Федеральная целевая программа

Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Соглашение
14.607.21.0043 от 22.08.2014г.
на период 2014 - 2016 гг.
Тема: Получение персонализированных клеточных
препаратов на основе антиген-активированных
дендритных клеток и антиген-специфических Тлимфоцитов, предотвращающих рецидив опухоли.
Руководитель проекта: зав. лаборатории молекулярной
иммунологии, д.м.н., профессор Сенников С.В.
Науки о жизни
Участники проекта
Получатель субсидии: НИИФКИ
• исследование молекулярно-генетических механизмов регуляции процессов
активации, пролиферации и дифференцировки клеток иммунной системы в норме и при
иммунопатологических состояниях и разработку новых методов иммунокоррекции на
основе клеточных биотехнологий и генно-инженерных продуктов;
Индустриальный партнёр: ЗАО «Компания Витамакс»
• основное направление деятельности – разработка высокотехнологичных методов
лечения и фармпрепаратов в следующих областях: онкология / гематология; препараты
для лечения особо опасных вирусных инфекций (СПИД, гепатиты и т.д.) и др.
Внебюджетное финансирование по проекту – 6,02 млн.руб (2014-2 млн. рублей, 2015г –
1,87 млн. рублей, 2016г – 2,15 млн. рублей).
Соисполнитель: ИХБФМ СО РАН
• исследование противоопухолевой активности дендритных клеток, трансфицированных
ДНК-конструкциями, кодирующие эпитопы опухоль-специфических антигенов, на
модельных опухолях животных.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
2
Цели и задачи проекта
Цели проекта:
Разработка лабораторного регламента получения клеточных препаратов на основе антиген-активированных
дендритных клеток и антиген-специфических Т-лимфоцитов для предотвращения рецидива опухоли.
Задачи проекта:
1. Разработка лабораторного регламента культивирования зрелых дендритных клеток (ДК) у больных раком
молочной железы (РМЖ), колоректальным раком (КРР) и немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ).
3. Разработка методики создания ДНК-конструкций, кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов
(ОАА) для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований.
4. Разработка методики доставки антигенного материала в дендритные клетки.
5. Разработка лабораторного регламента получения фракции активированных мононуклеарных клеток больных
РМЖ, КРР и НМРЛ, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против опухолевых клеток и
лабораторного регламента использования факторов-регуляторов активности клеточных препаратов.
6. Разработка лабораторного регламента получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов,
обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток РМЖ.
7. Создание опытного образца ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы ОАА, в количестве, достаточном для
проведения доклинических исследований.
8. Разработка плана и проведение доклинических исследований;
9. Разработка проекта протокола клинического исследования клеточного препарата для медицинского
применения.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
3
Ожидаемые результаты проекта
- Экспериментальные образцы ДНК конструкций, кодирующих эпитопы опухольассоциированных антигенов для различных эпителиальных форм злокачественных
новообразований.
- Лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных
клеток
- Лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток,
обладающих цитотоксической активностью против опухолевых клеток.
- Методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки.
- Проект протокола ограниченного клинического исследования эффективности и
безопасности противоопухолевой клеточной иммунотерапии пациентов с
онкопатологией.
- Проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка технологий
клеточной иммунотерапии больных эпителиальными формами рака».
Проводимые работы позволят получить результаты являющиеся новыми в направлении
работ по разработке и применению ДНК-конструкций и дендритных клеток для
иммунотерапии больных эпителиальными формами рака.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
4
Перспективы практического использования
Потребителями научно-технических результатов ПНИ являются ИП (ЗАО «Компания
Витамакс»), а также другие медицинские и научные центры, медицинские лечебнопрофилактические учреждения, оказывающие высокоспециализированную медицинскую
помощь.
Перспективы практического использования результатов проекта:
- проведение ограниченных клинических исследований по оценке эффективности
разработанных технологий совместно с индустриальным партнером,
- продажа неисключительной лицензии на технологию получения и применения
клеточного препарата индустриальному партнеру,
- создание на базе лечебно-профилактических учреждений и медицинских центров
лабораторий по созданию персонифицированных клеточных препаратов для проведения
иммунотерапии онкологических больных.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
5
Результаты исследовательской работы,
полученные в 2015 г.
- разработка методики создания ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы опухольассоциированных антигенов для различных эпителиальных форм злокачественных
новообразований,
- наработка эксперим. образцов ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухольассоциированных антигенов для различных форм злокачественных новообразований
- лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных
клеток,
- методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки,
- лабораторный регламент получения антиген-специфических цитотоксических Тлимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против
опухолевых клеток,
- лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток,
обладающих цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток (рак
молочной железы),
- анализ активации воспалительного ответа на липоплексы, состоящие из
маннозилированных липосом и ДНК-конструкций, in vitro и in vivo.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
6
Разработка методики создания ДНК-конструкции,
кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов для
различных эпителиальных форм злокачественных новообразований
Этапы создания полиэпитопных конструкций:
1. Выбор антигенов.
2. Выбор эпитопов.
Использование современных методов
предсказания эпитопов плюс эпитопы
с доказанной эффективностью.
3. Оптимизация TAP-процессинга.
4. Соединение эпитопов с учетом
(иммуно)протеасомного расщепления.
Максимизация вероятности "правильного"
расщепления при попадании в протеасому.
5. Добавление сигнальной послед-ти.
Убиквитин направляет полипептид
в протеасому.
6. Поиск и удаление «паразитных»
(нежелательных) эпитопов.
7. Перевод аминокислотной послед-ти
в нуклеотидную.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
7
Наработка эксперим. образцов ДНК-конструкций,
кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов
для различных форм злокачественных новообразований
1. Все экспериментальные образцы ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы ОАА для
различных форм злокачественных новообразований, были наработаны в количестве,
достаточном для проведения всех необходимых экспериментов и исследований с
материалом от больных раком молочной железы, колоректальным раком и
немелкоклеточным раком легкого, и очищены от эндотоксинов с подтверждением
правильности нуклеотидной последовательности секвенированием.
2. ДНК-конструкции (в количестве 5 мг каждой) кодируют 323 эпитопа от 26 ОАА:
pmax-CTL1 содержит эпитопы из HER-2 (31), mammaglobin-A (13), NY-BR-1 (19) и hMena (8). Всего 71 эпитоп;
pmax-CTL2 содержит эпитопы из WT1 (12), теломеразы hTERT (23), survivin (6), p53 (23) и MUC1 (13). Всего 77;
pmax-CTL3 содержит эпитопы из MAGE-A10 (11), NY-ESO-1 (9) и MUC-1 (9). Всего 29 эпитопов;
pmax-CTL4 содержит эпитопы из MAGE-A3 (11), PRAME (12), EpCAM (4) и MUC-1 (9). Всего 36 эпитопов;
pmax-CTL5 содержит эпитопы из EpCAM (4), CEA (11), Guanylyl Cyclase C (11) и 5T4 (8). Всего 34 эпитопов;
pmax-CTL6 содержит эпитопы из Legumain (7), VEGFR-1 (10), VEGFR-2 (10), FAP (9) и Fos-related antigen-1 (5). Всего
41 эпитопов;
pmax-CTL7 содержит эпитопы из Brachyury (9), SOX2 (4), Snail1 (4) и Snail2 (4). Всего 21 эпитопов;
pmax-PolyTh содержит эпитопы из HER2 (2), hTERT (1), p53 (3), WT1 (1), NY-ESO-1 (1), VEGFR-2 (1), survivin (4) и
MAGE-A3 (1). Всего 14 эпитопов.
3. Чистота ДНК-конструкции составляет 99%.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
8
Лабораторный регламент получения зрелых
антиген-активированных дендритных клеток
• Выполнено сравнение методов выделения CD14+ моноцитов по соотношению
качество/время/эффективность с использованием нескольких методов: проточная сортировка
клеток, магнитная сепарация, адгезия к пластику.
• Проведены эксперименты по выбору оптимального временного режима культивирования
дендритных клеток и условия применения сочетаний цитокинов для получения незрелой и зрелой
фракции
дендритных клеток (ДК) с оценкой изменения фенотипических и функциональных характеристик
клеток.
В ходе выполнения работы было показано, что
% из CD14+ клеток
120.0
100.0
80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
магнитная проточная адгезия на
сортировка сортировка пластике
Процент CD14+ клеток в
популяции моноцитов здоровых
доноров
после процедуры выделения.
N=6.
методы проточной и магнитной сортировки не отличаются по
качеству и эффективности получаемой целевой фракции клеток.
Достоинства методов: высокий выход целевой фракции клеток.
Недостатки: высокая стоимость, временные затраты, сохранение в
целевой культуре компонентов сепарации (антител или магнитных
частиц)
Адгезия на пластике. Недостатки: менее чистая культура целевых
клеток
Достоинства: низкая стоимость, низкие трудозатраты, отсутствие
контаминации окрашивающими реагентами.
Таким образом, при сравнении трех методов получения фракции
клеток-предшественников дендритных клеток было решено
использовать метод адгезии на пластике, как позволяющий получить
достаточное количество CD14+ клеток, не вносящего сторонних
примесей в целевую культуру и наиболее экономичного по временным
и материальным затратам.
% клеток CD11c+HLA-DR+
Лабораторный регламент получения зрелых
антиген-активированных дендритных клеток
Для оптимизации протокола получения зрелых
дендритных клеток апробированы 12 протоколов
включающих различные сроки инкубации для
получения незрелых дендритных клеток, различные
стимулы для созревания дендритных клеток и
различные сроки инкубации с созревающими
стимулами.
95.0
90.0
85.0
80.0
75.0
70.0
65.0
60.0
55.0
50.0
Колоректальный рак
Рак молочной
железы
Немелкоклеточный
рак легкого
70.0
% клеток CD83+
60.0
50.0
Для получения зрелых ДК от больных раком
молочной железы и больных колоректальным
раком был подобран протокол включающий:
культивирование с IL-4 (100нг/мл) и GM-CSF
(50нг/мл) 4суток, и добавление созревающего
стимула TNF (25нг/мл) на 2 суток.
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
Колоректальный рак
Рак молочной
железы
Немелкоклеточный
рак легкого
Для получения зрелых ДК от больных
немелкоклеточным
раком
легкого
культивирование с IL-4 (100нг/мл) и GM-CSF
(50нг/мл) 4суток, и добавление созревающего
стимула TNF (25 нг/мл) и IL-1β (10нг/мл) на 2 суток.
Методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки
-проведен сравнительный анализ эффективности различных методов доставки (магнитная трансфекция,
нуклеофекция) ДНК-конструкции в дендритные клетки.
-обоснован выбор стадии созревания ДК для проведения процедуры переноса генетического материала.
Fitc+
80
клеток
70
А
60
50
40
30
20
1.8
Индекс
цитотоксичности
90
%
30
20
% GFP+ клеток
40
1.2
1
0
50
1.4
1.0
10
60
1.6
Б
1.
2.
3.
4.
5.
10
2
МНК
МНК+ДК без трансфекции
МНК+ДК, трансфицированные
незрелых
МНК+ДК, трансфицированные
незрелых
МНК+ДК, трансфицированные
зрелых
МНК+ДК, трансфицированные
зрелых
3
4
5
6
магнитной трансфекцией на стадии
методом нуклеофекции на стадии
магнитной трансфекцией на стадии
методом нуклеофекции на стадии
0
6.
Магнитная Нуклеофекция
трансфекция
Оценка эффективности
процедуры трансфекции
выполнена методами FlowFISH (А) и по экспрессии
тестовых плазмид, кодирующих
GFP белок (Б).
Показано отсутствие различий в эффективности переноса генетического
материала. По причине особенностей метода нуклеофекции (стоимость, и
закрытость системы) для дальнейших экспериментов нами выбран метод
магнитной трансфекции.
Наиболее эффективными для формирования противоопухолевого иммунного
ответа являются дендритные клетки с магнитной трансфекцией на стадии
зрелых клеток.
Лабораторный регламент получения антиген-специфических
цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой
цитотоксической активностью против опухолевых клеток
- разработана методика окраски антиген-специфических клеток;
-разработана методика магнитной сепарации Her2-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов;
-оптимизированы условия культивирования и стимуляции пролиферации
антиген-специфических Т-лимфоцитов;
- оценена эффективность формирования специфического цитотоксического иммунного ответа по развитию
прямого цитотоксического эффекта против опухолевых клеток.
Ag-specific lymphocytes
1,7%
CD
8+
97,3%
Разработанный протокол стимуляции с использованием ДК,
трансфицированных плазмидой, кодирующей эпитопы белка
Her2, позволяет получать до 2 % антиген-специфических Тлимфоцитов в культуре МНК.
Эффективность метода магнитной сепарации составляет в
среднем 97%.
80
Показано достоверное повышение
цитотоксичности культуры антигенспецифических клеток против
опухолевых клеток, по сравнению с
общей культурой активированных
ДК мононуклеарных клеток
60
40
% dead MCF-7
Для стимуляции пролиферации культуры антиген-специфических клеток подобраны
условия коктейля цитокинов рчИЛ-2 (50нг/мл), рчИЛ-7 (50нг/мл) и рчИЛ-15 (50нг/мл).
20
0
1
2
3
1 - Контроль MCF-7
2 - Активированные МНК
3 - Антиген-специфические
клетки
Лабораторный регламент получения активированных
мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической
активностью в отношении опухолевых клеток (рак молочной
железы)
МНК – мононуклеарные клетки,
МНК+ДК(0) – МНК, сокультивированные с дендритными клетками (ДК) без нагрузки
антигеном,
МНК+ДК(К) – МНК, сокультивированные с ДК, трансфицированные контрольной
ДНК-конструкцией без опухолевых антигенов,
МНК+ДК(Т) – МНК, сокультивированные с ДК, трансфицированные ДНКконструкцией, кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов, (n=14)
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
13
Эффективность получения мононуклеарных клеток в рамках лабораторного
регламента получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих
цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток (рак молочной
железы)
Относительное содержание CD4+, CD8+, CD19+ и CD16+CD56+ в культуре мононуклеарных
клеток, после культивирования с антиген-активированными дендритными клетками (n=4).
- заявленное минимальное содержание по ТЗ
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
14
Влияние факторов ингибирования толерогенных реакций при
сокультивировании дендритных клеток с мононуклеарными
клетками онкобольных (колоректальный рак)
ингибитор COX-2
ингибитор IDO
Пролиферативная активность CD4+ и
CD8+ лимфоцитов (пациент №1)
Соглашение №<номер>
-
ингибитор IDO (1-methyl-L-tryptophan)
ингибитор COX-2 (celecoxib)
Цитотоксическая активность МНК при
ссаживании с антиген-активированными ДК
(пациент №1)
Добавление ингибиторов IDO и COX-2 в
совместную культуру МНК и антигенактивированных дендритных клеток
приводило к снижению пролиферативной и
цитотоксической активности МНК
ФЦП ИР
2014-2020
15
Влияние ингибиторов IDO и COX-2 на противоопухолевую цитотоксическую
активность мононуклеарных клеток при сокультивировании с антигенактивированными дендритными клетками (немелкоклеточный рак легкого)
Добавление ингибиторов IDO
и COX-2 в совместную
культуру МНК и антигенактивированных дендритных
клеток приводило к снижению
цитотоксической активности
МНК.
Цитотоксическая активность МНК при ссаживании
с антиген-активированными ДК и добавлении в
культуру ингибиторов IDO и COX-2, (n=7).
МНК - мононуклеарные клетки,
МНК+ДК – мононуклеарные клетки,
культивированные в присутствии антигенактивированных дендритных клеток,
МТ – 1-метил-L-триптофан (ингибитор IDO)
Сх – целекоксиб (ингибитор COX-2)
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
16
Влияние IL-12 и IL-18 на противоопухолевую цитотоксическую активность
мононуклеарных клеток при сокультивировании с антиген-активированными
дендритными клетками (колоректальный рак)
Цитотоксическая активность МНК при ссаживании с антиген-активированными ДК и
добавлении в культуру цитокинов (IL-12 и IL-18), (n=8).
МНК - мононуклеарные клетки,
МНК+ДК(0) - мононуклеарные клетки, культивированные в присутствии дендритных
клеток,
МНК+ДК – мононуклеарные клетки, культивированные в присутствии антигенактивированных дендритных клеток,
МНК+ДК+IL12+и/или IL18 – мононуклеарные клетки, культивированные в присутствии
антиген-активированных дендритных клеток и цитокинов (IL-12 и/или IL-18).
ФЦП ИР
Соглашение №<номер>
2014-2020
17
Разработка метода доставки ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы
опухолеспецифических антигенов, в дендритные клетки с использованием
маннозилированных катионных липосом
60
50
40
30
20
10
LF 2X3 M1 M2 M3 M4 M5 M6
незрелые ДК
EGFP+ клетки, %
предшественники ДК
2
60
50
40
30
20
10
LF 2X3 M1 M2 M3 M4 M5 M6
1.6
MFI, RFU
MFI, RFU
Доставка pEGFP-C2
Маннозилированными катионными
липосомами
EGFP+ клетки, %
Катионные липиды были синтезированы к.х.н. Шмендель Е.В., д.х.н. Масловым М.А., МИТХТ им.
М.В. Ломоносова (Москва)
1.5
1
1
0.5
0.5
LF 2X3 M1 M2 M3 M4 M5 M6
LF 2X3 M1 M2 M3 M4 M5 M6
Определение адресности доставки ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы
опухолеспецифических антигенов, с помощью маннозилированных
катионных липосом в дендритных клетки
D-манноза
МЛ+ConA
Специфическое связывание
маннозилированных липосом
(МЛ) с аналогом маннозного
рецептора (ConA) in vitro
время,
с
1.7 раз
2.2 раза
Активация анти-В16
цитотоксических
лимфоцитов после
системного введения
комплексов липосом с
РНК-В16 in vivo
Эффектор/таргетное
отношение
Анализ активации воспалительного ответа на липоплексы, состоящие из
маннозилированных липосом и ДНК-конструкций, in vitro и in vivo
ИЛ-1β, пг/мл
ИЛ-6, пг/мл
ГМ-КСФ, пг/мл
ФНО-α, пг/мл
Состояние выполнения запланированных индикаторов
№
Наименование
Индикаторы
1
Объем привлеченных внебюджетных средств
Число публикаций по результатам проекта в научных
2
журналах, индексируемых в базе Scopus/Web of Science
Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей
3
численности исследователей-участников проекта
Число патентных заявок, поданных по результатам
4
проекта
Показатели
Число диссертаций на соискание ученых степеней,
1
защищенных по результатам проекта
2
Средний возраст исследователей - участников проекта
Количество мероприятий по демонстрации и
популяризации результатов и достижений науки, в
3
которых приняла участие и представила результаты
проекта организации-исполнитель проекта
Количество используемых при проведении
4
исследований и разработок в рамках проекта
уникальных научных установок
Количество используемых при проведении
5
исследований и разработок объектов зарубежной
инфраструктуры сектора исследований и разработок
Количество центров коллективного пользования
научным оборудованием, научное оборудование
6
которых использовалось при проведении исследований
и разработок в рамках проекта
Eдиница
измерения
Значение за текущий год
Запланировано
Достигнуто
на текущий год
на текущий год
млн.руб
9,34
9,70378366
единиц
4
4
процентов
37,4
76,9
единиц
1
2
единиц
1
1
лет
44
35,4
единиц
1
3
единиц
0
0
единиц
0
0
единиц
2
2
Подготовлено 7 и опубликованы в 4 журналах, индексируемых Scopus и/или Web of Science:
- Scandinavian journal of Immunology (импакт-фактор 1,882),
- Journal of Controlled Release (импакт-фактор 7,261),
- PLOS ONE (импакт-фактор
3,26),
Соглашение
№<номер>
- Вопросы онкологии (импакт-фактор 0,316),
ФЦП ИР
2014-2020
21
Спасибо за внимание!
Докладчик:
Ответственный исполнитель,
старший научный сотрудник
лаборатории молекулярной иммунологии НИИФКИ
Курилин В.В.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
22