерона были выявлены и на других типах артерий, включая грудную аорту (Yue, 1995; Honda, 1999; Ding, 2001), брыжеечные (Tep-Areenan, 2002), легочные (English, 2001) артерии. Выдвигается предположение, что патологические сдвиги в андрогензависимых механизмах регуляции сосудистого тонуса могут лежать в развитии артериальной гипертензии (АГ) и обеспечивать половые различия в данном заболевании (Honda, 1999; Dubey, 2002; Khalil, 2005). Так, в опытах с кастрацией показаны прогипертензивные эффекты андрогенов (Ganten, 1989; Chen, 1991; Rowland, 1992; Crofton, 1993; Reckelhoff, 2000). 3 С другой стороны, существуют работы, в которых выявлена гипотестостеронемия у гипертензивных объектов (Fogari, 2002; Ishikura, 2008). На фоне стресса показаны неоднозначные реакции со стороны андрогенов в мужском и женском организме. Так, в клинических исследованиях выявлено, что уровень тестостерона снижается при ежедневном воздействии психологического стресса, причем наиболее выраженно это происходит у мужчин по сравнению с женщинами среднего возраста (King, 2005). При этом, в этих условия уровень кортизола, как основного гормона стресса, изменяется менее выраженно по сравнению с тестостероном (Francis, 1981). В экспериментах на крысах также показано, что хронический стресс сопровождается подавлением секреции андрогенов, что влечет за собой снижение активности различных форм нитроксидсинтазы, ксантиноксидазы и NADPH- диафоразы (Шерстюк, 2007). Однако, не только в условиях хронического стресса, но и экстремальные кратковременные стрессы, такие как острые эмоции, которые испытывают молодые мужчины при прыжках с парашютом или с дельтапланом, также сказываются на функциях половых желез в виде снижения их секреторной деятельности (Chatterton, 1997). Таким образом, научные сведения о продукции мужских половых гормонов и их регулирующих влияниях на сосуды нуждаются в более детальных исследованиях и структурированности для формирования более четкого видения роли мужских половых гормонов в процессах стресса и адаптации. Вышеизложенное определило цель и задачи настоящих исследований. Целью исследования явилось изучение роли андрогенов в механизмах регуляции сосудистой стресс-реактивности и стресс-устойчивости, а также изучение системных и молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов. Задачи исследования: 1. Изучить влияние стресса на процесс образования тестостерона и установить взаимосвязь между секрецией гормона и стресс-индуцированными изменениями в уровне АД при использовании моделей легких физиологических, хронических и запредельных стрессов; 2. Исследовать стресс-индуцированные изменения в экспрессии андрогенных рецепторов в мозге и висцеральных органах на фоне хронически высокого АД и развития в этих условиях гипотестостеронемии с применением метода иммунофлуоресценции и модели АГ у крыс длительно проживающих в условиях социального стресса; 3. Выявить взаимосвязь между низким содержанием тестостерона в крови и устойчивостью к развитию стресс-индуцированных сосудистых «катастроф» в мозге с использованием моделей естественной и патологической гипотестостеронемии у новорожденных и взрослых гипертензивных крыс, соответственно. 4. Исследовать андроген-зависимые механизмы регуляции сосудистой стресс-реактивности у крыс с применением методов гонадэктомии и блокады андрогенных рецепторов на фоне фармакологической модуляции 4 холинергических влияний атропином; 5. Установить эффекты андрогенов в отношении регуляции интенсивности адреналового ответа при стрессе на гормональном и молекулярном уровнях, изучая эффекты дефицита мужских половых гормонов на секрецию адреналина и бета-аррестина-1 в крови; 6. Оценить эффективность фармакологической коррекции низкого содержания тестостерона путем введения сустанона в отношении устойчивости к стресс-индуцированому развитию инфаркта мозга у гипертензивных крыс. Научная новизна. Впервые было изучено влияние различных видов стресса на продукцию тестостерона у самок и самцов крыс. Новыми являются уточняющие данные о том, что стрессы – хронические (для мужского организма) и запредельные (для мужского и женского организма) являются важными факторами в подавлении секреции тестостерона. Впервые с применением оригинальных моделей естественного и патологически низкого уровня андрогенов у крыс установлено, что низкий уровень тестостерона не является прямым показателем снижения сосудистой стресс-устойчивости, однако, подавление секреции гормона в динамике сопряжено с критическим состоянием механизмов адаптации к стрессу и нарушением сосудистого гомеостаза. В экспериментах на моделях легкого эмоционального, хронического и запредельного стрессов впервые было выявлено, что индуцированные стрессом изменения в уровне АД и содержании тестостерона в крови не сопряжены напрямую друг с другом. Впервые на модели стрессиндуцированной АГ установлено, что гипотестостеронемия в этих условиях сопряжена со снижением экспрессии ядерных андрогенных рецепторов в семенниках и церебральных сосудах, что свидетельствует о подавлении регуляторных возможностей андрогенов в отношении процессов синтеза мужских половых гормонов, а также ассоциируется с низкой устойчивостью к развитию геморрагического инфаркта мозга. Оригинальными являются данные о том, что сосудистые эффекты андрогенов заключаются в ограничении интенсивности сосудистой стресс-реактивности опосредовано через холинергические влияния, а также подавления адреналового представительства на сосудах как со стороны гормонального звена (адреналин), так и сигнальных систем стресса (бета-аррестин-1). Впервые выявлено, что фармакологическое замещение низкого уровня тестостерона в крови путем введения сустанона на фоне хронически высокого уровня АД не улучшает течение гипертензии и не повышает устойчивость к стресс-индуцированному повреждению церебральных сосудов, сопровождающих развитие интракраниальных геморрагий. Показано, что лимитирующие эффекты андрогенов в отношении сосудистой стресс-реактивности проявляются как второстепенные запасные механизмы на фоне прямых процессов поддержания сосудистого гомеостаза. Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют научные представления о роли андрогенов в сосудистой стресс-устойчивости и в механизмах адаптации к стрессу. На большом экспериментальном материале было показано, что сосудистые эффекты андрогенов определяются исходным состоянием организма, 5 проявляясь преимущественно в критические периоды стресса. Важным результатом явился тот факт, что изменения в секреции мужских половых гормонов не зависят напрямую от уровня АД, а строго определяются стрессогенным фоном. При этом, развитие АГ является фактором, провоцирующим подавление секреции андрогенов у мужских особей, но не у женских. Эти данные имеют важное значение для уточнения алгоритмов назначения гормон-заместительной терапии гипертензивным пациентам. Яркими результатами явились данные по резкому снижению тестостерона в крови вне зависимости от пола на фоне запредельных стрессов при развитии геморрагического инфаркта мозга и язвенного кровотечения. При этом, предварительные исследования по возможности коррекции стрессустойчивости церебральных сосудов при помощи фармакологического восстановления уровня андрогенов в крови не дали положительных результатов. Однако, было обнаружено, что андрогены выполняют функции «запасного аэродрома» при снижении адаптивных возможностей организма за счет проявления лимитирующих эффектов в отношении стресс-реактивности адренергической системы (адреналин) и активации сигнальных молекул стресса (бета-аррестин-1). Эти результаты могут быть «золотым ключиком» в открытии новых терапевтических подходов в восстановлении секреции мужских половых гормонов за счет модуляции экспрессии бета-аррестина-1. В условиях стресса, введение сустанона - синтетического аналога тестостерона, «не видится» организмом, несмотря на визуальное повышение содержания горомона в крови. Это означает, что в критических ситуациях на фоне запредельного стресса андрогены теряют доступ к механизмам регуляции сосудистой стрессреактивности, возможно, за счет подавляющего воздействия бета-аррестина-1. ткрытиях последних лет показано, что модуляция активности бета-аррестина-1 оказывает выраженные терапевтические эффекты при стресс-индуцированных мутагенных изменениях в тканях, включая семенники. На основе этих данных, тестирование выдвинутой гипотезы о возможной коррекции секреции андрогенов с помощью блокады бета-аррестина-1 и повышения сосудистой стресс-устойчивости в клинических и экспериментальных исследованиях может явиться одним из основных векторов новых научных работ в этом направлении. Выявлено, что андрогены оказывают лимитирующие влияния на прессорные эффекты стресса опосредованно через холинергические механизмы и ограничения адреналового доступа на сосуды. Эти факты являются важной теоретической основой для развития нового фармакологического направления в лечении сосудистых патологий с помощью гормон-заместительной терапии. Интересным фактом, требующим детальных и дальнейших исследований, явилась «модель» низкого содержания андрогенов в крови у новорожденных крыс, но более высокой их устойчивости к запредельным стрессам по сравнению со взрослыми гипертензивными животными. Использование данной модели, в сравнении с половозрелыми особями, позволит понять какие механизмы выходят из строя в условиях тяжелых стрессов, требующих подключения «запасного аэродрома» в виде андрогенов. 6 Материалы и методы исследования Исследования выполнены на 302 половозрелых, 22 новорожденных самцах и 73 самках белых беспородных крыс. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Регистрацию среднего артериального давления (ср.АД) у бодрствующих крыс осуществляли на компьютерно-вычислительном комплексе для прямой регистрации кровяного давления у мелких животных (PowerLab/400 ML 401, ID Instruments, 2002, Австралия) с программным обеспечением Chart 4, оснащенным датчиками кровяного давления (MLT0699, PowerLab, ID Instruments). С этой целью за сутки до экспериментов животным вживлялся полиэтиленовый катетер в аорту через левую ветвь сонной артерии под общей нембуталовой анестезией (0.40 мг/кг, ip). Стандартная операционная процедура по имплантации полиэтиленовых катетеров в сосуды подробно описана в следующих научных работах (Мурашев, 1992; Глушковская-Семячкина, 2002). В экспериментах использовались полиэтиленовые катетеры (ClayAdams, Parsippany, NewYersey), маркированные как BB31695-PE/1 (наружный диаметр - 0.61 мм, внутренний диаметр – 0.28 мм) и BB31695-PE/3 (наружный диаметр - 0.96 мм, внутренний диаметр – 0.58 мм). Для постоперационного восстановления животные помещались в индивидуальные клетки (0.3×0.25×0.2 м). Эксперименты проводили спустя 24 часа после операции. Перед началом каждого опыта крысы адаптировались к экспериментальной обстановке в течение 30 мин. В этот период испытуемому животному через катетер вводили раствор гепарина для предотвращения тромбообразования на его стенках (Biochemi, Vienna/Austria 25000 ED/5ml) из расчета 1000 ED/0.2 мл гепарина в 0.8 мл физиологического раствора в объеме 0,2 мл раствора гепарина). Способы моделирования ренальной и стресс-индуцированной артериальной гипертензии подробно описаны в патентах РФ 68280, 2409872. С целью изучения резервных возможностей сердечно-сосудистой системы изучали структуру кардиоваскулярной стресс-реактивности в условиях тяжелого стресса, провоцирующего развитие церебро- и кардиоваскулярных повреждений (Анищенко, 1992; 1995). Моделирование тяжелого стресса, представляющего собой комбинированное воздействие иммобилизации и прерывистого звука 100 дБ в течение 120 мин, осуществляли по методу Т.П. Романовой (1989). У новорожденных крыс применяли модифицированную нами методику (Патент РФ 2505805). Определение тестостерона, адреналина и бета-аррестина-1 в крови проводили иммуноферментным методом (Wilson, 1992) с использованием компьютерно-диагностического комплекса IMMULITE 2000 (США). Определение экспрессии андрогенных рецепторов проводили с помощью иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного методов с применением специфических антител (AN1-15, Santa Cruz sc 56824) и конфокального микроскопа Leica TCS SP5X (2014). Морфологические исследования тканей мозга осуществляли с помощью стандартной процедуры проводки и заливания 7 парафином срезов тканей толщиной 4-5 мкм. Для окрашивания срезов исследуемых тканей применялись гистологические красители: гематоксилин и эозин. Оценку морфологических изменений в тканях осуществили с помощью микровизора µVizo-101 (ЛОМО). С целью изучения роли половых гормонов в регуляции базального и стрессорного уровней АД проводили гонадэктомию нормотензивных и гипертензивных самцов в соответствии со стандартной методикой кастрации (Коган, 1980). Для блокады андрогенных рецепторов применяли флутамид (10 мг/кг, per os), который применяли в течение 2-х недель. Для изучения устойчивости к стресс-индуцированному инфаркту мозга в условиях низкого содержания тестостерона крысам вводили однократно Сустанон-250 (10 мг/кг) разведенный в стерильном оливковом масле, внутримышечно двукратно с перерывом в одну неделю. Исследования гемодинамических параметров мозгового кровотока проводили с использованием 3D оптической когерентной томографии на установке OCS1300SS (США) и системы лазерной спекл-визуализации. Подробное описание этих методов изложено в следующих публикациях (Semyachkina-Glushkovskaya, 2013 а, б). Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью пакета программ Statistica 5.0. Различия считались достоверными при р<0.05. Данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего. Положения, выносимые на защиту: 1. Уровень тестостерона определяется силой и продолжительностью стресса. Снижение секреции гормона в динамике отражает критическое состояние адаптивных и резервных возможностей организма. 2. Сосудистые эффекты андрогенов выполняют функцию «запасного аэродрома» в адаптивных механизмах организма, проявляясь в виде второстепенных процессов «обороны» или сдерживания интенсивности сосудистой стресс-реактивности за счет модулирования холинергических влияний, а также лимитирования адреналового представительства на сосудах со стороны гормонов (адреналин) и сигнальных систем стресса (бета-аррестин-1). 3. Фармакологическое замещение низкого уровня тестостерона на фоне хронически высокого артериального давления не повышает устойчивость к стресс-индуцированным «сосудистым катастрофам». Апробация работы. Результаты исследования были представлены на международной конференции по фотонике (Саратов, Россия, 25-26 сентября 2013 г. и 23-26 сентября 2014 г.); на международном конгрессе «Наука будущего» (Санкт-Петербург, Россия, 17-20 сентября 2014 г.); на 6-й международной конференции по фотонике и оптической электронике (Вухань, Китай, 21-23 мая 2013 г.); на международной конференция по нелинейной динамике детерминированных и стохастических систем (Саратов, Волжские Дали, Россия,19-23 мая 2014 г.). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на открытом заседании кафедры физиологии человека и животных федерального образовательного учреждения высшего 8 профессионального образования “Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского”. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов. Общий объем диссертации 124 страницы с 26 рисунками и 9 таблицами. Список цитированной литературы включает 192 источников, в том числе 24 отечественных и 168 иностранных. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе рекомендованных ВАК РФ - 7, 1 патент РФ на изобретение. Декларация личного участия автора. Экспериментальные исследования выполнялись автором лично, либо при его непосредственном участии в коллективных работах, выполненных по гранту президента РФ для молодых докторов наук МД-2216.2014.4, 2014-2015 гг.; гранту РНФ Соглашение № 14-15-00128, 2014-2016 гг.; гранту РФФИ a-11-02-00560, 20112013 гг.; гранту ФЦП, государственный контракту NK-1063P, соглашение 14.B37.21.0216, 2012-2013 гг.; гранту Минобрнауки РФ, конкурсная часть задания 3.1340.2014/К, гранту Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих учёных в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования (договор №14.Z50.31.0004 от 4 марта 2014 г.). В совместных публикациях вклад автора составил 50-70%. 2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. Влияние различных видов стресса на секрецию тестостерона и уровень артериального давления у крыс На первом этапе исследований были проведены эксперименты на половозрелых самках и самцах белых крыс по изучению адаптивных и резервных возможностей системы продукции и секреции мужских половых гормонов на фоне различных по силе и продолжительности стрессов и связанными с этими процессами изменениями в уровне артериального давления. Были выбраны следующие виды стресса: «легкие», такие как иммобилизация в течение 10 мин и взятие животного в руки в течение 5 мин на протяжении двух недель; хронические стрессы – проживание в условиях высокой популяционной плотности (перенаселение) и в одиночестве (изоляция) на протяжении 4 месяцев; запредельные, сопровождающиеся развитием необратимых нарушений в организме, в частности, стрессиндуцированное язвенное кровотечение и геморрагический инфаркт мозга. Критерием адаптивных и резервных возможностей системы продукции и секреции мужских половых гормонов явилась концентрация общего тестостерона в крови, которую определяли иммуноферментным методом. Число животных в группах и результаты исследования представлены в таблице 1. Каждая группа включала свой контроль в силу проведения экспериментов в разное время года. Контрольными животными служили крысы, не 9 подвергающиеся стрессу и проживающие в обычных для них стандартных условия вивария. Таблица 1 Эффекты различных видов стресса на уровень артериального давления и содержание в крови общего тестостерона у крыс разного пола Виды стресса Иммобилизация, n=11(♀), n=10(♂) Контроль, n=10(♀), n=10(♂) Взятие в руки, n=11(♀), n=10(♂) Контроль, n=9(♀), n=10(♂) Перенаселение, n=10(♀), n=10(♂) Изоляция, n=12(♀), n=12(♂) Контроль, n=10(♀), n=10(♂) Сильный звуковой стресс, вызывающий геморрагический инфаркт мозга, n=10 Сочетание хронического социального стресса (5 мес.) и иммобилизации (1 мес.), приводящего к язвенному кровотечению, n=17 Контроль, n=10(♀), n=10(♂) Самцы Самки «Легкие» стрессы ср.АД, мм рт.ст. Уровень ср.АД, мм рт.ст. Уровень (максимальные тестостерона, (максимальные тестостерона, значения) нмоль/л значения) нмоль/л (сред. значения) (сред. значения) 121±3 *† 3.87±0.09 107±2 * 0.39±0.04 105±3 3,89±0.05 98±2 0.35±0.03 125±4 *† 3.91±0.07 112±3 * 0.33±0.03 100±2 3,83±0.07 103±2 0.37±0.08 Хронические стрессы (через 4 месяца исследования) 170±6 *† 2,25±0.03 * 144±6 * 0.31±0.01 182±3 *† 2,00±0.02 * 160±7 * 0.35±0.02 95±2 3,78±0.02 97±1 0.30±0.01 83±9 * 0,12±0.01 * 90±6 * «Тяжелые» стрессы 1,12±0.04 * 85±4 * 1,23±0.02 * 77±5 * 0,14±0.02 * 110±4 4.02±0.03 107±6 0.36±0.02 *-p<0.05 относительно контрольной группы; † - разница в ср.АД между самками и самцами; - снижение уровня тестостерона; -нет изменений в уровне тестостерона. 10 Легкие стрессы, иммобилизация и взятие крыс в руки на протяжении двух недель, сопровождались кратковременными стресс-индуцированными гипертензивными реакциями, которые быстро нормализовались после прекращения воздействия. У самок прессорные реакции на стресс были менее выраженными и менее продолжительными, чем у самцов, что согласуется с результатами многих других исследователей (Семячкина - Глушковская О.В., 2010, 2011, 2012; Reckelhof 2005). При этом, несмотря на половые различия в стресс-реактивности по показателям уровня ср.АД в обоих моделях стресса, значения тестостерона в крови не изменялись ни у самцов, ни у самок. Хронические стрессы на протяжении 4 месяцев, перенаселение и изоляция, приводили к постепенному формированию устойчиво высоких значений АД (ежемесячно брали по 10 животных из общей группы для мониторинга уровня ср.АД). У самцов гипертензивные значения АД устанавливались в более быстрые сроки и у большего числа особей по сравнению с самками. Стресс-индуцированная гипертензия также была более выраженная у самцов, чем у самок, как в опытах по перенаселению, так и с изоляцией. Хроническое стрессирование крыс и развитие более выраженной гипертензии у самцов по сравнению с самками сопровождалось снижением уровня тестостерона в крови у мужских особей, но не у женских. Однако, снижение уровня тестостерона в крови у самцов происходило не параллельно с изменениями АД. Анализ индивидуальных данных в изменениях ср.АД и уровня тестостерона на протяжении 4 месяцев наблюдения показал, что гипертензивные значения АД устанавливались в более ранние сроки (начиная со второго месяца экспериментов), в то время как гипотестостеронемия развивалась только с третьего месяца наблюдения. При этом, ни у всех гипертензивных особей на втором и третьем месяце исследований выявлялись низкие значения тестостерона. Яркие результаты по стресс-индуцированному развитию артериальной гипертензии и связанному с этим процессом подавлением секреции тестостерона были получены спустя 4 месяца проживания животных в условиях перенаселения и изоляции. Поскольку нами не была выявлена четкая корреляция между стресс-индуцированными изменениями в уровне АД и тестостерона в крови на протяжении развития стресс-индуцированной артериальной гипертензии, мы предполагаем, что подавление секреции тестостерона в этих условиях является отражением общих процессов снижения адаптационных и резервных возможностей организма, но не прямых механизмов нарушения регуляции сосудистого тонуса. Для подтверждения данного предположения были проведены дальнейшие исследования с целью поиска ответа на вопрос, как меняется секреция тестостерона у самок и самцов крыс на фоне действия запредельных стрессов, приводящих к развитию «сосудистых катастроф», которые сопровождаются гипотензией. Для этого использовали модели стресс-индуцированного геморрагического инфаркта (Романова Т.В., 1989) и язвенного кровотечения (Патент РФ 2472231). Каждая группа, в том числе контрольная 11 (нестрессированные крысы), включала по 10 животных для самок и самцов. Результаты исследования представлены в таблице №1. Развитие стрессиндуцированного кровотечения сопровождалось гипотензий как у самок, так и у самцов. Половые различия в гипотензивных реакциях на фоне стрессиндуцированного повреждения сосудов мозга и желудка не выявлялись. При этом у животных обоего пола независимо от типа кровотечения наблюдалось резкое снижение содержания тестостерона в крови. Так, уровень гормона был снижен в 3,5 раза у самцов и в 3 раза у самок как при развитии мозговых, так и желудочных геморрагий, индуцированных стрессом. В целом, полученные результаты позволяют заключить, что «легкие» стрессы на протяжении месяца не вызывали устойчивого повышения АД и каких-либо изменений в содержании тестостерона в крови ни у самцов, ни у самок. Хронические социальные стрессы продолжительностью 4 месяца сопровождались развитием АГ у животных обоего пола, но снижением уровня тестостерона у самцов, но не у самок. Отметим, что значения АД были значительно выше у самцов по сравнению с самками. Запредельные стрессы, провоцирующие развитие «сосудистых катастроф» (язвенное кровотечение и геморрагический инфаркт мозга) на фоне резкого снижения АД, вызывали подавление секреции тестостерона как у самцов, так и у самок, что отражалось на снижении уровня гормона в крови у крыс обоего пола. Анализ индивидуальных значений уровня АД и тестостерона в крови у самцов на протяжении всего срока развития стресс-индуцированной артериальной гипертензии не выявил прямой корреляции между процессами установления гипертензивных значений АД и снижения секреции гормона на ранних сроках развития болезни, однако, яркие результаты были получены на фоне снижения адаптивных возможностей организма при прогрессировании патологии. Полученные данные позволяют заключить, что андрогены имеют отношение к процессам стресс-устойчивости сосудов, но не уровню АД как таковому. Их снижение в условиях хронических (у самцов) и, особенно, запредельных стрессов (у самцов и самок) позволяет предположить о том, что андрогены выполняют защитную функцию в отношении сосудистого гомеостаза. 2.2 Изменение экспрессии андрогенных рецепторов в мозге и висцеральных органах на фоне снижения секреции тестостерона в условиях стресс- индуцированного повышения артериального давления В предыдущей главе 2.1 было показано, что уменьшение секреции тестостерона проявляется только у самцов, но не у самок на фоне снижения резервных возможностей организма при развитии стресс-индуцированной артериальной гипертензии. На следующем этапе работ был поставлен вопрос, меняется ли экспрессия андрогенных рецепторов при снижении содержания тестостерона в крови у гипертензивных самцов. Для ответа на поставленный вопрос, были проведены исследования по изучению экспрессии андрогенных рецепторов в мозге и периферических органах у крыс со стресс-индуцированной 12 артериальной гипертензией и низким содержанием тестостерона в крови. Эксперименты были выполнены на 17 гипертензивных самцах, у которых устойчиво высокий уровень АД развивался при их длительном (4 месяца) проживании в условиях высокой популяционной плотности. Контролем служили 10 нормотензивных интактных самцов. Результаты исследования показали, что у гипертензивных особей с низким содержанием тестостерона в крови отмечалась сниженная экспрессия андрогенных рецепторов в тканях мозга, преимущественно в области церебральных сосудов (рис. 1,2) Рисунок 1 – Экспрессия андрогенных рецепторов в мозге в норме (слева) и на фоне развития стресс-индуцированной АГ (справа). Иммуногистохимический метод (рецепторы отражены коричневым цветом) и иммунофлуоресцентный метод (рецепторы отражены зеленым цветом, увеличение х 630) Рисунок 2 – Экспрессия андрогенных рецепторов в семенных канальцах в норме (слева) и на фоне развития стресс-индуцированной АГ (справа). Иммуногистохимический метод (рецепторы отражены коричневым цветом) и иммунофлуоресцентный метод (рецепторы отражены зеленым цветом, увеличение х 630). Аналогичные изменения были обнаружены в семенниках, где наблюдалось снижение плотности ядерных андрогенных рецепторов, что 13 свидетельствует о подавлении регуляторных возможностей андрогенов в отношении геномных процессов синтеза мужских половых гормонов (рис. 2, 3). Рисунок 3 – Экспрессия андрогенных рецепторов в семенниках (ядерная локализация) у нормотензивного (слева) и гипертензивного (справа) самцов крыс (иммуногистохимический метод). Экспрессия андрогенных рецепторов показана коричневым цветом. В других периферических органах, таких как сердце (в коронарных сосудах), почки и надпочечники, активно вовлекаемые в регуляции уровня АД и стрессорную реакцию, не было обнаружено каких-либо изменений в экспрессии андрогенных рецепторов между контрольной и экспериментальной группами. Важная роль андрогенов в развитии АГ показана во многих исследованиях, большинство из которых рассматривает мужские половые гормоны как прогипертензивный фактор (Dubey, 2002; Orshal, 2004; Reckelhoff, 2001, 2005; Khalil, 2005). Однако, большинство работ в этой области построены по стандартному алгоритму, когда создается искусственный дефицит андрогенов или блокируется доступ рецепторов к их воздействию. (Chen, 1991; Rowland, 1992; Crofton, 1993; Reckelhoff, 2000). Не существует экспериментальных данных, объясняющих клинический факт гипотестостеронемии у гипертензивных мужчин (Fogari, 2002; Ishikura, 2008). В известной нам литературе отсутствуют данные относительного того, как изменяется экспрессия андрогенных рецепторов при формировании гипертензивного статуса. Существуют результаты, в которых показано на спонтанно-гипертензивных крысах, что блокада андрогенных рецепторов флутамидом снижает уровень АД у животных, однако, употребление финастерида не сопровождалось подобными изменениями. Авторы сделали вывод о том, что конверсия тестостерона в дегидротестостерон не изменяется в этих условиях (Reckelhoff, 1999). В целом, результаты двух глав 2.1 и 2.2 позволяют заключить о том, что индуцированная стрессом АГ сопровождается снижением секреции тестостерона и подавлением экспрессии андрогенных рецепторов в мозге и семенниках, что возможно, является одним из механизмов снижения стрессустойчивости на уровне сосудистой системы. 2.3 Сравнение устойчивости к запредельному стрессу на фоне естественного и патологически низкого содержания тестостерона в крови у крыс В предыдущей главе 2.1 было показано, что уровень тестостерона в крови определяется силой и продолжительностью стресса. Чем более сильный стресс и чем дольше он воздействует на организм, тем более выражено подавляется продукция мужского гормона. Было выдвинуто предположение о том, что 14 мужские половые гормоны играют важную роль в сосудистой стрессустойчивости. Для проверки данной гипотезы были проведены эксперименты на новорожденных (1-2 дня после рожденья) крысах с естественно низким фоном тестостерона в крови и на половозрелых самцах крыс, у которых содержание гормона снижается в силу прогрессирования ренальной гипертензии (Семячкина-Глушковская О.В., 2011). Животных подвергали воздействию запредельного звукового стресса с целью индуцирования развития геморрагического инфаркта мозга (Патент РФ № 2505860, Романова Т.П., 1989). Через сутки после воздействия оценивали площадь геморрагий в мозге гистологическим методом и проводили сравнение уровня тестостерона в крови до и после эксперимента. Рассмотрим данные результатов, представленные в таблице 2. Базальные значения тестостерона в крови у новорожденных крыс существенно ниже, чем у половозрелых нормотензивных особей (1.94±0.04 нмоль/л против 4.02±0.03 нмоль/л, p<0.05). Наложение клипсы на левую ренальную артерию сопровождалось развитием устойчивого высоких значений АД, которые через два месяца после операции устанавливались на гипертензивном уровне (187±9 мм рт.ст. против 110±4 мм рт.ст., p<0.05). При этом концентрация тестостерона в крови снижалась в 2 раза. Таким образом, мы получили модель естественного и патологического низкого содержания тестостерона в крови у новорожденных и гипертензивных крыс, у которых низкий уровень гормона не отличался (1.94±0.04 нмоль/л против 2.07±0.05 нмоль/л, соответственно). У новорожденных особей низкий уровень тестостерона обусловлен неактивной половой функцией; у гипертензивных – за счет патологических процессов нарушения кровоснабжения органов и нарушения работы эндокринной функции в условиях чрезмерно высоких значений АД. Таблица 2 Уровень тестостерона в крови и площадь кровоизлияния в мозге на фоне стрессиндуцированного развития геморрагического инфаркта мозга у новорожденных и половозрелых крыс Исследуемые показатели Новорожденные крысы Контроль n=10 1.94±0.04 † Уровень тестостерона в крови, нмоль/л Площадь кровоизлияний в тканях мозга, мм2 срАД, мм рт.ст. 43±4 † Половозрелые крысы Стрессированные Интактные Гипертензивные n=10 1.87±0.07 n=10 4.02±0.03 n=25 2.07±0.05 * 0.007±0.0004† 45±3 Стрессированные n=10 1.05±0.09 *# 0.082±0.007 110±4 187±9 * 78±5*# (n=6) p<0.05 относительно: * - контроля; † - половозрелых крыс; # - гипертензивной группы 15 Воздействие в течение 2-х часов звуковым стрессом сопровождалось развитием геморрагического инфаркта мозга у всех испытуемых животных. При этом у 6 из 10 гипертензивных особей, но не у новорожденных крыс отмечалось снижение уровня АД до уровня гипотензивных значений. Площадь кровоизлияний в мозге у половозрелых крыс была выше, чем у новорожденных животных (0.082±0.007 мм2 против 0.007±0.0004 мм2, p<0.05). Таким образом, в опытах на новорожденных крысах, у которых не активна половая функция и наблюдаются низкие значения тестостерона, было показано, что, несмотря на эти факты, их устойчивость к развитию стрессиндуцированных «сосудистых катастроф» в мозге выше, чем у половозрелых гипертензивных особей, имеющих также низкие значения гормона. При этом у них не наблюдается динамики в снижении секреции тестостерона на фоне стресса, которая отмечается у взрослых животных (1.87±0.07 нмоль/л против 1.94±0.04 нмоль/л для новорожденных; 1.05±0.09 нмоль/л против 2.07±0.05, нмоль/л, p<0.05 для взрослых крыс). Результаты данной серии экспериментов при моделировании ситуации низкого содержания тестостерона в естественных условиях и при сосудистой патологии (АГ) не выявили прямой зависимости между гипотестостеронемией и сосудистой устойчивостью к стрессу. Однако, нами была установлена закономерность о подавлении секреции тестостерона в зависимости от силы и длительности стресса (глава 2.1), а также при стресс- индицированном хроническом повышении уровня АД (главы 2.1, 2.3). Принимая во внимание эти факты можно заключить, что андрогены не играют прямой роли в поддержании сосудистого гомеостаза, а подключаются к его регуляции как второстепенные запасные механизмы при снижении адаптивных возможностей организма. На этом основании была выдвинута гипотеза о том, что андрогензависимые механизмы регуляции сосудистой стресс-устойчивости реализуются не как прямонаправленные процессы регуляции сосудистого тонуса и АД, а опосредованно через модулирование других факторов регуляции, непосредственно вовлекаемых в поддержание сосудистого гомеостаза. 2.4. Изучение холинергических механизмов регуляции сосудистой стресс-реактивности в условиях дефицита мужских половых гормонов и блокады андрогенных рецепторов На основании полученных экспериментальных данных, представленных в главах 2.1-2.3, нами была выдвинута гипотеза о том, что андроген-зависимые механизмы регуляции сосудистой стресс-устойчивости реализуются как запасные звенья поддержания сосудистого гомеостаза. Проявление этих механизмов происходит при снижении адаптивных и резервных возможностей организма через модуляцию активности факторов, принимающих непосредственное участие в регуляции стресс-реактивности и стрессустойчивости. В наших предыдущих работах было показано, что андрогены оказывают стимулирующее влияние на активность КАТФ-каналов, которые релаксируют сосуды (Семячкина-Глушковская О.В., 2012). В условиях развития АГ (при ее 16 устойчивых и злокачественных формах) снижается уровень тестостерона в крови, что сопровождается подавлением активирующей функции андрогенов в отношении КАТФ-каналов. Это, в свою очередь, влечет за собой нарушения эндотелиальной функции (синтеза оксида азота). Поскольку миогенная и эндотелиальная релаксация сосудов находится под контролем холинергической нервной системы, в данном исследовании мы изучали влияние кастрации и введения флутамида, блокирующего андрогенные рецепторы, на эффекты холинергической регуляции сосудистой стрессреактивности. С этой целью в данном исследовании применяли атропин, который вводили в покое и на фоне стресса следующим группам животных: 1) интактные самцы (n=10); 2) кастрированные самцы (n=15); 3) самцы, получающие флутамид (n=12). В качестве модели стресса использовали широко применяемую в наших предыдущих исследованиях 2-х часовую иммобилизацию животных на спине (Semyachkina- Glushkovskaya O. 2011, 2010, 2008, 2006). Рисунок 4 – Эффекты атропина на уровень cр.АД (мм рт.ст.) у интактных ( ), кастрированных ( ) и с блокадой андрогенных рецепторов ( ) самцов крыс: * - р<0,05 относительно исходного уровня; † - р<0,05 относительно интактных животных. Однако, гонадэктомия самцов и блокада андрогенных рецепторов сопровождалась прессорными эффектами атропина. Действительно, у кастрированных самцов атропинизация приводила к длительному повышению уровня ср.АД, которое регистрировалось на протяжении 2-х часов наблюдения (рис. 4). 17 Блокада андрогенных рецепторов сопровождалась аналогичными изменениями в уровне ср.АД на фоне введения атропина. Повышенные значения ср.АД отмечались на протяжении 60 мин эксперимента (рис. 4). Рисунок 5 – Сравнение стрессорной динамики ср.АД (мм рт.ст.) у интактных самцов без атропина ( ) и на фоне введения препарата ( ): * - р<0,05 относительно исходного уровня. Рисунок 6 - Сравнение стрессорной динамики ср.АД (мм рт.ст.) у интактных ( )и кастрированных ( ) самцов, а также мужских особей с блокадой андрогенных рецепторов ( ): * - р<0,05 относительно исходного уровня. 18 В условиях стресса, введение атропина интактным самцам не изменяло характер стрессорных реакций со стороны АД (рис. 5 ). Так, уровень ср.АД повышался при стрессе с 105±2 мм рт.ст. до 125±4 мм рт.ст. (максимальные значения) у крыс без атропина и с 101±2 мм рт.ст. до 123±6 мм рт.ст. при введении препарата, что составило 19% (p<0.05) и 21% (p<0.05), соответственно. Длительность стресс-индуцированных гипертензивных реакций также не отличалась до и после введения атропина интактным животным. Кастрация животных и блокада андрогенных рецепторов не сопровождалась изменениями в стрессорной динамике ср.АД ни по амплитуде, ни по длительности (рис. 6). А Б Рисунок 7 – Эффекты атропина на стрессорную динамику ср.АД (мм рт.ст.) у кастрированных самцов (А) и мужских особей с блокадой андрогенных рецепторов (Б). * - р<0,05 относительно исходного уровня; † - р<0,05 – эффект атропина. У кастрированных самцов атропин, не изменяя интенсивность, существенно пролонгировал прессорные эффекты стресса (Рис. 7А). Действительно, если у кастрированных самцов до введения атропина повышенные значения ср.АД наблюдались только в первые 10 мин воздействия, то на фоне его введения - на всем протяжении стресса (60 мин) и в течение 20 мин после его отмены. Блокада андрогенных рецепторов 19 сопровождалась повышением амплитуды и продолжительности прессорных реакций при стрессе на фоне введения атропина (рис. 7 Б). Таким образом, в условиях дефицита андрогенов и блокады андрогенных рецепторов проявляются сосудистые эффекты атропина, которые не выявляются в норме. В покое и при стрессе атропин у кастрированных самцов и у особей, принимающих флутамид, вызывает вазоконстрикцию, повышая сосудистую стресс-реактивность по длительности (кастрация) и по амплитуде и длительности (флутамид). Эти данные дают основание судить об «ограничивающих» эффектах андрогенов в отношении сосудистой стрессреактивности через опосредованные влияния холинергической системы. 2.5. Влияние дефицита андрогенов на адренергическую гормональную активацию в условиях стресса на фоне нормального и патологически высокого уровня артериального давления В главе 2.4. было показано, что андрогены ограничивают прессорные реакции в условиях стресса посредством влияния на холинергические механизмы управления АД. Поскольку сосудистый тонус регулируется вегетативной нервной системой, где адренергическим влияниям отводится ведущая роль, на следующем этапе экспериментов был поставлен вопрос, оказывают ли какие-либо эффекты андрогены на адренергические механизмы управления стрессорной динамикой АД. С этой целью было изучено, как влияет искусственный дефицит андрогенов, вызванный путем гонадоэктомии, и естественный, сопровождающий развитие стресс-индуцированной и ренальной АГ, на стрессорную активацию гормонального звена адренергической системы (уровень адреналина в крови). Концентрацию адреналина в крови изучали с помощью иммуноферментного метода. В качестве стресса использовали модель 2-х часовой иммобилизации животных. Результаты исследований показали, что кастрация нормотензивных самцов не оказывала влияний на базальное содержание адреналина в крови (Таблица 3). Так, базальные значения адреналина в крови не различались между кастрированными и интактными самцами. Иммобилизация интактных самцов в течение 2-х часов сопровождалась повышением уровня адреналина в крови на 77% (p<0.05); у кастрированных – на 82% (p<0.05). Таким образом, дефицит андрогенов не оказывал влияний на интенсивность стрессорной активации адреналового ответа. Полученные данные позволяют сделать вывод об отсутствии модулирующих влияний андрогенов на базальную и стрессорную секрецию адреналина в условиях нормы. В условиях патологии при развитии АГ разного генеза повышалось АД и снижалось содержание тестостерона в крови (ср.АД - 172±11 мм рт.ст. для стресс- индуцированной АГ (n=23) и 187±15 мм рт.ст. для ренальной АГ (n=25); тестостерон - 2.25±0.03 нмоль/л и 2.31±0.05 нмоль/л, соответственно). Контрольные значения (n=10) для срАД - 110±0.4 мм рт.ст. и уровень тестостерона в крови - 4.02±0.03 нмоль/л. Развитие АГ различного генеза не сопровождалось изменениями в 20 базальном уровне адреналина в крови, несмотря на высокие значения ср.АД. Значения адреналина в плазме крови у гипертензивных животных были в пределах нормы (Таблица 3). Однако, в условиях стресса содержание адреналина резко увеличивалось по сравнению с интактными стрессированными самцами. Так, уровень адреналина у гипертензивных самцов увеличивался на 108% (p<0.05) – стресс-индуцированная АГ и на 103% (p<0.05) – ренальная АГ, что на 31% и 26% было больше, чем у нормотензивных кастрированных самцов, соответственно. Таблица 3 Содержание адреналина (пг/мл) в крови у нормотензивных и гипертензивных крыс в покое и при стрессе в условиях тестостеронемии Нормотензивные самцы Интактные животные Дефицит андрогенов (гонадэктомия) Покой Стресс 776±19 1377±18 * Гипертензивные самцы (стрессиндуцированная АГ) Покой Стресс 765±25 762±22 1389±20 * (дефицит андро-генов на фоне развития АГ) 1593±18 *† Гипертензивные самцы (ренальная АГ) Покой 737±27 Стресс 1503±22 *† (дефицит андро-генов на фоне развития АГ) p<0.05 относительно: * - базальных значений; † - нормотензивных крыс Данные результаты позволяют заключить, что андрогены сдерживают интенсивность адреналового ответа на стресс при патологическом повышении уровня АД. Полученные результаты подтверждают результаты других экспериментальных работ, в которых выявлены тестостерон-зависимые эффекты в отношении модуляции синтеза катехоламинов надпочечниками (Kumai, 1995), высвобождения нейропептида из окончаний симпатических нервов, (Zukowska-Grojec, 1995) и регуляции активности тирозингидроксилазы (Kumai, 1995, 1995а). 2.6. Влияние кастрации на активацию сигнальных молекул стресса (бета-аррестина-1) при различных состояниях организма В публикации Nature за 2001 год было показано, что хроническое повышение секреции адреналина при стрессе ведет к мутагенным повреждениям клеток и необратимым последствиям в отношении развития сосудистых заболеваний (Hara, 2011). Отражением данных процессов является гиперэкспрессия белков семейства бета- аррестина, которые выполняют роль ко-факторов в процессах трансформации нервного импульса при возбуждении адренорецепторов в активацию вторичных мессенджеров и фосфорилизацию специфических белков. Показано, что фармакологическая модуляция системы G-белка и бета-аррестина-1 может существенно повысить стресс-устойчивость клеток различных тканей при формировании многих патологий, включая метастатическую активность на фоне прогрессирования злокачественных опухолей, где прорастание сосудов в пораженную ткань и 21 повышение ее микроциркуляции играет ключевую роль (Hara, 2013; Engineer, 2013; Powe, 2011). Отметим, что злокачественные изменения в семенниках сопровождаются резким снижением секреции андрогенов и значительным повышением экспрессии бета-аррестина-1 (Zhang, 2011). На основании этих данных была поставлена задача определить роль андрогенов в регуляции молекулярных механизмов стрессорного управления сосудами на основе изучения продукции бета-аррестина-1 в крови в условиях развития различных форм АГ. Для этого изучали как влияет дефицит андрогенов на базальные и стрессорные уровни бета-аррестина-1 в плазме у крыс, подвергнутых гонадэктомии (n=17), на фоне естественного снижения уровня тестостерона при прогрессировании стресс- индуцированной АГ (n=20) и ренальной АГ (n=23). Бета-аррестин-1 определяли иммуноферментным методом. В качестве стресса применяли модель 2-х часовой иммобилизации. Результаты исследования представлены в таблице 4. Кастрация вызывала снижение содержания тестостерона в крови на 69% (p<0.05), развитие АГ, индуцированное стрессом и окклюзией ренальной артерии, также сопровождалось подавление секреции гормона на 38% (p<0.05) и 45% (p<0.05), соответственно (4.51±0.06 нмоль/л в норме; 1.37±0.09 нмоль/л у кастрированных самцов; 2.82±0.05 нмоль/л у крыс со стресс-индуцированной АГ; 2.48±0.04 нмоль/л у крыс с ренальной АГ). Таблица 4 Базальные и стрессорные значения бета-арретина-1 (нг/мл) в крови в норме и на фоне дефицита андрогенов у крыс Покой Стресс Норма Интактные здоровые животные 0.33±0.07 0.41±0.08 * Дефицит андрогенов Кастрация 0.35±0.05 0.54±0.07 * Стресс-индуцированная АГ 0.34±0.03 0.67±0.07 * Ренальная АГ 0.31±0.06 0.58±0.03 * p<0.05 относительно: * - базальных значений Базальные значения бета-аррестина-1 не различались между самцами с нормальным фоном андрогенов и в группах с дефицитом мужских половых гормонов. Однако, стрессорная динамика в продукции бета-аррестина-1 существенно различалась между нормой и в условиях дефицита андрогенов. Так, если в норме секреция бета-аррестина-1 увеличивалась на 24% (p<0.05), то на фоне дефицита андрогенов – на 54% (p<0.05) в группе с кастрацией, на 97% (p<0.05) в группе со стресс-индуцированной АГ и на 87% (p<0.05) в группе с ренальной АГ. Таким образом, в условиях дефицита мужских половых гормонов стрессорный ответ со стороны активации молекулярных механизмов регуляции сосудистой стресс- реактивности таких как синтез бета-аррестина-1 становится высоким, превышающим по интенсивности более чем в 2 раза таковой в норме. Снижение уровня тестостерона влечет за собой чрезмерную активацию процессов адренергического «доступа» к сосудам при стрессе за счет 22 повышенного синтеза ко-фактора (бета-аррестина-1), координирующего клеточные процессы фосфорилирования специфических белков при стимуляции бета- адренорецепторов адреналином. 2.7. Оценка эффективности фармакологической коррекции низкого уровня тестостерона в отношении устойчивости к развитию стресс-индуцированного инфаркта мозга у гипертензивных крыс Как было показано в главе 2.1 подавление секреции тестостерона сопровождает процессы развития АГ и наиболее ярко проявляется при стрессиндуцированных сосудистых катастрофах, таких как мозговые и язвенные кровотечения. Целью данного эксперимента был поиск ответа на вопрос, возможно ли гормон - заместительной терапией, поднимая уровень тестостерона в крови фармакологическим путем, повысить сосудистую стресс-устойчивость на примере развития геморрагического инфаркта мозга у гипертензивных крыс. Для этого, вызывали развитие ренальной АГ у самцов крыс (n=20) и после достижения устойчиво высоких показателей АД по истечении 2-х месяцев после окклюзии ренальной артерии половине крыс (n=10) вводили однократно Сустанон-250 (разведенный в стерильном оливковом масле) в дозе 10 мг/кг, внутримышечно двукратно с перерывом в одну неделю. По истечению 14 дней после введения сустанона проводили исследования тестостерона в крови и определяли влияние сустанона на диаметр и скорость потока крови в различном типе сосудах (сагиттальный синус, сонная артерия, ренальная артерия, а также мозговые и брыжеечные артериолы) с помощью коммерческого оптического когерентного томографа, совмещенного с допплеровской системой и полнопольной лазерной спекл-визуализацией сосудов. Для мозговых и брыжеечных артериол считали среднее значение измеряемых показателей. Далее всех гипертензивных крыс, получающих и не получающих сустанон, подвергали воздействию сильного звукового стресса (Романова Т.П., 1989) с целью изучения их устойчивости к развитию геморрагического инфаркта мозга. Результаты данных исследований следующие. Введение сустанона сопровождалось повышением уровня тестостерона в крови у всех гипертензивных крыс (4.73±0.3 против 2.17±0.05, p<0.05). Оптические исследования крупных и микро-сосудов мозга и на периферии выявили различия между нормотензивными и гипертензивными особями только в диаметре и скорости кровотока сагиттального синуса. Диаметр данного сосуда был увеличен у гипертензивных крыс на фоне снижения скорости кровотока в нем, что свидетельствует о нарушении оттока венозной крови из мозга при развитии ренальной АГ. Однако, по церебральной и периферической микроциркуляции, а также по оптическим показателям состояния сонной и ренальной артерии не были найдены различия в указанных группах крыс. Введение сустанона не оказывало эффектов на исследуемые сосуды ни у нормотензивных, ни у гипертензивных крыс, включая сагиттальный синус. Патологические изменения в данном венозном сосуде мозга не были устранены 23 путем повышения уровня тестостерона в крови у гипертензивных крыс. У всех гипертензивных крыс, получающих и не получающих сустанон, звуковой стресс вызывал повреждение мозговых сосудов в равной степени. Как число, так и площадь геморрагий у крыс не зависели от приема сустанона. Таким образом, результаты данных исследований свидетельствуют о том, что фармакологическое замещение уровня низкого уровня тестостерона, сопровождающего развитие АГ, не может быть использовано в качестве терапевтического подхода для решения проблем риска возникновения «сосудистых катастроф» в мозге на фоне прогрессирования болезни. ВЫВОДЫ 1. Стрессы – хронические (для мужского организма) и запредельные (для мужского и женского организма) являются важными факторами в подавлении секреции тестостерона. 2. Мужской организм по сравнению с женским более чувствителен к различным видам стресса по показаниям уровня тестостерона в крови. Постепенное умеренное снижение секреции тестостерона у них наблюдается уже в условиях хронических стрессов, в то время как в женском организме данные изменения отмечаются только при тяжелых стрессах. Важно отметить, что запредельные стрессы с одинаковой интенсивностью воздействуют на продукцию тестостерона как в мужском, так и в женском организме. 3. Индуцированные стрессом изменения в уровне артериального давления и содержании тестостерона в крови не сопряжены напрямую друг с другом. Подавление секреции тестостерона отмечается как при высоком уровне артериального давления, например, в условиях хронического стресса, так и при низких показателях данного параметра, например, на фоне запредельного стресса, сопровождающего развитие «сосудистых катастроф», таких как геморрагический инфаркт мозга и язвенное кровотечение. 4. Низкий уровень тестостерона не является прямым показателем снижения сосудистой стресс-устойчивости, однако, подавление секреции гормона в динамике сопряжено с критическим состоянием механизмов адаптации к стрессу и нарушением сосудистого гомеостаза. 5. На модели хронического социального стресса и развития в этих условиях артериальной гипертензии показано, что прогрессирование стрессиндуцированных процессов нарушения регуляции сосудистого тонуса сопряжено с постепенным уменьшением секреции тестостерона и снижением экспрессии ядерных андрогенных рецепторов в семенниках и церебральных сосудах. Это свидетельствует о подавлении регуляторных возможностей андрогенов в отношении процессов синтеза мужских половых гормонов, а также ассоциируется с низкой устойчивостью к развитию геморрагического инфаркта мозга. 6. Сосудистые эффекты андрогенов проявляются в виде сдерживания интенсивности сосудистой стресс-реактивности опосредовано через холинергические влияния, а также ограничения адреналового 24 представительства на сосудах как со стороны гормонального звена (адреналин), так и сигнальных систем стресса (бета-аррестин-1). 7. Фармакологическое замещение низкого уровня тестостерона в крови на фоне хронически высокого уровня АД не улучшает течение гипертензии и не повышает устойчивость к стресс-индуцированному повреждению церебральных сосудов, сопровождающих развитие интракраниальных геморрагий. Эти данные позволяют заключить о том, что андрогены не выполняют прямой функции повышения стресс- устойчивости. Однако, на основании вышеприведенных данных о лимитирующих эффектах андрогенов в отношении сосудистой стресс-реактивности можно сделать вывод о том, что эти эффекты проявляются как второстепенные запасные механизмы на фоне прямых процессов поддержания сосудистого гомеостаза. Статьи в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ 1. Кассим М., Синдеева О., Синдеев С., Зинченко Е., Уланова М., Гекалюк А., Агранович И., Семячкина-Глушковская О. Влияние эмоциональных и тяжелых патологических стрессов на уровень артериального давления и продукцию тестостерона у самок и самцов крыс // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. 2015 - Т. 15 , Вып. 2 , С. 46-53. 2. Semyachkina-Glushkovskaya O., Pavlov A., Semyachkin-Glushkovskiy I., Zinchenko E., Kassim M., Al-Fatle F., Al Hassani L., Ulanova M., Gekaluk A. Role of testosterone in resistance to development of stress-related vascular diseases in male and female organisms: models of hypertension and ulcer bleeding // Proc. of SPIE. 2015.Vol. 9448, 94481H . 3. Семячкина-Глушковская О., Уланова М., Абдурашитов А., Гекалюк А., Синдеев С., Синдеева О., Кассим М. Роль бета-2-адренозависимых механизмов в нарушениях венозного кровотока мозга у новорожденных крыс с внутричерепным кровоизлиянием // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. 2015 - Т. 15, Вып. 2 , С. 93-97. 4. Semyachkina-Glushkovskaya O., Lychagov V., Abdurashitov A., Sindeeva O., Sindeev S., Zinchenko E., Kajbeleva E., Pavlov A., Kassim M., Tuchin V. Changes in the cerebral blood flow in newborn rats assessed by LSCI and DOCT before and after the hemorrhagic stroke // Proc. of SPIE. 2015.-Vol. 9305, 93051D. 5. Semyachkina-Glushkovskaya O., Lychagov V., Bibikova O., SemyachkinGlushkovskiy I., Sindeev S., Zinchenko E., Kassim M., Braun H., Al-Fatle F. , Al Hassani L., Tuchin V. The assessment of pathological changes in cerebral blood flow in hypertensive rats with stress- induced intracranial hemorrhage using Doppler OCT: particularities of arterial and venous alterations // Journal of Photonics and Lasers in Medicine. 2013. - Vol.1. - P. 1-8. 6. Semyachkina-Glushkovskaya O. V., Lychagov V., Bibikova, Olga A., Semyachkin- Glushkovskiy I. A., Sindeev S., Zinchenko E. M., Kassim M., Al-Fatle F., Al Hassani L., Maria V.; Tuchin V. The experimental study of stress-related pathological changes in cerebral venous blood flow in newborn rats assessed by DOCT // Journal of Innovative Optical Health Sciences .2013- Vol. 6, No. 3 (10 pages). 7. Семячкина-Глушковская О.В., Бибикова О.А., Семячкина-Глушковская О.В., Анищенко Т.Г., Синдеева С.А., Семячкин-Глушковский И.А., Зинченко Е.М., Кассима М.А., Аль-Фатле Ф., Фльхассани. Сосудистые и хронотропные эффекты 25 стресса у крыс разного возраста // Фундаментальные исследования. 2012. №10 (2). - С. 389-392. Патент 8. Семячкина-Глушковская О.В., Тучин В.В., Семячкин-Глушковский И.А., Бибикова О.А., Синдеев С.С., Зинченко Е.М., Кассим М., Аль-Фатле Ф., Альхассани Л. Способ моделирования развития мелкоочаговых мозговых геморрагий в коре головного мозга у новорожденных крыс. Патент на изобретение № 2505865 зарегистрировано 27.01.2014 г. Заявка на патент № 2012145191/14 от 24.10.2012 г. Срок действия до 24.10.2032 г. Статьи в сборниках материалов международных и российских научных конференций 9. Semyachkina-Glushkovskaya O., Lichagov V., Bibikova O., Sindeev S., Zinchenko E., Gekalyuk A., Ulanova M., Agranivich I., Razubaeva V., Kassim M., Yang Z., Pengcheng Li, Zhu D., Qingming L., Tuchin V. Hemorrhagic stroke in newborns: obvious and incredible problem // “Science of Future”, 17-20 September, 2014, Sankt-Petersburg, Russia. 10. Bibikova O., Sindeev S., Zinchenko E., Kassim M., Ulanova M., Gekaluyk A., Al- Fatle F.A., Al Hassani L. Wavelet analysis of blood pressure signals and cardiovascular catastophes //“Nonlinear Dynamics of Deteministic and Stochastic systems”, 19-23 May, 2014, Saratov, Russia. 11. Уланова М.В., Кассим М. А., Разубаева В.И. Влияние артериальной гипертензии у беременных самок на мозговой кровоток у новорожденных крыс:эффект глибенкладмида // Исследования молодых ученых в биологии и экологии.,17- 21 апреля 2014. С.3-7. Саратов. 12. Semyachkina-Glushkovskaya O., Pavlov A., Semyachkin-Glushkovskiy I., Zinchenko E., Kassim M., Al-Fatle F., Alhassani L., Ulanova M., Gekaluk A. Role of testosterone in resistance to development of stress-related vascular diseases in male and female organisms: models of hypertension and ulcer bleeding // Saratov Fall Meeting SFM’14 September 23 – 26, 2014 Saratov, Russia. 13. Semyachkina-Glushkovskaya O., Lychagov V., Bibikova O., SemyachkinGlushkovskiy I., Sindeev S., Zinchenko E., Kassim M., Al-Fatle Ali F., Al Hassani L., Ulanova M. and Tuchin V. The experimental study of stress-related pathological changes in cerebral venous blood flow in newborn rats assessed by DOCT // Photonics and Imaging in Biology and Medicine, 27-29 May, 2013 Wuhan, China. 14. Semyachkina-Glushkovskaya O. , Lychagov V., Bibikova O., Sindeev S., Zinchenko E., Kassim M., Ulanova M., Al-Fatle F., Al Hassani L., Tuchin V. The Intracranial Hemorrhage in Newborn Rats: Alterations in Cerebral Venous Blood Flow and Brain Tissue Oxygen Saturation // Saratov Fall Meeting - SFM’13 25 – 28 SeptemberW, 2013 Saratov, Russia. 26
