COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF LYMPHOKINE- ACTIVATED KILLERS GENERATED FROM DIFFERENT CELL-SOURCES 43

43
БИОТЕРАПИЯ
ÓÄÊ 577.24:616-006.04
I. Zh. Shubina, K. S. Titov, O. V. Lebedinskaya, L. V. Demidov, M. V. Kiselevsky
COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF LYMPHOKINEACTIVATED KILLERS GENERATED FROM DIFFERENT
CELL-SOURCES
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
Comparative characteristics of lymphokine-activated killers (LAKs) generated from mononuclear leukocytes of
peripheral blood, pleural effusion, spleen and liver of cancer patients was performed on the basis of morphology,
immunophenotype and cytotoxicity analysis. Assessment methods involved morphological-histochemical study, flow
cytometry and cytotoxicity tests. The data demonstrated technological feasibility for generation of highly functional
LAKs with similar characteristics that may be obtained from different sources for adoptive immunotherapy of cancer
patients.
Key words: lymphokine-activated killers, malignant lesions.
È. Æ. Øóáèíà, Ê. Ñ. Òèòîâ, Î. Â. Ëåáåäèíñêàÿ, Ë. Â. Äåìèäîâ, Ì. Â. Êèñåëåâñêèé
ÑÐÀÂÍÈÒÅËÜÍÀß ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ËÈÌÔÎÊÈÍÀÊÒÈÂÈÐÎÂÀÍÍÛÕ ÊÈËËÅÐÎÂ,
ÃÅÍÅÐÈÐÎÂÀÍÍÛÕ ÈÇ ÐÀÇËÈ×ÍÛÕ ÈÑÒÎ×ÍÈÊÎÂ
ÃÓ ÐÎÍÖ èì. Í. Í. Áëîõèíà ÐÀÌÍ, Ìîñêâà
ÐÅÇÞÌÅ
Ïðîâåäåíû èññëåäîâàíèÿ ïî ñðàâíèòåëüíîé õàðàêòåðèñòèêå ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûõ êèëëåðîâ (ËÀÊ), ãåíåðèðîâàííûõ èç ìîíîíîíóêëåàðíûõ ëåéêîöèòîâ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè, ýêññóäàòà, ñåëåçåíêè è ïå÷åíè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ íà îñíîâå îöåíêè ìîðôîëîãè÷åñêèõ, ôåíîòèïè÷åñêèõ è öèòîòîêñè÷åñêèõ ñâîéñòâ
ËÀÊ. Àíàëèç êëåòî÷íûõ ïîïóëÿöèé ïðîâåäåí ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåòîäîâ ìîðôî-ãèñòîõèìè÷åñêîãî èññëåäîâàíèÿ, ïðîòî÷íîé öèòîôëþîðèìåòðèè è öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà. Ïîëó÷åííûå äàííûå ïðîäåìîíñòðèðîâàëè âîçìîæíîñòü ãåíåðàöèè èç ðàçëè÷íûõ êëåòîê-èñòî÷íèêîâ ôóíêöèîíàëüíî àêòèâíûõ ËÀÊ, èìåþùèõ ñõîäíóþ õàðàêòåðèñòèêó, êîòîðûå ìîæíî ïðèìåíÿòü äëÿ àäîïòèâíîé èììóíîòåðàïèè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûå êèëëåðû, çëîêà÷åñòâåííûå íîâîîáðàçîâàíèÿ.
ÂÂÅÄÅÍÈÅ
Àäîïòèâíàÿ èììóíîòåðàïèÿ ïðåäïîëàãàåò èñïîëüçîâàíèå àêòèâèðîâàííûõ ex vivo ýôôåêòîðîâ èììóíèòåòà. Íàèáîëüøèé êëèíè÷åñêèé ìàòåðèàë íàêîïëåí ïî
ïðèìåíåíèþ èíòåðëåéêèíà-2 (ÈË-2) â ëå÷åíèè çëîêà÷åñòâåííûõ íîâîîáðàçîâàíèé.  ðåçóëüòàòå ýêñïåðèìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé áûëà âûÿâëåíà âîçìîæíîñòü ãåíåðèðîâàòü in vitro ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûå êèëëåðíûå (ËÀÊ) êëåòêè, îáëàäàþùèå
âûðàæåííîé öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ â îòíîøåíèè îïóõîëåâûõ êëåòîê [5; 10].
Àäîïòèâíàÿ ÈË-2/ËÀÊ èììóíîòåðàïèÿ ðàñøèðÿåò ñïåêòð âîçìîæíîñòåé ïðîòèâîîïóõîëåâîãî ëå÷åíèÿ.
№3/том5/2006
Îíà îòëè÷àåòñÿ õîðîøåé ïåðåíîñèìîñòüþ è ìîæåò
ïðèìåíÿòüñÿ ñîâìåñòíî ñ äðóãèìè òðàäèöèîííûìè
ìåòîäàìè ëå÷åíèÿ – â ñëó÷àÿõ ëåêàðñòâåííîé ðåçèñòåíòíîñòè, à òàêæå äëÿ ñòèìóëÿöèè ìåñòíîãî ïðîòèâîîïóõîëåâîãî êëåòî÷íîãî èììóíèòåòà. ÈË2/ËÀÊ òåðàïèÿ ïðèâîäèò ê íîðìàëèçàöèè ïîêàçàòåëåé èììóííîãî
ñòàòóñà è óëó÷øåíèþ êà÷åñòâà æèçíè îíêîëîãè÷åñêèõ
áîëüíûõ [3; 9; 16].
 êà÷åñòâå èñòî÷íèêà äëÿ ãåíåðàöèè ËÀÊ ÷àùå
âñåãî èñïîëüçóþòñÿ ìîíîíóêëåàðíûå ëåéêîöèòû ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè (ÌÍË), êóëüòèâèðóåìûå â ïðèñóòñòâèè ïðåïàðàòîâ ÈË-2 [3; 6].
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ÈË-2/ËÀÊ òåðàïèÿ èñïîëüçóåòñÿ â àäúþâàíòíîì ðåæèìå ñ öåëüþ ïðîäëåíèÿ áåçðåРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
44
БИОТЕРАПИЯ
öèäèâíîãî ïåðèîäà è óëó÷øåíèÿ êà÷åñòâà æèçíè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ, à òàêæå äëÿ àêòèâàöèè ìåñòíîãî èììóííîãî îòâåòà â óñëîâèÿõ ëîêàëüíîãî (ëîêî-ðåãèîíàðíîãî) ââåäåíèÿ ËÀÊ [13; 17].
Ïðîâåäåííûå â ÃÓ ÐÎÍÖ èì. Í. Í. Áëîõèíà êëèíè÷åñêèå èññëåäîâàíèÿ ïîêàçàëè, ÷òî àäîïòèâíàÿ èììóíîòåðàïèÿ ó ïàöèåíòîâ ñî çëîêà÷åñòâåííûìè âûïîòàìè (îïóõîëåâûìè ïëåâðèòàìè, àñöèòàìè è ïåðèêàðäèòàìè)
ïîçâîëèëà
ïîëó÷èòü
êëèíè÷åñêóþ
ýôôåêòèâíîñòü ó 88 % ïàöèåíòîâ [1]. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî çàìåäëåíèå èëè ïðåêðàùåíèå ýêññóäàöèè íàñòóïàëî òîëüêî â òåõ ñëó÷àÿõ, êîãäà â ïëåâðàëüíîì âûïîòå îòìå÷àëîñü çíà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî àêòèâèðîâàííûõ
ëèìôîèäíûõ
êëåòîê
ñ
íàëè÷èåì
èììóíîáëàñòîâ è ìèòîçîâ. Èññëåäîâàíèå ïîêàçàëî ýôôåêòèâíîñòü ïðåäëîæåííîãî ìåòîäà àäîïòèâíîé èììóíîòåðàïèè ïðè ñåðîçèòàõ ó áîëüíûõ äèññåìèíèðîâàííûì ðàêîì ÿè÷íèêîâ. Ïðè ÈË-2/ËÀÊ òåðàïèè îòìå÷àëàñü äåãðàäàöèÿ è ïîñëåäóþùåå èñ÷åçíîâåíèå èç
çëîêà÷åñòâåííîãî âûïîòà îïóõîëåâûõ êëåòîê íà ôîíå
ïîâûøåíèÿ ÷èñëà àêòèâèðîâàííûõ ëèìôîèäíûõ ýëåìåíòîâ ó 67 % áîëüíûõ, à òàêæå ñíèæåíèå óðîâíÿ ìàðêåðà ÑÀ-125 ó 50 % è ÷àñòè÷íàÿ ðåãðåññèÿ îïóõîëè
ó 13 % ïàöèåíòîê [2]. Ïðè ÈË-2/ËÀÊ òåðàïèè ïëåâðàëüíûõ âûïîòîâ â êà÷åñòâå èñòî÷íèêà ãåíåðàöèè ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûõ êèëëåðîâ áûëè èñïîëüçîâàíû
ëèìôîöèòû, âûäåëåííûå èç ýêññóäàòèâíîé æèäêîñòè.
ÈË-2/ËÀÊ èììóíîòåðàïèÿ ìîæåò òàêæå ïðèìåíÿòüñÿ äëÿ êîððåêöèè íàðóøåíèé èììóíèòåòà ó îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ.  ÷àñòíîñòè, ïðè ðàäèêàëüíûõ
îïåðàöèÿõ ó áîëüíûõ ðàêîì æåëóäêà ïðîèçâîäèòñÿ
ñïëåíýêòîìèÿ êàê ýëåìåíò ëèìôîäèññåêöèè D2, ÷òî
âûçûâàåò äëèòåëüíóþ è ñïîíòàííî íå âîññòàíàâëèâàþùóþñÿ èììóíîñóïðåññèþ, ïðèâîäÿùóþ ê ïîâûøåíèþ êîëè÷åñòâà ïîñëåîïåðàöèîííûõ èíôåêöèîííûõ
îñëîæíåíèé ó áîëüíûõ äàííîé êàòåãîðèè, à ïî íåêîòîðûì äàííûì è óìåíüøàåò èõ 5-ëåòíèþ âûæèâàåìîñòü
íà 10 % [4; 12]. Âïîëíå î÷åâèäíî, ÷òî áîëüíûå ÐÆ
ïîñëå ðàäèêàëüíûõ îïåðàöèé, ñîïðîâîæäàþùèõñÿ
óäàëåíèåì çíà÷èòåëüíîé ÷àñòè ëèìôîèäíîé òêàíè,
â òîì ÷èñëå ñåëåçåíêè, íóæäàþòñÿ íå òîëüêî â çàìåñòèòåëüíîé, íî è â äîïîëíèòåëüíîé ïðîòèâîîïóõîëåâîé
òåðàïèè [15]. Äëÿ êîððåêöèè èììóíîëîãè÷åñêèõ íàðóøåíèé ó ýòîé ãðóïïû áîëüíûõ áûëà èññëåäîâàíà âîçìîæíîñòü ïðèìåíåíèÿ ÈË-2\ËÀÊ àäîïòèâíîé èììóíîòåðàïèèè.  ñâÿçè ñ ýòèì áûëà ðàçðàáîòàíà ìåòîäèêà ãåíåðàöèè ËÀÊ-êëåòîê èç ëèìôîöèòîâ ñåëåçåíêè
äëÿ ïîñëåäóþùåãî ïðèìåíåíèÿ â êà÷åñòâå àäîïòèâíîé
ÈË-2/ËÀÊ èììóíîòåðàïèè ñ èñïîëüçîâàíèåì ÈË-2
(ðîíêîëåéêèí).
 îðãàíèçìå íàðÿäó ñ òàêèìè ýôôåêòîðàìè âðîæäåííîãî èììóíèòåòà, êàê íàòóðàëüíûå êèëëåðû (ÍÊ),
îáíàðóæèâàþò ïîïóëÿöèþ ÍÊÒ-êëåòîê, ýêñïðåñèèðóþùèõ íå òîëüêî àíòèãåíû ÍÊ (CD16, CD56), íî è Òêëåòî÷íûå ìàðêåðû (CD3), ãåíåðàöèÿ êîòîðûõ ïðîèñõîäèò ãëàâíûì îáðàçîì â ïå÷åíè. Ïî ìíåíèþ íåêîòîðûõ èññëåäîâàòåëåé [7; 8; 11; 14], ÍÊÒ îáëàäàþò
âûðàæåííîé ïðîòèâîîïóõîëåâîé àêòèâíîñòüþ. Ïîñêîëüêó ïå÷åíü ÿâëÿåòñÿ îäíèì èç îñíîâíûõ îðãàíîâ
№3/том5/2006
ìåòàñòàçèðîâàíèÿ ïðè ðîñòå îïóõîëåé ðàçëè÷íûõ ëîêàëèçàöèé, àêòèâàöèÿ ÍÊÒ ìîæåò óñèëèòü èõ öèòîòîêñè÷åñêèé ïîòåíöèàë â îòíîøåíèè ðàçâèâàþùèõñÿ ìåòàñòàçîâ.
Äëÿ îöåíêè ñâîéñòâ ËÀÊ, ïîëó÷àåìûõ èç ðàçíûõ
ïîïóëÿöèé êëåòîê-èñòî÷íèêîâ, áûëè ïðîâåäåíû ñðàâíèòåëüíûå èññëåäîâàíèÿ: èçó÷åíèå ìîðôîëîãè÷åñêèõ,
ôåíîòèïè÷åñêèõ è öèòîòîêñè÷åñêèõ ñâîéñòâ ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ èç ìîíîíîíóêëåàðíûõ ëåéêîöèòîâ
(ÌÍË) ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè, ýêññóäàòà, ñåëåçåíêè
è ïå÷åíè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ.
ÌÀÒÅÐÈÀËÛ È ÌÅÒÎÄÛ
Âûäåëåíèå ÌÍË èç ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè
Èç ñòàáèëèçèðîâàííîé ãåïàðèíîì (20 åä/ìë) ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè çäîðîâûõ äîíîðîâ âûäåëÿëè ìîíîíóêëåàðíûå êëåòêè (ÌÍË) íà îäíîñòóïåí÷àòîì ãðàäèåíòå ôèêîëëà-óðîãðàôèíà ïëîòíîñòüþ 1,077 ã/ñì3
(ÏàíÝêî, Ðîññèÿ) öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 400 g â òå÷åíèå 30 ìèí. Ëèìôîèäíûå êëåòêè, îáðàçîâàâøèå èíòåðôàçíîå êîëüöî, ñîáèðàëè ïèïåòêîé è òðåõêðàòíî îòìûâàëè â 10-êðàòíîì îáúåìå ñðåäû öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 200 g. ÌÍË êóëüòèâèðîâàëè â ñðåäå RPMI 1640 ñ
L-ãëóòàìèíîì (150 ìêã/ìë), ïåíèöèëëèíîì (50 Åä./ìë)
ñî ñòðåïòîìèöèíîì (50 ìêã/ìë), 10% ýìáðèîíàëüíîé òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêîé (ÏàíÝêî, Ðîññèÿ) (äàëåå — ïîëíàÿ
ñðåäà) ïðè 37 °Ñ â àòìîñôåðå 5,0 % ÑÎ2.
Âûäåëåíèå ÌÍË èç ýêññóäàòèâíîé æèäêîñòè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ ñ ìåòàñòàòè÷åñêèì ïëåâðèòîì
Ïëåâðàëüíóþ ïîëîñòü áîëüíûõ äðåíèðîâàëè êàòåòåðîì íà 2 íåä. ïî ðàçðàáîòàííîé â ÃÓ ÐÎÍÖ èì.
Í. Í. Áëîõèíà ìåòîäèêå ïîä ìåñòíîé àíåñòåçèåé.
 áîëüøèíñòâå ñëó÷àåâ ïëåâðàëüíóþ ïóíêöèþ ïðîâîäèëè ïî ëîïàòî÷íîé è çàäíå-ïîäìûøå÷íîé ëèíèè.
Íà îñíîâàíèè ðåíòãåíîëîãè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé ïðîâîäèëèñü ïóíêöèè â îïòèìàëüíûõ òî÷êàõ ñêîïëåíèÿ
ïëåâðàëüíîãî âûïîòà. Äëÿ äðåíèðîâàíèÿ ïëåâðàëüíîé
ïîëîñòè èñïîëüçîâàëè íàáîð «Ïëåâðîêàí» (ôèðìû
ÑØÀ), êðîìå òîãî, ïðèìåíÿëè ïîäêëþ÷è÷íûé êàòåòåð,
ñîåäèíåííûé ñî ñòåðèëüíûìè åìêîñòÿìè ñ ãåïàðèíîì
(20 åä/ìë), â êîòîðûå ýâàêóèðîâàëñÿ ýêññóäàò. Ñîáðàííûé ýêññóäàò ðàçäåëÿëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì
(1000 îá/ìèí, 20 ìèí) íà êëåòî÷íóþ è ïëàçìåííóþ ÷àñòè. Èç êëåòî÷íîé ôðàêöèè âûäåëÿëèñü ìîíîíóêëåàðíûå (ÌÍË) è îïóõîëåâûå êëåòêè íà îäíîñòóïåí÷àòîì
ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîëëà-óðîãðàôèíà. Îïóõîëåâûå êëåòêè ñêàïëèâàëèñü â âèäå áåëîãî êîëüöà â îáëàñòè ìåíüøåé ïëîòíîñòè, â òî âðåìÿ, êàê ÌÍË ñîáèðàëèñü íà ãðàíèöå ñðåäû è ãðàäèåíòà ïëîòíîñòè. Èíòåðôàçíîå êîëüöî ÌÍË ñîáèðàëè â 15-ìë ïðîáèðêè
è òðèæäû îòìûâàëè ñðåäîé RPMI 1640 ïîñðåäñòâîì
öåíòðèôóãèðîâàíèÿ. Ïîëó÷åííûå ÌÍË èñïîëüçîâàëè
äëÿ ãåíåðàöèè ËÀÊ-êëåòîê.
Âûäåëåíèå ÌÍË èç ñåëåçåíêè áîëüíûõ ðàêîì æåëóäêà, óäàëåííîé âî âðåìÿ ðàäèêàëüíîé îïåðàöèè
 èññëåäîâàíèå áûëè âêëþ÷åíû 23 áîëüíûõ ñî
ñïëåíýêòîìèåé, êîòîðûì áûëà ïðîâåäåíà ðàäèêàëüíàÿ
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
БИОТЕРАПИЯ
îïåðàöèÿ ïî ïîâîäó ðàêà æåëóäêà. Âî âñåõ ñëó÷àÿõ äèàãíîç áûë ïîäòâåðæäåí ãèñòîëîãè÷åñêè, ïðåîáëàäàëè
àäåíîêàðöèíîìû ðàçëè÷íîé ñòåïåíè äèôôåðåíöèðîâêè. Èñòî÷íèêîì ïîëó÷åíèÿ ËÀÊ-êëåòîê ñëóæèëà ñåëåçåíêà, óäàëåííàÿ âî âðåìÿ îïåðàöèè. Åå ìåõàíè÷åñêè
èçìåëü÷àëè è ãîìîãåíèçèðîâàëè. Âçâåñü ñïëåíîöèòîâ
äâàæäû îòìûâàëè êóëüòóðàëüíîé ñðåäîé RPMI 1640
è âûäåëÿëè ÌÍË íà îäíîñòóïåí÷àòîì ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîëëà-óðîãðàôèíà. Ïîëó÷åííûå ÌÍË ðåñóñïåíäèðîâàëè â ïîëíîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäå è èñïîëüçîâàëè äëÿ ãåíåðàöèè ËÀÊ-êëåòîê.
Âûäåëåíèå ÌÍË èç èíòàêòíîé òêàíè è ïàðàòóìîðàëüíîé îáëàñòè ïå÷åíè
 èññëåäîâàíèå áûëè âêëþ÷åíû 10 áîëüíûõ â âîçðàñòå îò 15 äî 67 ëåò ñ îïóõîëåâûì ïîðàæåíèåì ïå÷åíè.
Ïîëó÷åííûé îïåðàöèîííûé ìàòåðèàë ïå÷åíè ãîìîãåíèçèðîâàëè ìåõàíè÷åñêè â ñòåêëÿííîì ãîìîãåíèçàòîðå
â ñòåðèëüíûõ óñëîâèÿõ. Ãåïàòîöèòû è ýðèòðîöèòû îòäåëÿëè îò ÌÍË öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 50 g â òå÷åíèå
5 ìèí. ÌÍË âûäåëÿëè öåíòèðèôóãèðîâàíèåì íà ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîëëà-óðîãðàôèíà. Ïîëó÷åííûå
ÌÍË ðåñóñïåíäèðîâàëè â ïîëíîé ñðåäå RPMI 1640
è èñïîëüçîâàëè äëÿ ãåíåðàöèè ËÀÊ-êëåòîê.
Ãåíåðàöèÿ ËÀÊ
Äëÿ ïîëó÷åíèÿ êóëüòóðû ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûõ êèëëåðîâ (ËÀÊ êëåòîê) ÌÍË, âûäåëåííûå èç ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè, ýêññóäàòèâíîé æèäêîñòè, ñåëåçåíêè èëè ïå÷åíè, ðåñóñïåíäèðîâàëè â ïîëíîé ñðåäå
RPMI 1640 ñ äîáàâëåíèåì 10% ýìáðèîíàëüíîé òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêè, L-ãëóòàìèíà è àíòèáèîòèêîâ (ÏàíÝêî,
Ðîññèÿ) â êîíöåíòðàöèè 1õ106 êëåòîê â 1 ìë ñðåäû. Çàòåì äîáàâëÿëè 2000 ÌÅ/ìë ÈË-2 («Ðîíêîëåéêèí»,
Áèîòåõ, Ðîññèÿ). Êëåòêè êóëüòèâèðîâàëè â ïëàñòèêîâûõ ôëàêîíàõ ïðè 37 °Ñ è àòìîñôåðå 5 % ÑÎ2 â òå÷åíèå 3 ñóò.
Öèòîòîêñè÷åñèé òåñò
Öèòîòîêñè÷åñêóþ àêòèâíîñòü ëèìôîöèòîâ îïðåäåëÿëè íà ÍÊ-÷óâñòâèòåëüíîé ëèíèè ýðèòðîáëàñòíîãî
ëåéêîçà ÷åëîâåêà Ê-562. Îïóõîëåâûå êëåòêè
(1x104 â 1 ìë) èíêóáèðîâàëè â ïîëíîé êóëüòóðàëüíîé
ñðåäå ñ ÌÍË èëè ËÀÊ (â ïðèñóòñòâèè ÈË-2) â ñîîòíîøåíèÿõ êëåòêè-ìèøåíè/ýôôåêòîðû, ðàâíûõ 1:5; 1:2;
1:1 è 1:0,5 â ïëîñêîäîííûõ 96-ëóíî÷íûõ ìèêðîïëàíøåòàõ (Costar, Ôðàíöèÿ) 48 ÷. Ïî èñòå÷åíèè ñðîêà èíêóáàöèè â ëóíêè äîáàâëÿëè òåòðàçîëèåâóþ ñîëü ÌÒÒ
(3-(4,5-äèìåòèëòèàçîë-2-èë)2,5-äèôåíèë òåòðàçîëèÿ
áðîìèä; ÏàíÝêî, Ðîññèÿ)), êîòîðàÿ ìåòàáîëèçèðóåòñÿ
æèçíåñïîñîáíûìè êëåòêàìè, ïðåâðàùàÿñü â íåðàñòâîðèìûé â âîäå ôàðìàçàí, è èçìåíÿÿ îïòè÷åñêóþ ïëîòíîñòü ðàñòâîðà ïðîïîðöèîíàëüíî êîëè÷åñòâó âûæèâøèõ êëåòîê. Äëÿ ïîñëåäóþùåé êîëè÷åñòâåííîé îöåíêè êðèñòàëëû ôàðìàçàíà ðàñòâîðÿëè ÄÌÑÎ
(äèìåòèëñóëüôîêñèä, ÏàíÝêî, Ðîññèÿ). Îïòè÷åñêóþ
ïëîòíîñòü èçìåðÿëè íà ìóëüòèñêàíå ÌÑÑ-340
(Labsystem, Ôèíëÿíäèÿ) è ðàññ÷èòûâàëè ïðîöåíò ëèçèñà îïóõîëåâûõ êëåòîê (ïðîöåíò öèòîòîêñè÷íîñòè)
№3/том5/2006
45
è ñðåäíåýôôåêòèâíîå ñîîòíîøåíèå êëåòêè-ìèøåíè/ýôôåêòîðû (ÝÑ50), ïðè êîòîðîì îòìå÷àåòñÿ ëèçèñ
50 % îïóõîëåâûõ êëåòîê.
Ïðîòî÷íàÿ öèòîôëþîðèìåòðèÿ
Ýêñïðåññèþ ïîâåðõíîñòíûõ àíòèãåíîâ ÌÍË
è ËÀÊ îïðåäåëÿëè ïðè ïîìîùè ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë (Caltag Laboratories, ÑØÀ) ïðîòèâ ñîîòâåòñòâóþùèõ àíòèãåíîâ. Ðåçóëüòàòû ó÷èòûâàëè ìåòîäîì ïðîòî÷íîé öèòîôëþîðîìåòðèè íà öèòîìåòðå FACScan
(Becton Dickinson, ÑØÀ). Îïðåäåëÿëè óðîâåíü ýêñïðåññèè äèôôåðåíöèðîâî÷íûõ àíòèãåíîâ CD3, CD4,
CD8, CD16; àêòèâàöèîííûõ àíòèãåíîâ CD25, CD38,
HLA-DR; ìîëåêóë àäãåçèè CD58. Ãåéò ïîïóëÿöèè êëåòîê óñòàíàâëèâàëè íà îñíîâå êîìáèíàöèè ïðÿìîãî
(FSC) è áîêîâîãî (SSC) ñâåòîðàññåÿíèÿ. Ïðè ó÷åòå ðåçóëüòàòîâ ïîäñ÷èòûâàëè 5000 ñîáûòèé â ãåéòå. Ñòàòèñòè÷åñêàÿ îáðàáîòêà ìàòåðèàëà ïðîâåäåíà ïðè ïîìîùè ïðîãðàììíîãî ïàêåòà WINMDI 2.8.
Ìîðôî-ãèñòîõèìè÷åñêîå èññëåäîâàíèå
Íà 3-è ñóòêè êóëüòèâèðîâàíèÿ ÌÍË è ËÀÊ êëåòî÷íûå ñóñïåíçèè öåíòðèôóãèðîâàëè è îòìûâàëè îò
ñðåäû äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ ìàçêîâ êëåòîê, êîòîðûå îêðàøèâàëè íà ÐÍÊ ïî Áðàøå ñ êîíòðîëüíîé îáðàáîòêîé
ÐÍÊ-àçîé, ýîçèí-àçóðîì ïî Ðîìàíîâñêîìó-Ãèìçà, ðåàêòèâîì Øèôôà ïî Øàáàäàøó ñ êîíòðîëåì àìèëàçîé
íà ãëèêîãåí è ãëèêîçàìèíîãëèêàíû (Ð. Ëèëëè, 1969).
 îêðàøåííûõ ïî Áðàøå ìàçêàõ ïîäñ÷èòûâàëîñü ïðîöåíòíîå ñîäåðæàíèå âûÿâëÿåìûõ êëåòîê. Ñòàòèñòè÷åñêàÿ îáðàáîòêà äàííûõ ïðîâîäèëàñü ñ èñïîëüçîâàíèåì
ïðîãðàììû «ÈÏ-Ñλ (Ðîññèÿ).
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ È ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ
Öèòîëîãè÷åñêîå èçó÷åíèå ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ
èç ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè äîíîðîâ, ïîêàçàëî, ÷òî
íà 3-è ñóòêè èíêóáàöèè â ìàçêàõ êóëüòóðàëüíîé âçâåñè
âûÿâëÿþòñÿ â áîëüøîì êîëè÷åñòâå áëàñòíûå êëåòêè,
ïðîëèìôîöèòû è àêòèâèðîâàííûå ïèðîíèíîôèëüíûå
ëèìôîöèòû, à òàêæå íåêîòîðîå ÷èñëî êëåòî÷íûõ ôîðì
ñ ìîðôîãèñòîõèìè÷åñêèìè ïðèçíàêàìè äåíäðèòíûõ
êëåòîê (ðèñ. 1). Áëàñòíûå ôîðìû — êëåòêè êðóïíûõ
ðàçìåðîâ ñ ýóõðîìàòè÷íûìè ÿäðàìè, ñîäåðæàùèìè
íåñêîëüêî ïèðîíèíîôèëüíûõ ÿäðûøåê, è öèòîïëàçìîé, èìåþùåé ÿðêî ïèðîíèíîôèëüíóþ îêðàñêó, èíòåíñèâíîñòü êîòîðîé çíà÷èòåëüíî ñíèæàåòñÿ ïîñëå îáðàáîòêè ÐÍÊ-çîé. Äàííàÿ ìîðôîãèñòîõèìè÷åñêàÿ
õàðàêòåðèñòèêà ñâèäåòåëüñòâóåò îá àêòèâíîñòè ñèíòåòè÷åñêèõ ïðîöåññîâ â êëåòêàõ è ïîâûøåííîì êîëè÷åñòâå ÐÍÊ. Ïðîëèìôîöèòû è àêòèâèðîâàííûå ëèìôîöèòû òàêæå èìåþò ÿðêî ïèðîíèíîôèëüíóþ öèòîïëàçìó,
èíòåíñèâíîñòü îêðàñêè êîòîðîé óìåíüøàåòñÿ ïðè äåéñòâèè ÐÍÊ-çû.
Èññëåäîâàíèå èììóíîôåíîòèïà ËÀÊ ïîçâîëèëî
óñòàíîâèòü, ÷òî ýòè êëåòêè àêòèâíî ýêñïðåññèðóþò íà
ñâîåé ìåìáðàíå àíòèãåíû ÍÊ (CD16) - äî 19,98 % ïî
ñðàâíåíèþ ñ ýêñïðåññèåé ýòîãî ìàðêåðà íà ïîâåðõíîñòè ÌÍË, äîñòèãàþùåé 9,13 %, è àêòèâàöèîííûå ìîëåêóëû CD25 - äî 34,82 %, â òî âðåìÿ, êàê íà èíòàêòРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
46
БИОТЕРАПИЯ
À
Á
Ðèñ. 2. Ýêñïðåññèÿ ïîâåðõíîñòíûõ àíòèãåíîâ íà
ëèìôîöèòàõ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè (ÌÍË) è ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûõ-êèëëåðàõ (ËÀÊ), ïðåäñòàâëåííàÿ
â ðåæèìå «DotPlot»:
À — ÌÍË, óðîâåíü ýêñïðåññèè CD3 – 64,80 %,
CD16 – 9,13 %, CD4 – 39,74 %, CD25 – 1,49 %;
Á — ËÀÊ, óðîâåíü ýêñïðåññèè CD3 – 57,31 %,
CD16 – 19,98 %, CD4 – 14,16 %, CD25 – 34,82 %
Â
Ðèñ. 1. Ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûå êèëëåðû
(ËÀÊ) â êóëüòóðå ìîíîíêóëåàðíûõ äåéêîöèòîâ (ÌÍË)
ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ÷åëîâåêà, èíêóáèðîâàííûõ
ñ èíòåðëåéêèíîì-2 (3-è ñóòêè êóëüòèâèðîâàíèÿ).
Ìèêðîôîòîãðàôèè ËÀÊ â ìàçêàõ êóëüòóðàëüíîé
âçâåñè:
À – îêðàñêà àçóðîì II-ýîçèíîì. Îê. 10; îá. 40;
Á – îêðàñêà ìåòèëîâûì çåë¸íûì-ïèðîíèíîì ïî
Áðàøå. Îê. 10; îá. 100;
 – îêðàñêà Øèôô-éîäíîé êèñëîòîé ïî Øàáàäàøó. Îê. 10; îá. 100
íûõ ÌÍË ýêñïðåññèÿ àíòèãåíà ê ÈË-2 ïðàêòè÷åñêè íå
ðåãèñòðèðóåòñÿ (1,49%) (ðèñ. 2, À, Á).
Îá àêòèâàöèè ËÀÊ ñâèäåòåëüñòâóåò òàêæå ïîâûøåííàÿ ýêñïðåññèÿ àíòèãåíà ãëàâíîãî êîìïëåêñà ãèñ№3/том5/2006
òîñîâìåñòèìîñòè II êëàññà (HLA-DR) (ðèñ.3) è ìîëåêóë àäãåçèè (CD58) (ðèñ. 4).
Êàê ñëåäóåò èç òàáë. 1, ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûå èç
ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè, îáëàäàëè äîñòîâåðíî
áîëüøåé ÍÊ-àêòèâíîñòüþ ïî ñðàâíåíèþ ñ èíòàêòíûìè ÌÍË. ÝÑ50 äëÿ ýòèõ êëåòîê ñîñòàâëÿåò 2,2 è 5,6 ñîîòâåòñòâåííî. Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè ëèìôîöèòîâ ïîêàçàëî, ÷òî ïðè ñîîòíîøåíèè
êëåòêà-ìèøåíü/ýôôåêòîð 1:5 ÌÍË ëèçèðóþò 52 %
êëåòîê Ê-562, â òî âðåìÿ, êàê â àíàëîãè÷íûõ óñëîâèÿõ
ËÀÊ âûçûâàþò ãèáåëü 92 % îïóõîëåâûõ êëåòîê.
 ìåíüøèõ ñîîòíîøåíèÿõ (1:2 è 1:1) ýòè ðàçëè÷èÿ íå
ñòîëü çíà÷èìû, õîòÿ àêòèâíîñòü ËÀÊ ïðåâûøàåò òàêîâóþ äëÿ ÌÍË.
Àíàëèç ìîðôîëîãè÷åñêîé, èììóíîôåíîòèïè÷åñêîé è öèòîòîêñè÷åñêîé õàðàêòåðèñòèê ãåíåðèðîâàííûõ
êëåòîê ïîêàçàë, ÷òî ïðè âîçäåéñòâèè ÈË-2 íà ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè çäîðîâûõ äîíîðîâ ïðîèñõîäèëà
àêòèâàöèÿ êëåòîê ëèìôîèäíîãî ðÿäà — ãåíåðàöèÿ
ËÀÊ. Ïðè ýòîì çðåëûå ëèìôîöèòû ïîäâåðãàëèñü
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
БИОТЕРАПИЯ
47
Ðèñ. 3. Ãèñòîãðàììû ýêñïðåññèè HLA-DR íà ëèìôîöèòàõ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè (ÌÍË) è ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûõ-êèëëåðàõ (ËÀÊ):
À — ÌÍË; Á - ËÀÊ;
Ïî îñè àáñöèññ – êîëè÷åñòâî êëåòîê; ïî îñè îðäèíàò – èíòåíñèâíîñòü ôëþîðåñöåíöèè;
— ãèñòîãðàììà êîíòðîëüíûõ êëåòîê;
— ãèñòîãðàììà êëåòîê, îêðàøåííûõ ÌÊÀ ê HLA-DR
Ðèñ. 4. Ãèñòîãðàììû ýêñïðåññèè CD58 íà ëèìôîöèòàõ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè (ÌÍË) è ëèìôîêèí-àêòèâèðîâàííûõ-êèëëåðàõ (ËÀÊ):
À — ÌÍË; Á - ËÀÊ;
Ïî îñè àáñöèññ – êîëè÷åñòâî êëåòîê; ïî îñè îðäèíàò – èíòåíñèâíîñòü ôëþîðåñöåíöèè;
— ãèñòîãðàììà êîíòðîëüíûõ êëåòîê;
— ãèñòîãðàììà êëåòîê, îêðàøåííûõ ÌÊÀ ê CD58
áëàñòòðàíñôîðìàöèè è õàðàêòåðèçîâàëèñü ìîðôîëîãè÷åñêè êàê ïðîëèìôöèòû è èììóíîáëàñòû. Îá àêòèâàöèè ëèìôîöèòîâ ñâèäåòåëüñòâóåò íàêîïëåíèå ÐÍÊ
â öèòîïëàçìå, ïðîÿâëÿâøååñÿ â åå ÿðêîé ïèðîíèíîôèëüíîé îêðàñêå. Õàðàêòåð èììóíîôåíîòèïà ËÀÊ
â âèäå ïîâûøåííîé ýêñïðåññèè àêòèâàöèîííûõ àíòèãåíîâ è ìîëåêóë àäãåçèè òàêæå îòðàæàåò ôåíîòèïè÷åñêèé ïðîôèëü àêòèâèðîâàííûõ ëèìôîöèòîâ. Ñòèìóëÿöèÿ öèòîòîêñè÷åñêîé ôóíêöèè ïðîÿâèëàñü â ïîâûøåíèè êèëëåðíîé àêòèâíîñòè ËÀÊ ïî îòíîøåíèþ
№3/том5/2006
ê îïóõîëåâûì êëåòêàì â ñðàâíåíèè ñ èíòàêòíûìè
ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè çäîðîâûõ äîíîðîâ.
Ïðè ìîðôîëîãè÷åñêîì èçó÷åíèè ýêññóäàòà áîëüíûõ ñ ìåòàñòàòè÷åñêèì ïëåâðèòîì áûëî âûÿâëåíî, ÷òî
â çëîêà÷åñòâåííîì âûïîòå ïðè ïåðâîì èññëåäîâàíèè
îáíàðóæèâàåòñÿ áîëüøîå êîëè÷åñòâî îïóõîëåâûõ êëåòîê è íåçíà÷èòåëüíîå ÷èñëî çðåëûõ ëèìôîöèòîâ è ìàêðîôàãîâ (ðèñ. 5, À).
 ðåçóëüòàòå ýêñòðàêîðïîðàëüíîé ãåíåðàöèè ËÀÊêëåòîê èç ÌÍË ýêññóäàòà â êóëüòóðå îïðåäåëÿëîñü
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
48
БИОТЕРАПИЯ
Òàáëèöà 1
Öèòîòîêñè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ËÀÊ-êëåòîê è ÌÍË, %
áîëüøîå êîëè÷åñòâî áëàñòíûõ ôîðì è ïðîëèìôîöèòîâ. Öèòîëîãè÷åñêîå èññëåäîâàíèå îñòàòî÷íîé ýêññóäàòèâíîé æèäêîñòè â êîíöå 1-ãî êóðñà âíóòðèïëåâðàëüíîé ÈË-2/ËÀÊ èììóíîòåðàïèè (14 ñóò) âûÿâèëî
ïðàêòè÷åñêîå îòñóòñòâèå èëè íåçíà÷èòåëüíîå ÷èñëî
äåãðàäèðóþùèõ îïóõîëåâûõ êëåòîê, à òàêæå íàëè÷èå
áîëüøîãî êîëè÷åñòâà àêòèâèðîâàííûõ ëèìôîöèòîâ
(ñì. ðèñ. 5, Á).
Ïðè èçó÷åíèè èììóíîôåíîòèïà äàííîé ïîïóëÿöèè ËÀÊ íàáëþäàëîñü óâåëè÷åíèå ýêñïðåññèè ìàðêåðà ÍÊ CD16 (äî 30 %), àêòèâàöèîííûõ àíòèãåíîâ
CD25 (äî 44 %), CD38 (äî 24 %), ìîëåêóë àäãåçèè
CD58 (äî 87 %), ìàðêåðà ÃÊÃ II òèïà HLA-DR (äî
49 %) ïî ñðàâíåíèþ ñ ýêñïðåññèåé òåõ æå ìàðêåðîâ íà
ïîâåðõíîñòè ÌÍË, âûäåëåííûõ èç ýêññóäàòà, êîòîðàÿ
äëÿ âñåõ íàçâàííûõ ìàðêåðîâ ðåãèñòðèðîâàëàñü íà
óðîâíå 0–10 %. Îäíàêî óðîâåíü ýêñïðåññèè îòìå÷åííûõ ïîâåðõíîñòíûõ àíòèãåíîâ ýòîé ïîïóëÿöèè ËÀÊ
áûë íåñêîëüêî íèæå, ÷åì ó ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ èç
ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè çäîðîâûõ äîíîðîâ. Öèòîòîêñè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ èç ÌÍË ýêññóäàòà, äîñòèãàëà 804,5 % , â òî âðåìÿ, êàê öèòîòîêñè÷íîñòü ÌÍË ýêññóäàòà ñîñòàâëÿëà 55±3,8 % (ð<0,05).
Ïðè àíàëèçå ñâîéñòâ ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ èç ëèìôîöèòîâ ñåëåçåíêè áîëüíûõ ÐÆ, áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî
èõ ìîðôî-ôóíêöèîíàëüíàÿ õàðàêòåðèñòèêà ñîâïàäàåò
ñ ËÀÊ, ïîëó÷åííûìè èç ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè
äîíîðîâ. Ýòè êëåòêè áûëè ïðåäñòàâëåíû êðóïíûìè
ëèìôîöèòàìè òèïà èììóíîáëàñòîâ ñ ýêñïðåññèåé àêòèâàöèîííûõ ìîëåêóë (CD38+, CD58+, HLA-DR+) è âûñîêîé öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ (äî 90 % ± 2,2).
Ïðè îïóõîëåâîì ïîðàæåíèè ïå÷åíè â ïàðàòóìîðàëüíîé îáëàñòè îáíàðóæèâàþò áîëüøîå êîëè÷åñòâî
ÍÊÒ-êëåòîê. ÍÊÒ, âûäåëåííûå èç ïàðàìåòàñòàòè÷åñêèõ ó÷àñòêîâ ïå÷åíè áîëüíûõ, îáëàäàëè ïî÷òè â 3 ðàçà áîëüøåé ÍÊ-àêòèâíîñòüþ ïî ñðàâíåíèþ ñ èíòàêòíûìè ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ýòèõ ïàöèåíòîâ
(òàáë. 2). ÝÑ50 äëÿ äàííûõ ñóáïîïóëÿöèé ñîñòàâëÿåò
1,3 è 3,5 ñîîòâåòñòâåííî. Èññëåäîâàíèå öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè ëèìôîöèòîâ ïîêàçàëî, ÷òî ïðè ñîîòíîøåíèè êëåòêà-ìèøåíü/ýôôåêòîð 1:5 ÌÍË ëèçèðóþò
62 % êëåòîê ëèíèè Ê-562, â òî âðåìÿ, êàê â àíàëîãè÷íûõ óñëîâèÿõ ÍÊÒ-êëåòêè ïå÷åíè âûçûâàþò ãèáåëü
90 % îïóõîëåâûõ êëåòîê. Ïðè ñîîòíîøåíèÿõ 1:2 è 1:1
ðàçëè÷èÿ â öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè çíà÷èòåëüíî
ìåíüøå, õîòÿ àêòèâíîñòü ÍÊÒ îñòàåòñÿ áîëåå âûñîêîé
ïî ñðàâíåíèþ ñ ÌÍË.
№3/том5/2006
ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûå èç ÍÊÒ ïå÷åíè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ, ïî ñâîåé êèëëåðíîé àêòèâíîñòè ïî÷òè
íà ïîðÿäîê ïðåâûøàþò öèòîòîêñè÷íîñòü èíòàêòíûõ
À
Á
Ðèñ. 5. Êóëüòóðà êëåòîê ïëåâðàëüíîãî ýêññóäàòà
îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ:
À – ìèêðîôîòîãðàôèÿ îïóõîëåâûõ êëåòîê â ìàçêå
êóëüòóðàëüíîé âçâåñè ïëåâðàëüíîãî ýêññóäàòà îíêîëîãè÷åñêîãî áîëüíîãî;
Á – ìèêðîôîòîãðàôèÿ îïóõîëåâîé êëåòêè, îêðóæåííîé ìàêðîôàãàìè è àêòèâèðîâàííûìè ëèìôîöèòàìè, â ìàçêå êóëüòóðàëüíîé âçâåñè ïëåâðàëüíîãî ýêññóäàòà îíêîëîãè÷åñêîãî áîëüíîãî ïðè ñòèìóëÿöèè èíòåðëåéêèíîì-2.
Îêð. àçóðîì II-ýîçèíîì. Îê. 10; îá. 100
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
БИОТЕРАПИЯ
49
Òàáëèöà 2
Öèòîòîêñè÷åñêàÿ è ÍÊ-àêòèâíîñòü ËÀÊ-êëåòîê, ïîëó÷åííûõ èç ÍÊÒ ïå÷åíè è ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè
îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ ñ ìåòàñòàçàìè â ïå÷åíü, %
ÌÍË (ÝÑ50 ðàâíà 0,27 è 3,5 ñîîòâåòñòâåííî). Ïðè ýòîì
ËÀÊ, ïîëó÷åííûå èç ÍÊÒ ïå÷åíè, ïðåâûøàþò ïî öèòîòîêñè÷íîñòè ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûå èç ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè. ËÀÊ, ïîëó÷åííûå èç ÍÊÒ ïå÷åíè,
òàêæå äîñòîâåðíî ïðåâîñõîäÿò öèòîòîêñè÷íîñòü èíòàêòíûõ ÍÊÒ-êëåòîê ïå÷åíè (ÝÑ50 ðàâíà 0,27 è 1,3 ñîîòâåòñòâåííî). Íàðÿäó ñ ýòèì ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî
êèëëåðíûå ñâîéñòâà ÍÊÒ-êëåòîê ïå÷åíè ïðàêòè÷åñêè
íå îòëè÷àþòñÿ îò àêòèâíîñòè ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ èç
ÌÍË ïðè èññëåäîâàíèè â óêàçàííîì äèàïàçîíå ñîîòíîøåíèé êëåòêà-ìèøåíü/ýôôåêòîð.
Êàê ñëåäóåò èç äàííûõ, ïðåäñòàâëåííûõ â òàáë. 3,
óðîâåíü ýêñïðåññèè äèôôåðåíöèðîâî÷íûõ àíòèãåíîâ
CD3, CD4 è CD8 ËÀÊ, ïîëó÷åííûõ èç ëèìôîöèòîâ ïå÷åíè è ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ, ðàçëè÷åí.  ïîïóëÿöèè ËÀÊ èç ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ïðåîáëàäàåò CD3+ è CD4+ (â 2
è 14,5 ðàç áîëüøå, ÷åì â ïîïóëÿöèè ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ èç ÍÊÒ ïå÷åíè, ñîîòâåòñòâåííî), â òî âðåìÿ,
êàê ýêñïðåññèÿ àíòèãåíà CD8 âûøå íà ËÀÊ, ïîëó÷åííûõ èç ÍÊÒ. Óðîâåíü ýêñïðåññèè ðåöåïòîðîâ ÈË-2
(CD25) â ðàññìàòðèâàåìûõ ïîïóëÿöèÿõ ËÀÊ ñóùåñòâåííî íå îòëè÷àåòñÿ. Íàèáîëåå âûðàæåííûå ðàçëè÷èÿ
íàáëþäàþòñÿ â ñîîòíîøåíèè àêòèâàöèîííûõ àíòèãåíîâ CD38 è HLA-DR, óðîâåíü êîòîðûõ çíà÷èòåëüíî
âûøå íà ËÀÊ èç ÍÊÒ ïå÷åíè, ÷åì íà ËÀÊ èç ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè (â 2 è 6,5 ðàç ñîîòâåòñòâåííî). Ñóùåñòâåííûõ ðàçëè÷èé â óðîâíå ýêñïðåññèè àíòèãåíîâ ÍÊ
(CD16, CD57) è ìîëåêóë àäãåçèè (CD58) äëÿ ËÀÊ, ïîëó÷åííûõ èç îáîèõ èñòî÷íèêîâ, íå âûÿâëåíî.
Òàêèì îáðàçîì, ËÀÊ, ïîëó÷åííûå èç ÍÊÒ ïå÷åíè,
ñóùåñòâåííî ïðåâûøàëè ïî óðîâíþ ÍÊ-àêòèâíîñòè
ËÀÊ-êëåòêè èç ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè, à òàêæå èíòàêòíûå ÍÊÒ ïå÷åíè è ÌÍË. Íàèáîëåå çíà÷èìûå ðàçëè÷èÿ âûÿâëÿëèñü ïðè ñîîòíîøåíèÿõ êëåòêè-ìèøåíü/ýôôåêòîðû 1:2; 1:1 è 1:0,5. ËÀÊ-êëåòêè, ïîëó÷åííûå èç ÍÊÒ ïå÷åíè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ,
ïî ñâîåìó èììóíîëîãè÷åñêîìó ôåíîòèïó îòëè÷àþòñÿ
îò ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ èç ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé
êðîâè òåõ æå áîëüíûõ. Ýòè ðàçëè÷èÿ âûðàæàþòñÿ
ïðåæäå âñåãî â óðîâíå äèôôåðåíöèðîâî÷íûõ àíòèãåíîâ CD3 è CD4, ýêñïðåññèÿ êîòîðûõ âûøå íà ïîâåðõíîñòè ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûõ èç ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé
êðîâè.  òî æå âðåìÿ â ïîïóëÿöèè ËÀÊ, ïîëó÷åííûõ
èç ÍÊÒ ïå÷åíè, îòìå÷àåòñÿ áîëüøèé ïðîöåíò êëåòîê,
ýêñïðåññèðóþùèõ ìàðê¸ðû ÍÊ, ìîëåêóëû àäãåçèè
Òàáëèöà 3
Èììóíîôåíîòèï ËÀÊ-êëåòîê, ïîëó÷åííûõ èç ÍÊÒ ïå÷åíè è ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ
№3/том5/2006
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
50
БИОТЕРАПИЯ
è àêòèâàöèîííûå àíòèãåíû CD38 è HLA-DR ïî ñðàâíåíèþ ñ ËÀÊ èç ÌÍË. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî èç ÍÊÒ ïå÷åíè ìîãóò áûòü ïîëó÷åíû ËÀÊ, îáëàäàþùèå áîëåå âûñîêîé öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ, ÷åì ËÀÊ, ãåíåðèðîâàííûå èç
ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè.
ÇÀÊËÞ×ÅÍÈÅ
Òàêèì îáðàçîì, ïðè ñðàâíèòåëüíîé îöåíêå ËÀÊ,
ãåíåðèðóåìûõ èç ÌÍË ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè çäîðîâûõ äîíîðîâ è îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ, ÌÍË, âûäåëåííûõ èç ýêññóäàòèâíîé æèäêîñòè áîëüíûõ ñ ìåòàñòàòè÷åñêèì ïëåâðèòîì, ñåëåçåíêè è ÍÊÒ îíêîëîãè÷åñêèõ
áîëüíûõ, ïîêàçàíî, ÷òî ËÀÊ, ïîëó÷åííûå èç ïîïóëÿöèé ðàçëè÷íûõ êëåòîê-èñòî÷íèêîâ, èìåþò ñõîäíûå
ìîðôîëîãè÷åñêèå, èììóíîôåíîòèïè÷åñêèå è öèòîòîêñè÷åñêèå ñâîéñòâà. Ïðè ýòîì êëåòî÷íûé ñîñòàâ ïîïóëÿöèè àêòèâèðîâàííûõ ÈË-2 ìîíîíóêëåàðíûõ ëåéêîöèòîâ âêëþ÷àåò çíà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî ïðîëèìôîöèòîâ
è áëàñòíûõ êëåòîê. Èììóíîôåíîòèïè÷åñêèå è ôóíêöèîíàëüíûå ñâîéñòâà ËÀÊ çàìåòíî îòëè÷àþòñÿ îò
ñâîéñòâ èíòàêòíûõ ëèìôîöèòîâ, ÷òî ïðîÿâëÿåòñÿ â ïîâûøåííîé ýêñïðåññèè àêòèâàöèîííûõ àíòèãåíîâ è çíà÷èòåëüíîì óñèëåíèè öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè â îòíîøåíèè îïóõîëåâûõ êëåòîê.  ðåçóëüòàòå ïðîâåäåííûõ èññëåäîâàíèé ïðåäëîæåíû âàðèàíòû ãåíåðàöèè
ôóíêöèîíàëüíî àêòèâíûõ ËÀÊ èç ðàçëè÷íûõ êëåòîêèñòî÷íèêîâ, êîòîðûå ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû äëÿ
àäîïòèâíîé èììóíîòåðàïèè îíêîëîãè÷åñêèõ áîëüíûõ.
ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ
1. Äàâûäîâ Ì. È., Íîðìàíòîâè÷ Â. À., Êèñåëåâñêèé Ì. Â. è äð. Àäîïòèâíàÿ èììóíîòåðàïèÿ ïðè îïóõîëåâûõ ïëåâðèòàõ: êëèíèêî-ëàáîðàòîðíîå èññëåäîâàíèå // Ðîññèéñêèé îíêîëîãè÷åñêèé æóðíàë. – 2000. –
¹ 6. – Ñ. 14–17.
2. Êèñåëåâñêèé Ì. Â., Áëþìåíáåðã À. Ã. Àäîïòèâíàÿ èììóíîòåðàïèÿ ðàêà ÿè÷íèêîâ: Ñáîðíèê ñòàòåé,
ïðèóðî÷åííûé ê Åâðîïåéñêîé øêîëå ïî îíêîëîãèè. –
2001. – Ñ. 164–176.
3. Ðîçåíáåðã Ñ. Àäîïòèâíàÿ êëåòî÷íàÿ òåðàïèÿ:
êëèíè÷åñêèå èññëåäîâàíèÿ Â. Ò. ÄåÂèòà, Ñ. Õåëëìàí,
Ñ. À. Ðîçåíáåðã (ðåä.). Áèîëîãè÷åñêèå ìåòîäû ëå÷åíèÿ
îíêîëîãè÷åñêèõ çàáîëåâàíèé: Ïåð. ñ àíãë. - Ì.: Ìåäèöèíà, 2002. – Ñ. 504–522.
4. Ñóñëîâ Þ. À., Øïèãîòñêèé À. Í., Áàëóåâà Í. Â.
è äð. Êîìáèíèðîâàííàÿ õèìèîèììóíîòåðàïèÿ â ëå÷åíèè ðàñïðîñòðàíåííîãî ðàêà æåëóäêà // Ìåäèöèíñêèé
âåñòíèê. – 2003. - ¹ 2. - Ñ. 12-16.
5. Òîïåéëèåí Ñ. Ë. Àäîïòèâíàÿ êëåòî÷íàÿ òåðàïèÿ: ïðåêëèíè÷åñêèå èññëåäîâàíèÿ Â. Ò. ÄåÂèòà,
Ñ. Õåëëìàí, Ñ. À. Ðîçåíáåðã (ðåä.). Áèîëîãè÷åñêèå ìå-
№3/том5/2006
òîäû ëå÷åíèÿ îíêîëîãè÷åñêèõ çàáîëåâàíèé: Ïåð.
ñ àíãë. - Ì.: Ìåäèöèíà, 2002. – Ñ. 484–503.
6. Basse P.H. Tissue distribution and tumor localization of effector cells in adoptive immunotherapy of cancer // APMIS Suppl. - 1995. - Vol. 55. - P. 1-28.
7. Godfrey D. I., Kronenberg M. Going both ways:
Immune regulation via CD1d-dependent NKT cells //
Clin. Invest. - 2004 - Vol. 114. - P. 1379-1388.
8. Kenna T., Mason L. G., Porcelli S. A. et al. NKT
cells from normal and tumor-bearing human liver are phenotypically and functionally distinct from murine NKT
cells // Journal of Immunology. - 2003. - Vol. 171, ¹ 4. P. 1775-1779.
9. Morse M. A., Clay T. M., Lyerly H. K. Current
status of adoptive immunotherapy of malignancies //
Exp Opin Biol Ther. – 2002. – Vol. 2, ¹ 3. - P.
237–247.
10. Mule J. J., Shu S., Rosenberg S. A. The anti-tumor
efficacy of lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin 2 in vivo // J Immunol. - 1985. – Vol. 135.
- P. 642–646.
11. Nakagawa R., Nagafune I., Tazunoki Y. et al.
Mechanisms of the antimetastatic effect in the liver and of
the hepatocyte injury induced by -galactosylceramide in
mice // Journal of Immunology. - 2001. - Vol. 166, ¹ 11.
- P. 6578-6584.
12. Okuna K., Tanaka A., Shironory H. et al.
Suppression of T-cell function in gastric cancer patients
after total gastrectomy with splenectomy: implications
of splenic autotransplantation // Gastric cancer. - 1999. ¹ 2. - P. 20-25.
13. Sato T. Locoregional immunotherapy for liver
metastases. // Semin Oncol. - 2002. - Vol. 29, ¹ 2. - P.
160–167.
14. Sincovics J. G., Horvath J. C. Human natural
killer cells: a comprehensive review // Int J Oncol. - 2005.
– Vol. 27, ¹ 1. - P. 5-47.
15. Sugimachi K., Kodama Y., Kumashiro R. et al.
Clinical evaluation of prophilactic splenectomy in a total
gasrtectomy for gastric cancer // Gastric cancer. - 1980. Vol.70. - P. 701-709.
16. Taneja S. S., Pierce W., Figlin R., Belldegrun A.
Immunotherapy of renal cell carcinoma: The era of interleukin-2 treatment // Urology. - 1995. – Vol. 45. – P.
911–924.
17. Yamaguchi Y., Ohshita A., Kawabuchi Y.,
Ohta K. et al. Adoptive immunotherapy of cancer
using autologus lymphocytes – current status and new
strategies // Hum Cell. - 2003. – Vol. 16, ¹ 4. –
P.183–189.
Ïîñòóïèëà 17.08.2006.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ