На правах рукописи КОРОБЕЙНИКОВА АННА ВАСИЛЬЕВНА
реклама
На правах рукописи КОРОБЕЙНИКОВА АННА ВАСИЛЬЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ L5 И L25 В ФОРМИРОВАНИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-АКТИВНОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РИБОСОМЫ 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте белка РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Гарбер Мария Борисовна Официальные оппоненты: кандидат биологических наук Асеев Виктор Васильевич доктор химических наук Сергиев Петр Владимирович Ведущая организация: Филиал Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Защита состоится «24» июня 2011 года в ___ часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд.536. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан «___» мая 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Синтез белка на рибосоме – важнейший из клеточных процессов. Уникальная структурная организация и функционирование рибосомы базируется на специфических взаимодействиях РНК и белков. В связи с этим, в рамках проблемы биосинтеза белка одной из приоритетных задач является выяснение роли отдельных компонентов рибосомы и их межмолекулярных контактов в формировании функционально-активной рибосомы. За почти полвека исследований накоплено много детальной информации о структуре рибосомы и ее компонентов, однако о принципах специфического взаимодействия РНК и белков в рибосоме до сих пор известно немного. Кроме того, большая часть имеющихся на сегодняшний день данных получена в экспериментах in vitro, которые далеко не всегда могут адекватно отражать процессы, происходящие в клетке. Поэтому изучение роли отдельных рибосомных белков в формировании и функционировании рибосомы, особенно в системе in vivo, является сегодня весьма актуальным. Цель работы: исследование роли межмолекулярных контактов рибосомных 5S рРНК-связывающих белков L5 и L25 в сборке и функционировании рибосомы Escherichia coli. Основные задачи работы: – исследовать особенности специфического взаимодействия рибосомного белка L25 E. coli и его гомологов (белков семейства СТС) с изолированной 5S рРНК, – выяснить, необходимо ли взаимодействие белка L25 с 5S рРНК для его встраивания в рибосому in vivo, – проверить, какой эффект оказывает отсутствие рибосомного белка L5 в клетках E. coli на сборку in vivo большой рибосомной субчастицы, – выяснить важность контакта с тРНК петли β2-β3 белка L5 для работы бактериального аппарата трансляции. Научная новизна и практическая ценность работы. Проведено комплексное исследование специфического взаимодействия рибосомного белка L25 E. coli и его гомологов (белков семейства СТС) с 5S рРНК. Установлено, что все пять аминокислотных остатков 5S рРНК-связывающего модуля этих белков играют ключевую роль в стабилизации уже сформированного комплекса с изолированной РНК. Доказано, что изменения, обнаруженные в белке СТС и 5S рРНК некоторых бактерий, имеют компенсаторный характер и направлены на сохранение этими молекулами способности формировать стабильный комплекс. Впервые получены данные, свидетельствующие о том, что формирование прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК, не являясь обязательным условием для встраивания этого белка в рибосому in vivo, необходимо для его удержания в ней. Присутствие белка L25 в рибосоме приводит к увеличению стабильности ассоциации рибосомных субчастиц. Учитывая то, что белки семейства СТС являются особенностью бактериального аппарата трансляции, полученные в работе результаты могут иметь практическую ценность в разработке новых бактериостатических агентов. В данной 4 работе впервые продемонстрировано, что рибосомный белок L5 E. coli строго необходим для встраивания 5S рРНК-белкового комплекса, а также белков L16, L27, L30 и L33 в большую субчастицу рибосомы in vivo. Показано, что укорочение петли β2-β3 белка L5, контактирующей с тРНК в Р-участке рибосомы, приводит к снижению белок-синтезирующей активности рибосом и, как следствие, к замедлению роста клеток E. coli. Полученные в ходе выполнения работы штаммы E. coli и генетические конструкции могут быть использованы для дальнейших детальных исследований аппарата трансляции этой бактерии. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют рисунков и таблиц. Общий объем диссертации страниц. Библиография включает названий. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты данной работы неоднократно докладывались на российских и международных конференциях. Определенная в работе последовательность участка ДНК Aquifex aeolicus была депонирована в GenBank (Accession number EU851040). РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 5S рРНК является неотъемлемым компонентом рибосом всех ныне живущих организмов. С одной стороны, эта рибосомная РНК расположена в непосредственной близости от функциональных центров рибосомы, но не принимает прямого участия в их работе. С другой стороны, большая субчастица рибосомы, реконструированная in vitro в отсутствие 5S рРНК, функционально неактивна. В связи с этим, уже более сорока лет актуален вопрос, что же делает эта РНК в рибосоме. 5S рРНК специфически взаимодействует с несколькими рибосомными белками (например, в E. coli – это L5, L18 и L25). Литературные данные указывают на то, что именно эти белки в значительной степени определяют уникальное положение этой РНК в рибосоме (для обзора см. Гонгадзе и др., 2008, Успехи Биолог. Химии, 48, 105-132). Несколько лет назад в нашей лаборатории было показано, что нокаут гена рибосомного белка L5 или L18 летален для клеток E. coli (Korepanov et al., 2007, J. Mol. Biol., 366, 11991208). В то же время, без рибосомного белка L25 клетки выживали, но росли медленнее клеток исходного штамма, а ΔL25 рибосомы отличались сниженной эффективностью в биосинтезе белка. Все это свидетельствует о важности 5S рРНКсвязывающих белков для работы рибосомы. Однако конкретная роль этих белков в формировании рибосомы в клетке оставалась невыясненной. В связи с этим, в рамках данной работы были проведены исследования, посвященные выяснению роли рибосомных белков L5 и L25 в сборке и функционировании рибосомы E. coli. 5 1. Изучение специфического взаимодействия рибосомного белка L25 Escherichia coli и его гомологов (белков семейства СТС) с 5S рРНК 1.1. Белок СТС Aquifex aeolicus не является исключением среди белков семейства Рибосомные белки L25 Escherichia coli и TL5 Thermus thermophilus принадлежат к семейству белков СТС, представители которого обнаружены только в бактериях (для обзора см. Гонгадзе и др., 2008). Данное семейство получило название по первому описанному представителю – основному стрессовому белку СТС (catabolite controlled) Bacillus subtilis. Белок СТС B. subtilis вырабатывается клеткой в ответ на различные типы стресса и при этом обнаруживается в рибосомной фракции клеток. Все изученные белки семейства СТС объединяет одно свойство – они способны специфически связываться с рибосомной 5S РНК. На сегодняшний день семейство белков СТС насчитывает более трехсот представителей, и все они содержат в N-концевой части молекулы так называемый «5S рРНК-связывающий домен», соразмерный и гомологичный рибосомному белку L25 E. coli. Единственным исключением можно было считать белок СТС из гипертермофильной бактерии Aquifex aeolicus. В геноме этой бактерии, представленном в банке данных, ген ctc Рис. 1. Нуклеотидная последовательность участка ДНК A. aeolicus, определенная в данной работе. Нумерация нуклеотидов приведена в соответствии с их положением в геноме (Accession number AE000657). Пропущенный нуклеотид (С228501) отмечен белым символом на черном фоне. Стартовые кодоны для укороченного и полноразмерного гена ctc обозначены пунктирной и сплошной рамками, соответственно. Под нуклеотидными последовательностями приведены аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемых соответствующими ОРС. Они расположены на разных строках для того, чтобы показать сдвиг рамки считывания соответствующей ОРС. Возможный сайт связывания рибосомы подчеркнут. 6 кодировал белок, лишенный первых пятидесяти остатков 5S рРНК-связывающего домена. Такой полипептид был не способен связываться с 5S рРНК (Корепанов и др., 2004, Биохимия, 69, 749-754). Мы решили прояснить вопрос об исключительности белка СТС A. aeolicus среди белков данного семейства. Участок генома A. aeolicus, содержащий ген ctc, был нами проанализирован. Открытая рамка считывания (ОРС) гена, депонированного в банке данных как ген ctc, начиналась с довольно редкого стартового кодона TTG (Рис. 1). Мы обнаружили дополнительную короткую ОРС. Эта ОРС кодировала полипептид, который обладал гомологией с N-концевой частью 5S рРНК-связывающего домена белков СТС. Однако две эти ОРС находились в разных рамках считывания. Данную ситуацию можно было объяснить либо мутацией в гене ctc, которая привела к кодированию дефектного белка, либо ошибкой при прочтении генома. Соответствующий участок (~700 нуклеотидов) хромосомной ДНК A. aeolicus был нами амплифицирован и секвенирован (Рис. 1). Оказалось, что действительно один нуклеотид (С в положении 228501) был пропущен ранее при прочтении генома. Присутствие этого нуклеотида восстанавливает общую рамку для обеих указанных выше ОРС. В результате этих изменений новая ОРС (ген ctc) кодирует белок в 202 аминокислотных остатка. Такой белок содержит полноразмерный 5S рРНКсвязывающий домен, гомологичный соответствующим участкам рибосомных белков L25 E. coli и TL5 T. thermophilus. Определенная в работе последовательность участка ДНК A. aeolicus депонирована в GenBank (Accession number EU851040). Полноразмерный белок СТС A. aeolicus был выделен, и его РНК-связывающие свойства были исследованы. Как видно на рисунке 2, в отличие от укороченного белка (дорожки 3 и 8), полноразмерный белок СТС формирует стабильный комплекс как с 5S рРНК A. aeolicus, так и с другими бактериальными 5S рРНК (дорожки 2, 5 и Рис. 2. Электрофоретический анализ РНК-связывающих свойств полноразмерного белка СТС A. aeolicus (12%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). 1. 5S рРНК A. aeolicus; 2. 5S рРНК A. aeolicus + СТС A. aeolicus; 3. 5S рРНК A. aeolicus + Δ51 СТС A. aeolicus; 4. 5S рРНК Е. coli; 5. 5S рРНК Е. coli + СТС A. aeolicus; 6. 5S рРНК Е. coli + L25; 7. (5S рРНК Е. coli + L25) + CTC A. aeolicus; 8. 5S рРНК T. thermophilus + Δ51 СТС A. aeolicus; 9. 5S рРНК T. thermophilus + СТС A. aeolicus; 10. 5S рРНК T. thermophilus + TL5; 11. (5S рРНК T. thermophilus + TL5) + CTC A. aeolicus; 12. тРНК Е. coli + CTC A. aeolicus; 13. фрагмент 23S рРНК T. thermophilus (55 н.) + CTC A. aeolicus. Соотношение РНК:белок в инкубационных смесях 1:1. 7 9). Кроме того, полноразмерный белок СТС A. aeolicus конкурирует с другими белками семейства (L25 и TL5) за связывание с 5S рРНК (дорожки 7 и 11). Причем даже при эквимолярных соотношениях белок СТС A. aeolicus вытесняет белок L25 из комплекса с 5S рРНК. Таким образом, из полученных данных следует, что ген ctc A. aeolicus кодирует белок с полноразмерным 5S рРНК-связывающим доменом и этот белок не является исключением в семействе СТС, так как он способен формировать стабильный комплекс с 5S рРНК. 1.2. Роль отдельных аминокислотных остатков белков L25 и TL5 в формировании и стабилизации их комплекса с 5S рРНК 10 лет назад были определены пространственные структуры двух представителей семейства СТС, рибосомных белков L25 E. coli и TL5 T. thermophilus, в комплексе со специфическим фрагментом 5S рРНК (Lu & Steitz, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2023-2028; Fedorov et al., 2001, Acta Crystallogr. D, 57, 968-976). Сравнительный анализ структур этих комплексов показал, что в обоих белках контактирующие с РНК аминокислотные остатки можно разделить на две группы, неконсервативные и консервативные (Рис. 3) (Gongadze et al., 2005, J. Biol. Chem., 280, 16151-16156). Остатки первой группы расположены по периферии контактирующей с РНК поверхности белка и формируют доступные воде межмолекулярные водородные связи. Остатки второй группы расположены в центральной части контактирующей с РНК поверхности белка и образуют межмолекулярные водородные связи, недоступные для воды. В отличие от остатков первой группы, остатки второй группы оказались не только идентичными в обоих белках (R10/9, R19/21, Y29/31, H85/88 и D87/90 в TL5/L25), но и строго консервативными в других белках семейства СТС. Нами было проведено детальное исследование роли указанных выше аминокислотных остатков белков TL5 и L25 во взаимодействии с 5S рРНК. Рис. 3. Области контакта белков TL5 и L25 с 5S рРНК. Контактирующая область отмечена на поверхности белка светло-серым цветом. Положение консервативных и неконсервативных аминокислотных остатков, образующих водородные связи с РНК, указано прямоугольниками и овалами, соответственно. Используя метод направленного мутагенеза, в гены данных белков были внесены соответствующие изменения. Мутантные формы белков были выделены, и их 5S рРНК-связывающие свойства исследованы несколькими методами. 8 Необходимо отметить, что в работе был использован не полноразмерный белок TL5, а его N-концевой домен (остатки 1-91) (NtdTL5), так как: 1) он обладает такими же 5S рРНК-связывающими свойствами, как и полноразмерный белок (Gongadze et al., 1999, FEBS Lett., 451, 51-55); 2) в комплексе только NtdTL5 взаимодействует с 5S рРНК (Fedorov et al., 2001); 3) NtdTL5 соразмерен и гомологичен белку L25, что делает сравнение результатов, полученных для двух белков, более корректным. Полученные данные суммированы в таблицах 1-2. Табл. 1. 5S рРНК-связывающие свойства мутантных форм белка L25 и N-концевого домена белка TL5 (NtdTL5). Контроль (NtdTL5) Замены неконсервативных остатков Замены консервативных остатков Одновременные замены неконсервативных и консервативных остатков Контроль (L25) Замены консервативных остатков Замена Kd, мкМ wt 0.08 (0.10) K14A; S16A; R20A; R31A; R72A; Q73A; N75A 0.12 (0.15) S16A/R20A; K14A/Q73A 0.16 (0.20) K14A/S16A/R20A; S16A/R20A/R72A 0.18 (0.24) N34A 0.60 R10A; R19A; H85A ~1.30 (~5.00) D87E 2.50 H85F; Y29F; D87S; D87N - R10A/R19A - R19A/K14A; R19A/R20A - R19A/Q73A; H85A/K14A ~4.00-5.00 (-) wt 0.1 H88F - Y31A - D90A - Кажущиеся константы диссоциации (Kd) РНК-белковых комплексов определены методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах. В скобках указаны значения Kd, полученные в экспериментах, проводившихся в растворе с высокой ионной силой (500 мМ KCl). Знак «-» используется, если связывание РНК не детектируется при концентрации белка до 5 мкМ. Знак «;» используется при перечислении мутаций в разных белках, а «/» – при перечислении мутаций в одном белке. Сначала был проверен эффект одиночных замен некоторых остатков обеих групп в белке TL5 на его РНК-связывающие свойства (Gongadze et al., 2005). Оказалось, что замена некоторых неконсервативных остатков практически не влияла 9 на 5S рРНК-связывающие свойства белка. Однако замена любого из консервативных остатков приводила к сильной дестабилизации комплекса или невозможности его образования. На основании этих данных было сделано предварительное заключение о том, что именно пять консервативных остатков (вторая группа) формируют 5S рРНКсвязывающий модуль в данном белке. Для уточнения границ 5S рРНК-связывающего модуля белков TL5 и L25, а также выяснения роли указанных межмолекулярных водородных связей в формировании и стабилизации РНК-белкового комплекса, были проведены более детальные исследования. Для этого был проверен эффект замены каждого из аминокислотных остатков двух указанных групп или их сочетания, а также влияние изменения ионных условий на образование и стабильность 5S рРНКбелкового комплекса. Наши эксперименты показали, что замена любого (за исключением N34) неконсервативного РНК-связывающего остатка белка ТL5 на аланин не влияет на образование и стабильность комплекса с РНК (Табл. 1). Даже одновременная замена двух или трех остатков, при которой исключается до половины всех межмолекулярных водородных связей, образуемых этой группой остатков, практически не изменяет РНК-связывающие свойства белка (Табл. 1, Рис. 4А, Рис. 4Б, дорожка 3). Единственным исключением в этой группе является остаток N34. Эффект от замены данного остатка в NtdTL5 на аланин ближе к эффекту, наблюдаемому при замене консервативного остатка (Табл. 1, Рис. 4А, Рис. 4Б, дорожки 4, 5). В этих случаях наблюдается не только сравнимое увеличение Kd (в 8 и 15 раз, соответственно), но и наличие ниже полосы комплекса шлейфа свободной РНК, который указывает на диссоциацию комплекса во время электрофореза. В более чем половине известных белков семейства в данной позиции присутствует пролин. В комплексе L25-5S рРНК этот остаток пролина не образует водородных связей с РНК (Lu & Steitz, 2000), тогда как N34 в TL5 образует две водородные связи с РНК, одна из которых частично недоступна для растворителя (Gongadze et al., 2005). Можно предположить, что аспарагин в данной позиции белка TL5 является эволюционным приобретением, увеличивающим стабильность РНК-белкового комплекса в экстремально термофильном организме. Ранее было отмечено, что в формировании и стабилизации комплексов белков L25 и TL5 c 5S рРНК кроме водородных связей могут принимать участие и электростатические взаимодействия (Stoldt et al., 1999, EMBO J., 18, 6508-6521; Fedorov et al., 2001). Учитывая то, что такие взаимодействия чувствительны к концентрации ионов в растворе, мы использовали разные концентрации KCl, чтобы оценить, насколько существенен их вклад в стабилизацию комплекса TL5-5S рРНК. Оказалось, что повышение концентрации KCl от 170 до 500 мМ практически не влияет на образование комплекса 5S рРНК с белком TL5 дикого типа или его мутантными формами с заменами неконсервативных остатков (Табл. 1). Таким образом, полученные данные позволяют сделать следующее заключение: доступные растворителю межмолекулярные водородные связи, образованные 10 неконсервативными остатками, а также электростатические взаимодействия между белком и РНК не вносят существенного вклада в стабильность комплекса TL5-5S рРНК. Рис. 4. 5S рРНК-связывающие свойства NtdTL5 и некоторых его мутантных форм. А. Кривые зависимости связывания [32Р]-меченной 5S рРНК E. coli от концентрации белка. 1. NtdTL5, 170 мМ KCl; 2. NtdTL5 S16A/R20A/R72A, 170 мМ KCl; 3. NtdTL5 N34A, 170 мМ KCl; 4. NtdTL5 R19A, 170 мМ KCl; 5. NtdTL5 R19A, 500 мМ KCl. Б. Электрофореграмма комплексов некоторых мутантных форм NtdTL5 с 5S рРНК (12%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). 1. 5S рРНК E. coli; 2. + NtdTL5 (1:1); 3. + NtdTL5 S16A/R20A/R72A (1:1); 4. + NtdTL5 N34A (1:3); 5. + NtdTL5 R19A (1:3); 6. + NtdTL5 R19A/Q73A (1:3); 7. + NtdTL5 R19A/R20A (1:3); 8. + NtdTL5 R10A/R19A (1:3). Молярные соотношения РНК:белок в инкубационных смесях указаны в скобках. Стрелкой отмечено положение РНК-белкового комплекса. Что же касается консервативных аминокислотных остатков, образующих с РНК закрытые от растворителя водородные связи, то из полученных результатов стало очевидным, что эти остатки играют ключевую роль во взаимодействии белка TL5 с 5S рРНК. Одиночная замена каждого из остатков этой группы приводит либо к значительной дестабилизации РНК-белкового комплекса, либо к невозможности его образования (Табл. 1). Аналогичный эффект оказывают соответствующие мутации в белке L25 E. coli (Табл. 1). Учитывая то, что эти пять указанных остатков строго консервативны в белках СТС, предполагается, что такой 5S рРНК-связывающий модуль должен быть характерен для большинства белков этого семейства. Хотелось бы немного подробнее остановиться на нескольких моментах, касающихся роли остатков РНК-связывающего модуля исследуемых белков. Из таблицы 1 видно, что любая замена консервативных остатков Y29 и D87 в белке TL5 приводит к полной утрате белком 5S рРНК-связывающих свойств. Аналогичный результат был получен и для белка L25 (Табл. 1). Такой сильный эффект может быть объяснен тем, что уникальная ориентация боковых групп этих двух остатков на поверхности белков L25 и TL5 стабилизирована водородной связью между этими остатками (Lu & Steitz, 2000; Fedorov et al., 2001). Замена одного из этих остатков может приводить к увеличению подвижности боковой группы второго остатка, что, в свою очередь, может исключить возможность образования закрытых от растворителя водородных связей с РНК сразу для двух остатков. Одиночная замена любого из трех 11 других остатков РНК-связывающего модуля белка TL5 (R10, R19 или H85), хотя и делает комплекс существенно менее стабильным, но не исключает полностью способности такого белка связываться с 5S рРНК (Табл. 1, Рис. 4Б, дорожка 5). Мы провели замену на аланин сразу двух консервативных остатков, R10 и R19, в белке TL5 и проверили РНК-связывающие свойства такого белка. Оказалось, что такая замена приводит к полной утрате белком 5S рРНК-связывающих свойств (Табл. 1, Рис. 4Б, дорожка 8). Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что замена одного из остатков, образующих закрытые от растворителя водородные связи с РНК, приводит к дестабилизации 5S рРНК-белкового комплекса, а замена двух из них полностью исключает способность белка образовывать комплекс с РНК. К полной потере РНК-связывающей способности белка TL5 приводит также дополнительная к одиночной замене остатков R10, R19 или H85 замена неконсервативного остатка, образующего водородные связи с РНК. Как видно из данных, представленных в таблице 1 и на рисунке 4, комплекс с одиночной заменой остатка R10, R19 или H85 в белке по своей стабильности занимает пограничное положение. Внесение дополнительной замены неконсервативного остатка в такой белок или экранирование межмолекулярных электростатических взаимодействий (при увеличении ионной силы раствора) приводит к невозможности образования комплекса с РНК (Табл. 1, Рис. 4А, Рис. 4Б, дорожки 6 и 7). Такие воздействия не влияют на связывание РНК с интактным белком, но оказывают значительный эффект на взаимодействие с РНК белка с дефектом в РНКсвязывающем модуле. Полученные результаты могут быть объяснены увеличением доступности внутренней области межмолекулярного контакта молекулам растворителя. Таким образом, функция внешней области контакта двух молекул (водородные связи, образованные неконсервативными остатками, и электростатические взаимодействия), по-видимому, заключается в поддержании статуса «закрытости от молекул растворителя» РНК-связывающего модуля белка. Для того чтобы выяснить, на какой этап, образование комплекса с 5S рРНК или его диссоциацию, влияют замены группы консервативных остатков в белке TL5, мы использовали метод поверхностного плазмонного резонанса (Katsamba et al., 2002, Methods, 26, 95-104). В экспериментах был использован специфический фрагмент 5S рРНК E. coli, иммобилизованный на сенсорном чипе. Исследования были проведены с некоторыми типичными мутантными формами NtdTL5. Оказалось, что для всех мутантных форм белка, сохранивших способность связываться с РНК, константа скорости ассоциации с РНК меняется незначительно (Табл. 2). В то же время, замена консервативного остатка в белке TL5 приводит к увеличению константы скорости диссоциации РНК-белкового комплекса в 30-50 раз (Табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что данные остатки необходимы для стабилизации уже сформированного РНК-белкового комплекса. 12 Табл. 2. Кинетические константы взаимодействия NtdTL5 и его мутантных форм со специфическим фрагментом 5S рРНК. Замена Контроль (NtdTL5) Замена неконсервативных остатков Замена консервативных остатков wt S16A S16A/R20A N34A R10A H85A H85F D87S Константа скорости ассоциации, ka (×106 M-1s-1) 6.19 6.45 4.66 2.45 1.20 1.90 Константа скорости диссоциации, kd (×10-4 s-1) 7.95 9.04 7.12 442 471 198 - KD, nM 0.14 0.14 0.12 18.0 38.7 10.4 «KD» – равновесная константа диссоциации «-» – связывание РНК не детектируется при концентрации белка до 5 мкМ На основании всей совокупности полученных данных, можно предположить, что формирование исследуемых РНК-белковых комплексов проходит, по крайней мере, в два этапа. На первом этапе (узнавание молекулами друг друга) наиболее важным для взаимодействия молекул является вся уникальная область контакта белка, а не отдельные ее элементы (аминокислотные остатки). На втором же этапе (стабилизация комплекса) ключевую роль выполняют пять остатков 5S рРНКсвязывающего модуля, стабилизируя уже сформировавшийся комплекс. 1.3. РНК-связывающие свойства белков СТС с природными заменами в их 5S рРНК-связывающем модуле При детальном анализе первичных структур белков семейства СТС мы обнаружили несколько интересных случаев природных замен одного из остатков 5S рРНК-связывающего модуля этих белков. Так, у Enterococcus faecalis (класс Bacilli) остаток консервативной аспарагиновой кислоты белка СТС заменен остатком глютаминовой кислоты (E90). При такой замене (D87E) белок TL5 образовывал крайне нестабильный комплекс с 5S рРНК (Табл. 1). В то же время, в петле Е 5S рРНК (сайт связывания белков СТС) этого организма произошло единственное изменение: G75, азотистое основание которого взаимодействует с остатком консервативной аспарагиновой кислоты в комплексах L25-5S рРНК и TL5-5S рРНК, заменен на урацил (Рис. 5). Другой случай – замена остатка аспарагиновой кислоты на серин или аланин обнаружен в белках СТС типа Cyanobacteria. Такая замена в белках TL5 или L25 приводила к утрате ими 5S рРНК-связывающих свойств (Табл. 1). Однако одновременно с изменениями в РНК-связывающем модуле белка СТС Cyanobacteria (например, Nostoc sp.) в петле Е 5S рРНК этой группы бактерий произошли многочисленные изменения (Рис. 5). Мы предположили, что указанные случаи могут быть примерами коэволюции структур двух взаимодействующих макромолекул. 13 Рис. 5. Схемы вторичной структуры фрагментов 5S рРНК (район петли Е) некоторых бактерий. Консервативные нуклеотиды (>80% в бактериальных 5S рРНК) отмечены черными символами, неконсервативные нуклеотиды – серыми символами. Изменения консервативных нуклеотидов показаны открытыми символами. Стрелкой указан нуклеотид, взаимодействующий с D87 белка TL5. Замены консервативной аспарагиновой кислоты в соответствующих белках СТС показаны справа от РНК. Для того чтобы проверить это предположение белки СТС и специфические фрагменты 5S рРНК из E. faecalis и Nostoc sp. были получены, и проверена их способность образовывать гомологические комплексы. Оказалось, что в обоих случаях образуются стабильные комплексы (Рис. 6, дорожки 5 и 8). Для сравнения в том же эксперименте проверяли связывание мутантных форм белка TL5 с соответствующими заменами (D87E или D87S) в РНК-связывающем модуле с фрагментами 5S рРНК E. coli, E. faecalis или Nostoc sp. Как уже отмечалось, белок TL5 с заменой D87E формирует с фрагментом 5S рРНК E. coli крайне нестабильный комплекс (Рис. 6, дорожка 3). На это указывает наличие ниже полосы комплекса шлейфа свободной РНК и избыток белка, который требуется для того, чтобы вся РНК перешла в комплекс. Более стабильный комплекс белок TL5 D87E образует с фрагментом 5S рРНК E. faecalis (Рис. 6, дорожка 4). Белок TL5 с заменой D87S не образует комплекса не только с фрагментом 5S рРНК E. coli, но и с фрагментом 5S рРНК Nostoc sp. (Рис. 6, дорожки 6, 7). 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 6. Электрофоретический анализ 5S рРНК-связывающих свойств белков СТС E. faecalis и Nostoc sp. (12%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). 1. фрагмент РНК 5S рРНК E. coli; 2. фрагмент 5S рРНК E. coli + NtdTL5 (1:1); 3. фрагмент 5S рРНК E. coli + NtdTL5 D87E (1:3); 4. фрагмент 5S рРНК E. faecalis + NtdTL5 D87E (1:1); 5. фрагмент 5S рРНК E. faecalis + белок CTC E. faecalis (1:1); 6. фрагмент 5S рРНК E. coli + NtdTL5 D87S (1:2); 7. фрагмент 5S рРНК Nostoc sp. + NtdTL5 D87S (1:2); 8. фрагмент 5S рРНК Nostoc sp. + белок СТС Nostoc sp. (1:1). Молярные соотношения РНК:белок в инкубационных смесях указаны в скобках. Стрелкой отмечено положение РНК-белкового комплекса. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что параллельно произошедшие изменения в белке СТС и 5S рРНК некоторых бактерий имеют компенсаторный характер и направлены на сохранение этими молекулами способности формировать стабильный комплекс. 14 Все описываемые и обсуждаемые выше результаты были получены на изолированных молекулах белка СТС и 5S рРНК. Однако, как реализуются выявленные принципы специфического взаимодействия этих двух молекул в клетке, было неясно. Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение специфического взаимодействия одного из представителей данного семейства, рибосомного белка L25 E. coli, c 5S рРНК в системе in vivo. 2. Необходимость взаимодействия белка L25 с 5S рРНК для его встраивания в рибосому in vivo Рибосомный белок L25 E. coli расположен в центральном протуберанце 50S субчастицы рибосомы (Рис. 7А и Б) (Lotti et al., 1989, Mol. Gen. Genet., 216, 245-253), где он взаимодействует только с двумя молекулами – 5S рРНК и белком L16 (Schuwirth et al., 2005, Science, 310, 827-834). Причем, в отличие от обширного и плотного взаимодействия с 5S рРНК (см. раздел 1.2), другой межмолекулярный контакт белка L25 ограничивается несколькими водородными связями с C-концевым «хвостом» белка L16 (Рис. 7В). Недавно было обнаружено, что отсутствие белка L25 в рибосоме приводит к снижению эффективности ее функционирования (Korepanov et al., 2007). Оказалось, что такой эффект обусловлен дестабилизацией значительной части структуры центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы (Гонгадзе, 2010, Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук). Изучая взаимодействие белка L25 с 5S рРНК, мы показали, что замена одного из остатков РНК-связывающего модуля белка приводит к невозможности образования данного комплекса in vitro. Поэтому было решено проверить, будут ли такие мутантные формы белка L25 встраиваться в рибосому in vivo. Для этого было использовано два экспериментальных подхода: 1) В первом случае мы экспрессировали ген мутантной формы белка L25 in trans (с плазмиды) в клетках ΔL25 штамма, как описано в работе (Korepanov et al., 2007). Преимуществом данного подхода является его относительная простота. Однако в такой системе количество мутантного белка в клетке превышает его обычное количество примерно на 2 порядка. В связи с этим, нельзя было исключать побочные эффекты, связанные с очень высокой концентрацией свободного белка в клетке (например, неспецифическое связывание белка с РНК). 2) Во втором случае мы вносили направленные изменения непосредственно в хромосомный ген белка L25, используя метод «рекомбиниринг» (Yu et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5978-5983). Этот подход, предложенный для данной работы А.П. Корепановым (Институт белка РАН, г. Пущино), является более трудоемким, однако при этом ген мутантной формы белка находится под контролем собственного промотора, и белка в клетке синтезируется «нормальное» количество. В качестве контроля в этих экспериментах использовался штамм MS23 (проведен через те же генетические манипуляции, что и мутантные штаммы, но содержит интактный ген белка L25). 15 Рис. 7. А. Положение 5S рРНК-белкового комплекса в 50S субчастице рибосомы. Б. Детальная модель структуры центрального протуберанца 50S субчастицы. B. Фрагмент структуры центрального протуберанца, иллюстрирующий взаимодействие белков L16 и L25. Для построения моделей использовали структуру рибосомы E. coli (PDB code 2AW4) из работы Schuwirth et al., 2005. Было проверено влияние одиночных замен в 5S рРНК-связывающем модуле белка L25 (Y31A или H88F) на встраивание этого белка в рибосому in vivo. Оказалось, что указанные мутации в белке L25, исключающие его связывание с 5S рРНК in vitro (Табл. 1), не влияют на его встраивание в рибосому in vivo, ростовые характеристики и белок-синтезирующую активность бактериальных клеток. Полученные данные позволили предположить, что внесенные в белок L25 одиночные замены не полностью исключили его контакт с 5S рРНК в рибосоме. Мы решили внести сразу несколько массивных аминокислотных остатков (замены S17L/I29F/D90Y или S17L/Y31L/H88F) в область контакта белка L25 с 5S рРНК, чтобы создать стерическое препятствие для образования плотного контакта между этими молекулами. Указанные изменения в белке так же, как и одиночные замены, приводили к невозможности образования комплекса с 5S рРНК in vitro. В случае продукции указанных мутантных форм белка с хромосомы (штаммы MS23a и MS23b) мы наблюдали сильное замедление роста клеток (Рис. 8А) в сравнении с клетками контрольного штамма MS23. Причем замена S17L/Y31L/H88F в белке оказывала на рост клеток эффект, сравнимый с нокаутом гена этого белка в хромосоме (штамм KNB800). На основании этих данных можно было предположить, что исследуемые мутантные формы белка не встраиваются в рибосому. Рибосомы из 16 клеток исследуемых штаммов были выделены двумя способами. В первом случае рибосомы из цитоплазмы просто осаждали центрифугированием (без очистки). Во втором случае рибосомы очищали стандартным методом – центрифугированием через плотную среду (сахарозу) в условиях высокой ионной силы. Анализ белкового Рис. 8. А. Скорость роста клеток исследуемых штаммов, содержащих в хромосоме измененный ген белка L25 (среда LB, 37°С). Сравнительный анализ рибосом (Rs) из клеток штамма KNB800 (Б) и клеток исследуемых (MS23, MS23a и MS23b) штаммов (В). Представлены профили седиментации рибосом (центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 5-20%), на вставке – фрагмент двумерного ПААГ-электрофореза белков соответствующего препарата рибосом. Для анализа использованы препараты «неочищенных» рибосом. Отмечено положение 30S и 50S субчастиц, а также 70S рибосомы. Стрелкой указано положение белка L25 или его мутантной формы. состава выделенных рибосом показал (Рис. 8В), что только одна из мутантных форм белка L25 (S17L/I29F/D90Y) присутствует в рибосомах, причем только в препарате «неочищенных» рибосом. Этот препарат рибосом содержит приблизительно эквимолярное количество мутантного белка. Однако после стандартной очистки белок L25 S17L/I29F/D90Y в рибосомах отсутствует. В свою очередь, белок L25 S17L/Y31L/H88F не обнаруживается в обоих образцах рибосом. Следует отметить, что во всех образцах рибосом из мутантных штаммов MS23a и MS23b была нарушена стабильность ассоциации рибосомных субчастиц в сравнении с рибосомами контрольного штамма MS23 (Рис. 8В). При этом седиментационные профили мутантных рибосом были очень похожи на профиль рибосом ΔL25 штамма (KNB800) (Рис. 8Б и В). В то же время, при экспрессии генов мутантных форм белка L25 с тройными 17 заменами in trans в клетках ΔL25 штамма были получены неожиданные, но интересные результаты (Рис. 9). Один из мутантных белков (L25 S17L/I29F/D90Y) в значительной степени восстанавливал рост клеток ΔL25 штамма (Рис. 9А). Второй мутантный белок (L25 S17L/Y31L/H88F) хотя и частично, но тоже восстанавливал Рис. 9. А. Скорость роста клеток штамма KNB800 (ΔL25), экспрессирующих in trans интактный ген белка L25 или его мутантную форму (среда LB, 37°С). Сравнительный анализ рибосом из клеток ΔL25 штамма (Б) и клеток этого же штамма, в которых продуцируется указанная мутантная форма белка L25 (В и Г). В секциях В и Г представлен анализ препаратов «неочищенных» и очищенных рибосом, соответственно. Компоновка панели и обозначения как на рисунке 8. рост клеток этого штамма (Рис. 9А). Более того, оказалось, что в препаратах «неочищенных» рибосом из клеток обоих указанных штаммов мутантный белок присутствует (Рис. 9В), а после стандартной очистки – нет (Рис. 9Г). При этом образцы мутантных рибосом до очистки содержат заметно меньше диссоциированных рибосомных субчастиц, чем ΔL25 рибосомы (Рис. 9Б и В), а после очистки их профили седиментации выглядят примерно одинаково (Рис. 9Б и Г). 18 Совокупность полученных данных позволяет сделать следующие заключения. Образование специфического комплекса между 5S рРНК и белком L25 не является строго необходимым условием для его встраивания в рибосому in vivo. При значительном увеличении концентрации в клетке белка L25 с множественными мутациями, лишенного способности связываться с изолированной 5S рРНК, он встраивается в рибосому, что приводит к увеличению стабильности ассоциации рибосомных субчастиц. В то же время, указанные изменения в белке L25 значительно ослабляют его удержание в рибосоме, особенно при «физиологических» концентрациях белка в клетке. Таким образом, взаимодействие 5S рРНК и белка L25 строго необходимо для удержания этого белка в работающей рибосоме в бактериальной клетке. 3. Исследование роли рибосомного белка L5 в сборке и функционировании рибосомы Escherichia coli Рибосомный 5S рРНК-связывающий белок L5 E. coli локализован в центральном протуберанце большой рибосомной субчастицы (Lotti et al., 1989), как и другие компоненты 5S рРНК-белкового комплекса (5S рРНК, белки L18 и L25) (Рис. 7А и Б). Ряд данных указывает на то, что белок L5 важен для работы аппарата трансляции. Во-первых, он присутствует в рибосомах всех ныне живущих организмов. Во-вторых, нокаут гена белка L5 летален для клеток E. coli (Korepanov et al., 2007). В-третьих, белок L5 наряду с белком L18 необходим для образования комплекса между изолированными молекулами 5S рРНК и 23S рРНК (Spierer et al., 1979, Nucl. Acids Res., 6, 1669-1682; Rohl & Nierhaus, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 729-733). Это косвенно подтверждается тем, что в структуре рибосомы 5S рРНК и 23S рРНК взаимодействуют преимущественно через белки L5 и L18 (Schuwirth et al., 2005). В-четвертых, кристаллографические исследования рибосом и их функциональных комплексов выявили ряд межмолекулярных контактов данного белка, которые могут быть функционально важными (Yusupov et al., 2001, Science, 292, 883-896; Selmer et al., 2006, Science, 313, 1935-1942). Так, оказалось, что белок L5 взаимодействует c тРНК в Р-участке рибосомы и участвует в формировании межсубъединичного мостика B1b, взаимодействуя с белком S13. Однако, несмотря на имеющиеся данные, конкретная роль белка L5 в сборке и функционировании рибосомы все еще остается неясной. В связи с этим, в рамках данной работы были выделены следующие задачи: – проверить, какой эффект оказывает отсутствие рибосомного белка L5 в клетках E. coli на сборку in vivo большой рибосомной субчастицы, – выяснить важность контакта с тРНК петли β2-β3 белка L5 для работы бактериального аппарата трансляции. 19 3.1. Получение и характеристика больших рибосомных субчастиц, собранных in vivo в отсутствие белка L5 Ранее в нашей лаборатории был создан штамм (MS01) E. coli с регулируемой экспрессией гена рибосомного белка L5. В данном штамме хромосомный ген белка L5 (rplE) был заменен на ген устойчивости к хлорамфениколу в присутствии плазмиды, несущей ген белка под контролем индуцибельного арабинозного промотора. Штамм MS01 был нами использован для получения клеток E. coli, дефицитных по белку L5. Схема эксперимента представлена на рисунке 10А. Сначала клетки растили в присутствии индуктора – арабинозы. При этом белок L5 Рис. 10. Схема эксперимента (А) и кривые роста клеток штамма MS01 (Б), выращенных в присутствии или отсутствии арабинозы. Стрелками отмечено время отбора клеток для анализа рибосом. Анализ препаратов рибосом (центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 5-20%) из клеток до переноса (В) и после переноса (Г) в «свежую» среду (в присутствии (+) или отсутствии (-) арабинозы). Указано положение 30S, 45S, и 50S субчастиц, а также 70S рибосом. синтезировался. Затем клетки осаждали и две одинаковые порции клеток суспендировали в «свежей» среде (с индуктором или без него). В условиях отсутствия индуктора (-арабиноза) синтез белка L5 должен был прекратиться, и в клетках должны были накапливаться рибосомные субчастицы, собранные в отсутствие данного белка. На рисунке 10Б видно, что рост клеток штамма MS01 в указанных условиях довольно быстро замедляется и выходит на плато. Клетки 20 штамма MS01, выращенные в присутствии индуктора (+арабиноза), были использованы в качестве контроля. Для выявления роли белка L5 в сборке большой рибосомной субчастицы нами был проведен сравнительный анализ свойств рибосом из клеток исследуемого штамма, выращенных в присутствии и отсутствии арабинозы. Для этого отбирали клетки в разное время роста (Рис. 10Б) и анализировали рибосомы из них (Рис. 10В и Г). На рисунке видно, что после прекращения синтеза белка L5 (перенос в среду без индуктора) в клетках начинает накапливаться фракция рибосомных субчастиц. К моменту, когда клетки перестают делиться (плато на кривой роста), уже не более 15% рибосомных субчастиц находится в форме 70S рибосом. Большие рибосомные субчастицы из клеток, дефицитных по белку L5, были выделены и охарактеризованы. Они оказались неспособны ассоциировать с 30S субчастицами. Коэффициент седиментации таких субчастиц был равен 45S (±1), что приблизительно совпадает с данным параметром для субчастиц, реконструированных in vitro в отсутствие 5S рРНК и, как известно, лишенных всего 5S рРНК-белкового комплекса (Dohme & Nierhaus, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2221-2225; Selivanova et al., 1986, FEBS Lett., 197, 79-83). Мы проверили наличие 5S рРНК в исследуемых субчастицах, и обнаружили только ее следовые количества (не более Рис. 11. Анализ белкового состава больших рибосомных субчастиц из дефицитных по белку L5 (справа) и контрольных клеток (слева) двумерным гельэлектрофорезом. Стрелками на электрофореграмме отмечено положение соответствующих рибосомных белков. 5% в сравнении с контрольными 50S субчастицами). Анализ белкового состава 45S субчастиц показал, что в них в следовых количествах присутствует не только белок L5 (не более 5%), но и другие 5S рРНК-связывающиеся белки, L18 и L25 (не более 10%) (Рис. 11). Таким образом, нами было показано, что в отсутствие рибосомного белка L5 в клетках E. coli собираются большие рибосомные субчастицы, лишенные всех компонентов 5S рРНК-белкового комплекса. При этом данный комплекс (5S рРНК, белки L18 и L25) обнаруживается в цитоплазме клеток в количестве, соизмеримом с количеством рибосом. Кроме того, нами было обнаружено, что исследуемые 45S субчастицы содержат сильно уменьшенное количество белков L16, L27, L30 и L33 (Рис. 11). Центральный протуберанец большой рибосомной субчастицы формируется 5S рРНК-белковым комплексом, структурными элементами доменов II и V 23S рРНК 21 и белками L16, L27, L30, L33 и L35 (Рис. 7Б). В данной работе нами впервые продемонстрировано, что in vivo рибосомный белок L5 строго необходим для встраивания в большую рибосомную субчастицу и удержания в ней всего 5S рРНКбелкового комплекса, а также других компонентов (белки L16, L27, L30 и L33) центрального протуберанца. Анализ пространственной структуры рибосомы E. coli показывает, что белки L16, L27 и L30 образуют плотный контакт со спиралью H38 23S рРНК, которая в свою очередь взаимодействует с 5S рРНК (Рис. 7Б). Полученные нами результаты согласуются и с некоторыми данными о том, что происходит при сборке 50S рибосомной субчастицы in vitro в отсутствие 5S рРНК. Было отмечено, что такие рибосомные субчастицы помимо 5S рРНК-связывающихся белков также лишены белка L16 (Dohme & Nierhaus, 1976), а центральный протуберанец этих частиц обладает высокой подвижностью (Selivanova et al., 1986). В связи с этим, можно заключить, что отсутствие 5S рРНК-белкового комплекса в исследуемых нами рибосомных субчастицах приводит к дестабилизации структуры их центрального протуберанца и ослаблению связывания белков L16, L27, L30 и L33 с этим участком рибосомы. Таким образом, белок L5 прямо или опосредованно влияет на формирование и стабильность целого структурно-функционального домена рибосомы. 3.2. Влияние мутаций в петле β2-β3 белка L5 на синтез полипептида рибосомами in vivo и in vitro При анализе структуры бактериальной рибосомы обнаруживается контакт между аминокислотными остатками петли β2-β3 белка L5 и нуклеотидами Т- и Dшпилек тРНК в P-участке (Selmer et al., 2006). Считая, что этот контакт может быть функционально важным, мы решили проверить влияние мутаций в указанном участке белка L5 на эффективность синтеза рибосомами функционально-активного полипептида. Для этого был проведен направленный мутагенез соответствующих аминокислотных остатков в белке L5 E. coli, причем изменения вносились непосредственно в хромосомный ген белка. Изменения в гене белка L5, приводившие к продукции белка с одиночной (S73A или R80A) либо двойной заменой (S73A/R80A) в петле β2-β3, практически не влияли на ростовые характеристики клеток E. coli. В то же время, делеция четырех или восьми остатков (Δ75-78 или Δ7380) в исследуемой петле белка приводила к более медленному росту клеток. Ростовые характеристики клеток E. coli, содержащих белок L5 с укороченной петлей β2-β3 (Δ75-78 или Δ73-80 – штаммы MS29d и MS30, соответственно), были детально исследованы (Табл. 4). В качестве контроля был использован штамм MS29 (проведен через те же генетические манипуляции, что и исследуемые штаммы, но содержит интактный ген белка L5). Оказалось, что клетки E. coli, содержащие белок L5 с укороченной петлей β2-β3, имеют холодочувствительный фенотип: разница между временем удвоения клеток мутантных и контрольного штаммов значительно увеличивается с понижением температуры культивации клеток (Табл. 4). При этом 22 удаление восьми остатков петли оказывает больший эффект, чем удаление четырех остатков. Логично было предположить, что замедление роста клеток мутантных штаммов связано с дефектами в биосинтезе белка. Для того чтобы проверить так ли это, была исследована функциональная активность рибосом из этих штаммов. Оказалось, что рибосомы, содержащие белок L5 с укороченной петлей β2-β3 (Δ75-78 или Δ73-80), менее эффективно синтезируют природный полипептид как in vivo, так и in vitro (Рис. 12). Причем понижение температуры приводит к увеличению разницы в белоксинтезирующей активности контрольных и мутантных рибосом. Этот результат полностью согласуется с данными по ростовым характеристикам мутантных штаммов. Табл. 4. Время удвоения клеток E. coli, содержащих белок L5 c укороченной петлей β2-β3, в среде LB при различных температурах. Штамм (белок) Время удвоения клеток, мин 25°С 32°С 37°С 42°С MS29 (L5 wt) 70±2 38±1 32±1 26±1 MS29d (L5 Δ75-78) 135±9 59±1 35±1 28±1 MS30 (L5 Δ73-80) 160±1 76±1 43±1 34±2 Рис. 12. Синтез полипептида рибосомами (Rs), содержащими белок L5 с укороченной петлей β2-β3, in vivo при 32°С (А) и in vitro при 25°С (Б). Активность β-галактозидазы указана в миллеровских единицах. При синтезе люциферазы в систему добавляли [14С]Leu, а синтезируемый продукт анализировали электрофорезом в ПААГ (градиент 10-20%, денатурирующие условия) с последующей авторадиографией. Стрелкой указано положение полноразмерной люциферазы. 1. Rs L5 wt; 2. Rs L5 ∆75-78; 3. Rs L5 ∆73-80. На рисунке 12Б видно, что полноразмерный активный белок (люцифераза) появляется во всех случаях примерно через одинаковое время после начала синтеза. Это означает, что для осуществления полного цикла трансляции природной мРНК (включающего инициацию, элонгацию и терминацию) мутантным и контрольным рибосомам требуется одинаковое время. Однако, как видно на этом же рисунке, накопление активного белка в случае мутантных рибосом происходит в два раза медленнее. Наиболее вероятными причинами обнаруженного эффекта могут быть 23 увеличение частоты ошибок трансляции или нарушение процесса транслокации тРНК и мРНК в рибосоме. Анализ продуктов трансляции мРНК люциферазы контрольными и мутантными рибосомами показал, что заметных различий в количестве полноразмерных и абортивных полипептидов между ними нет (Рис. 12Б). Из этого следует, что точность трансляции рибосомами, содержащими белок L5 с укороченной петлей β2-β3, не нарушена. Имеются литературные данные о том, что процесс транслокации замедляется при понижении температуры (Belitsina et al., 1975, FEBS Lett., 54, 35-38). Учитывая полученные нами результаты, можно предположить, что внесенные в петлю β2-β3 белка L5 изменения могут влиять на процесс транслокации мРНК и тРНК в рибосоме. ВЫВОДЫ 1. Из результатов комплексных исследований 5S рРНК-связывающих свойств рибосомного белка L25 Escherichia coli и его гомолога, белка TL5 Thermus thermophilus, следует, что: ● пять аминокислотных остатков – R10/9, R19/21, Y29/31, H85/88, D87/90 в TL5/L25, формирующих РНК-связывающий модуль этих белков, чрезвычайно важны для стабилизации их комплекса с изолированной 5S рРНК; ● формирование прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК не является обязательным условием для встраивания этого белка в рибосому in vivo. В то же время, этот межмолекулярный контакт необходим для прочного удержания белка L25 в рибосоме и стабильной ассоциации рибосомных субчастиц. 2. Доказано, что немногочисленные случаи одновременных природных изменений в контактирующих областях белка семейства СТС и 5S рРНК представителей класса Bacilli и типа Cyanobacteria имеют компенсаторный характер и направлены на сохранение этими молекулами способности формировать стабильный комплекс. 3. Установлено, что белок СТС Aquifex aeolicus обладает полноразмерным 5S рРНКсвязывающим доменом и, таким образом, не является исключением среди белков данного семейства. 4. Впервые показано, что рибосомный белок L5 E. coli строго необходим для встраивания 5S рРНК-белкового комплекса, а также белков L16, L27, L30 и L33 в большую субчастицу рибосомы in vivo. Из полученных данных следует, что белок L5 прямо или опосредованно влияет на формирование целого структурно-функционального домена (центрального протуберанца) бактериальной рибосомы. 5. Показано, что рибосомы E. coli, содержащие белок L5 с укороченной петлей β2-β3, менее эффективно синтезируют природные полипептиды. Сниженная функциональная активность данных рибосом не связана с увеличением частоты ошибок трансляции. 24 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Gongadze, G.M., Korepanov, A.P., Stolboushkina, E.A., Zelinskaya, N.V., Korobeinikova, A.V., Ruzanov, M.V., Eliseev, B.D., Nikonov, O.S., Nikonov, S.V., Garber, M.B., Lim, V.I. The crucial role of conserved intermolecular H-bonds inaccessible to the solvent in formation and stabilization of the TL5-5S rRNA complex // J. Biol. Chem. – 2005. – V.280. – P.1615116156. Коробейникова, А.В., Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Елисеев, Б.Д., Баженова, М.В., Гарбер, М.Б. 5S рРНК-узнающий модуль белков семейства СТС и его эволюция // Биохимия. – 2008. – T.73. – C.193-201. Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Коробейникова, А.В., Гарбер, М.Б. Бактериальные 5S рРНК-связывающие белки семейства СТС // Успехи Биолог. Химии. – 2008. – Т.48. – С.105-132. Korobeinikova, A.V., Shestakov, S.A., Korepanov, A.P., Garber, M.B., Gongadze, G.M. Protein CTC from Aquifex aeolicus possesses a full-sized 5S rRNA-binding domain // Biochimie. – 2009. – V.91. – P.453-456. Коробейникова, А.В., Пиндл, В., Корепанов, А.П., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Исследование взаимодействия рибосомного белка TL5 с 5S рРНК методом поверхностного плазмонного резонанса // 13-я Международная Пущинская школаконференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». – Сборник тезисов – 28 сентября – 2 октября 2009 – С.24. Корепанов, А.П., Коробейникова, А.В., Баженова, М.Б., Шестаков, С.А., Бубуненко, М.Г., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Роль 5S рРНК-связывающих белков L5 и L25 в сборке бактериальной рибосомы in vivo // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, Москва-Пущино. – Сборник тезисов – 28 сентября – 2 октября 2009 – С.250. Корепанов, А.П., Коробейникова, А.В., Максимова, Е.М., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Влияние мутаций в петле β2-β3 рибосомного белка L5 на рост клеток Escherichia coli и свойства аппарата трансляции // 14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». – Сборник тезисов – 2010 – С.146. Коробейникова, А.В., Корепанов, А.П., Аникаев, А.Ю., Никонов, С.В., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Встраивание мутантных форм рибосомного белка L25 Escherichia coli, неспособных связываться с 5S рРНК, в рибосому in vivo // 14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». – Сборник тезисов – 2010 – С.147. Коробейникова, А.В., Корепанов, А.П., Аникаев, А.Ю., Максимова, Е.М., Никонов, С.В., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Влияние специфических мутаций в рибосомных белках L5 и L25 на свойства аппарата трансляции и рост клеток Escherichia coli // III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Нижний Новгород. – Сборник тезисов – 2010 – С.98. Определенная в работе последовательность участка ДНК Aquifex aeolicus помещена в GenBank NCBI (Accession number EU851040). Для заметок Для заметок Заказ № 245-i-А/05/2011 Подписано в печать 18.05.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2 ООО “Цифровичок”, тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; e-mail:[email protected]
