Культивирование растительных организмов с использованием

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИНСТИТУТ МАТЕМАТИКИ, ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК И
ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
КАФЕДРА БОТАНИКИ, БИОТЕХНОЛОГИИ И ЛАНДШАФТНОЙ
АРХИТЕКТУРЫ
Белозерова А.А., Колоколова Н.Н.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАСТЕНИЙ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
Учебно-методический комплекс
Рабочая программа по большому спецпрактикуму
для студентов 4 курса, обучающихся по направлению
020200.62 «Биология» (бакалавриат)
Тюмень
2012
Белозерова А.А., Колоколова Н.Н. Культивирование микроорганизмов и
растений
с
методический
использованием
комплекс.
биотехнологических
Рабочая
учебная
методов.
программа
для
Учебностудентов
направления 020200.62 «Биология». Тюмень, Издательство Тюменского
государственного университета, 2012. 12с.
Учебно-методический
требованиями
комплекс
Государственного
составлен
в
образовательного
соответствии
стандарта
с
высшего
профессионального образования для студентов специальности 020200.62
Биология. Рабочая учебная программа включает в себя пояснительную записку,
содержание дисциплины, тематический план с указанием аудиторных часов для
самостоятельной работы по темам, вопросы к самостоятельной работе, темы
рефератов, перечень контрольных вопросов к зачету, список литературы.
Рабочая учебная программа дисциплины опубликована на сайте ТюмГУ:
Физиология
растений
[электронный
ресурс]
/
Режим
доступа:
http://www.umk.utmn.ru, свободный.
Рекомендовано к изданию кафедрой ботаники, биотехнологии и
ландшафтной архитектуры. Утверждено проректором по учебной работе
Тюменского государственного университета.
ОТВЕТСТВЕННЫЙ РЕДАКТОР: Н.А. Боме, д.с.-х.н., профессор
© Тюменский государственный университет
© Белозерова А.А., Колоколова Н.Н., 2012
1. Пояснительная записка
Большой спецпрактикум «Культивирование растений и микроорганизмов
с использованием биотехнологических методов» предназначен для студентов 4
курса направления 020200.62 «Биология» по специализации «Биотехнология».
Базируется на знаниях, полученных студентами при изучении морфологии и
анатомии растений, растениеводстве, физиологии растений, микробиологии.
Знания, умения и навыки, полученные при выполнении работ по данному
практикуму пригодятся для освоения дисциплин «Биотехнология растений»,
«Феногенетика и селекция растений», при выполнении дипломных работ.
Целью данного курса является знакомство с основными методами
культивирования растений и микроорганизмов in vitro.
Задачами спецпрактикума являются:
- знакомство с требованиями, предъявляемыми к лабораториям
биотехнологических и микробиологических исследований;
- освоение методик приготовления питательных сред, способов
стерилизации питательных сред, растительного материала;
- знакомство с методиками клонального микроразмножения растений;
- получение навыков работы с микроорганизмами и изучение
современных способов культивирования микроорганизмов;
- знакомство с методами создания трансгенных растений.
При завершении спецпрактикума студенты должны обладать
следующими теоретическими знаниями и практическими навыками:
- знать способы стерилизации помещений, посуды, инструментов,
питательных сред, растительного материала;
- освоить технологию приготовления питательных сред;
- уметь подбирать оптимальные условия культивирования растений и
микроорганизмов in vitro;
- закрепить навыки получения растительных эксплантов, пассирования
каллусных тканей;
- знать этапы клонального микроразмножения растений;
- освоить технику клонального микроразмножения растений;
- знать общие принципы работы с микроорганизмами и методы
выделения чистых культур;
- иметь представление о приемах и способах направленного синтеза
биологически активных веществ микроорганизмами;
- знать технологию бактериальной трансформации растений.
Общая трудоемкость дисциплины составляет 64 часа, из них 36 ч.
лабораторных работ, 28 ч. самостоятельной работы. Семестр 7. Итоговая форма
контроля - зачет.
2. Тематический план.
Таблица 1.
№
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Наименование темы
Модуль 1
Основные требования к
лаборатории
биотехнологических и
микробиологических
исследований
Приготовление питательных
сред и подбор оптимальных
условий культивирования
Стерилизация растительного
материала
Всего
Модуль 2
Техника введения в культуру и
культивирование
изолированных тканей
растений
Клональное
микроразмножение растений
Культивирование и хранение
микроорганизмов
Всего
Модуль 3
Биотехнология
получения
биологически
активных
веществ
и
отдельных
компонентов
микробных
клеток
Генетическая трансформация
растений
Фитонцидные свойства
растений
Всего
Итого (часов, баллов)
Лаборатор
ные работы
(кол-во
часов)
Самостоятельн
ая работа
студента
(кол-во часов)
Итого
часов по
теме
Итого
количе
ство
баллов
2
2
4
0-10
6
4
10
0-10
4
2
6
0-10
12
8
20
0-30
2
4
6
0-10
4
4
8
0-10
6
2
8
0-15
12
10
22
0-35
6
4
10
0-10
4
4
8
0-10
2
2
4
0-15
12
36
10
28
22
64
0-35
0 – 100
Таблица 2.
Формы текущего контроля
презента
ция
реферат
опрос
Модуль 1
1.
2.
3.
Всего
Модуль 2
1.
2.
3.
Всего
Модуль 3
1.
2.
3.
Всего
Итого
баллов
контрол
ьная
работа
Формы текущего контроля
отчет по
работе
№ темы
Итого количество
баллов
0-4
0-4
0-4
0-12
0-6
0-6
0-6
0-18
0-10
0-10
0-10
0-30
0-4
0-4
0-4
0-12
0-6
0-6
0-6
0-18
0-5
0-5
0-10
0-10
0-15
0-35
0-4
0-4
0-4
0-12
0-36
0-6
0-6
0-6
0-18
0-54
0-5
0-10
0-10
0-15
0-35
0-100
0-4
0-4
0-4
0-1
0-1
0-1
Таблица 3
Планирование самостоятельной работы студентов ОДО
№
Модули и темы
Модуль 1
1 Основные
требования к
лаборатории
биотехнологических
и
микробиологических
исследований
2 Приготовление
питательных сред и
подбор оптимальных
условий
культивирования
3 Стерилизация
растительного
материала
Всего по модулю 1:
Виды СРС
обязательные
дополнительные
Объем
часов
Кол-во
баллов
Работа с литературой.
Оформление и подготовка
отчета по лабораторным
работам
2
0-10
Работа с литературой.
Оформление и подготовка
отчета по лабораторным
работам
4
0-10
Работа с литературой.
Оформление и подготовка
отчета по лабораторным
работам
2
0-10
8
0-30
Модуль 2
1
Техника введения
в культуру и
культивирование
изолированных
тканей растений
2
Клональное
микроразмножени
е растений
3
Культивирование
и хранение
микроорганизмов
Работа с литературой.
Оформление и подготовка
отчета по лабораторным
работам
4
0-10
Работа с литературой.
Оформление и подготовка
отчета по лабораторным
работам
Работа с литературой.
Оформление и подготовка
отчета по лабораторным
работам.
4
0-10
2
0-15
Всего по модулю 2:
Модуль 3
1
Биотехнология
Работа с литературой.
получения
Оформление и подготовка
биологически
отчета по лабораторным
активных веществ работам
и
отдельных
компонентов
микробных
клеток
2
Генетическая
Работа с литературой.
трансформация
Оформление и подготовка
растений
отчета по лабораторным
работам
3
Фитонцидные
Работа с литературой.
свойства растений Оформление и подготовка
отчета по лабораторным
работам
Подготовка к
контрольной
работе.
10
Подготовка
реферата,
презентации.
Всего по модулю 3:
ИТОГО за семестр:
0-35
4
0-10
4
0-10
2
0-15
10
28
0-35
0-100
3. Содержание дисциплины
Тема 1.1. Основные требования к лаборатории биотехнологических и
микробиологических исследований
Необходимые для работы помещения, посуда, инструменты и
оборудование. Способы стерилизации помещений, посуды и инструментов.
Требования по технике безопасности при работе в биотехнологических и
микробиологических лабораториях. Студенты на практике отрабатывают
навыки по стерилизации ламинар-бокса, по подготовке необходимых для
проведения занятий посуды и инструментов.
Тема 1.2. Приготовление питательных сред и подбор оптимальных
условий культивирования
Компоненты питательных сред: макроэлементы, микроэлементы,
источники железа, органические добавки (витамины), источники углерода
(углеводы), органические добавки (регуляторы роста). Основные питательные
среды (Мурасиге-Скуга, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга, Уайта, Хеллера,
Линсмайера-Скуга и др.). Технология приготовления питательных сред.
Стерилизация питательных сред. Способы стерилизации питательных сред.
Методики подбора питательных сред для определенных видов растений и
микроорганизмов. Подбор условий культивирования для конкретных видов
растений и микроорганизмов (жидкие или твердые среды, состав питательных
сред, гормоны, рН среды, продолжительность освещения и качество света,
температура, влажность воздуха). Студенты самостоятельно готовят и
стерилизуют питательные среды, подбирают оптимальные условия
культивирования для какого-либо вида культурного растения (томат, табак,
морковь, картофель и т.п.) или микроорганизма.
Тема 1.3. Стерилизация растительного материала
Знакомство с набором веществ, используемых в качестве стерилизующих
агентов (этиловый спирт, сулема, диацид, гипохлориты кальция и натрия,
хлорамины, хлорная известь, перекись водорода). Приготовление растворов
стерилизаторов на примере гипохлорита натрия (коммерческий препарат
«Доместос») и этилового спирта. Подбор оптимального режима стерилизации
для конкретных
частей и органов растений. Технология стерилизации
растительного материала. Выращивание стерильных проростков. На данном
занятии используются семена и проростки различных сельскохозяйственных
культур (томаты, морковь, фасоль и т.п.).
Тема 2.1. Техника введения в культуру и культивирование
изолированных тканей растений
Типы эксплантов (кончики стеблей или корней, почки, зародыши,
семядоли, молодые листья, черенки, соцветия, чешуя луковиц и др.).
Методики получения каллусных культур. Метод получения каллусной
ткани из сердцевины стебля табака, корнеплода моркови. Получение каллусной
культуры из стерильных проростков редиса. Получение каллусной ткани из
листьев асептических растений редиса, табака, томата. Методика получения
каллусных культур из изолированных кончиков корешков фасоли, из меристем
конуса нарастания ростков клубня картофеля, столонов земляники, из листьев и
черешков моркови. Пассирование каллусной ткани. Регенерация растений in
vitro на примере соматического эмбриогенеза в каллусной ткани. На этом
занятии студенты должны закрепить навыки выделения различных типов
эксплантов, получение каллусных культур и растений-регенерантов.
Тема 2.2. Клональное микроразмножение растений
Этапы клонального микроразмножения: выбор растения-донора и
изолирование эксплантов; собственно микроразмножение; укоренение
размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям;
перенос укорененных микроклонов в теплицу, выращивание растенийрегенерантов и подготовка их к посадке в полевые условия. При изучении
данной
темы
студенты
должны
освоить
технику
клонального
микроразмножения какого-либо вида растения (картофель, земляника, томат,
табак, морковь, и т.п.).
В итоге студенты должны подготовить отчет о проделанной работе, с
указанием цели и задач исследования, объекта исследования, использованных
материалов и методов, полученных результатах. Результаты должны быть
обсуждены и по данным исследования сделаны выводы.
Тема 2.3. Культивирование и хранение микроорганизмов
Принципы составления сред для культивирования микроорганизмов.
Условия культивирования микроорганизмов. Получение накопительных и
выделение чистых культур микроорганизмов. Определение чистоты
выделенной культуры. Питательные среды для культивирования и хранения
микроскопических водорослей (на примере родов Chlorella и Spirulina).
Питательные среды для культивирования дрожжей, мицелиальных грибов и
бактерий.
При освоении данной темы студенты приобретают опыт самостоятельной
работы с чистыми культурами микроорганизмов и осваивают приемы и
способы
выделения
микроорганизмов,
относящихся
к
различным
экофизиологическим группам.
Тема 3.1. Биотехнология получения биологически активных веществ
и отдельных компонентов микробных клеток
Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами. Методы
изучения образования органических кислот микроорганизмами на примере
мицелиального гриба Aspergillus niger – продуцента лимонной кислоты.
Влияние условий культивирования на биосинтез антибиотических веществ
актиномицетом Streptomyces sp. Внеклеточные (капсульные) полисахариды
микроорганизмов. Условия образования бактериями полисахаридов.
Студенты
изучают
процессы
образования
микроорганизмами
биологически активных веществ и приобретают навыки работы с
продуцентами.
Тема 3.2. Генетическая трансформация растений
Применение микроорганизмов в качестве объектов генной инженерии для
клонирования генов и создания векторов. Технологии трансформации растений
с помощью почвенных агробактерий. Векторы для трансформации растений на
основе Ti-плазмид и
Ri-плазмид. Основные этапы бактериальной
трансформации. Методы трансформации растительных клеток: метод
кокультивации с агробактерией, методы прямого переноса генов в растение.
При освоении данной темы студенты знакомятся с основными методами
бактериальной трансформации растений и технологиями получения
трансгенных растений.
Тема 3.3. Фитонцидные свойства растений
Понятие о фитонцидах. Фитонциды как фактор иммунитета растений.
Антибиотические вещества мхов, лишайников, базидиомицетов и высших
растений. Определение фитонцидной активности летучих выделений и
внутриклеточных антибиотических веществ растений в отношении
сапрофитных микроорганизмов воздуха и условно-патогенных бактерий.
Студенты на практике оценивают фитонцидную активность разных видов
растений и делают выводы о влиянии фитонцидов на степень загрязнения
воздуха микроорганизмами.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
4. Вопросы для самостоятельной работы
Технология приготовления сред для однодольных и двудольных
растений.
Подготовка помещения, посуды и инструментов для проведения
манипуляций с растительными тканями.
Подбор стерилизующих агентов, выбор оптимального режима
стерилизации растительного материала.
Выделение различных типов эксплантов, получение каллусных культур и
растительных регенерантов.
Натуральные, синтетические и полусинтетические среды для
культивирования микроорганизмов.
Биотехнология получения антибиотиков.
Трансгенные растения с новыми биологическими свойствами.
По итогам самостоятельного изучения указанных вопросов студенты
пишут контрольную работу.
5. Темы рефератов
1. Методы получения безвирусного посадочного материала (термотерапия,
хемотерапия).
2. Культура апикальных меристем как метод оздоровления растений
картофеля от вирусных болезней.
3. Микроклональное размножение культур промышленного цветоводства.
4. Микроклональное размножение тропических и субтропических растений.
5. Микроклональное размножение плодово-ягодных культур.
6. Микроклональное размножение древесных растений.
7. Получение посадочного материала луковичных цветочных растений
8. Особенности клонального микроразмножения представителей рода
Brassica.
9. Методика получения эмбриоидов моркови, пшеницы, ячменя и других
растений.
10.Принципы конструирования устойчивых к болезням растений методами
генной и клеточной инженерии.
11.Флуоресцентно-микроскопические методы выявления и учета
микроорганизмов в образцах естественных субстратов.
12.Лиофильный способ хранения микроорганизмов.
13.Методы культивирования хемолитотрофных групп мироорганизмов.
14.Векторы для трансформации растений на основе Ti-плазмид и Riплазмид.
15.Симбиогенез.
Студенты на основе литературных источников и интернет-ресурсов
готовят реферат (объем 8-10 стр.), делают презентацию и доклад.
6. Вопросы к зачету
предъявляются к лаборатории биотехнологии и
1. Какие требования
микробиологии?
2. Назовите основные компоненты питательных сред, наиболее часто
используемых для каллусогенеза, различных типов морфогенеза и клонального
микроразмножения.
3. Назовите наиболее известные питательные среды, используемые для
культивирования клеток и тканей растений. Их отличительные особенности.
4. Опишите технологию приготовления питательных сред.
5. На какие условия обращают особенное внимание при культивировании
растений in vitro?
6. Какие типы эксплантов вы знаете? Технология их выделения.
7. Какие стерилизующие агенты используют для обработки эксплантов?
8. В чем заключается технология стерилизации эксплантов?
9. Каким образом получают стерильные проростки растений?
10. Что понимают под каллусной тканью? Получение каллусной ткани и
возможные нежелательные явления.
11. Что такое пассирование? С какой периодичностью оно проводится?
12. Назовите условия, необходимые для получения растений-регенерантов
in vitro.
13. Что понимают под микроклональным размножением растений? Назовите
основные этапы микроклонального размножения растений.
14. Назовите физические факторы, влияющие на процесс микроклонального
размножения.
15. Какова роль генотипа и экспланта в эффективности микроклонального
размножения?
16. Характеристика и принципы классификации питательных сред для
культивирования микроорганизмов.
17. Какие методы получения накопительных и чистых культур
микроорганизмов вы знаете?
18. Назовите методы хранения микроорганизмов.
19. Продуцентами каких биологически активных веществ могут быть
микроорганизмы?
20. Как условия культивирования влияют на биосинтез биологически
активных веществ микроорганизмами?
21. Назовите основные методы трансформации растительных клеток.
22. Что такое вектор и основные типы векторов?
23. Охарактеризуйте этапы агробактериальной трансформации растений.
24. Что такое фитонциды? Дайте характеристику антибиотических веществ,
образуемых растениями.
25. Назовите методы изучения фитонцидных свойств растений.
7. Учебно-методическое обеспечение дисциплины
7.1. Рекомендуемая литература
Основная:
1. Клунова, С. М. Биотехнология. М.: «Академия», 2010. – 256 с. Гриф УМО
2. Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. для студ. вузов/ ред. В. С.
Шевелуха. - 3-е изд., перераб. и доп.. - Москва: Высшая школа, 2008. - 710
с. Гриф МО
3. Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология. М.: Юрайт, 2012. – 445 с.
Гриф УМО
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Дополнительная:
Боме Н.А., Белозерова А.А. Основы биотехнологии растений: Учеб.
пособие. Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 2005. 72 с.
Боме Н.А., Белозерова А.А. Основы биотехнологии растений: Учеб.
пособие. 2-е изд-е. Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 2007. 96 с. Гриф УМО
Егорова, Т. А.
Основы биотехнологии: учеб. пособие для студ. вузов,
обуч. по спец. "Биология"/ Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина. Москва: Академия, 2003. - 208 с. Гриф УМО
Егорова, Т. А.
Основы биотехнологии: учеб. пособие для студ. вузов,
обуч. по спец. "Биология"/ Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина. 2-е изд., стер. - Москва: Академия, 2005. - 208 с. Гриф УМО
Практикум по росту и устойчивости растений / Под ред В.В. Полевого,
Т.В. Чирковой. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2001. 212 с.
Лутова Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник. СПб.: Изд-во С.Петерб. ун-та, 2003. 228 с.
Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. для студ. вузов, обуч. по
сельскохоз., естественнонауч. и пед. спец./ ред. В. С. Шевелуха. - 2-е изд.,
перераб. и доп.. - Москва: Высшая школа, 2003. - 469 с. Гриф УМО
8. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск: Сиб. унив. изд-во,
2004. 496 с. Гриф МО
9. Практикум по микробиологии / Под. ред. А.И. Нетрусова. М.: ИЦ
«Академия», 2005, 608 с. Гриф МО
10. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза
растений. М.: Наука, 1964. 272 с.
11. Промышленная микробиология: [учеб. пособие для вузов по спец.
"Микробиология" и "Биология"/ ред. Н. С. Егоров. - Москва: Высшая
школа, 1989. - 686 с. Гриф ГК СССР
12. Колоколова, Н.Н. Микроорганизмы в природных ценозах. Учебное
пособие. Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 2008. – 136 с. ИН
13. Теппер, Е.З. и др. Практикум по микробиологии. М.: Дрофа», 2005. -256 с.
Гриф УМО
7.2. Средства и материально-техническое обеспечение дисциплины
На занятиях используются семена различных культурных растений,
чистые культуры микроорганизмов, продуценты биологически активных
веществ, готовые питательные среды, компоненты для приготовления
питательных сред, химические реактивы, лабораторная посуда и инструменты.
Имеется
специализированная
лаборатория
биотехнологических
и
микробиологических исследований. Для отработки технологии клонального
микроразмножения
растений
и
культивирования
микроорганизмов
используются термостаты, климатическая камера, ламинарный шкаф,
сухожаровой шкаф, автоклав, весы, дистиллятор.