Пробиотики
advertisement
Препараты на основе живых культур микроорганизмов Асс. Фролова Д.Д. "Многочисленные разнообразные ассоциации микроорганизмов, населяющие пищеварительный тракт человека, в значительной степени определяют духовное и физическое здоровье человека". Илья Ильич Мечников - отец учения о дисбактериозе, пробиотиках и ортобиозе Что такое «пробиотики» Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ, 2001): Пробиотики — это живые микроорганизмы, которые при применении в адекватных количествах вызывают улучшение здоровья организма – хозяина. Пробиотики – это лекарственные препараты, БАДы и пищевые продукты, содержащие живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения положительное влияние на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина посредством стабилизации и оптимизации функции его нормальной микрофлоры и обменных процессов Наряду с термином «пробиотики» соответствующие препараты и БАДы иногда называют «эубиотиками» или «нормофлорами». СИМБИОЗ Первостепенное значение для создания пробиотиков имеют микроорганизмы-симбионты. Симбиоз: Совместное проживание организмов разных видов (в одной и той же экологической нише). Симбиоз многоклеточных организмов с микроорганизмами возник с момента их появления. Основные формы симбиоза: • Мутуализм – взаимовыгодный симбиоз • Паразитизм – симбиоз, при котором один из организмов получает выгоду в ущерб другому партнёру • Комменсализм - симбиоз, при котором один из организмов получает выгоду без ущерба другому партнёру. • Нейтрализм – совместно проживающие организмы никак не влияют друг на друга. По частоте встречаемости у здоровых людей симбионты делятся на три группы: 1. Облигатные. 2. Факультативные. 3.Транзиторные Наиболее частые бактериальные инфекции и их возбудители Галочкой ( √ ) отмечены микробы, которые встречаются у клинически здоровых людей √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ Возбудители некоторых бактериальных инфекций. Что они собой представляют и как они выглядят. Некоторые из этих бактерий могут находиться в организме клинически здоровых людей. Симбиоз человека с микроорганизмами. Бактерии кожи и слизистых человека БАКТЕРИЯ Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus* Streptococcus mitis Streptococcus salivarius Streptococcus mutans* Enterococcus faecalis* Streptococcus pneumoniae* Streptococcus pyogenes* Neisseria sp. Neisseria meningitidis* Enterobacteriaceae*(E. coli) Proteus sp. Pseudomonas aeruginosa* Haemophilus influenzae* Bacteroides sp.* Bifidobacterium bifidum Lactobacillus sp. Clostridium sp.* Clostridium tetani Corynebacteria Mycobacteria Actinomycetes Spirochetes Mycoplasmas Кожа Конъюнктива глаз ++ + + +/- +/- ++ + +/+/+ Нос Глотка Рот ++ + ++ + ++ ++ ++ + + + + + + + +/+ +/- +/+/- + + +/+ +/- + + ++ +/- ++ + + ++ + +/+ + ++ ++ +/+ +/+ + ++ +/- + +/+ + + + + ++ + Толстый Vagina кишечник + ++ +/- ++ + + ++ + +/+/+ + + + +/- ++ + + ++ ++ ++ ++ +/+ + ++ + Частоты встречаемости: ++ = около 100 %; + = часто (около 25%); +/- = редко (менее 5%) * = потенциальные патогены (условно-патогенные) +/++ + + Состав микрофлоры Состав микрофлоры Микробы у каждого свои Микрофлора (иногда её называют микробиота) индивида зависит от его генотипа и, соответственно, особенностей метаболизма, возраста, характера питания, образа жизни, одежды, общения с животными и другими людьми. Большинство бактерий передаются от человека к человеку через рукопожатия и более близкие контакты: через поцелуи и половым путем. Частота встречаемости разных бактерий на коже 6 субъектов Запахи, исходящие от здорового человека, являются, в основном, результатом жизнедеятельности многочисленной микрофлоры, которая обитает на коже и на слизистых оболочках. Разлагая продукты выделения потовых, сальных и других желез, бактерии кожи и слизистых продуцируют целую гамму веществ, которые и формируют запах тела. Микрофлора кожи и слизистых – это лишь часть единой микрофлоры организма. Ее главная часть (~ 1 кг) обитает в толстом кишечнике. Можно смело утверждать, что бактерии кожи и гениталий – это всего лишь региональные отделы от микрофлоры кишечника. Поэтому, чем будет пахнуть тело и изо рта, определяется состоянием кишечника. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). >1015 клеток, ~1000 видов Число микробных клеток примерно на два порядка превышает численность собственных клеток организма человека. Отношения в этом сообществе имеют филогенетически древнее происхождение и жизненно важны для обеих частей системы макроорганизм-микробиота. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Микрофлору ЖКТ делят на пристеночную и полостную. Пристеночная микрофлора тесно связана с кишечной стенкой, что позволяет их объединять в единый микробно-тканевой комплекс. Это так называемая биоплёнка, состоящая из микроколоний бактерий и продуцируемых ими метаболитов, слизи (муцина), эпителиальных клеток слизистой оболочки, а также клеток стромы слизистой оболочки (фибробласты, лейкоциты и др.) Обильный рост на чашке Петри бактерий из стенки кишечника свидетельствует о многочисленности и многообразии находящегося здесь микробного сообщества. Полостная микрофлора является более изменчивой и зависит от поступления пищевых субстратов, в частности, пищевых волокон, которые являются питательным субстратом и играют роль матрицы, на которой фиксируются и образуют колонии кишечные бактерии. Полостная флора доминирует в фекальной микрофлоре, что заставляет с осторожностью оценивать изменения в различных микробных популяциях, выявляемые при бактериологическом исследовании. Частота выделения и среднее количество основных представителей кишечной микрофлоры в 1 г кала практически здоровых лиц Название микроорганизма Частота обнаружения М±m,% Среднее содержание в 1 г кала M±m, lg Бифидобактерии 98,0±1,0 9,6±0,6 Бактероиды 90,0±3,0 9,2±0,5 Лактобациллы 96,0±1,0 6,9±0,3 100 7,7±0,3 50,0±4,0 6,5±0,4 0 0 Протеи 2,0±0,5 3,4±0,2 Неферментатирующие бактерии, 2,0±0,5 3,9±0,4 0 0 Энтерококки 80,2±2,0 5,6±0,5 Стафилококки, 15,0±3,0 3,2±0,3 0 0 Пептострептококки 55,0±5,0 6,4±0,6 Вейлонеллы 23,0±3,0 4,7±0,7 Клостридии 60,0±4,0 4,8±0,4 Эшерихии, из них лактозоотрицательные гемолитические из них синегнойные палочки из них коагулазоположительные Роль симбионтной микрофлоры ЖКТ в жизнедеятельности организма человека • Обеспечение колонизационной резистентности. • Общая антигенная стимуляция иммунной системы, стимуляция локального иммунитета (секреции IgA). • Обеспечение макроорганизма питательными и биологически активными веществами, в том числе, важными для трофики кишечника короткоцепочечными жирными кислотами (КЖК). • Участие в процессе пищеварения. • Участие в электролитном обмене. • Регуляция метаболизма желчных кислот и холестерина. • Участие в обезвреживании экзогенных и эндогенных вредных субстратов (биосорбция и биотрансформация токсических веществ). • Стимуляция перистальтики кишечника и эвакуации кишечного содержимого. Роль симбионтной микрофлоры была установлена, в частности, в опытах со стерильными животными – гнотобионтами. Некоторые физиологические эффекты низкомолекулярных метаболитов микрофлоры, в частности, короткоцепочечных жирных кислот (КЖК ) Эффект Метаболиты Энергообеспечение эпителия КЖК (уксусная, пропионовая, масляная) Антибактериальный эффект Пропионовая кислота, пропионат Регуляция пролиферации и дифференцировки эпителия Пропионовая кислота, пропионат, масляная кислота, бутират Поставка субстратов глюконеогенеза Пропионовая кислота, пропионат Поставка субстратов липогенеза Ацетат, бутират Блокировка адгезии патогенов к эпителию Пропионовая кислота, пропионат Активация фагоцитоза Формиат Регулировка моторной активности кишечника ГАМК, глутамат, КЖК и их соли Поставка субстратов для синтеза коферментов (пантотената) b-Аланин Усиление местного иммунитета Бутират, масляная кислота Основные группы микроорганизмов-симбионтов ЖКТ 1. Мутуалистические микроорганизмы В основном представлены бифидобактериями и молочнокислыми бактериями (МКБ) – лактобациллами и энтерококками. 2. Условно-патогенные (оппортунистические) и гнилостные микроорганизмы. В основном представлены бактероидами, энтеробактериями, клостридиями, эубактериями, пептококками, пептострептококками, стептококками, стафилококками, дрожжами рода Candida и другими микроорганизмами. Бифидобактерии • Грамположительные, не образующие спор и изогнутые палочки вариабельной формы (с бифуркациями в виде Y и V). • Строго анаэробные (редкие штаммы проявляют толерантность к кислороду) • Сбраживают углеводы, в основном, с образованием молочной и уксусной кислот в молярном соотношении примерно 2:3 и без CO2. • Способны метаболизировать множество олиго- и полисахаридов растительного происхождения, которые не перевариваются пищеварительными ферментами макроорганизма. Бифидобактерии – симбионты человека и животных. Составляют 95% общей популяции бактерий кишечника здорового грудного ребёнка и 330% популяции бактерий кишечника здорового взрослого человека. Постоянный компонент микрофлоры влагалища здоровой женщины. Устойчивость к антибиотикам у бифидобактерий • Природная устойчивость к аминогликозидам*: гентамицину, канамицину, неомицину, стрептомицину; спектиномицину налидиксовой кислоте, полимиксину В, метронидазолу * обусловлена тем, что транспорт этих антибиотиков через цитоплазматическую мембрану связан с системами переноса электронов, которые у анаэробов отсутствуют (Bryan et al.,1979) • Приобретенная устойчивость к макролидам и линкозамидам: эритромицину, спиромицину, олеандомицину, азитромицину, кларитромицин, линкомицину, тетрациклину ванкомицину, фусидовой кислоте, триметроприму, норфлосацину, Mолочнокислые бактерии, МКБ: • Грамположительные, не образующие спор кокковидные или палочковидные бактерии • Анаэробные (обычно аэротолерантные) • Каталазонегативные • Продуцируют молочную кислоту как конечный продукт ферментации Важнейшие семейства: Lactobacillaceae; Streptococcaceae; Pediococcus; Enterococcaceae; Leuconostocaceae. Молочнокислые бактерии в природе встречаются на поверхности растений (например, на листьях, фруктах, овощах, зёрнах), в молоке, наружных и внутренних эпителиальных покровах человека, животных, птиц, рыб (например, в кишечнике, влагалище, на коже, во рту и носу человека). Ауксотрофность бифидобактерий и МКБ – нуждаются в большом количестве готовых органических соединений для роста Потребность в факторах роста штамма дикого типа Lactobacillus casei Исключённая добавка Рост Исключённая добавка + : выраженная стимуляция роста; ± : слабая стимуляция; – : нет стимуляции роста. Рост Полезные свойства МКБ • Консервирующее действие продуцируемых органических кислот, перекиси и бактериоцинов • Улучшение вкуса, аромата, консистенции продуктов • Повышение содержания полезных веществ в продуктах и их усвоения • Положительное влияние на жизнедеятельность и здоровье организма человека и животных Применение МКБ МОЛОЧНАЯ И ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ • • • • • • • • Сыроделие и маслоделие (Lactococcus lactis) Йогурты (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus) Кисломолочные продукты (Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus lactis и др.) Ферментированные колбасы и сосиськи (Lactobacillus plantarum) Хлебопечение (Lactobacillus plantarum и др.) Квашеные овощи (Lactobacillus plantarum и др. Соусы и напитки Консерванты (Lactococcus lactis) МЕДИЦИНА И ДИЕТОЛОГИЯ • Микробные препараты и пробиотики (Lactobacillus acidophilus, L. fermentum, L. plantarum, L. casei и др; Enterococcus faecium) • Ферменты и белки СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО И ВЕТЕРИНАРИЯ • Силосование кормов (L. plantarum и др; Enterococcus sp., Pediococcus sp. и др.) • Микробные препараты(Lactobacillus acidophilus, L. fermentum, L. plantarum, L. casei и др; Enterococcus faecium). Условно-патогенные микроорганизмы Представители семейства Enterobacteriaceae Escherichia Salmonella Citrobacter Hafnia Morganella Providencia Serratia Enterobacter Klebsiella Proteus Вызывают при избыточном размножении и у ослабленных лиц: А также представители родов Bacteroides Eubacteria Streptococcus Staphylococcus Clostridium Дрожжи рода Candida Заболевания ЖКТ заболевания моче-половой системы – пневмонию – менингит – септицемию – – 24 Гнилостные микроорганизмы Гниение – анаэробное разложение белка с разрушением аминокислот Структура белка Структура аминокислот Гнилостные микроорганизмы Процесс гниения вызывают бактерии, у которых имеются ферменты, осуществляющие деградацию аминокислот Бактерии рода: Clostridium Bacteroides Proteus Escherichia Streptococcus Продукты гниения: Аммиак Углекислый газ Сероводород Меркаптаны Метан Амины Индол Фенол Скатол Продукты метаболизма гнилостных бактерий оказывают токсическое воздействие на организм человека. Так, амины, фенолы, крезолы, индол, скатол, а также вторичные желчные кислоты — подавляют кроветворение и деятельность сердечнососудистой системы, а также являются канцерогенами. Аммиак является гепато- и нейро-токсичным ядом. Бифидобактерии и МКБ регулируют численность условно-патогенных и гнилостных микроорганизмов Этот эффект достигается благодаря тому, что бифидобактерии и МКБ: • Продуцируют органические кислоты, в том числе КЖК • Продуцируют перекись водорода и микробный лизоцим (мурамидазу) • Продуцируют антибиотико-подобные вещества (бактериоцины) • Изменяют окислительно-восстановительный потенциал среды • Образуют биоплёнку на поверхности слизистой кишечника • Конкурируют за питательные вещества и за адгезивные рецепторы (осуществляют конкурентное вытеснение) 27 Продукция молочной и уксусной кислот бифидобактериями и лактобациллами ПРОДУКЦИЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА И БАКТЕРИОЦИНОВ Под воздействием фермента каталазы перекись водорода расщепляется на воду и атомарный кислород, который убивает клетки бактерий H2O2 Бактериоцины – один из факторов антимикробной активности МКБ. Это вещества, подавляющие родственные или более широкий круг бактерий. H2O + O Продукция перекиси водорода отобранными штаммами разных видов Lactobacillus Стрелки показывают накопление перекиси: A, L. amylovorus, L. gallinarum, L. acidophilus and L .crispatus; B, L. gasseri; C, L. johnsonii; D, L. delbrueckii. (Girgis and Klaenhammer, 2000). Зоны подавления роста Enterococcus faecalis бактериоцином, продуцируемых Lactobacillus acidophilus. (Barefoot and Klaenhammer, 1983). Продукция бактериоцинов штаммами МКБ, выделенными из кишечника человека Подавление ++ Подавление различных бактерий бесклеточным нейтрализованным супернатантом культур Lасtococcus lactis MM 19 и Pediococccus acidilactici MM33. Стимуляция и модуляция МКБ иммунной системы Dı´az-Ropero et al. Two Lactobacillus strains, isolated from breast milk, differently modulate the immune response (Journal of Applied Microbiology, 2006) Фагоцитарная активность лейкоцитов крови мышей через 4 недели после приёма штаммов Lactobacillus salivarius CECT 5713 и L. fermentum CECT5716, выделенных из грудного молока женщины Продукция цитокинов клетками селезёнки мышей, получавших бактерии Продукция цитокинов макрофагами костного мозга крыс, инкубированных с Lactobacillus fermentum CECT5716 (черные столбики), Lactobacillus salivarius CECT5713 (серые столбики) и без бактерий (белые столбики) a) b) Без стимуляции макрофагов; При стимуляции LPS (10 ng/ml) Дисбиоз (дисбактериоз) Дисбиоз (дисбактериоз) кишечника - изменение численного и видового состава микрофлоры кишечника, обычно сопровождающееся уменьшением численности бифидобактерий и МКБ, возрастанием численности условнопатогенных и гнилостных микроорганизмов, а также транслокацией их в другие органы и ткани. 400 лет до н.э. знаменитый греческий врач Гиппократ писал: «Смерть сидит в кишечнике; плохое пищеварение – источник всех зол» Изменение показателей бактериального исследования копрокультуры при различных фазах дисбактериоза № Микроорганизмы Норма I фаза 1 Патогенные микробы 2 Дисбактериоз II III фаза фаза IV фаза 0 0 0 0 0 Общее количество кишечной палочки 107–108 108–109 109 109–1010 >1010 3 Гемолизирующая кишечная палочка до 10% 10–15% 15–20% 20–30% >30% 4 Др. условнопатогенные энтеробактерии 104–105 105–106 106–107 107–108 >109 5 Энтерококки 106–108 106–107 105–106 104–105 <103 6 Стафилококки 0–104 0–104 0–105 105–106 >106 7 Микробы рода протея 0–103 0–103 0–105 105–106 >106 8 Грибы рода кандида 0–104 0–104 0–104 104–105 >105 9 Клостридии 0–105 0–105 0–105 105–106 >106 10 Лактобациллы 106–108 106–107 105–106 104–105 <104 11 Бифидобактерии >108 107–108 105–106 103–104 <103 Клинические проявления дисбактериоза кишечника 1. Симптомы со стороны ЖКТ - Снижение или отсутствие аппетита. - Тошнота. - Рвота. - Металлический привкус во рту. - Боль в животе (тупая или схваткообразная) самостоятельная и при пальпации. - Отрыжка. - Аэрофагия. - Метеоризм. - Урчание, вздутие живота. - Чувство неполного опрожнения кишечника. - Императивные позывы на дефекацию. - Запор. - Понос. - Чередование запора и поноса. Каловые массы: - в виде пробкообразного стула (кашицеобразный или жидкий кал с твердой первой порцией его, иногда с примесью слизи, - овечий кал (при запоре) с примесью слизи, гнилостный или кислый запах каловых масс. 2. Гиповитаминоз. -Заеды. - Сухость кожи и слизистых. 3. Аллергический синдром. - Зуд кожи и слизистых. - Аллергические высыпания на коже. 4. Общие симптомы. - Утомляемость. - Слабость. - Головные боли. - Нарушение сна. Клинические проявления дисбактериоза кишечника Многие заболевания, причины которых до сих пор не установлены, могут быть связаны с дисбактериозом. Диаграмма и таблица изменений численности части микрофлоры кишечника, типичных для себорейного дерматита (себореи). Причины дисбиоза (дисбактериоза) Поступление в ЖКТ веществ с антибактериальной активностью -Антибиотики -Консерванты -Гербициды и пестициды Несбалансированное питание - Дефицит белков, углеводов - Дефицит витаминов - Дефицит микроэлементов Изменение гормонального статуса - Возрастные изменения - Беременность - Стрессы Нарушение переваривания и всасывания пищи. - Заболевания, сопровождающиеся этой патологией, создают условия, неблагоприятные для существования кишечных микроорганизмов. - В свою очередь, дисбактериоз усугубляет нарушение переваривания и всасывания пищи. Возникает порочный круг. Фрукты и овощи – источники углеводов, витаминов и микроэлементов для человека и его симбионтов Диарея, связанная с применением антибиотиков Частота ассоциированной с антибиотиками диарреи у детей Препарат и Частота Возрастные изменения микрофлоры ЖКТ С возрастом заметно снижается численность бифидобактерий, и растёт количество клостридий. Feces 50-дневного ребёнка Feces 33-летней женщины Feces 66-летнего мужчины Образующиеся при стрессах катехоламины индуцируют рост и вирулентность патогенных и условно-патогенных бактерий Схема синтеза катехоламинов Бактерии Рост Вирулентность Пробиотики предупреждают и лечат дисбактериоз Микроорганизмы, которые чаще всего используются для получения пробиотиков (в рамках – симбионты). Лактобациллы: Энтерококки Бифидобактерии L. acidophilus L. casei L. fermentum L. gasseri L. johnsonii L. lactis L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus L. Salivarius L. bulgaricus E. faecium E. faecalis B. bifidum B. breve B. lactis B. longum B. adolescentis B. infantis Другие МКБ Lactococcus spp. Leuconostoc spp. Pediococcus spp. Энтеробактерии Escherichia coli M17 Дрожжи Sacharomyces boulardii S.cerevisiae Бациллы B. cereus IP B. coagulans B. subtilis B. licheniformis Стрептококки S. thermophilus Микроорганизмы, не являющиеся симбионтами, оказывают положительный эффект и быстро самоэлиминируются. Наиболее распространенные штаммы лактобацилл и бифидобактерий, используемые для производства пробиотиков и продуктов функционального питания Культуры, используемые за рубежом ШТАММ Фирма-производитель L. acidophilus NCFM Rhodia Inc. Lactobacillus acidophilus 100аш; NK1; K3Ш24; Ер317/402 L. acidophilus SBT-2062 Snow Brand Milk Products Lactobacillus fermentum 90-TC-4 L. acidophilus LA-1/ LA-5 Chr. Hansen Lactobacillus plantarum 8РA-3 L .casei Shirota Yakult Bifidobacterium bifidum 1; 791; ЛВА-3 L. casei Immunitas Danone Bifidobacterium longum B379M L. fermentum RC-14 Urex Biotech L. johnsonii La 1/Lj1 Nestle L. paracasei CRL 431 Chr.Hansen L. plantarum Probi AB L. reuteri SD 2112/MM2 Biogai L. rhamnosus GG Valio L. rhamnosus GR-1 Urex Biotech L. rhamnosus 271 Probi AB L. lactis L 1A Probi AB B. animalis Danone B. lactis B6-12 Chr. Hansen B. longum BB 536 Morinaga Milk Industry B. longum SBT- 2928 Snow Brand Milk Products B. breve Yakult Штаммы, используемые в России Bifidobacterium breve 79119; 79-88 Bifidobacterium infantis Г 73-15; 79-43 Bifidobacterium adolescentis 7513; MC-42; Г013 Требования к пробиотическим штаммам I. Безопасность • Симбионты должны быть выделены из организма здорового человека • Должны быть идентифицированы по фено- и генотипическим признакам и иметь генетический паспорт • Не должны обладать патогенностью и токсигенностью, и не вызывать побочных эффектов при длительном применении • Должны быть иммунологически безопасными • Не должны угнетать собственные мутуалистические бактерии • Не должны содержать мобилизуемые гены резистентности к антибиотикам Требования к пробиотическим штаммам II. Биологическая активность • Должны обладать способностью к выживанию и размножению в условиях кишечного микроокружения (например: быть резистентными к низким значениям pH и органическим кислотам, к высокому содержанию желчи, солей натрия) • Должны обладать широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов • Должны быть способны к колонизации кишечника • Должны быть способны к адгезии к кишечному эпителию • Должны обеспечивать благотворное воздействие на организм человека, доказанное при клинических испытаниях Требования к пробиотическим штаммам III. Технологичность в производстве и при хранении • Должны быть способны к эффективному росту (высокая скорость роста и достижение высокого титра) в питательных средах при культивировании в ферментерах. • Должны сохранять жизнеспособность при процедурах, связанных с лиофилизацией (замораживание и высушивание) или с другими методами приготовления конечной лекарственной формы. • Должны сохранять жизнеспособность и быстро восстанавливать метаболическую активность после хранения. IV. Должны быть депонированы в Национальной или Международной коллекции Основные этапы получения препаратов пробиотиков. 1. Проверка штаммов на стерильность и соответствие паспортным характеристикам. 2. Приготовление посевного материала. 3. Ферментация - культивирование в ферментёре в условиях, оптимальных для роста бактерий. 4. Отделение клеточной массы от культуральной жидкости. 5. Высушивание (лиофилизация) в присутствии криопротекторов и ксеропротекторов. 6. Получение лекарственной формы препарата: (лифильно высушенный препарат в ампулах, флаконах, пакетах, желатиновых капсулах, таблетках или свечах). В России сегодня производят и жидкие препараты пробиотиков, т.е. непосредственно полученную ферментацией культуральную жидкость, в которую могут быть введены и дополнительные компоненты. Питательные среды, крио- и ксеропротекторы Компоненты питательных сред для пробиотических бактерий должны быть абсолютно безвредными для человека. Питательные среды для бифидобактерий и молочнокислых бактерий, которые являются полиауксотрофами, т.е. нуждаются для роста в большом числе готовых аминокислот, витаминов, пиримидинов и пуринов, которые они сами не синтезируют, должны быть обогащены соответствующими веществами. Обычно питательные среды содержат: • Ферментативные гидролизаты казеина • Дрожжевой экстракт • Глюкоза или лактоза • Микроэлементы (высокоочищенные соли магния, кальция, марганца, железа, цинка, кобальта). В процессе лиофилизации в качестве криопротекторов и ксеропротекторов используют белок-содержащие субстраты (желатин обезжиренное молоко и др.) и углеводы (лактозу, сахарозу и др.) Cохранение биологических свойств пробиотических штаммов ПОЛУЧАЮТ КАКПСУЛЫ И ТАБЛЕТКИ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ВЫЖИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЖЕЛУДКЕ И ДУОДЕНУМ Выживаемость, % Выживание бактерий без защитного слоя Защитный олигосахаридный слой Защитный слой из белков сои Время, мин Выживание бактерий с защитным слоем Выживаемость, % Пробиотические бактерии Время, мин Препараты пробиотиков хранят в холодильнике при Т 4 - 6° С Колонии бактерий маркированного штамма-пробиотика в фекалиях, % Судьба пробиотических штаммов в ЖКТ Пробиотик применяется Пробиотик не применяется Время, дни В большинстве случаев бактерии штамма-пробиотика лишь временно находятся в ЖКТ Препараты пробиотиков осуществляют так называемую «заместительную терапию» дисбактериоза, компенсируя дефицит собственных лактобацилл и бифидобактерий и способствуя восстановлению их численности. В большинстве случаев штаммыпробиотики действуют только во время курса лечения и в кале обнаруживаются лишь в течение 3–7 дней после его окончания. Поэтому для достижения устойчивого терапевтического эффекта необходим длительный или повторный их прием. Судьба пробиотических штаммов в ЖКТ Недавно российские учёные представили данные о том, что пробиотические микроорганизмы многих сертифицированных препаратов гибнут, преодолевая естественные барьеры ЖКТ, и до толстой кишки доходит лишь очень незначительная доля от их исходной численности. В первую очередь это относится к микроорганизмам, не защищённым специальными покрытиями. Но и капсулы не всегда предупреждают значительное снижение их выживаемости. В связи с этим в настоящее время большое значение придаётся пребиотикам, которые применяются в сочетании с пробиотиками или самостоятельно. Пребиотики Пребиотики - это вещества которые стимулируют рост и жизнедеятельность полезной микрофлоры ЖКТ. К пребиотикам в первую очередь относятся углеводы (лактулоза, инулин, фрукто-, галакто-олигосахариды и др.), которые обладают одновременно двумя важными свойствами: 1. Не перевариваются и не всасываются в верхних отделах пищеварительного тракта; 2. Селективно ферментируются микрофлорой толстой кишки, вызывая активный рост бифидобактерий и лактобацилл. Однако способностью стимулировать рост и жизнедеятельность симбионтной микрофлоры, обладает большое число соединений, которые не в полной мере отвечают этим критериям, в частности, перевариваемости, абсорбируемости, селективности. Эти соединения некоторые исследователи также относят к пребиотикам. Пребиотики На основании способности стимулировать рост и активность полезной микрофлоры ЖКТ, к пребиотикам относят следующие соединения: - ди- и олигосахариды (лактулёза, лактоза, раффиноза, ксилобиоза, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды и др.); - полисахариды (пектины, декстрин, инулин и др.); - полиспирты (ксилит, сорбит, и др.); - пептиды (соевые, молочные и др.); - ферменты (лизоцим, протеазы сахаромицетов, b-галактозидазы). - аминокислоты (валин, аргинин, глутаминовая ксилота); - витамины (А, С, Е, парааминобензойная кислота, каротиноиды); - ненасыщенные жирные кислоты (эйкозопентаеновая кислота и др.); - органические кислоты (уксусная, пропионовая, лимонная и др.); - микробные и растительные и экстракты (дрожжевой, экстракты различных водорослей, морковный, картофельный, тыквенный и др.); - другие соединения (лецитин, лактоферрин, лектины, глутатион). Пребиотики Наиболее изученным и популярным пребиотиком в мире является лактулоза (40-β-D-галактопиранозил-D-фруктоза). Её считают «бифидогенным фактором № 1». Лактулозу получают из молочного сахара – лактозы методом химической модификации. Она представляет собой белое кристаллическое вещество без запаха, сладкое на вкус, хорошо растворимое в воде. Препараты лактулозы: «Лактусан», «Дюфалак», «Нормазе» и др. С чем связана эффективность лактулозы как пребиотика: • В организме человека нет ферментов бетагликозидаз, способных расщеплять лактулозу • Лактулоза проходит транзитом в толстый кишечник, где используется его полезной микрофлорой как источник энергии и углерода. • Это способствует увеличению численности бифидобактерий и лактобацилл. • В результате метаболизма ими лактулозы в толстом кишечнике накапливаются молочная, масляная, уксусная и другие жирные кислоты • В результате этого подавляется гнилостная и патогенная микрофлора и обеспечивается трофика кишечного эпителия. В России на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов (рафтилина и рафтилозы) растительного происхождения разработан пребиотик Стимбифид . ПРОБИОТИКИ Биопрепараты (эубиотики) лекарственные средства, используемые в медицине Биологически активные добавки (БАДы) Молочные и другие продукты Лекарственные средства, используемые в ветеринарии Не все следуют рекомендациям Всемирной Гастроэнтерологической Организации не использовать термин «пробиотик» для продуктов, не имеющих четко описанных характеристик или не прошедших обстоятельного контролируемого исследования на пациентах. Между тем имеются документированные данные о неспособности некоторых препаратов и БАДов подтвердить утверждения о количестве и типе микроорганизмов, содержащихся в них, и о количестве этого продукта, необходимом для терапевтического эффекта. Классификация пробиотиков по составу препарата • монокомпонентные пробиотики содержат только один вид микроорганизмов. Например, "Бифидумбактерин" – бифидобактерии, "Лактобактерин" – лактобациллы, "Колибактерин" – кишечная палочка. • поликомпонентные пробиотики включают несколько видов микроорганизмов. Например, "Бифиформ", "Бификол", "Линекс” • комбинированные пробиотики (синбиотики) - "два в одном" - содержат пробиотики, пребиотики или другие факторы. Например, "Бифилиз", "Бактистатин", "Примадофилиус", "Полибактерин, “Биофлор” и др. • генетически модифицированные пробиотики - содержат бактерии в которые введены полезные чужеродные гены, придающие новые свойства. Например, препарат "Субалин" содержит бациллы, синтезирующие интерферон. по состоянию микроорганизмов в препарате • сухие пробиотики содержат лиофильно высушенные микроорганизмы. Такими являются большинство препаратов. Например, "Бифидумбактерин сухой« и т.д. • жидкие пробиотики представляют собой бактерии с ферментационной средой, в которой они культивировались. Например, «Бифидум БАГ», “Биофлор” и др. •сорбированные пробиотики содержат микроорганизмы, иммобилизованые на каком-либо носителе. Например "Бифидумбактерин форте", «Флорин форте», «Экофлор». Пробиотики – биопрепараты и БАДы Препараты отечественные БАДы зарубежные отечественные зарубежные Монокомпонентные Бифидумбактерин Бифидумбактерин форте Пробифор Лактобактерин Биобактон Колибактерин Бифидоген Эугалан Гастрофарм Бифидумбактерин 1000 Жидкий бифидумбактерин Биобактон Нарине Соя лактум Биовестин Вайтадофилюс Поликомпонентные Бифилонг Ацилакт Бифацид Бификол Бифиформ Линекс Нормофлорин LB Эуфлорин LB LB – комплекс Полибактерин Нормоспектрум Экофлор Биовестин - лакто Примадофилюс Флорадофилюс Пробиотикс Ацидофилис Пробиотики–самоэлиминирующиеся антагонисты Споробактерин Бактиспорин Биоспорин Бактисубтил Флонивин В Энтерол - Лактофайбер Лактоспора ЭнричПро -Бионикс Комбинированные пробиотики (синбиотики) Бифилиз Биофлор Бифиформ Ламинолакт Бифистим Кипацид Бифиформ комплекс Монокомпонентные пробиотики Содержат один вид пробиотического микроорганизма Поликомпонентные пробиотики Содержат два и более различных штаммов или видов микроорганизмов Препараты пребиотиков Молочнокислые и другие продукты, содержащие пробиотические бактерии Большой выбор таких продуктов. Но все ли они действительно эффективны? На этикетке продукта должно быть указано название пробиотических бактерий и их численность в 1 г продукта к концу срока годности. Выбор препаратов при дисбиозе Применение пробиотиков • Для профилактики дисбактериозов и ускорения формирования состава микрофлоры у детей, в том числе, недоношенных. • Для профилактики дисбактериозов у взрослых, лиц преклонного возраста и стариков. • В комплексной терапии ОКИ (дизентерия, коли-инфекция, сальмонеллез, кампилобактериоз, стафилококковый энтероколит, ротавирусная инфекция), диареи невыясненной этиологии, а также вызванных Clostridium difficile и др. у детей и взрослых. • При хронические воспалительные заболевания толстой и тонкой кишок (колиты, в том числе связанные с приемом антибиотиков, болезнь Крона, синдром раздраженной толстой кишки, синдром мальабсорбции). • При панкреатите, холецистите, хронических заболеваниях печени и желчевыводящих путей. • При гастритах, гастродуоденитах, панкреатитах, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. • Перед и после операций на кишечнике, печени, поджелудочной железе. Применение пробиотиков • При подготовке к плановым гинекологическим операциям. • В комплексном лечении больных нематодозами. • При аллергических заболеваниях (бронхиальная астма, экзема, нейродермиты, атопические дерматиты). • При дисбиозах вагины, включая, вагиниты, кольпиты, эндоцервициты различной этиологии. • В предродовой подготовке беременных групп риска, связанного с инфекционными осложнениями, а также страдающих вагинозами. • При сахарном диабете • При гипертоническая болезнь • При гиперхолестеринемия • При гипероксалурия Способы применения пробиотиков Способ применения и дозы зависят от лекарственной формы пробиотика и характера заболевания Перорально: Капсулы, таблетки и жидкие формы пробиотиков, принимают за 30 минут до еды, запивая небольшим количеством воды 1-3 раза в день Ректально: Свечи вводят в прямую кишку, на ночь. Жидкие формы, а также лиофилизированные препараты разводят в кипячёной воде и вводят микроклизмой. Вагинально: Свечи вводят во влагалище на ночь. Жидкие формы обычно наносят на поверхность тампона, пропитанного тёплой кипячёной водой и вводят во влагалище на 4-8 часов или применяют в виде микроспинцеваний 1 раз в день, разбавив препарат водой или физраствором. Рекомендуемый курс лечения – от 10 дней до месяца. Применение пробитиков Профилактика детских инфекций и диареи у новорожденных должна начинаться до того, как ребёнок появился на свет. Ребенок, проходя по естественным родовым путям, уже в момент рождения получает «родных представителей микрофлоры матери» Первые микроорганизмы попадают в стерильный ЖКТ новорожденного от матери Состав микроорганизмов переходного стула новорожденного (3 суток) в точности совпадает с вагинальной микрофлорой матери Грудное вскармливание – важнейшее условие здоровья новорожденного. Грудное молоко содержит культуры пробиотических бактерий и пребиотики. Бактерии, обнаруженные в грудном молоке Род Основные виды Staphylococcus spp. S. epidermidis S. hominis S. capitis Streptococcus spp. S. salivarius S. mitis S. parasanguis Lactobacillus spp. L. gasseri L. rhamnosus L. acidophilus L. plantarum L. fermentum L. salivarius L. reuteri Enterococcus sp. E. faecium E. faecalis Bifidobacterium sp. B. bifidum B. infantis Пребиотики грудного молока: лактоза и олигосахариды Применение пробиотиков и пребиотиков у новорожденных У части детей самого раннего возраста применение пробиотиков может Суммарная частота, % приводить к нежелательным эффектам. Поэтому для нормализации микрофлоры кишечника ряд авторов рекомендует назначать таким детям только пребиотики. Раннее применение пребиотиков снижает у новорожденных частоту аллергий, связанных с дисбиотическими нарушениями. Ребёнок с атопическим дерматитом Влияние применения галактоолигосахаридов (GOS) и фруктоолигосахаридов (FOS) в первые 6 месяцев жизни ребёнка на частоту аллергических заболеваний. Пробиотики могут оказать хороший эффект при запорах «Если вы не хотите до конца дней своих сидеть в туалете, принимайте пробиотики» (Современная реклама) Микробные препараты на основе генно-инженерных и генетически модифицированных штаммов Генно-инженерные штаммы – это штаммы, полученные с помощью методов генетической инженерии. Генетически модифицированные штаммы – это организмы (ГМО), несущие чужеродные гены. • Методы генетики и генетической инженерии применяются для создания на основе МКБ и бифидобактерий штаммов, у которых усилены исходные полезные признаки (синтез перекиси, бактериоцинов, витаминов, аминокислот, гидролитических ферментов и пр.) • За счёт введения чужеродных генов могут быть получены штаммы с новыми, необычными признаками, а также живые вакцины. В совокупности эти методы позволят использовать пробиотики не только для нормализации симбионтной микрофлоры, но также для её оптимизации и профилактики различных инфекций и онкологических заболеваний. Требования к ГМО-штаммам: • Должно быть установлена их биобезопасность, отсутствие передачи рекомбинантных генов «новым хозяевам», возможность их широкого распространения и вероятного нарушения микробной экосистемы. • Клонированные гены должны быть интегрированы в хромосому, не иметь R-маркеров. • Рекомбинантные бактерии должны стабильно экспрессировать целевые антигены при многократном культивировании и длительном применении штаммов лабораторным животным. Оптимизация симбионтной микрофлоры методом «замещающей терапии» Бактерии полости рта и кариес С бактериями-симбионтами полости рта связан зубной кариес. В этиологии кариеса ведущую роль играют стрептококки группы Streptococcus mutans. Они способны прочно прикрепляться к гладкой поверхности зубов и формировать кариесогенные бляшки. Это свойство опосредуется синтезом полимеров из сахарозы, которая поступает с пищей. Ферменты глюкозилтрансфераза и фруктозилтрансфераза S. mutans расщепляет сахарозу на фруктозу и глюкозу и одновременно осуществляет синтез глюкановых и фруктановых полимеров. Образующийся при этом нерастворимые и клейкие глюкан и фруктан играет ключевую роль в прикреплении и агрегации S. mutans и в формировании зубных бляшек. Они вызывают межклеточную агрегацию как самого S. mutans, так и других видов бактерий, колонизирующих бляшки (Neisseria, Nocardia, Actinomyces viscosus, Candida). Выделяемая S. mutans молочная кислота вызывает деминерализацию эмали. Streptococcus mutans передаётся при поцелуях Оптимизация симбионтной микрофлоры методом «замещающей терапии» «Вакцина» для замещающей терапии против кариеса Д-р Джефрей Хиллман ( Jeffrey D. Hillman, University of Florida, USA) создал генетически модифицированый штамм Streptococcus mutans BCS3-L1. Новый штамм не продуцирует молочную кислоту, т.к. у него ген лактатдегидрогеназы заменён на ген алкогольдегидрогеназы из Zymomonas mobilis. Кроме того, штамм продуцирует бактериоцин, - лантибиотик MU1140. После заселения ротовой полости крысы штаммом BCS3-L1 он, благодаря продукции бактериоцина, вытесняет исходный («дикий») штамм S. mutans. В результате такого рода «замещающей терапии» у животного не развивается кариес. Вверху: Зубы крысы, заселённые диким штаммом S. mutans, (характерным и для человека). Внизу: Зубы крысы, заселённые штаммом S. mutans BCS3-L1, не продуцирующим молочную кислоту. “If there was a market for preventing cavities in rats, I’d be a millionaire,” Hillman says. Первый коммерческий пробиотик на основе ГМО-штамма для «замещающей терапии» против кариеса Dr. Jeffrey Hillman Исследования д-ра Хиллмана завешились в 2000 г. публикацией статьи в журнале «Infection and Immunity», в которой он доказал эффективность и безопасность полученного штамма в опытах на крысах. Однако прошло еще 8 лет, в течение которых были проведены клинические испытания, подтвердившие эти результаты на людях. Вслед за этим была организована фирма «Oragenics», которая планирует выпускать препарат, содержащий штамм Streptococcus mutans BCS3-L1, на применение которого получено разрешение Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (U.S. FDA). А пока она выпускает препарат, получивший название EvoraPlus, cодержащий 3 штамма стрептококков (не ГМО), продуцирующих перекись водорода для профилактики кариеса у взрослых и детей. Препараты Evora plus и Evora kids на основе штаммов Streptococcus (S. oralis KJ3™; S. uberisKJ2™; S. rattus JH145), разрешённый к применению в США.
