Меджидов М.М. Лабораторная диагностика урогенитального
реклама
Составители: зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии профессор Меджидов М.М., доц. Саидов М.С., доц. Царуева Т.В., асс. к.м.н. Газиев Г.М., асс.к.м.н. Саидова Б.М., асп. Акаева Ф.С. Рецензент: зав. кафедрой патологической физиологии, доктор медицинских наук, профессор Саидов М.З. Рекомендовано центральным координационным методическим советом ДГМА для печати и использования в учебном процессе (протокол № 9 от 6.05.2004г.) 3 Список сокращений: ИФМ – иммуноферментный метод МИК – минимальная ингибиторная концентрация НИФ – непрямой иммунофлюоресцентный метод ОП – оптическая плотность ПИФ – прямой иммунофлюоресцентный метод ПЦР – полимеразно-цепная реакция РТ – ретикулярное тельце ФСБ – фосфатно-солевой буфер ЭТ – элементарное тельце 4 Введение Хламидозы – группа инфекционных заболеваний человека, животных и птиц, вызываемых хламидиями. Хламидийная инфекция является причиной различных заболеваний человека: болезней глаз, урогенитального тракта, суставов и других органов. Особенно большое значение приобретают урогенитальных хламидийные инфекции, которые относятся к числу наиболее распространенных заболеваний, передаваемых половым путем. По данным ВОЗ генитальный хламидоз занимает 2-е место среди передаваемых половым путем заболеваний после трихомонадных инфекций (1990). Полагают, что около 50% мужчин и женщин земного шара страдают урогенитальным хламидиозом (1999). Хламидии могут быть переданы от матери плоду, оказывая отрицательное влияние на репродуктивное здоровье. Успешная борьба с этими заболеваниями возможна лишь при условии их своевременного и полного выявления, а это, учитывая высокую частоту бессимптомных форм инфекции, представляет значительные трудности. В предлагаемом учебном пособии описываются рутинные и современные методы исследования, их диагностическое значение и интерпретация полученных результатов. Пособие может быть рекомендовано студентам медвузов, слушателям курсов ФПО, врачам – лаборантам, акушерам-гинекологам, урологам и др. 5 1. Краткие сведения об урогенитальном хламидиозе Хламидии паразитизмом, – грамотрицательные которые выделены бактерии с облигатным внутриклеточным в отдельный порядок Chlamydiales, семейство Chlamidiaceae род Chamydia. К этому роду относятся 4 вида: C.trachomatis. C.psittaci, C.pneumoniae, C.pecorum. C.trachomatis по антигенной структуре имеет 15 сероваров (от А до L). Различные серовары C.trachomatis являются возбудителями венерической лимфогранулемы (L1 – L3), трахомы и коньюктивитов с включениями (А,В,Ва и С), а серовары Д-К – возбудителями урогенитального хламидиоза. Хламидии имеют две формы существования: внеклеточную – элементарное тельце (ЭТ) и внутриклеточную – ретикулярное тельце (РТ). ЭТ – зрелая, метаболически неактивная форма, способная существовать вне клетки хозяина. Это выоскоинфекционная форма возбудителя, имеющая сферическую форму диаметром 02-03 мкм. ЭТ окружены малопроницаемой клеточной стенкой, имеют плотный нуклеоид, что обеспечивает резистетнтность к факторам внешней среды, в т.ч. и к действию антимикробных препаратов. ЭТ прикрепляются к чувствительным клеткам и поглощаются ими с образованием внутриклеточной вакуоли. Они превращаются в метаболически активные неинфекционные внутриклеточные формы – РТ. РТ образуются через 6-8 часов после инфицирования клетки хозяина, имеют сферическую форму, диаметр – 0,6 -1,5 мкм. РТ делятся бинарно внутри образующейся эндосомы, которая представляет собой микроколонию и выявляется при микроскопии как включение. После 8-12 циклов деления РТ выходит из клетки превращаясь через стадию промежуточных телец в ЭТ. Полный цикл репродукции хламидий – 48-72 часа, что необходимо учитывать в терапии хламидийной инфекции. РТ используют субнитраты клетки – хозяина для синтеза РНК, протеинов, но они не способны синтезировать энергетические субстраты (АТФ, ГТФ). Они являются «энергетическими паразитами». РТ чувствительны к антибиотикам тетрациклиновой группы, макролидам, фторохинолонам и др. 6 Хламидии чувствительны к действию УФ излучения и высокой температуре. При температуре 370 ЭТ теряют инфекционность в течение 24-36 часов, а при t 18-190 C эти же штамы хламидий могут сохранять жизнеспособность в обычной воде до 5 суток. Хламидии быстро инактивируются под действием высокой температуры при 600С – в течение 15 минут, при кипячении погибают через 3 минуты. Урогенитальные штаммы хламидий высокочувствительны к действию дезинфицирующих веществ 700 этиловому спирту, 0,5 % раствору нитрата серебра, 2 % раствору лизола, 0, 1 % йодида калия, 0,5% перманганата калия, 25% перекиси водорода. 3% раствор хлорамина инактивирует хламидии в течение 1 минуты. Источником хламидиоза являются больные и носители. Особую опасность представляют последние, т.к. у них отсутствуют клинические признаки заболевания. Передача заболевания происходит половым путем, не исключен также контактнобытовой путь. Доказана передача хламидий от инфицированной матери во время беременности. Инкубационный период заболевания составляет 7-14 дней. После инкубационного периода появляются маловыраженные симптомы урогенитального хламидиоза: выделения, зуд, жжение при мочеиспускании. Клиника урогенитального хламидиоза весьма разнообразна: уретриты, эпидидимиты, простатиты, цервициты, эндометриты. Хламидийная инфекция обуславливает развитие бесплодия, патологии беременности и плода. C.trachomatis выделяют при болезни Рейтера. Это заболевание характеризуется триадой признаков: поражение мочеполовых органов (уретрит или простатит), заболевание глаз – (коньюктивит) и суставов (артрит). В 30-50% случаях урогенитальная хламидийная инфекция протекает бессимптомно. Наличие бессимптомных и персистирующих форм инфекции затрудняют диагностику урогенитального хламидиоза, в связи с чем ведущее значение приобретают методы лабораторной диагностики. 7 2. Методы лабораторной диагностики Взятие материала является ответственным этапом исследования. При заборе материала персонал должен соблюдать те же предосторожности, что и при исследовании любого инфекционного материала. При взятии соскоба из уретры пациента необходимо предупредить, что он не должен мочиться за 1-2 часа до забора материала. Исследуемый материал на хламидии забирают следующим образом: - у мужчин специальным ватным тампоном, щеточкой или зондом, который вводят в уретру на глубину 2-4 см, вращательным движением производят забор материала. У женщин забор производят из уретры и цервикального канала. Из уретры материал берут вращательным движением тампона, который вводят на глубину 1-1,5 см, шейку матки необходимо промокнуть ватным тампоном для удаления избытков слизи. Затем вторым тампоном производят забор материала из цервикального канала вращательным движением, не касаясь стенок влагалища. Материал должен содержать эпителиальные клетки. Материал из уретры следует брать после предварительного массажа ее в дистальном направлении через влагалище. Материал из канала шейки матки можно также взять ложечкой Фолькмана с использованием влагалищных зеркал. Для лабораторной диагностики хламидиозной инфекции применяются следующие методы: 1. Бактериоскопический (микроскопический); 2. Бактериологический метод (изоляция возбудителя из тканей больного определение его инфекционности) 3. Серологический метод, (НИФ, ИФМ, и др.) 4. Молекулярно - биологический и 8 2.1. Бактериоскопический (микроскопический метод). 2.1.1. Микроскопический метод для обнаружения цитоплазматических включений хламидий в эпителиальных клетках. Взятый материал распределяют тонким слоем на поверхности чистого, обезжиренного предметного стекла. Фиксацию мазков производят ацетоном, метиловым или этиловым спиртом. Окраску фиксированных мазков из клинического материала (соскобы из уретры, шейки матки и др.) производят по Романовскому Гимза. Цитоплазматические включения часто определяются вблизи ядра в виде «шапочки», иногда имеют разнообразную форму и окраску. Включения содержат ретикулярные тельца, которые имеют сине-фиолетовый цвет. Мелкие зрелые структуры (элементарные тельца) имеют фиолетово-красный цвет. Включения по цвету и структуре отличаются от ядра клетки и цитоплазмы. На ранних стадиях включения увеличиваются в размерах и могут занимать большую часть цитоплазмы, оттесняя ядро на периферию клетки. Цитоплазматические включения необходимо дифференцировать от пигментных гранул – черного или темно-зеленого цвета, зерен муцина, окрашенных в красный или синий цвет, находящихся в цитоплазме отдельно друг от друга. Для постановки диагноза хламидийной инфекции достаточно обнаружить одно типичное цитоплазматическое включение. Метод характеризуется низкой чувствительностью (до 15-20%) и редко применяется в настоящее время с целью диагностики урогенитального хламидиоза. Этот метод рекомендован для диагностики коньюктивита новорожденных и при острых глазных инфекциях у взрослых, когда чувствительность метода достигает 90100%. 2.1.2. Прямой иммунофлюоресцентный метод (ПИФ) Метод предполагает выявление антигенов хламидий в исследуемом клиническом материале. Для нанесения материала применяются специальные деколированные предметные стекла. При их отсутствии применяются чистые, обезжиренные предметные стекла без царапин. Мазок фиксируют охлажденным (40С) ацетоном или метанолом в течение 5-10 минут. На фиксированный мазок наносят раствор флюоресцирующих 9 антител (раствором моноклональных или поликлональных, меченных ФИТЦ с синькой Эванса) в количестве 25-50 мкл. Мазок инкубируют во влажной камере 20-25 минут, затем препарат ополаскивают фосфатнобуферным раствором 2 раза по 5 минут. После высушивания препарат исследуют в люминесцентном микроскопе при увеличении 6001000 с возбуждающими фильтрами ФС1-2, БС8-2 и запирающим фильтром С3С24-4. Микроскопию производят с использованием нефлюоресцирующего иммерсионного масла, объектива 90-х, окуляра 7-х. Результат считается положительным, если в мазке обнаруживают ярко-зеленое свечение в виде точки (для элементарного тельца) или овала (для ретикуляционных телец). Тельца располагаются отдельно, на поверхности эпителиальных клеток или внутриклеточно. Эпителиальные клетки окрашены в красно-оранжевый цвет. В этих случаях положительная оценка теста предполагает выявление в препарате не менее 10 элементарных или ретикулярных телец четко выделяющихся на красном фоне контрастно-окрашенных клеток. Результат считается отрицательным, если в мазке отсутствует специфическое свечение при обязательном наличии не менее 50 эпителиальных клеток. При ограниченном количестве эпителиальных клеток в клинических образцах цитоплазматические включения обнаруживаются редко. При отсутствии в препарате эпителиальных клеток, но при обнаружении образований, схожих с хламидиями, следует повторить исследование, чтобы устранить сомнения в правильности взятия материала. Контроль излеченности с помощью определения люминесцирующих антител следует проводить не ранее, чем через 1-1,5 мес. после окончания лечения антибиотиками, так как возможно получение ложноположительных результатов из-за не достаточно быстрой элиминации погибших хламидий. Применение диагностических наборов, содержащих люминесцирующие моноклональные антитела к родо-видоспецифическим антителам хламидий значительно увеличивает чувствительность этого метода. Метод прямой иммунофлюоресценции обеспечивает диагностику хламидийной инфекции у 60% - 70% инфицированных. Преимуществом метода является его простота, быстрота исполнения, высокая специфичность. Недостатками прямого иммунофлюоресцентного метода следует признать невозможность длительного сохранения окрашенных препаратов, а также частое проявление в препаратах из клинического материала неспецифической флюоресценции, субъективизм в трактовке результатов. 10 2.2 Бактериологический метод Хламидии являются облигатными внутриклеточными паразитами и на искусственных питательных средах не растут. Заражение желточного мешка куриного эмбриона и белых мышей редко применяются в лабораторной диагностике хламидиозов. Более широкое применение нашло выделение хламидий путем заражения первичных или перевиваемых клеточных культур. В большинстве зарубежных лабораторий с этой целью используют культуру клеток. Мак-коя, обработанных антиметаболитами. Эта культура признана ВОЗ (1977) наиболее чувствительным и специфичным для диагностики хламидийной инфекции. В качестве культур клеток применяются также Hela , L-929, 229 и ВНК – 21, др. Исследуемый материал помещают в 1 мл охлажденной стерильной транспортной среды со стеклянными бусинками (для размельчения материала). В качестве транспортной среды используют среду 199 или среду Игла с добавлением 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. В транспортную среду добавляют 40 ЕД на мл гентамицина или другого антибиотика и нистатина 25 мкг/мл.для подавления сопутствующей флоры. Антибиотки выбирают не действующие на жизнедеятельность хламидий. При невозможности своевременной доставки материала в лабораторию его хранят в холодильнике в течение суток (при – 200С не более 2-х недель). Для выделения хламидий клетки Мак Коя, НеLa, L-929 выращивают на покровных стеклах, помещенные в плоскодонные пробирки. Посевная доза клеток – 100 тыс. кл/мл среды. В питательную среду 199 добавляется 5% сыворотки крупного рогатого скота. Более оптимальной считают среду RРМ I- 1640 Через 24 часа культивирования клетки дают рост в виде монослоя. До заражения исследуемым материалам клетки обрабатывают ДЕАЕ-декстраном (30 мкг/мл) в течение 30 минут. Затем на монослой клеток наносят 0,2 исследуемого материала и центрифугируют при 3000 об/мин в течение часа (метод принудительной адсорбции). Затем клетки помещают в питательную среду с добавлением 5% эмбиональной сыворотки крупного рогатого скота, 5% 0,5 М раствора глюкозы и с антибиотиком циклогексамидом (0,5-1,0 мкг/м1) подавляющую синтетическую активность клетки хозяина. Дальнейшее культивирование проводят в течение 48-72 часов при температуре 35,50С. 11 Оценку результатов производят через 48-72 часа методами прямой или непрямой люминисцетной микроскопии, параллельно одно стекло окрашивается по РомановскомуГимза или раствором Люголя. При получении отрицательных результатов рекомендуется произвести пересев – пассаж материала. Для этого из пробирки через 72 часа после инфицирования сливают среду, стекла растирают в стерильной ступке, добавляют слитую среду и 1 мл свежей среды, содержащий 2% эмбриональной сыворотки, 1% глюкозы и антибиотик (гентамицин). Инфицирование монослоя и оценку результатов производят по вышеуказанной методике. При учете результатов – наличие хотя бы одного цитоплазматического включения, имеющего специфическое окрашивание, форму и структуру расценивается как положительный результат, свидетельствующий о хламидийной инфекции. Метод является эталонным, «золотым «стандартом в лабораторной диагностике хламидиозов. Он имеет 100% специфичность и чувствительность 70-80%, которая зависит от количества инфицированных эпителиальных клеток и правил взятия, транспортировки материала. Оснащение: стандартное оборудование для лаборатории культуры клеток (бокс или ламинарный шкаф, термостат, СО2 – инкубатор, холодильник), морозильная камера (700С), центрифуга, пипеточные дозаторы, пробирки плоскодонные, среда 199 (Игла), эмбриональная сыворотка рогатого скота, антибиотики, стекла покровные, ступки фарфоровые. Оборудование для проведения ПИФ (люминесцентный микроскоп, реактивы). Определение чувствительности хламидий к антибиотикам. Определение чувствительности хламидий к антибиотикам является достаточно сложным и трудоемким методом. Материал от больного помещается в 3 пробирки, содержащие монослой чувствительных клеток. Через 36 часов после процедуры инфицирования культур клеток одно стекло делится на 2 части. Одна часть окрашивается раствором Люголя, вторая – обрабатывается флюоресцирующими моноклональными антителами к хламидиям (ПИФ). Из оставшихся 2 пробирок через 72 часа после заражения сливают среду, стекла растирают в ступке, добавляют слитую среду, 1 мл свежей ростовой культуральной среды с 2% эмбриональной сыворотки, антибиотики. 12 Инфицирование клеточного монослоя осуществляют по стандартной методике (1-й пассаж). Аналогичную процедуру проводят через 72 часа после инфицирования (2-й пассаж). В случае обнаружения хламидий во втором пассаже зараженных клеток культуральную жидкость сливают, стекла, где находятся клетки с хламидиями, растирают в стерильных ступках, материал объединяют с культуральной жидкостью и разливают по 0,3 мл в 24 пробирки, содержащие покровные стекла монослоем. После процедуры инфицирования добавляется среда с антибиотиками. Для каждого антибиотика берется минимальная ингибирующая концентрация (МИК) и двойная МИК, МИК определяется предварительно в опытах с перевиваемыми штаммами С.trachomatis. Титрование антибиотиков проводится на культуре клеток, зараженных С.trachomatis с множественностью заражения 20%. Эритромицин добавляется в концентрации 50 мкг/мл (МИК) и 100 мкг/мл ципрофлоксацин – 25 мкг/мл (МИК) и 50 мкг/мл (МИК) и 50 мкг/мл, ломефлоксацин 20 мкг/мл (МИК) и 40 мкг. С каждой концентрацией испытуемого антибиотика берут 2 пробирки положительного (перевиваемый штамм С.trahomatis c множественностью заражения не менее 20%) и 2 – отрицательного контроля с незараженным монослоем чувствительных клеток. Через 72 часа после добавления антибиотиков стекла с клеточным монослоем фиксируют и проводят ПИФ или окраску на наличие гликогена (люголевским раствором). Отсутствие включений при обеих концентрациях антибиотика трактуется как наличие чувствительности к данному препарату. Отсутствие включения при двойной МИК, (при наличии их при МИК) учитывается как слабая чувствительность. 2.2. Серологические методы диагностики Методы серологической диагностики хламидиоза основаны на определении специфических антител в сыворотке крови и других секретах инфицированных. Для серологической диагностики применяются иммунофлюоресценции (НИФ) и иммуноферментный метод (ИФМ). метод непрямой 13 2.3.1.Непрямой метод иммунофлюоресценции (НИФ). При проведении НИФ используются предметные стекла с заранее нанесенным антигеном. Сыворотку больных наносится на антиген, затем на мазок наносят антивидовую люминесцирующую сыворотку. При наличии соответствующих антигену антител в сыворотке больных образуется комплекс антиген – антитело к которому присоединяются меченые флюоресцирующие антитела к глобулину человека. Методика постановки: Стекла с антигенами и люминесцирующую сыворотку вынимают из морозильной камеры и оставляют при комнатной температуре на 20-60 минут. Каждое разведение испытуемых сывороток (1:16, 1:32, 1:64) начиная с максимального наносят на лунки с антигенами микропипеткой в объеме 5-7 мкл. Стекла с нанесенными сыворотками помещают во влажную камеру при температуре 37 0 на 30 минут. После инкубации материал смывают фосфатно-солевым буфером и трижды отмывают в трех сменяемых порциях ФСБ в течение 5-7 минут. После третьей промывки стекла подсушивают на воздухе, наносят люминесцирующую сыворотку в объеме 5-7 мкл на каждую лунку. Стекла помещают во влажную камеру при t 370С на 30 минут, после чего трижды отмывают ФСБ, как описано выше. После высушивания на воздухе наносят монтирующего жидкость и накрывают покровным стеклом. Лишнюю монтирующую жидкость и образующиеся воздушные пузырьки удаляются фильтровальной бумагой, стекла тщательно протирают и микроскопируют в люминесцентном микроскопе с использованием нефлюоресцирующего иммерсионного масла. С каждой группой исследуемых сывороток необходимо ставить контроли: контроль на отсутствие неспецифического свечения, контроль с положительной и отрицательными сыворотками. Оценку реакции проводят по степени специфической флюоресценции по 4-х бальной системе. ++++ - очень яркая флюоресценция элементарных и ретикулярных телец хламидий +++ - четкая яркая зеленая флюоресценция элементарных и ретикулярных телец хламидий ++ - удовлетворительная зеленая флюоресценция элементарных и ретикулярных телец 14 + - крайне слабая земная флюоресценция элементарных и ретикулярных телец хламидий. При отрицательном результате флюоресценция отсутствует Диагностическим титром при однократном исследовании считается титр 1:32. 2.3.2. Иммуноферментный метод (ИФМ) Для серологической диагностики урогенитального хламидиоза часто используют ИФМ. Суть метода полистироловых заключается планшетах в следующем: обрабатывается антиген испытуемой фиксированный сывороткой, а на затем антивидовым иммуноглобулином, меченым ферментом, который выявляется после добавления субстрата. Для постановки реакции у обследуемого берут кровь в количестве 3-5 мл в сухую стерильную пробирку. Если реакция сразу не ставится, сыворотку можно хранить в холодильнике до 5 дней, при – 200С 1 месяц. Схема проведения анализа. 1. Внесение испытуемых и контрольных сывороток в планшеты (стрипы) с сорбированным хламидийным антигеном. Инкубация при температуре 370С в течение 30 минут для взаимодействия с хламидийным антигеном специфических антител. 2. Отмывание планшета от непровзаимодействовавших антител (иммуноглобулинов) ФСБ с твином 5 - кратно вручную или вошером. 3. Инкубация образовавшегося комплекса антиген-антитело с антисывороткой к иммуноглобулинам человека, меченной ферментом в течение 30 минут. 4. По окончании инкубации непровзаимодействовавших меченых планшеты антител. отмывают Отмывание от производят раствором ФСБ 5 - кратно. 5. Проведение ферментативной биохимической реакции, в результате которой образуется цветной продукт. Для этого в тест-системе «Хламибест» (ЗАО «Вектор Бест») добавляют раствор тетраметил бензидина (ТМБ) и инкубируют 15 минут при температуре 20-250С, после чего добавляют в лунки по 50 мкл стоп-реагената и проводят учет реакции. Интенсивность окраски раствора соответствует количеству фермента в смеси, следовательно, количеству образовавшихся комплексов антиген-антитело, 15 число которых определяется содержанием противохламидийных антител в сыворотке сыворотке крови больного. Учет результатов. Результат ИФМ регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине 450 нм. Результаты исследования оценивают при соответствующих значениях ОП контролей. Серологические методы, в частности, ИФМ позволяют выявить антитела М, G, А в сыворотке крови пациента. При острой инфекции диагностическое значение имеет обнаружение антихламидийных 1gМ антител. Титры антител выше 1:64, как правило, свидетельствуют о наличии заболевания. Выявление антител в титрах 1: 16 и 1:32 может говорить как о перенесенном заболевании, так и начале заболевания. Для уточнения необходимо повторить исследование через 3-4 недели. Нарастание титров антител в 4 раза и больше подтверждают диагноз заболевания. Если при повторном исследовании нарастания титров не отмечается, то это свидетельствует в пользу перенесенной инфекции. Согласно инструкции к тест-системам для определения 1gG (ЗАО «Вектор-Бест») прилагается следующая интерпретация результатов: Оптическая плотность сыворотки Результат Титр 1gG От О до (ОП Крит – 0,05) Отрицательный Менее 1:10 От (ОП Крит-0,05 до ОП Крит+0,05) Сомнительный 1:10 От (ОПКрит+0,05) до 2хОПкрит Слабо положительный 1:20 От 2хОПКрит до 3хОПкрит Положительный 1:40 От 3хОПКрит до 7 х ОПкрит Резко положительный 1:80 – 640 Диагностическая значимость (специфичность и чувствительность) ИФМ при урогенитальном хламидиозе составляет не менее 90-95%. При бессимптомных инфекциях у мужчин и женщин чувствительность метода снижается до 40 – 50%. Серологический метод информативен для определения специфических до 40 - 50 % иммуноглобулинов при генерализованных формах инфекции, а также при 16 инфицированнии органов малого таза, пневмониях новорожденных т.е. в тех случаях, когда имеются затруднения с взятием материала для индикации возбудителя. При локализованных формах урогенитальной инфекции с помощью и иммуноферментного метода могут быть определены секреторные 1gА в цервикальном секрете у женщин, в соке простаты, в сперме у мужчин. Серологический метод имеет ограниченное применение для определения излеченности от хламидийной инфекции, т.к. антитела сохраняются в организме и после излечения в течение нескольких месяцев. К недостаткам ИФМ следует отнести и возможность ложно-положительных результатов. Оснащение: спектрофотометр, вошер, термостат, холодильник, пипеточные дозаторы.Диагностическая иммуноферментная тест-система для определения 1gG, 1gМ, 1gА, набор реагентов для ИФМ. Молекулярно–биологический метод (ДНК) диагностики 2.3. Сущность взаимодействии метода ДНК нуклеиновых диагностики заключается кислот, которое позволяет в комплементарном с высокой точностью идентифицировать последовательность нуклеотидов в генах искомого микроорганизма. Из методов генной диагностики наибольшее распространение получила полимеразно-цепная реакция (ПЦР). ПЦР основан на том, что в исследуемый образец с предполагаемым инфекционным агентом вносятся праймеры (нуклеотидные последовательности, коплементарные генетическому материалу искомого возбудителя). Праймеры способны специфически взаимодействовать с ДНК и РНК микроорганизма. Сначала молекула ДНК нагреванием разделяется две цепи, затем в присутствии праймеров происходит связывание их с комплементарными участками ДНК. Затем синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК – полимеразы. Получаются две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. ПЦР – циклический процесс: денатурация, отжиг праймеров, синтез праймеров и затем синтез ДНК. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации. 17 Идентификация синтезированного участка ДНК производится методом иммуноферментного анализа или методом электрофореза. В ПЦР используют любой биологический материал – сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат и др. Для диагностики урогенитального хламидиоза можно производить исследование первой порции утренней мочи. Исследование утренней мочи более чувствительно при обследовании мужчин, у женщин предпочтение отдается исследованию цервикальных образцов. Методика ПЦР состоит 3-х основных процедур: Подготовки исследуемого материала, которая сводится к изоляции нуклеиновой кислоты, собственно ПЦР и обнаружении амплифицированной ДНК. Методика постановки реакции более подробно изложена в соответствующих методических рекомендациях. Подготовка проб материала должна производиться в условиях исключающих ложноположительные результаты из-за перекрестного загрязнения исследуемых проб. Для исключения ложноотрицательных результатов необходимо выделение ДНК (либо РНК), что позволяет осуществлять концентрирование исследуемой матрицы нуклеиновой кислоты в малом объеме. ДНК – матрицы генов в условиях инактивации ДНКазы пригодны для ПЦР в течение длительного времени – десятков лет. Чувствительность метода очень высокая – для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, т.е. одной бактерии (вируса). По данным различных авторов чувствительность метода достигает 100%. Все перечисленные методы диагностики урогенитального хламидиоза имеют свои преимущества и недостатки. Правильный выбор метода (комплекса методов) имеет важное значение для установления диагноза заболевания. Сотрудники ЦКВИ (Г.А.Дмитриев, 2002) предлагает следующий алгоритм обследования пациентов с подозрением на урогенитальный хламидиоз: - для диагностики симптоматических форм с клиническими проявлениями – ПИФ в сочетании с культуральным или ПЦР методом; - для диагностики бессимптомных и осложненных форм хламидиоза – ИФМ в комплексе с культуральным методом или ПЦР. ПЦР метод полезен при выявлении 18 хламидий вне зависимости от присутствия сопутствующих антител (для обнаружения потенциально «слепого» антигена, не выявляемого другими способами.) Определенной диагностической проблемой является оценка критерия излеченности: сроки исследования после терапии и используемые тесты. Как оптимальный, авторы предлагают исследование материала, полученного от пациента через 1 месяц после окончания лечения в культуре клеток. При отсутствии возможности провести бактериологическое исследование может быть рекомендован ПИФ, но не ранее через 1-1,5 мес. после окончания лечения. Меры безопасности при диагностике урогенитального хламидиоза. Взятие клинического материала, его хранение и транспортировку проводят, соблюдая режим работы бактериологических лабораторий. Необходимо исключить возможность контаминации исследуемым материалом кожи рук и слизистых глаз, полости рта. Урогенитальные штаммы C. trachomatis высокочувствительны к действию 2% раствора лизола, 3% раствора хлорамина, 70 град. этилового спирта, 0,5% раствора перманганата калия, 25% раствора перикиси водорода. 3% растор хлорамина инактивирует хламидии в течение 1 минуты. Хламидии чувстивительны к действию высокой температуры. При температуре 80 град. хламидии погибают через 10 минут, при кипячении через 3 минуты. 19 Список использованной литературы: 1. Воробьев А.А. Микробиология и иммунология.- М.: Медицина, 1999.- 464 с. 2. Внутриутробные инфекции и патология новорожденных /Под ред. К.В. Орехова.- М.: Медпрактика, 2002.- 252 с. 3. Дмитриев Г.А. Урогенитальная хламидийная инфекция. Подходы к диагностике и терапии // ИППП.- № 2.- 2002. 4. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза.- М., 1999.- 19 с. 5. Лобзин Ю.В., Волжанин В.М.. Новое в диагностике и лечении распространенных форм мочеполового хламидиоза // Вестник РАМН.- 2003.№ 10.- С. 29-34. 6. Ориэл Дж., Риджуэй Д. Хламидиоз: Пер. с англ..- М.: Медицина, 1984.- 190 с. 7. Саидов М.С. Микробиологическая диагностика урогенитального хламидиоза: Метод. пособ.- Махачкала, 1993. 8. Финогеев Ю.П., Лобзин Ю.В., Винакмен Ю.А. и др. Клинико-лабораторная диагностика инфекционных болезней.-СПб.: Фолиант, 2001.- 379 с. 9. Шаткин А.А., Мавров И.И. Урогенитальные хламидиозы.- К.: Здоров’я, 1983.- 200 с. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ Дагестанская Государственная медицинская академия ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА (Учебное пособие для студентов, слушателей ФПО, врачей-лаборантов) Махачкала - 2005 г.
