Актуальные вопросы детекции возбудителей заболеваний с

Актуальные вопросы детекции
возбудителей заболеваний с фекальнооральным механизмом передачи
ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии»
Роспотребнадзора
Подколзин А.Т., Шипулин Г.А.
Особенности лабораторного мониторинга возбудителей
заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи
Восприимчивое
звено
Пациент
Факторы
передачи
1. Детекция
2. Типирование
Носитель
Вопросы для обсуждения
1. Детекция биопатогенов
- Выбор технологии
- Выбор инструмента
2. Оценка идентичности изолятов
- Выбор метода
3. Типичные ошибки
Практическая доступность перспективных
технологий детекции биопатогенов
Next generation sequencing
(высокопроизводительное секвенирование)
Масс-спектрометрия
(MALDI-TOF MS, IBIS Biosciences)
Амплификационные биочипы
(детекция биопатогенов)
Point-of-care (РОС)-тесты
(тесты у постели пациента)
Иммунологические и
неамплификационные биочипы
Классическое
секвенирование
Real-time PCR
Критерии оптимального выбора инструмента
1. Наличие и адекватный ассортимент доступных
диагностикумов
2. Экономическая целесообразность (стоимость приборов,
расходных материалов, диагностикумов, обучения
специалистов)
3. Открытость системы (потенциальная демонополизация
поставок расходных материалов и диагностикумов)
4. Наличие адекватного сервисного обслуживания
5.Регистрация на территории РФ
Сопоставление себестоимости лабораторных методов
детекции вирусных агентов ОКИ в РФ (2010г)
Тест-система
Amplified IDEIA Astrovirus (ПЦР)
R Biopharm Norovirus (ИФА-АГ)
Vegal Astrovirus (ИФА-АГ)
DRG Adenovirus (ИФА-АГ)
Savyon Rotavirus (иммунохроматография)
Savyon Adenovirus (иммунохроматография)
Seramun Astrovirus (ИФА-АГ)
Vegal Rotavirus (ИФА-АГ)
Seramun Rotavirus (ИФА-АГ)
Амплисенс Rotavirus grA(ПЦР-форез + экстракция НК)
Вектор Бест Аденовирус (ИФА-АГ)
Вектор Бест Ротавирус (ИФА-АГ)
Savyon Rotavirus/Adenovirus (иммунохроматография)
Амплисенс Rotavirus grA/Astrovirus/Adenovirus grF (ПЦР-FL+
экстракция НК)
Savyon Rotavirus (ИФА-АГ)
Аквапаст Ротавирус (ИФА-АГ)
Изоген Rotavirus (ПЦР-форез+ экстракция НК)
Амплисенс ОКИ скрин (ПЦР-FL+ экстракция НК)
Стоимость Кол-во Стоимость 1
тест-системы тестов иссл-я (RUR)
Стоимость
выявления 1
патогена (RUR)
731 (EUR)
696 (EUR)
135 (EUR)
316,8 (EUR)
3424 (RUR)
3424 (RUR)
240 (EUR)
69 (EUR)
207 (EUR)
3400 (RUR)
7844 (RUR)
7844 (RUR)
3712 (RUR)
96
96
30
96
25
25
96
30
96
50
96
96
25
317,5
302,3
187,7
137,6
137,0
137,0
104,3
95,9
89,9
82,5
81,7
81,7
148,5
317,5
302,3
187,7
137,6
137,0
137,0
104,3
95,9
89,9
82,5
81,7
81,7
74,2
8446 (RUR)
107 (EUR)
2100 (RUR)
4120 (RUR)
9744 (RUR)
50
96
48
100
50
183,4
46,5
43,8
57,0
209,4
61,1
46,5
43,8
41,2
29,9
Соответствие методов выявлении патогенов
целям исследований (на примере ротавирусов гр А)
Пациенты с манифестной
до1012
инфекцией
Пациенты с бессимптомной
104 - 106
инфекцией
Концентрированные
образцы из
окружающей среды
Продукты
питания
102 - 105
Все методы (МАНК, ИФА-АГ, культуральные
методы, иммунохроматография)
МАНК, культуральные методы.
ИФА-АГ, иммунохроматография риск ложнонегативных результатов
МАНК, культуральные методы.
ИФА-АГ ,
иммунохроматография неприменимы
Культуральные методы?
МАНК- риск
Минимальная инфицирующая доза
ложнонегативных
результатов.
ИФА-АГнеприменимы
Специализированные диагностические тесты
для детекции биопатогенов в ООС
Комплекты реагентов для детекции
бактериальных патогенов в ООС
этап культурального
обогащения
(проводится в соответствии с
требованиями действующих
ГОСТ и СП)
-
Амплисенс Shigella spp EIEC FL
Амплисенс EHEC O157H7 FL
Амплисенс Listeria monocytogenes FL
Амплисенс Salmonella spp FL
Амплисенс Campylobacter spp FL
Амплисенс Cronobacter (E sakazakii) FL
Основные требования к прикладным методам
генетического типирования биопатогенов
-Достаточная разрешающая (дифференцирующая)
способность
-Стабильность маркеров для эпидемиологических
исследований
- Воспроизводимость (этапов анализа, учета
результатов и интерпретации)
Основные методы генетического
типирования биопатогенов
Вирусные
агенты
Секвенирование
вариабельных участков
генома (отличаются от
используемых в
диагностических тестсистемах)
Бактериальные
агенты
Могут
использоваться
без выделения
чистой культуры
Мультилокусное
секвенированиетипирование
(MLST)
Требуют выделения чистой
культуры
- Риботипирование
- Электрофорез в пульсирующем
поле (PFGE)
- Оценка полиморфизма длин
фрагментов амплификации (AFLP)
- Методики амплификации
повторяющихся элементов
переменной копийности (MLVA)
Методы генетического типирования
Стабильность маркеров для
эпидемиологических исследований
Пример из практики
Кол-во изолятов
S.Enteritidis из
очага
(n)
Генотип характерный для очага
Плазмидный PFGE-тип
тип (n)
(n)
MLVA-тип (n)
Очаг№ 5 (9)
1 (4)
2 (4)
3 (1)
2 (9)
4 (9)
Очаг№ 6 (3)
1 (5)
2 (3)
3 (3)
6 (3)
Очаг№ 1 (8)
1 (1)
6 (1)
5 (6)
1 (8)
2 (8)
Изоляты, выделенные в одном очаге
различались по наличию
низкомолекулярных плазмид.
Низкомолекулярные плазмиды являются эпидемиологически
нестабильным маркером что отражается в их потере или
приобретении бактериальной клеткой из-за влияния факторов
окружающей среды в короткий по эпидемиологическим меркам
промежуток времени, в т.ч. в период формирования очага
групповой заболеваемости или изоляции культур.
Типовые казусы
(к вопросу о здравом смысле)
Примеры нецелевого использования
диагностических инструментов
зима 2010 – поиск ротавирусов в снегу (как потенциального источника
поступления ротавирусов в реку, из которой проводится водозабор)
РФ 2010 – плановое тестирование молочной продукции на
содержание ротавирусов в период сезонного подъема
заболеваемости
РФ 2010 – применение ИФА-АГ для выявления
ротавирусов в воде
Примеры нецелевого использования
диагностических инструментов
Псевдотипирование
Применение методов амплификации со случайными праймерами (RAPD –
ПЦР) - внутрилабораторный уровень невоспроизводимости
Нецелевое секвенирование
Попытки установить серотиповую принадлежность энтеровирусов
(определяемую геном капсида – VP1) на основе секвенирования 5’ UTR
(мишень в диагностических тест-системах)
В качестве заключения…
Лабораторные методы детекции биопатогенов в
факторах передачи – важный, но ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ
инструмент в руках эпидемиолога.
Принципы доказательной медицины успешно
реализуются при использовании косвенных - статистических
методов анализа эпидемиологических данных,
доказывающих роль факторов передачи в развитии
заболеваемости.
Благодарю за внимание!
Контактная информация:
«Референс-центр по мониторингу возбудителей
острых кишечных инфекций»
111123, Россия, г.Москва, ул. Новогиреевская, 3а
+7(495) 974 96 46.