Л11 2014 Файл

Реклама
Кинетические методы и
ИФА
Лекция 11.
Применение
некаталитических реакций
Ферментативные методы
анализа
Лектор к.х.н., доцент
Ю.Ю.Петрова
Определение неорганических веществ
Реакции окисления-восстановления
Анализ анионов (серосодержащие
анионы, S2- и SCN-):
 Для определения сульфида выполняют
денситометрические измерения после
контакта пробы с фотопластинкой в
течение некоторого периода времени.
 Роданид в концентрации 4·10-5 — 5·10-4 М
определяют по ингибирующему действию
на реакцию между IO3- и Н2РО3- (выделяется йод, который реагирует с роданидом).
Определение неорганических веществ
Сочетание реакций окисления-восстановления
и комплексообразования:
использовали при разработке методик определения таких металлов, как Fe(II), Co, Ni и Pd по
реакции окисления гидразона бензил-2-пиридилкетона (R) броматом с образованием флуоресцирующего продукта (P).
M + R  [MR]
R + BrO3-  P
скорость реакции снижается, что можно связать с
концентрацией металла.
На этом принципе основана также методика
определения 20—150 мкг/мл кобальта (II) в
системе КВrО3- /2-пиридилгидразон пиридин-2альдегида.
Определение цианида с
использованием системы KI/MnO4Выделяющийся иод связывается в ICN,
что замедляет образование I2 (последний и
детектируют фотометрически при 575 нм по
поглощению синего комплекса с крахмалом):
10I- + 2MnO4- + 16H+ = 5I2 + 2Mn2+ + 8H2O
I2 + CN- = ICN + I-
Определение органических
соединений




Природа аналитической реакции различна:
окисление, если соединение содержит
способные окисляться группы;
бромирование, если имеются
ароматические ядра;
конденсация или присоединение в случае
аминов и карбонильных соединений;
гидролиз и т. п.
Определение органических соединений.
Реакции окисления


Определение алифатических спиртов на
уровне нескольких мкг/мл:
Этанол определяют в интервале 0,2—2,0 мкг/мл,
регистрируя при 400 нм поглощение перманганата,
восстанавливающегося до манганата:
2KMnO4 + CH3CH2OH + 2KOH =
2K2MnO4+ CH3CHO + 2H2O
Допустимо присутствие метанола в 5-кратном
избытке, однако другие алифатические спирты
(пропанол-1, пропанол-2, бутанол) мешают
определению.
Определение органических соединений
Реакции окисления


Определение алифатических спиртов на уровне
нескольких мкг/мл:
Измерение индукционного периода окисления
трет-бутанола тетраоксидом ксенона позволяет
определять спирт при содержании более 22 мкг:
(СH3)3COH +XeO4 =
CH3COCH3 +CO2 + Xe + 2H2O
Индукционный период:
4CH3OH + 3XeO4 = 4CO2 + 3Xe + 8H2O
По влиянию cпиртов на индукционный период этой
реакции можно определять метанол, этанол и
пропанол-2.
Определение гидроксилсодержащих
органических соединений
(фенолы и хлорфенолы)
Их определяют по реакции окисления
периодатом методом фиксированного
времени, регистрируя оптическую плотность
при 340 нм (λmax хинонов и хинолов).
Диапазон определяемых содержаний —
50—500 мкг/мл.
Определение гидроксилсодержащих
органических соединений
Гликоли с вицинальными гидроксигруппами
окисляют периодатом (реакция Малапраде):
СН2ОН(СНОН)nСН2ОН + (n + 1)НIO4 =
2НСНО + nНСООН + (n + 1)НIO3 + Н2О
Например:
СН2(ОН)СН2ОH + НIO4 = НСНО + НСООН + НIO3;
СН3СН(ОН)СН2ОН + НIO4 =
СН3СНО + НСНО + НIO3 + Н2O
Так, этилен-, пропилен- и бутиленгликоли можно определять
в интервале концентраций (1,4 —7,0)·10-3 М с
погрешностью около 0,7%.
Реакции бромирования



Субстраты, определяемые бромированием, — это
обычно фенолы (R); бром при этом генерируется in
situ (ВrО3-/Вr- в кислой среде).
(1) BrO3- + 5Br- + 6H+ = Br2 + 3H2O
(2) Br2 + R = P1
1 = 2
Br2 + МО = P2 (бесцветный)
Время обесцвечивания МО должно быть пропорционально концентрации определяемого соединения.
Так определяют крезолы, ксиленолы, этил- и
фенилфенолы, парацетамол, салициловую и
ацетилсалициловую кислоты (метод фиксированной
концентрации, cmin около 1·10-3 М).
Ферментативные методы
основаны на использовании зависимости
скорости катализируемой ферментом
химической реакции от концентрации
реагирующих веществ и фермента.
Использование биологических катализаторов позволяет значительно повысить
чувствительность и селективность
методов анализа.
Области применения
ферментативных методов
Анализ объектов
окружающей среды
Использование ферментативных тест-методик
для определения токсикантов в объектах
окружающей среды
Аналит
Объект
Вода Черного моря
(0,650,05) нг/мл
Hg(II)
Вода р. Обь
Подземная вода
Почвы
(подзолистые,
чернозем)
глины,
Вода Карского
моря
Почвы
(глины, чернозем)
Тест-методика
Hg(II)
Метилртуть
Pb(II)
Альтернативный
метод
0.66 нг/мл
(0,210,03) нг/мл
0.19 нг/мл
(0,820,02) нг/мл
0.76 нг/мл
(2.0  0.5) мг/кг
(2.2  0.6) мг/кг
(1.8  0.4) г/кг
(0.58  0.03) M
(14.50.4) мг/кг
(15.50.3) мг/кг
(2.0  0.7) мг/кг
(2  1) мг/кг
(2.0  0.5) мкг/кг
(0.7  0.2) M
(16  5) мг/кг
(151) мг/кг
Анализ объектов медицины
(биологических жидкостей)
Результаты определения магния в моче пациентов
активирующему действию на щелочную фосфатазу
цыпленка (норма - 100-300 мг Mg /сут)
Возраст,
Содержание магния в моче
Найдено
В аликвоте,
В суточной моче,
годы
по граф.,
нг/мл
мкг/мл
мг/сут
5
6.00
18.00
14.40
15
14.50
17.40
20.88
20
2.50
15.00
21.00
25
по его
из кишечника
2.50
15.00
Возможные причины дефицита магния
у пациентов
Повышенная возбудимость, снижение
иммунитета
Гипокалорийные диеты для борьбы с
лишним весом
27.00
Физическое перенапряжение,
хроническая усталость, расстройство
сна, общая слабость
30
7.00
8.40
12.60
Желче- и мочекаменная болезнь,
повышенная функция щитовидной
железы
50
10.00
6.00
10.80
Гипертония, применение диуретических
средств
Результаты определения Hg(II) с использованием иммобилизованной
на ППУ пероксидазы из корней хрена в плазме крови и моче пациентов
больницы г. Лыткарино
(ПФЗ Hg(II) в крови и моче – (20 – 50) нг/мл)
N пациента
Концентрация Hg(II), пг/мл
Плазма крови
Моча
1
1,3 + 0,4
2,6 + 0,2
2
1,5 + 0,2
2,8 + 0,3
3
1,4 + 0,3
2,6 + 0,2
4
1,6 + 0,4
2,4 + 0,3
5
1,2 + 0,2
1,8 + 0,2
6
1,8 + 0,2
2,9 + 0,2
7
1,4 + 0,4
2,4 + 0,2
8
1,2 + 0,4
2,2 + 0,2
Анализ пищевых продуктов
Результаты определения Hg(II) и Pb(II) в минеральных водах с
использованием иммобилизованных на ППУ
пероксидазы из корней хрена и
щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка
Минеральные воды
Концентрация Ме(II), нг/мл
Hg(II)
Pb(II)
«Аким»
1,4 + 0,2
75 + 2
«Ранова»
1,0 + 0,3
5+2
«Святой источник»
1,8 + 0,3
50 + 3
«Мантуровская»
20 + 3
5+2
«Благо»
1,1 + 0,3
10 + 2
«Барюм»
30 + 4
50 + 2
Определение ионов металлов в пищевых продуктах
с использованием иммобилизованных на ППУ пероксидазы
из корней хрена,
щелочных фосфатаз из кишечника цыпленка и
тонкой кишки тюленя
Содержание Ме(II), мг/кг
Объект
Hg(II)
Cd(II)
Pb(II)
Zn(II)
Горох
2,2 + 0,2
0,0062 + 0,0006
0,13 + 0,03
5,5 + 0,2
Виноград
2,4 + 0,4
0,0024 + 0,0008
0,23 + 0,02
1,7 + 0,3
Говядина
1,5 + 0,3
0,19 + 0,02
0,007 + 0,002
9,4 + 0,4
Свинина
7+2
< 0,001
0,09 + 0,02
4,9 + 0,4
Ферментативными методами
можно определять:
сами ферменты (Е);
 их субстраты (S);
 соединения, воздействующие на
каталитическую активность
ферментов, — их эффекторы,
активаторы (A) или ингибиторы (I).

Ферменты —
катализаторы белковой природы,
ускоряющие химические реакции в
живых организмах и вне их.
Ферменты обладают уникальными свойствами:
 высокая каталитическая активность
(добавка фермента 10-9— 10-7 М ускоряет
превращение субстрата в 108—1012 раз);
 специфичность (избирательность) их
действия в отношении структуры субстрата,
типа реакции и условий ее проведения.
Гипотеза «ключа и замка»
1890 г. Эмиль Фишер
Схематическое
объяснение
причин
специфичности
действия
ферментов
Гипотеза Кошланда (1958 г.) о
наведенном соответствии («рукаперчатка»)
Стабилизация
переходного состояния
Классификация ферментов
Класс ферментов
Оксидоредуктазы
Тип реакций
Окислительно-восстановительные
Гидролазы
Разрыв связей C-O, C-N или C-C
с участием молекул Н2О
Трансферазы
Перенос функциональных групп
от донора к акцептору
Разрыв связей C-O, C-N или C-C
с образованием двойных связей
Соединение 2-х молекул субстрата
Лиазы
Лигазы
Изомеразы
Геометрические или структурные
изменения в молекуле субстрата
Субстрат
Фермент
Мочевина (Urea)
Уреаза
Пероксид
Пероксидаза
Липиды
Липаза
Фосфаты
Фосфатаза
Щелочная (рН 8,0-10,5)
Кислая
(рН 3,0-5,8)
Пепсин
Трипсин
Молочная к-та – 2Н+  пировиноградная к-та
лактатдегидрогеназа
Молочная к-та + О2  уксусная к-та + СО2 + Н2О2
лактатоксидаза
Ферменты и их субстраты
Название фермента
Субстрат
Оксидоредуктазы
Альдегиддегидрогеназа
Бетаинальдегиддегидрогеназа
Альдегиды
Бензальдегид
Бетаинальдегид
Алкогольдегидрогеназа
Алкогольоксидаза
Арилалкогольоксидаза
Спирты
Алифатические спирты
Ароматические спирты
Пероксидаза
Пероксид водорода
Ароматические амины
Бензальдегиддегидрогеназа
Гидролазы
Уреаза
Мочевина
Щелочная (рН 8,0 – 10,5)
Кислая
(рН 3,0 – 6,0)
фосфатазы
Моноэфиры о-фосфорной
кислоты
Ферменты –
сложные белковые молекулы, представляющие собой высокомолекулярные
соединения, состоящие из -L-аминокислот, связанных друг с другом
пептидными (амидными) связями:
NH2 – CH – CO OH + H N – CH – COOH
R’
H
R’’
Трёхмерные структуры белка на
примере триозофосфатизомеразы
Слева — «стержневая» модель, с изображением всех атомов и связей
между ними; цветами показаны элементы. В середине — мотив
укладки. Справа — контактная поверхность белка, построенная с
учётом ван-дер-ваальсовых радиусов атомов; цветами показаны
особенности активности участков.
Строение глобулы пероксидазы
Схематическое изображение взаимодействия
фермента с субстратом и эффекторами
Холофермент = апофермент + кофактор
Апофермент – белковая часть фермента
может образовывать комплексы с
• коферментом – небелковым органическим
соединением, слабо связанным с ферментом;
• простетической группой – группой
органических соединений, прочно связанных
с ферментом;
• ионом металла (кофактором).
Кофактор (cofactor)

вещество небелковой природы,
необходимое ферменту для
осуществления реакции, т.е.
проявления каталитической
активности (ассоциация с активным
центром фермента)
Кофакторы ферментов



Кофакторы могут быть как
неорганическими молекулами (ионы
металлов, железо-серные кластеры и
др.), так и органическими (например,
флавин или гем).
Органические кофакторы, прочно
связанные с ферментом, называют
также простетическими группами.
Кофакторы органической природы,
способные отделяться от фермента,
называют коферментами.
Кофакторы ферментов



Фермент, который требует наличия
кофактора для проявления каталитической
активности, но не связан с ним, называется
апофермент.
Апофермент в комплексе с кофактором
носит название холофермента.
Есть и такие простетические группы,
которые связаны с ферментом ковалентно,
например, тиаминпирофосфат в
пируватдегидрогеназе.
Ферменты в аналитической химии
Кофакторы:
- Ионы металлов: Zn2+ (алкогольдегидрогеназа),
Mn2+ (фосфортрансфераза),
Fe2+ (цитохромы);
- Коферменты (коэнзимы).
кофактор
+
апофермент
=
холофермент
Коферменты (Р) и
простетические группы (П)
Структурная формула кофермента
никотинамидаденозиндифосфата
(НАД+)
NH2
N
N
N
N
O
O
O
H
H
OH
H
OH
H
P
O-
O
O
P
N
O
O
O
O-
H
H
OH
H
OH
H
H2N
НАД+ + Н+ + 2е  НАДН
(переносчик ОН-групп и электронов)
Эффекты 1Н ХПЯ в реакции фотоиндуцированного
окисления НАДН, катализируемого ПХ: (1) реакционная
смесь НАДН и ПХ до облучения; (2) времяразрешенная
фотоиндуцированная 1Н ХПЯ.
δ, м.д.: 2.75, эмиссия (С-4 протоны НАДН); 4.75 (HDO).
H
H
5
5H
(1)
НАДН•+
НАДН →
→ НАД• → НАД+
O
C
4
6
6H
H
R(adenosine-diphosphoribosyl)
4H
NADH
Per3+
.+
e—
(2)
HDO
7
6
NH2
2
N
H
2H
H
5
Per2+ + НАДH
.+
НФ
НАДН
НФ
4H
4
3
2
1
0
м.д.
Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их
иммобилизация перевод в водонерастворимое состояние
путем связывания с носителем или
модифицирование водорастворимыми
полимерами с полным или частичным
сохранением ферментами каталитической
активности.
- любое ограничение свободы движения белковых молекул
(или их фрагментов) в пространстве (благодаря
внутримолекулярной или межмолекулярной «сшивке»
белковых молекул низкомолекулярными
бифункциональными агентами или присоединением к
растворимому полимеру).
Способы иммобилизации ферментов
Физические
(фермент не связан с носителем ковалентными
связями)
 адсорбция на нерастворимых носителях;
 включение в поры геля или полимера;
 пространственное отделение фермента от
остального объема реакционной системы
полупроницаемой перегородкой (мембраной);
 включение в двухфазную реакционную среду,
в которой фермент растворим и может
находиться в одной из фаз.
Химические
(за счет образования ковалентных связей между
белком и носителем с участием «сшивающих»
агентов)
Особенности:
 обеспечивается высокая прочность образующегося
конъюгата, устойчивого к изменениям температуры, рН;
 фермент не десорбируется с носителя
и не загрязняет продукты катализируемой им реакции;
 возможны существенные изменения свойств
ферментов: субстратной специфичности и
каталитической активности.
Преимущества иммобилизованных
ферментов
 Более высокая стабильность;
 Легкость отделения от реакционной среды, что
дает возможность:
 остановить реакцию в нужный момент;
 использовать катализатор многократно.
 Возможно
 получать продукт, незагрязненный ферментом;
 проводить ферментативный процесс непрерывно и
регулировать скорость реакций, а также выход продукта
путем изменения скорости потока;
 целенаправленно изменять свойства катализатора:
субстратной специфичности, каталитической
активности, ее зависимости от рН, ионного состава;
 регулировать каталитическую активность фермента
путем изменения свойств носителя.
Носители для иммобилизации
ферментов
Требования, предъявляемые к носителям
 высокая химическая и биологическая стойкость;
 высокая механическая прочность;
 достаточная проницаемость для фермента и субстрата;
 большая удельная поверхность, высокая емкость и
пористость;
 возможность получения в виде форм, удобных в
технологическом отношении (гранул, порошков,
таблеток, пластинок, мембран);
 легкое переведение в реакционноспособную форму
(активация);
 высокая гидрофильность, позволяющая проводить
реакции связывания фермента с носителем в водной
среде;
 невысокая стоимость.
Неорганические носители
Силикагели, глины, керамика, природные минералы,
графитированная сажа, металлы и их оксиды
Органические носители
Полимерные
Природные
Полисахариды
целлюлоза,
хитин, агароза
Синтетические
Полимеры на
основе стирола:
акриламид, нейлон
Низкомолекулярные
Природные
Синтетические
Липиды
ПАВ
ВОЗМОЖНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ
МЕТОДОВ АНАЛИЗА
Фермент катализирует реакции, в которых
участвуют, как правило, один или два субстрата.
Простейшая односубстратная реакция
описывается обычно схемой Михаэлиса—Ментен:
k1
k2
E + S  ES  P + E
k-1
где Е — фермент, S — субстрат, ES —
промежуточный комплекс фермента с
субстратом (комплекс Михаэлиса-Ментен),
Р — продукт.
ВОЗМОЖНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ
МЕТОДОВ АНАЛИЗА
При [Е] « [S]o начальная стационарная скорость
образования продукта описывается уравнением:

k кат [ E ][ S ]0
0 =
,
K m  [ S ]0
где 𝒌кат = 𝒌𝟐 , 𝑲𝒎 =
(2)
𝒌−𝟏 +𝒌𝟐
𝒌𝟏
Согласно уравнению (2), концентрация
субстрата [S]o будет пропорциональна 0 только
при условии, когда [S]o « Km. Тогда
[S]0 = 0 Km / kкат [E] (3)
Кинетические исследования
0 =
k кат [ E ][ S ]0
,
K m  [ S ]0
ВОЗМОЖНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ
МЕТОДОВ АНАЛИЗА (cв, сн и сmin)

cв определяемых концентраций субстрата

cн определяемых концентраций субстрата


ограничена величиной Km.
определяется той величиной 0, которая
может быть зафиксирована с помощью используемого для наблюдения инструментального
метода.
Величина 0 тем выше для одного и того же
значения [S]0, чем выше kкат и [Е].
Использование высокоактивного фермента
(большое значение k кат) и повышение его
концентрации в реакционной смеси могут
существенно снизить cmin субстрата.
Способы измерения скорости
ферментативной реакции
1. Измерение «по конечной точке» (end
point method)
 Такой способ называют еще
одноточечной кинетикой. Как правило,
по истечении указанного отрезка
времени t в реакционную смесь
добавляют реагент, останавливающий
ферментативную реакцию, например
щелочь или кислоту.
Способы измерения скорости
ферментативной реакции
2. Измерение двухточечное (two point
metod)

При этом способе оптическую плотность определяют
на линейном участке кинетической кривой дважды,
четко фиксируя интервал времени t между
измерениями. Скорость изменения оптической
плотности рассчитывают по формуле: ΔА/мин = (А2
– А1)/t. Этот способ используют, например, в
современных методах определения активности амилазы на основе блокированных мальтоз и
щелочной фосфатазы.
Способы измерения скорости
ферментативной реакции
3. Измерение многоточечное, или
кинетическое (kinetic measurement)
При этом способе оптическую плотность на
линейном участке кинетической кривой
определяют 3–5 и более раз через четко
фиксированные равные интервалы времени t.
Скорость изменения оптической плотности
рассчитывают по формуле: ΔА/мин = ΔĀ/t.
Либо для повышения точности измерения
применяют МНК.
Измерение скорости ферментативной
реакции: а – «по конечной точке»; б –
двухточечное; в – многоточечное
Определение эффекторов ферментов
Обратимые неконкурентные
ингибиторы, взаимодействуя с
ферментом по реакции:
KI
E + I  EI
(4)
где I - ингибитор, а KI = [ЕI]/([Е][I]),
образуют каталитически неактивные
комплексы EI.
Определение ингибиторов ферментов
Можно показать, что в присутствии
ингибитора I отношение разности
[Е]о - [Е] = [E]/[E]0 записывается
выражением:
[ E ]
K I [I ]

[ E ]0 1  K I [ I ]
Определение ингибиторов ферментов
При малых значениях [I], когда KI[I] « 1,
относительное уменьшение активности фермента
будет прямо пропорционально концентрации
ингибитора. Тогда
1 E
1 E
[ I[
] I ] 
(6)
K [E]
I
0
K I [E] 0
При высокой концентрации ингибитора (6),
точность ее определения уменьшается и,
наконец, при KI[I] » 1 отношение Δ[E]/[E]0
не зависит от концентрации ингибитора.
Необратимые ингибиторы
или инактиваторы
Е + nI
kин
Eнеакт
(7)
если значение kин достаточно велико, так
что временной зависимостью реакции (7)
можно пренебречь, уменьшение активности
фермента Δ[E] будет пропорционально
концентрации инактиватора: Δ[E] = n [I],
где n — число молекул инактиватора или
ингибитора, взаимодействующих с одной
молекулой фермента.
Необратимые ингибиторы
или инактиваторы
Если же величина kин относительно
мала, то при небольшой глубине
протекания реакции (Δt мало, а [Е] мало
отличается от [Е]0) можно показать, что
относительное уменьшение активности
фермента
Δ[E]/[E]0 = kин Δt [I]n
зависит от длительности процесса
активации.
Скачать