Федеральная целевая программа

<Номер соглашения>
<Номер постера>
Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Науки о жизни
Тема: Получение персонализированных клеточных препаратов на основе антиген-активированных
дендритных клеток и антиген-специфических Т-лимфоцитов, предотвращающих рецидив опухоли
Руководитель проекта: рук. лаб. молекулярной иммунологии
Соглашение 14.607.21.0043
на период 2014 - 2016 гг.
НИИФКИ Сенников С.В.
Получатель субсидии: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт
клинической и фундаментальной иммунологии» (НИИФКИ)
Цели и задачи проекта
Цели проекта: Разработка лабораторного регламента получения клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т-лимфоцитов для предотвращения рецидива опухоли.
Задачи проекта:
1. Разработка лабораторного регламента культивирования зрелых дендритных клеток (ДК) у больных раком молочной железы (РМЖ), колоректальным раком (КРР) и немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ).
3. Разработка методики создания ДНК-конструкций, кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований.
4. Разработка методики доставки антигенного материала в дендритные клетки.
5. Разработка лабораторного регламента получения фракции активированных мононуклеарных клеток больных РМЖ, КРР и НМРЛ, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против опухолевых клеток и лабораторного регламента
использования факторов-регуляторов активности клеточных препаратов.
6. Разработка лабораторного регламента получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток РМЖ.
7. Создание опытного образца ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы ОАА, в количестве, достаточном для проведения доклинических исследований.
8. Разработка плана и проведение доклинических исследований;
9. Разработка проекта протокола клинического исследования клеточного препарата для медицинского применения.
Ожидаемые результаты проекта
- Экспериментальные образцы ДНК конструкций, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований.
- Лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток
- Лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью против опухолевых клеток.
- Методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки.
- Проект протокола ограниченного клинического исследования эффективности и безопасности противоопухолевой клеточной иммунотерапии пациентов с онкопатологией.
Проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка технологий клеточной иммунотерапии больных эпителиальными формами рака».
Проводимые работы позволят получить результаты являющиеся новыми в направлении работ по разработке и применению ДНК-конструкций и дендритных клеток для иммунотерапии больных эпителиальными
формами рака.
Перспективы практического использования
Потребителями научно-технических результатов ПНИ являются ИП (ЗАО «Компания Витамакс»), а также другие медицинские и научные центры, медицинские лечебно-профилактические учреждения, оказывающие
высокоспециализированную медицинскую помощь.
Перспективы практического использования результатов проекта:
- проведение ограниченных клинических исследований по оценке эффективности разработанных технологий совместно с индустриальным партнером,
- продажа неисключительной лицензии на технологию получения и применения клеточного препарата индустриальному партнеру,
- создание на базе лечебно-профилактических учреждений и медицинских центров лабораторий по созданию персонифицированных клеточных препаратов для проведения иммунотерапии онкологических больных.
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Создание ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы опухольассоциированных антигенов для различных эпителиальных
форм злокачественных новообразований.
Все экспериментальные образцы ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы ОАА для
различных форм злокачественных новообразований, были наработаны в количестве,
достаточном для проведения всех необходимых экспериментов и исследований с
материалом от больных раком молочной железы, колоректальным раком и
немелкоклеточным раком легкого, и очищены от эндотоксинов с подтверждением
правильности нуклеотидной последовательности секвенированием.
ДНК-конструкции (в количестве 5 мг каждой) кодируют 323 эпитопа от 26 ОАА:
pmax-CTL1: содержит эпитопы из HER-2 (31), mammaglobin-A (13), NY-BR-1 (19) и hMena
(8);
pmax-CTL2: эпитопы из WT1 (12), теломеразы hTERT (23), survivin (6), p53 (23) и MUC1
(13);
pmax-CTL3: эпитопы из MAGE-A10 (11), NY-ESO-1 (9) и MUC-1 (9);
pmax-CTL4: эпитопы из MAGE-A3 (11), PRAME (12), EpCAM (4) и MUC-1 (9);
pmax-CTL5: эпитопы из EpCAM (4), CEA (11), Guanylyl Cyclase C (11) и 5T4 (8);
pmax-CTL6: эпитопы из Legumain (7), VEGFR-1 (10), VEGFR-2 (10), FAP (9) и Fos-related
antigen-1 (5);
pmax-CTL7: эпитопы из Brachyury (9), SOX2 (4), Snail1 (4) и Snail2 (4);
pmax-PolyTh: эпитопы из HER2 (2), hTERT (1), p53 (3), WT1 (1), NY-ESO-1 (1), VEGFR-2
(1), survivin (4) и MAGE-A3 (1);
Чистота ДНК-конструкции составляет 99%.
Лабораторный регламент получения зрелых
антиген-активированных дендритных клеток
• Выполнено сравнение методов выделения CD14+ моноцитов по соотношению
качество/время/эффективность с использованием нескольких методов: проточная
сортировка клеток, магнитная сепарация, адгезия к пластику.
• Проведены эксперименты по выбору оптимального временного режима
культивирования дендритных клеток и условия применения сочетаний цитокинов для
получения незрелой и зрелой фракции
дендритных клеток (ДК) с оценкой изменения фенотипических и функциональных
характеристик клеток.
Методика доставки ДНК-конструкций в
дендритные клетки
-проведен сравнительный анализ эффективности
различных методов доставки (магнитная трансфекция,
нуклеофекция) ДНК-конструкции в дендритные клетки.
-обоснован выбор стадии созревания ДК для проведения
процедуры переноса генетического материала.
Лабораторный регламент получения антиген-специфических
цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой
цитотоксической активностью против опухолевых клеток
Разработанный протокол стимуляции с использованием ДК, трансфицированных
плазмидой, кодирующей эпитопы белка Her2, позволяет получать до 2 % антигенспецифических Т-лимфоцитов в культуре МНК.
Эффективность метода магнитной сепарации составляет в среднем 97%.
Для стимуляции пролиферации культуры антиген-специфических клеток подобраны
условия коктейля цитокинов рчИЛ-2 (50нг/мл), рчИЛ-7 (50нг/мл) и рчИЛ-15 (50нг/мл).
1 - Контроль MCF-7
2 - Активированные МНК
3 - Антигенспецифические клетки
Оценка эффективности процедуры трансфекции выполнена
методами Flow-FISH (А) и по экспрессии тестовых плазмид,
кодирующих GFP белок (Б).
Показано отсутствие различий в эффективности переноса
генетического материала. По причине особенностей
метода нуклеофекции (стоимость, и закрытость системы)
для дальнейших экспериментов нами выбран метод
магнитной трансфекции.
Наиболее эффективными для формирования
противоопухолевого иммунного ответа являются
дендритные клетки с магнитной трансфекцией на стадии
зрелых клеток.
Для оптимизации протокола получения зрелых
дендритных клеток апробированы 12 протоколов
включающих различные сроки инкубации для получения
незрелых дендритных клеток, различные стимулы для
созревания дендритных клеток и различные сроки
инкубации с созревающими стимулами.
Для получения зрелых ДК от больных раком молочной
железы и больных колоректальным раком был
подобран протокол включающий:
культивирование с IL-4 (100нг/мл) и GM-CSF (50нг/мл)
4суток, и добавление созревающего стимула TNF (25нг/мл)
на 2 суток.
Для
получения
зрелых
ДК
от
больных
немелкоклеточным раком легкого культивирование с IL4 (100нг/мл) и GM-CSF (50нг/мл) 4суток, и добавление
созревающего стимула TNF (25 нг/мл) и IL-1β (10нг/мл) на
2 суток.
Показано достоверное
повышение цитотоксичности
культуры антиген-специфических
клеток против опухолевых
клеток, по сравнению с общей
культурой активированных ДК
мононуклеарных клеток
Лабораторный регламент получения активированных
мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической
активностью в отношении опухолевых клеток
(рак молочной железы)
МНК – мононуклеарные клетки,
МНК+ДК(0) – МНК, сокультивированные с
дендритными клетками (ДК) без нагрузки антигеном,
МНК+ДК(К) – МНК, сокультивированные с ДК,
трансфицированные контрольной ДНК-конструкцией
без опухолевых антигенов,
МНК+ДК(Т) – МНК, сокультивированные с ДК,
трансфицированные ДНК-конструкцией, кодирующей
эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов.
Эффективность получения мононуклеарных клеток в рамках
лабораторного регламента получения активированных
мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью
в отношении опухолевых клеток (рак молочной железы)
Относительное содержание CD4+, CD8+,
CD19+ и CD16+CD56+ в культуре
мононуклеарных клеток, после
культивирования с антигенактивированными дендритными клетками.
- заявленное минимальное
содержание по ТЗ
Партнеры проекта
Индустриальный партнёр: ЗАО «Компания Витамакс»
основное направление деятельности – разработка высокотехнологичных методов лечения и фармпрепаратов в следующих областях: онкология / гематология; препараты для лечения особо опасных вирусных
инфекций (СПИД, гепатиты и т.д.) и др. Внебюджетное финансирование по проекту – 6,02 млн.руб (2014-2 млн. рублей, 2015г – 1,87 млн. рублей, 2016г – 2,15 млн. рублей).
Соисполнитель: ИХБФМ СО РАН
исследование противоопухолевой активности дендритных клеток, трансфицированных ДНК-конструкциями, кодирующие эпитопы опухоль-специфичкских антигенов, на модельных опухолях животных.
14.607.21.0043
<Номер постера>