Михайлина А.О.
advertisement
Получение домена I рибосомного белка L1 археи Haloarcula marismortui Михайлина А.О., Костарева О.С. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН, Пущино, Россия alisamikhaylina15@gmail.com Определение структуры изолированного L1-выступа, содержащего рибосомный белок L1 (HmaL1) и спирали 76-78 23S рРНК, позволит уточнить модель большой рибосомной субчастицы H. marismortui. Ранее нами были получены препараты белка L1 и L1-связывающего фрагмента 23S рРНК из археи H. marismortui, и методом аналитического ультрацентрифугирования показано, что белок и рРНК образуют комплекс в буфере, содержащем 3М KCl, что приблизительно соответствует условиям существования археи. Однако в нормальных солевых условиях нам не удалось получить комплекс белка со специфическим фрагментом рРНК H. marismortui. В отличие от определенных нами ранее структур этого белка из бактерий и архей, которые относятся к белкам, имеющим изоточку в щелочной области рН, около четверти аминокислотной последовательности HmaL1 составляют остатки аспаргиновой и глутаминовой аминокислот. В целом белок обладает значительным отрицательным зарядом, что должно затруднить его взаимодействие с отрицательно заряженной рРНК в обычных условиях. Особенно большой отрицательный заряд несет второй домен; доля аспаргиновой и глутаминовой аминокислот в его последовательности превышает 30%. Мы предполагаем, что, как и в случае бактериальных белков, домен I белка L1 археи H. marismortui достаточен для узнавания и связывания РНК. Недавно была получена генетическая конструкция на основе плазмиды pET-11a, несущая ген домена I белка HmaL1. Для получения штамма-суперпродуцента использовали систему Штудиера. Поскольку ген белка HmaL1 содержит кодоны для Gly, Arg и Ile редкие в E.coli, клетки штамма BL21(DE3) предварительно трансформировали плазмидой Rosetta, которая несет гены тРНК, узнающих редкие кодоны. Несмотря на то, что H. marismortui не является термофильным организмом было показано, что домен I белка L1 не денатурирует при температуре до 75°С. Белок выделен и очищен с помощью стадии прогрева лизата при 75°С, хроматографии на ButylSepharose и гель-фильтрации на Superdex 75. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 14-04-00414_а) и Программы МКБ РАН.
