Область Гинье

Общие положения малоугловой дифракции
Вид дифракционной картины и возможности извлечения из нее структурной
информации существенно зависят от упорядоченности в рассеивающем объекте
Картина рассеяния от
объекта в кристаллическом
состоянии (кристалл)
Когерентное, упругое
Картина рассеяния от объекта
в частично упорядоченном
состоянии (волокно)
Частично когерентное, упругое
Картина рассеяния от
объекта в неупорядоченном
состоянии (раствор)
Некогеррентное, «упругое»
Главный вывод: чем выше степень упорядоченности объекта , тем более
информативной будет от него картина дифракции
1
Общий вид кривой в малоугловом рассеянии
Область Гинье
I
Область формы частицы
Область, где выявляются детали
внутренней структуры частицы
Q =4π/λ×sinθ (Å-1)
0.01
0.1
0.2
2
Аппроксимация Гинье
В 1939 году А. Гинье показал, что в области малых углов интенсивность
рассеяния может быть представлена экспоненциальной функцией
I (Q)  I (0) exp 1 / 3 RG Q2
2
Это уравнение известно как аппроксимация Гинье. Оно верно для частицы любой формы
при условии что произведение QRG меньше или равно 1.
ln I (Q)  ln I (0) 1 / 3 RG Q2
2
M =50 кДа
Rg = 52 Å,
Рассеяние нейтронов
3
Радиус инерции Rg в механике и его свойства
RG   m j r j
2
2
m
j
• Свойство 1. Радиус инерции однородной частицы не зависит от ее плотности.
• Свойство 2. Радиус инерции однородной сферической частицы связан с ее радиусом r0
Rg2  3 r02
5
• Свойство 3. Радиус инерции двух сферических частиц зависит от расстояния
между ними L
2
2
2
2
Rgoo
 1 / 2 Rgo
 1 / 2Rgo
 1 / 4L2  Rgo
 1 / 4L2
• Свойство 4. Радиус инерции совокупности сферических частиц зависит от
их распределения в пространстве
3
2
1
ro
1
2
3
3
1
2
2
1
3
4
• Свойство 5. Радиус инерции неоднородной частицы зависит от распределения
«рассеивающей плотности» внутри нее. Для двухкомпонентной частицы
с «рассеивающими плотностями» 1 и 2
2 =0
1 > 2
2
1
1
Rg
1 = 2
2
1
Rg
2
1 < 2
1
Rg
2
Rg
• Свойство 6. Для частиц простой формы радиус инерции связан с их
геометрическими размерами следующим образом
h2
R  3 / 5r
2
g
2
0
R  (a2  2b2) / 5r
2
g
2
0
Rg2  L2 / 12
Rg2  h 2 / 6 5
• Свойство 5. Радиус инерции неоднородной частицы зависит от распределения
«рассеивающей плотности» внутри нее. Для двухкомпонентной частицы
с «рассеивающими плотностями» 1 и 2
2 =0
1 > 2
2
1
1
Rg
>
1 = 2
2
1
Rg
>
1 < 2
2
Rg
1
>
2
Rg
• Свойство 6. Для частиц простой формы радиус инерции связан с их
геометрическими размерами следующим образом
h2
R  3 / 5r
2
g
2
0
R  (a2  2b2) / 5r
2
g
2
0
Rg2  L2 / 12
Rg2  h 2 / 6 6
Фактор EF1A в изолированном состоянии и в комплексе с лигандом (т-РНК)
М=50 кDa
Rg = 32 Å,
Расчетный Rg для
eEF1A:tRNA=3:1 (▼) белка в составе
комплекса равен 28 Å.
eEF1A (○)
eEF1A:tRNA=1:3 (Δ)
Oжидаемый Rg для белка в
компактной форме равен 26 Å
т-РНК (●)
Элонгационный эукариотический фактор eF1A не являeтся
глобулярным белком в обычном понимании, а относится
к классу природно неструктурированных белков.
Такие белки не имеют уникальной третичной структуры в
физиологических условиях, а приобретают ее при
взаимодействии с лигандами”
7
Сравнение радиуса инерции частицы с ее гидродинамическими параметрами
Радиус инерции и константа
поступательного трения
RT
f 
D
f  60 R0 F ( p)
s 
Rg0 s
D 
M (1   0 )
M (1   0 )
f 
s
Радиус инерции и
характеристическая вязкость
a  2b
R 
5
2
2
2
g
2
4  5Rg 
V
p

3  p 2  2 
Rg0 D

RT
3
2
   5 V  ( p)
2M
Rg
 13 M
1
3
Функции  и  могут быть рассчитаны теоретически и определены экспериментально
D 
Rg0 D
RT
γmin=4.22

Rg
  3 M
1
1
3
αmin=1.96
8
Примеры использования функций  и 
1.
Миоглобин
М=17.836 Da, D=10.810-7 cm2/sec, s =2.08 S
=0.741 cm3/g, []=3.1 cm3/g, Rg=15.8 Å
=2.00, s=4.28, D=4.32, p=1.6, 1/p=2.0
2.
Апоферритин
M=465.000 Da, D=3.6410-7 cm2/sec, s =17.6 S
•
=0.747 cm3/g, []=3.2 cm3/g, Rg =51.9 Å
=2.20, s=4.60, D=4.63.
1.
Ферритин
M=890.000 Da, D=3.6110-7 cm2/sec, s =67 S
=0.51 cm3/g, []=3.0 cm3/g, Rg =37.3 Å
=1.7, s=3.43, D=3.38.
2.
•
50S Е. coli
M=1.65 106 Da, D=1.8710-7 cm2/sec, s =50.0 S
=0.61 cm3/g, []=3.8 cm3/g, Rg =75.0 Å
s=3.42, D=3.43.
9
Форма молекулы из кривой рассеяния
Область Гинье
Кривые рассеяния для сферы и
эллипсоидов
с
разным
соотношением осей (υ).
Жирным выделена область Гинье, в
которой произведение QRG порядка
1. В этой “малоугловой” области
кривая рассеяния не зависит от
формы частиц.
Кривая
рассеяния
“чувствует”
форму частицы вне области Гинье,
когда QRG >2.
Для наблюдения за формой частицы,
независимо от eё абсолютных
размеров кривые интенсивности
следует строить как функцию QRG.
В данном контексте s = Q
6
10
I
Apoferritin in D2O
Q
Q
4

I
sin 
4

sin 
Головка
Cд фага
Примеры кривых рассеяния частицами, форма которых близка к сферической
11
Контраст в быту
Воздух (n=1)
ЧТ 02 12
ЧТ 02 12
Толуол (n=1.49)
ЧТ 02 12
ЧТ 02 12
Вода (n=1.33)
Номера автомобилей
Книгопечатание
Стеклянная палочка (n=1.49)
Цирковые фокусы
12
Контраст в рассеянии света, рентгеновских лучей и нейтронов
|Q|=4/sin
I раствора(Q)  I (Q) растворителя  N (ачастицы  а растворителя )2 F (Q)
контраст
Контраст в рассеянии
Контраст в рассеянии
Контраст в рассеянии
света
рентгеновских лучей
нейтронов
I ~ (n1  n0 ) 2
I ~ ( 1   0 ) 2
На практике не
может быть
изменен
На практике достигается за счет изменения
свойств растворителя
I ~ (a1  a0 ) 2
На практике достигается как за
счет изменения свойств растворителя, так и свойств частицы.
13
Контрастирование в малоугловом рассеянии рентгеновских лучей:
добавление «электронно-плотных» веществ в растворитель.
I ~ ( 1   0 ) 2
A
0 
N Ad 0
M
 част 
A
1
NA
M
част
H
20
28
e
23
 24

 6.02 10 1.0 10  0.334 3   D2O
18
A
е
 белок  0.42 3
А
 РНК  0.55
е
А3
Зависимость квадрата радиуса
инерции миоглобина кашалота
от обратного контраста (○○○).
Бесконечый
контраст
Параметр  >0, что
свидетельствует о наличии в
частице гидрофобного ядра и
гидрофильной оболочки.
Плотность последней больше
таковой ядра.
RG   m j r j
2
2
m
14
j
?
15
Контрастирование в малоугловом рассеянии нейтронов
16
Вариация контраста в нейтронном рассеянии
1.
Изменение рассеивающих свойств растворителя (использование
разных H2O/D2O смесей)
2. Изменение рассеивающих свойств частицы (биосинтетическое
дейтерирование)
3.
Использование смесей частиц с разными рассеивающими
свойствами ( изотопическое замещение на тройном уровне,
техника триангуляции)
4.
Изменение взаимной ориентации спинов протонов частицы и
падающего нейтрона (спин-спиновое взаимодействие)
17
Контраст в малоугловом рассеянии
I (0) ~ (a1  a0 ) 2
I0
Точка компенсации
Rg2  R2 

a1  a0


(a1  a0 ) 2
Rg2
α < 0, β=0
α = 0, β=0
α > 0, β=0
Плотность рассеяния растворителя
α < 0, β=0 означает, что менее
плотная компонента находится
в центре частицы
a0
Обратный контраст
1 /( a1  a0 )
α > 0, β=0 означает, что более
плотная компонента
α =0, β=0 означает, что оба
компонента в частице
находится в центре частицы
равномерно перемешаны.
18
Неравенство β нулю означает, что центры тяжести компонент смещены друг относительно
Вариация контраста методом H2O/D2O смесей
a0
a b

k k
M
N A d 0 aчаст
ab


k k
M
NA
1
част
aH = -3.7410-13
aD = +6.69 10-13
aN = +9.4010-13
aO = +5.80 10-13
aP = +5.1110-13
aC = +6.05 10-13
a H 2O 
(2  3.74  5.80) 13
10  6.02 10 23 1.00 10  24  0.56 10 14 cm / A3
18
aD2O 
(2  6.69  5.80) 13
10  6.02 10 23 1.10 10  24  6.38 10 14 cm / A3
20
aH 2O / D2O  0.56  6.94Y
aбелок ( H 2О)  1.72 1014 cm / A3
aбелок ( D2O)  2.94 1014 cm / A3
aРНК ( H 2O)  3.73 1014 cm / A3
aРНК ( D2O)  4.60 1014 cm / A3
aбелок  1.72  1.22Y
aРНК  3.73  0.87Y
19
9 .0
D - ДНК
10
-2
8 .0
Плотность амплитуды рассеяния 10 см
7 .0
D - б ел о к
6 .0
5 .0
ДНК
4 .0
РНК
Б ел о к
3 .0
2 .0
В ода
1 .0
Ф о с ф ат и д и л х ол и н
0 .0
- 1.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% D 2O
Плотность амплитуды нейтронного рассеяния биологических частиц как функция
процентного содержания тяжёлой воды в смеси
Наклон каждой прямой связан с дейтерообменом
20
Кошка Штурмана
Белок и РНК в H2О
Белок в 40% D2О
РНК в 70% D2О
Белок и РНК в D2О
• При бесконечном отрицательном или положительном контрасте
проявляется форма частицы
• При малом контрасте проявляется внутренняя структура
21
Вариация контраста за счет рассеивающих свойств среды:
биосинтетическое дейтерирование
(H)-белок в H2O
а  1.72 10
14
см / А
14
см / А
3
(H)-белок в D2О
а  2.94 10
(D)-белок в D2O
а  8.44 10 14 см / А3
абелок  1.72  1.22Y  5.50S
3
(H)-РНК в H2O
а  3.73 10 14 см / А3
(H)-РНК в D2O
а  4.60 10 14 см / А3
(D)-РНК в D2O
а  7.80 10 14 см / А3
aРНК  3.73  0.87Y  3.20S
где Y-доля D2O в смеси H2O/D2O, S- доля D2O в среде выращивания
Оптическая
плотность
Время в часах. a) H2O; b) 78% D2O; 100% D2O
22
Рибосома в пре- и пост-транслоцированном состоянии
Растворитель 91% D2O
30S*50S
30S*50S
30S*50S
30S*50S
30S*50S
H
H
D
H
H
D
D
D
H
D
D
23
30S
50S
Рис. Ж2.14 Положение 30S
субъединицы до взаимодействия
с элонгационным фактором
(полупрозрачный розовый) и
после (желтый)(Valle et al., 2003)
У большого пестрого дятла трель
идет со скоростью 20-27 ударов в
секунду.
У малого пестрого дятла - 50
ударов в секунду (Энциклопедия)24
Использование смесей частиц разной степени дейтерированности
Техника триангуляции (W. Hoppe and P. Moore)
_
=
L
25
Пространственное расположение 21 белков в 30S рибосомной субчастице
Структура 30S рибосомной субчастицы Т. termophilus
Структура некоторых
рибосомных белков 30S
субчастицы Т. Th., полученная
методом ЯМР.
Вторичная структура 16S РНК
и ее три домена: 5’-домен
(красный), центральный домен
(зеленый) и 3’- домен (желтый)
и 3’ малый домен (голубой)
Рентгеновская структура 30S
рибосомной частицы T. th. с
разрешением 3Å. Вверху - стерео
изображение третичной структуры.
Внизу – фронтальная и обратная
сторона 30S субчастицы. Серым цветом
окрашена РНК, сиреневым цветом 26
белки
Использование смесей частиц разной степени дейтерированности
Метод тройного изотопического замещения (М. Павлов и И. Сердюк)
H
«Одна» частица
H,D
H,D
D
D
-
H,D
=
H,D
H,D
D
Раствор 1
H,D
Раствор 2
Разность двух растворов
I1 (Q)  I 2 (Q)  N (1   )( aH  aD ) 2 F (Q)
27
Изменение взаимной ориентации спинов протонов частицы и падающего
нейтрона (спин-спиновое взаимодействие) (Х. Штурманн)
Hn
H 
Неполяризованное рассеяние
H (-0.374)
D (+0.667)
Поляризованное рассеяние
H
Hn

Hn
H
(+1.082)
28
 (-1.83)