ПОТЕНЦИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К ЭРИТРОПОЭТИНУ

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002, Приложение № 4
86
ÏÎÒÅÍÖÈÐÎÂÀÍÍÛÅ ÀÍÒÈÒÅËÀ Ê ÝÐÈÒÐÎÏÎÝÒÈÍÓ:
ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÌÓÒÀÃÅÍÍÛÕ ÑÂÎÉÑÒÂ
Î.Ë.Âîðîíîâà, Î.Ï.Ðîãîçèíà, Þ.Ì.Äóãèíà*, À.Â.Ìàðòþøåâ*, Î.È.Ýïøòåéí*
ÍÈÈ ôàðìàêîëîãèè ÒÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ; *ÍÏÔ “Ìàòåðèà Ìåäèêà Õîëäèíã”, Ìîñêâà
 ýêñïåðèìåíòàõ íà ìûøàõ ëèíèè ÂÀLÂ/ñ ïîêàçàíî, ÷òî ñâåðõìàëûå äîçû àíòèòåë ê
ýðèòðîïîýòèíó ïðè îäíîêðàòíîì è êóðñîâîì ââåäåíèè íå âûçûâàþò óâåëè÷åíèÿ äîëè
ïîâðåæäåííûõ ìåòàôàç â êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà è íå ÿâëÿþòñÿ ãåíîòîêñè÷íûìè â
òåñòå ñîìàòè÷åñêîãî ìîçàèöèçìà íà êëåòêàõ êðûëà Drosophila melanogaster.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: àíòèòåëà ê ýðèòðîïîýòèíó, ìóòàãåííîñòü
 êëèíè÷åñêîé ïðàêòèêå äëÿ êîððåêöèè àíåìè÷åñêîãî ñèíäðîìà ïðèìåíÿþòñÿ ðàçëè÷íûå ïðåïàðàòû ýðèòðîïîýòèíà [5,7]. Îêàçûâàÿ âûðàæåííîå ñòèìóëèðóþùåå äåéñòâèå íà ýðèòðîèäíûé
ðîñòîê êðîâåòâîðåíèÿ, îíè âûçûâàþò ðÿä ïîáî÷íûõ ýôôåêòîâ [6], ïîýòîìó àêòóàëüíûì ñòàíîâèòñÿ ïðèìåíåíèå ïðåïàðàòîâ, ñîäåðæàùèõ
ñâåðõìàëûå äîçû äåéñòâóþùèõ âåùåñòâ, íå âûçûâàþùèõ ïîáî÷íûõ ýôôåêòîâ ïðè äëèòåëüíîì
ïðèåìå [8,9].
Öåëüþ íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ ÿâèëîñü
èçó÷åíèå öèòîãåíåòè÷åñêèõ ýôôåêòîâ íîâîãî
ïðåïàðàòà íà îñíîâå àíòèòåë ê ýðèòðîïîýòèíó
(ÀÒÝ), ñîçäàííîãî ÍÏÔ “Ìàòåðèà Ìåäèêà Õîëäèíã” (Ìîñêâà) è èçó÷åííîãî â êà÷åñòâå ãåìîñòèìóëÿòîðà â ÍÈÈ ôàðìàêîëîãèè ÒÍÖ ÑÎ
ÐÀÌÍ.
ÌÅÒÎÄÈÊÀ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
Âîçäåéñòâèå îäíîêðàòíîãî è êóðñîâîãî ââåäåíèÿ
ïðåïàðàòà ÀÒÝ [1] èçó÷àëè ìåòîäîì ó÷åòà õðîìîñîìíûõ àáåððàöèé â êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà
47 ìûøåé ëèíèè ÂALB/c ìàññîé 18-22 ã. Æèâîòíûõ, ïîëó÷åííûõ èç Íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêîé
ëàáîðàòîðèè ýêñïåðèìåíòàëüíî-áèîìåäèöèíñêîãî ìîäåëèðîâàíèÿ ÍÈÈ ôàðìàêîëîãèè ÒÍÖ ÑÎ
ÐÀÌÍ (ñåðòèôèêàò èìååòñÿ), ñîäåðæàëè â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðàâèëàìè, ïðèíÿòûìè Åâðîïåéñêîé êîíâåíöèåé ïî çàùèòå ïîçâîíî÷íûõ æèâîòíûõ, èñïîëüçóåìûõ äëÿ ýêñïåðèìåíòàëüíûõ è
èíûõ íàó÷íûõ öåëåé (Ñòðàñáóðã, 1986) è ñîãëàñíî ïðèêàçó ¹ 1179 ÌÇ ÑÑÑÐ îò 10.10.83 ã.
 I ñåðèè ýêñïåðèìåíòîâ ÀÒÝ (ñìåñü ãîìåîïàòè÷åñêèõ ðàçâåäåíèé Ñ12+Ñ30+Ñ200) ââîäèëè
îäíîêðàòíî âíóòðèæåëóäî÷íî â äîçå 0.5 ìë/20 ã
òîëüêî ñàìöàì. Âî II ñåðèè ýêñïåðèìåíòîâ èñïûòóåìûé ïðåïàðàò ââîäèëè òàêèì æå ñïîñîáîì
â äîçå 0.2 ìë/20 ã ñàìöàì è ñàìêàì åæåäíåâíî
íà ïðîòÿæåíèè 5 ñóò. Êëåòêè êîñòíîãî ìîçãà
ôèêñèðîâàëè ÷åðåç 24 ÷ ïîñëå ïîñëåäíåãî ââåäåíèÿ. Ìûøè ãðóïïû ñðàâíåíèÿ ïîëó÷àëè ïîòåíöèðîâàííóþ âîäó (Ñ12+Ñ30+Ñ200, íåãàòèâíûé
êîíòðîëü) èç ðàñ÷åòà 0.25 ìë íà 10 ã.  êà÷åñòâå ïîçèòèâíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè ââåäåíèå
ïëàòèíà (öèñ-äèõëîðäèãèäðîêñèëàìèíïëàòèí, çàâåäîìî îáëàäàþùèé öèòîãåíåòè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ) â äîçå 17 ìã/êã (ËÄ50) îäíîêðàòíî âíóòðèáðþøèííî. Äàííóþ ãðóïïó æèâîòíûõ ñðàâíèâàëè ñ ìûøàìè, êîòîðûì ââîäèëè òàêèì æå ñïîñîáîì ðàñòâîðèòåëü — 0.9% NaCl. Çà 1.5 ÷ äî
îêîí÷àíèÿ ýêñïîçèöèè (24 ÷) äëÿ íàêîïëåíèÿ
ìåòàôàç ìûøàì âíóòðèáðþøèííî ââîäèëè 0.025%
êîëõèöèí ïî 0.01 ìë/ã ìàññû æèâîòíîãî. Ïðåïàðàòû êëåòîê êîñòíîãî ìîçãà ãîòîâèëè ìîäèôèöèðîâàííûì ìåòîäîì Ôîðäà [3] è îêðàøèâàëè àçóðîì II è ýîçèíîì â òå÷åíèå 30 ìèí. Âî âñåõ ãðóïïàõ îò êàæäîãî æèâîòíîãî àíàëèçèðîâàëè 50-100
ìåòàôàç. Äëÿ àíàëèçà îòáèðàëè íåðàçðóøåííûå
êëåòêè îêðóãëîé ôîðìû ñ õîðîøèì ðàçáðîñîì
õðîìîñîì, áåç íàëîæåíèé, ñ ìîäóëüíûì ÷èñëîì
(40).  êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà ó÷èòûâàëè äîëþ
ïîâðåæäåííûõ ìåòàôàç è àáåððàíòíûõ õðîìîñîì.
Ñðåäè ñòðóêòóðíûõ íàðóøåíèé õðîìîñîì îòìå÷àëè îäèíî÷íûå, ïàðíûå ôðàãìåíòû è îáìåíû.
Çíà÷èìîñòü ðàçëè÷èé ïðè ñòàòèñòè÷åñêîé îáðàáîòêå äàííûõ îöåíèâàëè ïî t êðèòåðèþ Ñòüþäåíòà.
 îñíîâå ìåòîäà ñîìàòè÷åñêèõ ìîçàèê ëåæèò
ó÷åò ìîçàè÷íûõ ïÿòåí íà êðûëå, âîçíèêàþùèõ ó
ФАРМАКОЛОГИЯ СВЕРХМАЛЫХ ДОЗ
87
Òàáëèöà 1. Îöåíêà öèòîãåíåòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÀÒÝ â îòíîøåíèè ÷àñòîòû õðîìîñîìíûõ àáåððàöèé
â êëåòêàõ êîñòíîãî ìîçãà ìûøåé ëèíèè BALB/ñ (M±m)
Ïîêàçàòåëü
Èíòàêòíûå
(n=5)
Êîíòðîëü
H 2O (n=6)
0.9% NaCl
Ïëàòèí (n=7)
ÀÒÝ (n=5)
Количество исследованных
клеток
500
600
500
700
500
Количество аберраций, %
2.40±1.53
1.17±0.60
2.40±1.47
27.00±2.13*
0.6±0.4+
2.40±1.53
1.17±0.60
2.40±1.47
23.00±2.08*
0.6±0.4 +
0±0
0±0
0±0
0.14±0.14
0±0
обменов
0±0
0±0
0±0
3.86±0.83*
0±0+
Доля поврежденных
метафаз, %
1.20±0.38
1.17±0.60
2.40±1.47
19.00±1.43
0.6±0.4+
в том числе:
фрагментов
одиночных
парных
Примечание. Различия достоверны: *с соответствующим контролем (0.9 % NaCl), +с группой платина.
Drosophila melanogaster òåñòåðíûõ ëèíèé â ðåçóëüòàòå êîìïëåêñíîãî íàðóøåíèÿ ãåíîòèïà. Äåâcòâåííûõ ñàìîê ëèíèè mwh/mwh â êîëè÷åñòâå 10
îñîáåé ïîìåùàëè âìåñòå ñ 5 ñàìöàìè ëèíèè flr3/
TM3 â ïðîáèðêè, ñîäåðæàùèå ñòàíäàðòíóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó. ×åðåç 60-62 ÷ ðîäèòåëåé ïåðåñàæèâàëè â ïðîáèðêè ñî ñâåæåé ïèòàòåëüíîé
ñðåäîé, à â ïðåæíèå ïðîáèðêè äîáàâëÿëè ÀÒÝ
(500 ìêë/2 ìë ñðåäû). Ïðîñìîòð âûëåòåâøèõ
îñîáåé íà÷èíàëè ñ 9-10 äíÿ ïîñëå íà÷àëà ýêñïåðèìåíòà, îòáèðàëè ìóõ ñ ãåíîòèïîì mwh+/+flr3,
êîòîðûõ ôèêñèðîâàëè â 70% ýòèëîâîì ñïèðòå.
Èç êðûëüåâ ýòèõ ìóõ äåëàëè ìèêðîñêîïè÷åñêèå
ïðåïàðàòû â æèäêîñòè Ôîðà. Îáå ïîâåðõíîñòè
êðûëà, ñîñòîÿùèå èç ìîíîñëîÿ êëåòîê, ïðîñìàòðèâàëè ïîä ìèêðîñêîïîì (½400). Ìóòàíòíûå ïÿòíà ïîäðàçäåëÿëè íà êëàññû, âûäåëÿÿ åäèíè÷íûå
ïÿòíà èç 1-2 êëåòîê (mwh èëè flr), áîëüøèå åäèíè÷íûå ïÿòíà — 3 è áîëåå êëåòîê (mwh èëè flr)
è äâîéíûå ïÿòíà, ñîñòîÿùèå èç ðÿäîì ðàñïîëîæåííûõ êëîíîâ êëåòîê mwh è flr. Ýòè 3 êëàññà
ìóòàíòíûõ ïÿòåí îöåíèâàëè îòäåëüíî ïî ÷àñòîòå èõ ïîÿâëåíèÿ íà êðûëå [2].
Çíà÷èìîñòü ðàçëè÷èé ïðè ñòàòèñòè÷åñêîé
îáðàáîòêå äàííûõ îöåíèâàëè ïî êðèòåðèþ χ2 [4].
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
Äîëÿ ïîâðåæäåííûõ êëåòîê â ãðóïïå ìûøåé,
ïîëó÷àâøèõ ÀÒÝ â äîçå 0.5 ìë/20 ã ïðè ýêñïîçèöèè 24 ÷ îñòàâàëàñü íà óðîâíå ñòðóêòóðíûõ íàðóøåíèé â ôîíå è íåãàòèâíîì êîíòðîëå è äîñòîâåðíî ñíèæàëàñü ïî ñàìûì âàæíûì ïîêàçàòåëÿì
öèòîãåíåòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ïî ñðàâíåíèþ ñ
òàêîâûìè ïðè ââåäåíèè öèòîñòàòèêà (òàáë. 1).
Âî II ñåðèè ýêñïåðèìåíòîâ ó ñàìöîâ ÷åðåç
24 ÷ â 500 ìåòàôàçàõ îòìå÷åíî 1.40±0.75% êëå-
òîê ñ àáåððàöèÿìè õðîìîñîì, ñðåäè êîòîðûõ îòìå÷àëèñü òîëüêî îäèíî÷íûå ôðàãìåíòû, ÷òî ñîîòâåòñòâîâàëî êîíòðîëüíîìó óðîâíþ çíà÷åíèé.
Ó 5 ñàìîê, ïîëó÷àâøèõ ÀÒÝ, ÷åðåç 24 ÷ â 500
ìåòàôàçàõ äîëÿ ïîâðåæäåííûõ êëåòîê ñîñòàâëÿëà
1.00±0.45%. Àáåððàöèè õðîìîñîì áûëè ïðåäñòàâëåíû òîëüêî îäèíî÷íûìè ôðàãìåíòàìè.
Òàêèì îáðàçîì, îäíîêðàòíîå è êóðñîâîå âíóòðèæåëóäî÷íîå ââåäåíèå ÀÒÝ íå âûçûâàåò óâåëè÷åíèÿ äîëè ïîâðåæäåííûõ ìåòàôàç â êëåòêàõ
êîñòíîãî ìîçãà ìûøåé.
Ïîä âëèÿíèåì ÀÒÝ îòìå÷åíî äîñòîâåðíîå
ñíèæåíèå ÷àñòîòû ìóòàíòíûõ ïÿòåí (òàáë. 2).
Ïðè âîçäåéñòâèè ïðåïàðàòà âñòðå÷àþòñÿ òîëüêî
åäèíè÷íûå ìóòàíòíûå êëåòêè ñ äâóìÿ èëè òðåìÿ âîðñèíêàìè, ëîêàëèçîâàííûå â ðàçíûõ ÿ÷åéêàõ íà ïëîñêîñòè êðûëà. Ðàçëè÷èÿ ìåæäó îïûòíîé è êîíòðîëüíîé ãðóïïàìè, à òàêæå ñ èíòàêòíûìè ìóõàìè áûëè ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíû
(òàáë. 2). Òàêèì îáðàçîì, ïðåïàðàò ÀÒÝ íå ãåíîòîêñè÷åí äëÿ äðîçîôèëû.
Èòàê, îäíîêðàòíîå è êóðñîâîå âíóòðèæåëóäî÷íîå ââåäåíèå ÀÒÝ íå âûçûâàåò óâåëè÷åíèÿ
Òàáëèöà 2. Ó÷åò ñîìàòè÷åñêîãî ìîçàèöèçìà íà
êðûëå D. melanogaster (íà 100 êðûëüåâ) ïðè èñïîëüçîâàíèè ìàðêåðîâ mwh è flr
Ïîêàçàòåëü
Пятна
Èíòàêòíûå
Êîíòðîëü
ÀÒÝ
48
43
19
единичные (mwh/flr)
48/0
41/0
19/0
большие (mwh/flr)
0/0
1/0
0/0
0
1
0
Частота индукции, ½10—5
1.58
1.42
0.63
χ2
9.29
12.56
—
двойные (mwh и flr)
88
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002, Приложение № 4
÷àñòîòû öèòîãåíåòè÷åñêèõ íàðóøåíèé â êëåòêàõ
êîñòíîãî ìîçãà ìûøåé ëèíèè ÂÀLÂ/ñ. Êðîìå
òîãî, ïðåïàðàò íå îáëàäàåò ãåíåòè÷åñêîé òîêñè÷íîñòüþ è äàæå ñíèæàåò ñïîíòàííûé óðîâåíü ìóòàöèé è ðåêîìáèíàöèé íà êðûëå D. melanogaster.
ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ
1. Äóðíåâ À.Ä., Ðåâàçîâà Þ.À., Âåðñòàêîâà Î.Ë. è äð.
Ðóêîâîäñòâî ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èçó÷åíèþ íîâûõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ âåùåñòâ.
Ì., 2000. Ñ. 47-60.
2. Çàõàðåíêî Ë.Ï., Çàõàðîâ È.Ê. // Ãåíåòèêà. 1996. Ò. 32,
¹ 6. Ñ. 755-758.
3. Îðëîâ Â.Í., ×óäèíîâñêàÿ Ã.À., Êðþêîâà Å.Ï. Èññëåäîâàíèå õðîìîñîìíûõ íàáîðîâ ìëåêîïèòàþùèõ.
Ì., 1976.
4. Frei H., Wurgler F.E. // Mutat. Res. 1988. Vol. 203.
P. 297-308.
5. Geissler R.G., Schulte, Ganser A. // Int. J. Hematol.
1997. Vol. 65, N 4. P. 339-354.
6. Jabs K., Harmon W.E. // Adv. Ren. Replace Ther. 1996.
Vol. 3, N 1. P. 24-36.
7. Jelkmann W., Metzen E. // Anat. Anz. 1996. Vol. 178,
N 5. P. 391-403.
8. Kaplan B. // Prof. Care Mother Child. 1994. Vol. 4,
N 5. P. 151-152.
9. Poitevin B. // Bull. WHO. 1999. Vol. 77, N 2. P. 160-166.