Пирог, Т.П. Некоторые особенности метаболизма этанола у
advertisement
Пирог, Т.П. Некоторые особенности метаболизма этанола у мутантного штамма Acinetobacter sp., не образующего экзополисахариды / Т. П. Пирог, И. Г. Соколов, Ю. В. Кузьминская, Ю. Р. Малашенко // Микробиология. – 2002.– Т.2, № 2. – С. 222–229. УДК 579.841: 577.15 НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ЭТАНОЛА У МУТАНТНОГО ШТАММА Acinetobacter sp., НЕ ОБРАЗУЮЩЕГО ЭКЗОПОЛИСАХАРИДЫ Пирог Т.П., Соколов И.Г., Кузьминская Ю.В., Малашенко Ю.Р. Институт микробиологии и вирусологии Национальной академии наук Украины, Киев В клетках выращенного на этаноле мутантного штамма Acinetobacter sp., не образующего экзополисахариды (ЭПС), определены активности ключевых ферментов метаболизма этанола. Клетки исходного ЭПС-образующего штамма не могли быть использованы для проведения энзимологических исследований ввиду невозможности их отделения от высоковязкого ЭПС с высокой молекулярной массой. Установлено, что окисление этанола до ацетальдегида у Acinetobacter sp. НАД+-зависимой катализируется алкогольдегидрогеназой (КФ 1.1.1.1.). Акцепторами электронов в ацетальдегиддегидрогеназной реакции являются НАД+ и НАДФ+. Ацетат вовлекается в метаболизм Acinetobacter sp. при участии ацетилКоА-синтетазы (КФ 6.2.1.1.). Наличие изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1.) свидетельствует о том, что анаплеротической последовательностью реакций, восполняющих пул С4-дикарбоновых кислот в клетках Acinetobacter sp., является глиоксилатный цикл. «Узким» местом метаболизма этанола у бактерий Acinetobacter sp. является вовлечение ацетата в метаболизм, о чем свидетельствует ингибирование окисления ацетата в интактных клетках и активности ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном экстракте ионами натрия, а также лимитирование С2- метаболизма коэнзимом А. Полученные данные являются основой для разработки новой технологии получения экзополисахарида этаполана на основе этанола. 2 Ключевые слова: метаболизм этанола, ферментативная активность, скорость дыхания, регуляция. Acinetobacter Бактерии sp. являются продуцентом комплексного полисахаридного препарата (ЭПС) этаполана [1]. В предыдущие годы нами была разработана технология получения этаполана на основе этанола, разработаны подходы к интенсификации синтеза ЭПС, управлению его составом и физикохимическими свойствами [1, 2]. Однако для этих исследований привлекали данные лишь о возможных метаболических путях синтеза ЭПС у Acinetobacter sp. Энзимологические исследования штамма-продуцента этаполана не проводились, что было обусловлено невозможностью отделения клеток бактерий от высоковязкого ЭПС с высокой молекулярной массой. Методом нитрозогуанидин-индуцированного мутагенеза получены мутантные штаммы Acinetobacter sp., не образующие экзополисахариды Исходный и ЭПС---мутантные характерным для этих [3]. штаммы не отличаются между собой по бактерий физиолого-биохимическим признакам (потребность в ростовых факторах – пантотеновой кислоте и дрожжевом автолизате, ассимиляция этанола, моно- и дисахаридов, устойчивость к антибиотикам и др.). Идентичность исходного и мутантных штаммов подтверждена на основе анализа их 16SрРНК. Целью настоящей работы являлось исследование основных этапов метаболизма этанола у Acinetobacter sp. с использованием ЭПС---мутантных штаммов бактерий. Проведение таких исследований необходимо для выявления “узких” мест метаболизма этого субстрата и разработки подходов к их устранению, что позволит усовершенствовать технологию получения этаполана на основе этанола. 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основным объектом исследований являлся мутантный штамм бактерий Acinetobacter sp. 1НГ, не образующий ЭПС [3], а также исходный ЭПСсинтезирующий штамм Acinetobacter sp. 12S, описанный нами ранее [1]. Культивирование Acinetobacter sp. Бактерии выращивали на жидкой минеральной среде следующего состава (г/л): KH2PO4 – 6,8; NaOH – 0,9; NaCl – 1,1; NH4NO3 – 0,6; MgSO4x7H2O – 0,4; CaCl2x2H2O – 0,1; FeSO4x7H2O – 0,001 (стандартная среда 1). В среду дополнительно вносили 0,5% (по объему) дрожжевого автолизата и 0,0003 - 0,0009% пантотената кальция. В качестве источника углерода и энергии использовали этанол в концентрации 1% (по объему). Культивирование бактерий осуществляли также на жидкой минеральной среде 2, не содержащей соединений натрия (NaOH и NaCl были заменены на эквимолярные количества KOH и KCl). Acinetobacter sp. 1НГ культивировали в колбах на качалке (220 об/мин) при 30оС, рН 6,8-7,0 в течение 16 - 72 ч. Время выращивания Acinetobacter sp. 12S составляло 96 ч. В качестве посевного материала использовали суточную культуру, выращенную на смешанной агаризованной среде (мясо-пептонный агар + сусло-агар в соотношении 1:1). Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности клеточной суспензии с последующим пересчетом на абсолютно сухой вес клеток по калибровочному графику. Количество ЭПС устанавливали весовым методом, как описано в работе [1]. Концентрацию ацетата в культуральной жидкости определяли энзиматически с использованием ацетаткиназы [4]. ацетальдегида в культуральной жидкости устанавливали по Наличие реакции с нитропруссидом натрия и пиперидином [5]. Получение бесклеточных экстрактов. Бактериальную суспензию, полученную после культивирования Acinetobacter sp. 1НГ в жидкой минеральной среде, центрифугировали (4000 g, 15 мин., 4оС). Полученный осадок клеток дважды отмывали от остатков среды 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,0) или 0,05 М К+-фосфатным буфером (рН 7,4), центрифугируя (4000 g, 15 мин., 4оС). Отмытые клетки ресуспендировали в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,0) или 0,05 М 4 фосфатном буфере (рН 7,4) и разрушали ультразвуком (22 кГц) 3 раза по 30 с при 4оС на аппарате УЗДН-1. Полученный дезинтеграт центрифугировали (12000 g, 30 мин., 4оС), осадок отбрасывали, надосадочную жидкость использовали в качестве бесклеточного экстракта. Для получения бесклеточных экстрактов использовали клетки, находящиеся в середине и конце экспоненциальной фазы роста (16-20 и 40-44 ч культивирования соответственно), а также клетки из стадии стационарного роста (68-72 ч). Энзиматическте анализы. Активность алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1.) и альдегиддегидрогеназы (КФ 1.2.1.3 и КФ 1.2.1.4) определяли по восстановлению НАД+ алкогольдегидрогеназы или (КФ НАДФ+ 1.1.99.8) при 340 нм определяли [6, 7]. Активность по восстановлению дихлорфенолиндофенола в присутствии феназинметосульфата (ФМС) при 600 нм [8]. Активность ацетальдегиддегидрогеназы ацилирующей (КФ 1.2.1.10) [9] и ацетил-КоА-синтетазы (КФ 6.2.1.1) [10] анализировали по образованию ацетилКоА, используя его реакцию с гидроксиламином с образованием ацетилгидроксамата. Продукт реакции ацетилгидроксамата с хлорным железом определяли спектрофотометрически при 540 нм. Активность ацетаткиназы (КФ 2.7.2.1) [11] определяли по образованию ацетилфосфата, который при взаимодействии с гидроксиламином образует ацетилгидроксамат. Активность изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1) определяли по скорости образования фенилгидразона глиоксилата при 324 нм [12]. Активность ферментов определяли при температуре 28-30оС, оптимальной для роста Acinetobacter sp., и выражали в нмоль/мин мг белка. Содержание белка в бесклеточных экстрактах определяли по Bradford [13]. Константу Михаэлиса (Км) определяли графически методом двойных обратных величин Лайнуивера-Бэрка [14]. Для определения активностей алкоголь- и альдегиддегидрогеназы Acinetobacter sp. 1НГ выращивали на стандартной среде 1, при определении 5 ацетил-КоА-синтетазы, ацетаткиназы и изоцитратлиазы бактерии культивировали также на среде 2, не содержащей соединений натрия. Определение скорости окисления субстратов интактными клетками Acinetobacter sp. 1 НГ. Скорость окисления этанола, ацетальдегида (АА), ацетата и сукцината (скорость дыхания интактных клеток в присутствии данных субстратов) определяли по скорости потребления кислорода в реакционной смеси полярографически при помощи электрода закрытого типа на полярографе ППТ-1 при температуре 28-30оС, оптимальной для роста Acinetobacter sp. Удельную скорость потребления кислорода выражали в нмоль О2/мин мг клеток. Концентрация субстратов составляла 10 мМ. Для определения скорости дыхания клетки Acinetobacter sp. 1НГ, полученные после культивирования в стандартной жидкой минеральной среде 1 (16-20 часов, экспоненциальная фаза роста), центрифугировали (4000 g, 15 мин., 4оС). Полученный осадок клеток дважды отмывали от остатков среды 0,05 М трис-НСl или фосфатным буфером (рН 6,8), центрифугируя (4000 g, 15 мин., 4оС). Отмытые клетки ресуспендировали в 0,05 М трис-НСl или фосфатном буфере (рН 6,8) и инкубировали на качалке в течение 1- 20 часов (30оС, 220 об/мин). Инкубацию клеток в буфере (или «голодание» клеток) проводили с целью снижения уровня их эндогенного дыхания. Для отмывания и голодания клеток, а также для их инкубации при определении скоростей окисления субстратов использовали трис-НСl; К+, Na+- или К+-фосфатный буфер (0,05 M, pH 6,8). В одном из вариантов голодание клеток проводили в присутствии пантотеновой кислоты (витамина В3), которую вносили в фосфатный буфер в концентрации 0,0003%. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Окисление этанола. Первым этапом метаболизма этанола у бактерий является его окисление до ацетальдегида, осуществляемое ферментом алкогольдегидрогеназой. Известны два типа алкогольдегидрогеназ: НАД(Ф)+- и пирролохинолинхинон-зависимые ферменты [6, 8, 15, 16]. В первом случае 6 акцептором электронов (и простетической группой фермента) является НАД или + НАДФ+, во втором – пирролохинолинхинон (ПХХ). Акцептором электронов в реакции обнаружения ПХХ-зависимой ферментативной активности является искусственный акцептор электронов феназинметосульфат и 2,6- дихлорфенолиндофенол, в связи с чем ПХХ-зависимая алкогольдегидрогеназа называется также ФМС-зависимой. Окисление метанола у метилотрофных бактерий осуществляется ФМС-зависимой метанолдегидрогеназой [8, 15], хотя у Bacillus sp. C1 метанол окисляется НАД+-зависимым ферментом [16]. ФМС- зависимая этанолдегидрогеназа обнаружена у бактерий рода Pseudomonas [17]. Окисление этанола у четырех штаммов Acinetobacter calcoaceticus осуществляется НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназой [6]. В 90-е годы у некоторых грамположительных бактерий обнаружен новый тип никотинпротеиновых алкогольдегидрогеназ, которые используют N,N1-диметил4-нитрозоанилин в качестве акцептора электронов [18]. В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. зависимая алкогольдегидрогеназа, однако 1НГ не выявлена ФМС- обнаружена НАД+-зависимая этанолдегидрогеназная активность с оптимумом рН 9,0 (рис. 1, А). В процессе роста бактерий активность НАД+-зависимой этанолдегидрогеназы снижалась на 20-30% и в стационарной фазе составляла 260-270 нмоль/мин мг белка (табл.1). Таким образом, окисление этанола до АА у бактерий Acinetobacter sp. осуществляется НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназой. Окисление ацетальдегида. В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1НГ обнаружена активность НАД+-зависимой ацетальдегиддегидрогеназы с оптимумом рН 9,0 (как и в случае алкогольдегидрогеназной активности) (рис. 1, А). Алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназные активности характеризовались различным сродством к НАД+: константа Михаэлиса составляла 1 и 3 мМ соответственно (рис. 2). Вывод о том, одна или две различные НАД+-зависимые дегидрогеназы катализируют окисление этанола и ацетальдегида у Acinetobacter sp., может быть сделан только после выделения фермента (или ферментов) и изучения их физико-химических свойств. + Активность НАД -зависимой ацетальдегиддегидрогеназы была почти 7 в три раза ниже, чем активность алкогольдегидрогеназы (табл. 1, рис. 1). Однако скорость дыхания интактных клеток в присутствии ацетальдегида не отличалась от скорости дыхания в присутствии этанола (табл. 2), а в культуральной жидкости не был обнаружен ацетальдегид. Дальнейшие эксперименты показали, что акцептором электронов в ацетальдегиддегидрогеназной реакции у Acinetobacter sp. 1НГ, кроме НАД+, является также НАДФ+ (рис. 1). Так, полярографические исследования окисления АА бесклеточным экстрактом Acinetobacter sp. 1НГ показали, что в присутствии ФМС и НАДФ+ скорость окисления данного субстрата при всех исследованных значениях рН была в два раза выше, чем при добавлении НАД+, оптимум рН составлял 9,0 (рис. 1, Б). Аналогичные результаты были получены при спектрофотометрическом определении скорости НАД+- и НАДФ+-зависимого окисления ацетальдегида (рис. 1, А). Следует отметить, что НАДФ+ не являлся акцептором электронов в этанолдегидрогеназной реакции. Известно, что окисление АА может катализироваться ацетальдегиддегидрогеназой ацилирующей. Так, например, с также участием этого фермента происходит образование ацетил-КоА из ацетальдегида и коэнзима А у бактерий Pseudomonas sp. [19]. Однако активность ацетальдегиддегидрогеназы ацилирующей, обнаруженная в бесклеточном эктракте Acinetobacter sp. 1НГ, была крайне низкой (10-15 нмоль/мин мг белка) (табл. 1). Метаболизм ацетата. Очередной этап наших исследований был посвящен изучению скорости окисления этанола, ацетальдегида и ацетата интактными клетками Acinetobacter sp. 1НГ. Необходимость проведения таких исследований была обусловлена следующим. При выращивании на этаноле как исходного ЭПС-образующего, так и ЭПС---штамма Acinetobacter sp. в среде необходимо наличие достаточно емкого буфера с нейтральным значением рН. При культивировании бактерий в незабуференной среде наблюдается снижение рН культуральной жидкости до 4,5 [1], обусловленное накоплением ацетата (5065 мМ). Накопление ацетата наблюдается также при отсутствии или 8 недостаточной концентрации в забуференной среде пантотеновой кислоты (витамина В3) - предшественника коэнзима А, посредством которого, вероятно, ацетат включается в метаболизм [1, 2]. Таким образом, необходимо было выяснить причины накопления ацетата в культуральной жидкости при выращивании Acinetobacter sp. на этаноле. Исследование скорости окисления этанола, АА и ацетата целыми клетками Acinetobacter sp. 1НГ показало, что независимо от времени голодания клеток скорость дыхания в присутствии этанола и АА оставалась практически неизменной, однако по мере голодания существенно снижалась скорость дыхания в присутствии ацетата (табл. 2). Из представленных данных видно, что клетки с более высокой скоростью окисляли ацетат калия, чем ацетат натрия. В данных экспериментах клетки находились в K+, Na+-фосфатном буфере, состав которого аналогичен буферу в стандартной среде культивирования бактерий. При определении скорости дыхания интактных клеток бактерий в присутствии ацетата калия и натрия концентрация этих субстратов составляла 10 мМ. Таким образом, увеличение на 10 мМ содержания Na+, вносимого в виде ацетата, сопровождалось снижением скорости дыхания клеток в присутствии этого субстрата на 20 - 25% (при голодании клеток в течение 1-3 ч) и более, чем в два раза при голодании в течение 20 ч (табл. 2). Полученные результаты позволили выдвинуть предположение об ингибировании окисления ацетата в интактных клетках Acinetobacter sp. ионами натрия. Известно, что Na+ ингибирует активность ацетат-активирующего фермента (ацетил-КоА-синтетазы) [10]. Учитывая, что бактерии Acinetobacter sp. нуждаются в витамине В3, который принимает участие в метаболизме ацетата, предположили также, что этот витамин может служить активатором окисления ацетата. Дальнейшие эксперименты подтвердили наши предположения. Скорость дыхания в присутствии как ацетата калия, так и ацетата натрия через 3 ч голодания клеток в К+-фосфатном буфере не снижалась и была выше, чем при голодании клеток в K+, Na+-фосфатном буфере (табл. 3). Кроме того, клетки, голодавшие в присутствии В3, окисляли ацетат с более высокой скоростью, чем клетки, находящиеся в отсутствие этого витамина. 9 Скорость дыхания в присутствии ацетата калия клеток, находящихся как в K+, Na+-фосфатном, так и в К+-фосфатном буфере, была выше, чем в присутствии ацетата натрия (табл.3). При добавлении 25 - 100 мМ Na+ к клеткам, находящимся в К+- фосфатном буфере, скорость дыхания в присутствии ацетата снижалась в 1,3 - 2 раза (табл. 4). Аналогичные концентрации NH4+ не влияли на величину скорости дыхания клеток в присутствии этого субстрата. Кроме того, скорость дыхания интактных клеток Acinetobacter sp. 1НГ в присутствии этанола и сукцината практически не изменялась при добавлении исследуемых концентраций катионов натрия и аммония (табл. 4). Вместе с тем следует отметить, что скорость дыхания в присутствии этанола клеток, находящихся в К+-фосфатном буфере, была несколько выше, чем в K+, Na+-фосфатном (табл. 2 и табл. 4). При исследовании влияния К+ на скорость дыхания клеток в присутствии различных субстратов для отмывания, голодания клеток и их инкубации при определении скорости окисления использовали трис-НСl буфер (0,05 М, рН 6,8). Установлено, что катионы калия в концентрации 25-100 мМ не влияли на скорость дыхания интактных клеток в присутствии этанола и сукцината, которая составляла 60-70 нмоль О2/мин мг клеток. В то же время скорость дыхания в присутствии ацетата клеток, находящихся в трис-НСl буфере, была крайне низкой и не превышала 5-7 нмоль О2/мин мг клеток, в связи с чем исследование влияния К+ на окисление ацетата в этих условиях оказалось невозможным. Однако при инкубации таких клеток в К+-фосфатном буфере (аналогичной молярности и рН) скорость дыхания в присутствии ацетата повышалась в 6-8 раз. По нашему мнению, низкая скорость окисления ацетата клетками, находящимися в трис- НСl буфере, может быть обусловлена нарушением транспорта этого субстрата в клетки. Вполне вероятно, что ацетат поступает в клетки Acinetobacter sp. путем активного транспорта, использующего энергию протондвижущей силы, для генерации которой необходимо наличие ионных градиентов (например, К+ и Н+) на мембране клеток. 10 Таким образом, приведенные данные по влиянию катионов на скорость дыхания клеток Acinetobacter свидетельствовали о том, что sp. в присутствии различных субстратов катионы калия и аммония не ингибировали окисление этанола, ацетата и сукцината в интактных клетках бактерий. Результаты полярографических исследований позволили предположить, что при культивировании Acinetobacter sp. на стандартной этанолсодержащей среде наличие в ней ионов натрия может являться причиной лимитирования С2метаболизма бактерий и накопления ацетата в культуральной жидкости. При этом мы принимали во внимание то обстоятельство, что содержание Na+ в среде не обязательно соответствует концентрации этого катиона внутри клеток. Эксперименты показали, что при выращивании как мутантного, так и ЭПСобразующего штаммов Acinetobacter sp. на среде 2, не содержащей соединений натрия, с повышенной концентрацией В3 увеличивался уровень биомассы, ЭПС (для штамма 12S), не наблюдалось накопление ацетата и снижение рН культуральной жидкости (табл. 5). Положительное влияние катионов калия в среде культивирования ЭПС-образующего штамма на физико-химические свойства синтезируемого полисахарида показано нами ранее [20]. Обращает на себя внимание тот факт, что отрицательное влияние ионов натрия на рост бактерий менее выражено для ЭПС-образующего штамма, чем для мутантного. Наблюдаемое явление можно объяснить тем, что в процессе роста ЭПС-образующего штамма происходит структурирование синтезированного ЭПС одновалентными катионами, содержащимися в ростовой среде [1, 2]. При этом ионы натрия связываются с молекулами ЭПС и, следовательно, часть из них становится недоступной для клеток. В результате проведенных исследований были установлены условия культивирования ЭПС---штамма Acinetobacter sp., оптимальные для определения активности ферментов, участвующих в метаболизме ацетата. Вовлечение ацетата в метаболизм бактерий происходит двумя путями: при участии ацетаткиназы и фосфотрансацетилазы [21] или с помощью ацетил-КоАсинтетазы, которая акцептирует КоА с образованием ацетил-КоА [22, 23]. Для 11 многих видов бактерий, в том числе Escherichia coli, характерно наличие как ацетаткиназы, так и ацетил-КоА-синтетазы [23], причем E. сoli реализуют один из двух путей ассимиляции ацетата в зависимости от концентрации этого субстрата в среде. В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1НГ выявлена ацетаткиназная активность, которая не превышает 10 нмоль/мин мг белка, и, следовательно, не может иметь существенного значения для метаболизма ацетата у этих бактерий (табл. 1). Обнаружена также активность ацетил-КоА-синтетазы, более чем в 1015 раз превышающая ацетаткиназную (табл. 1). Уровень активности ацетил-КоАсинтетазы оставался неизменным в течение 48ч культивирования бактерий (до конца экспоненциальной фазы роста). Наличие в реакционной смеси ионов аммония не влияло на активность ацетил-КоА-синтетазы, в присутствии ионов натрия отмечалось существенное ингибирование активности данного фермента (табл. 4). Аналогичные закономерности установлены при исследовании влияния Na+ и NH4+ на скорость дыхания интактных клеток в присутствии ацетата (табл. 4). При выращивании Acinetobacter sp. 1НГ на стандартной среде, содержащей соединения натрия, активность ацетил-КоА-синтетазы в экспоненциальной фазе роста бактерий не превышала 70-75 нмоль/мин мг белка, тогда как на среде без Na+ она достигала 130-135 нмоль/мин мг белка (табл.1). Таким образом, энзимологические исследования подтвердили результаты полярографических исследований и ростовых экспериментов по ингибирующему влиянию ионов натрия на метаболизм ацетата у бактерий Acinetobacter sp. При росте бактерий на С2-соединениях анаплеротической последовательностью реакций, приводящиих к образованию оксалоацетата, является глиоксилатный цикл [21]. Одним из ключевых ферментов этого цикла является изоцитратлиаза. В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1НГ обнаружена изоцитратлиазная активность, которая остается на уровне 150-160 нмоль/мин мг белка даже на третьи сутки культивирования (стационарная фаза роста) (табл. 1). Следует отметить, что при культивировании Acinetobacter sp. 1НГ в условиях, приводящих к накоплению ацетата в культуральной жидкости (наличие соединений натрия и недостаточная концентрация В3 12 в среде) активность изоцитратлиазы снижалась до 7-7,5 нмоль/мин мг белка к концу экспоненциальной фазы роста (табл.1). Таким образом, в результате проведенной работы по изучению метаболизма этанола у Acinetobacter sp. установлено, что: - окисление этанола до ацетальдегида осуществляется НАД +-зависимой алкогольдегидрогеназой; - обнаружена ацетальдегиддегидрогеназная активность, акцепторами электронов являются НАД+ и НАДФ+; оптимум рН составляет 9,0; - включение ацетата в метаболизм происходит при участии ацетил-КоАсинтетазы, которая акцептирует КоА с образованием ацетил-КоА; - анаплеротической последовательностью реакций, восполняющих пул С4дикарбоновых кислот в клетках Acinetobacter sp. при росте на этаноле, является глиоксилатный цикл; - «узким» местом метаболизма этанола у бактерий Acinetobacter sp. является вовлечение ацетата в метаболизм, в частности, ингибирование окисления ацетата и активности ацетил-КоА-синтетазы ионами натрия, а также лимитирование С2- метаболизма коэнзимом А. Полученные данные являются основой для разработки новой технологии получения этаполана на основе этанола. ЛИТЕРАТУРА 1. Гринберг Т.А., Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р., Пинчук Г.Э. Микробный синтез экзополисахаридов на С1-С2-соединениях. Киев: Наук.думка, 1992. - 212 с. 2. Пирог Т.П. Принципы регуляции состава и физико-химических свойств экзополисахаридов, синтезируемых Acinetobacter sp. – Дисс….. докт. биол. наук. Киев, Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, 1999. – 450 с. 3. Пирог Т.П., Столяр С.М., Малашенко Ю.Р. Получение и исследование мутантных штаммов Acinetobacter sp., не образующих экзополисахариды // Микробиология. – 2000. - 69, N 5. – С. 674-680. 4. Криштаб Т.П., Соколов И.Г. Энзиматический метод количественного определения уксусной кислоты в культуральной жидкости // Микробиол. журнал. – 1985. – 47, N 1. – С. 86-88. 13 5. Файгль Ф. Капельный анализ органических веществ. М.: Госхимиздат, 1962. – 836 с. 6. Beardmore-Gray M., Anthony C. The absence of quinoprotein alcohol dehydrogenase in Acinetobacter calcoaceticus // J. Gen. Microbiol. – 1983. – 129, N 10. – P. 2979-2983. 7. Hommel R., Kurth J., Kleber H.P. NADP+-dependent aldehyde dehydrogenase from Acetobacter rancens CCM 1774: purification and properties // J. Basic Microbiol. – 1988. – 28, N 1-2. - P. 25-33. 8. Anthony C., Zatman L.J. The microbial oxidation of methanol. Purification and properties of the alcohol dehydrogenase of Pseudomonas sp. M27 // Biochem. J. – 1967. – 104. – P. 953-955. 9. Burton R.H., Stadtman E.R. The oxidation of acetaldehyde to acetyl coenzyme A // J. Biol. Chem. – 1953. – 202, N 2. – P. 873-890. 10. Beinert H., Green D.E., Hele P., Hift H., Von Korff R.W., Ramakrishnan C.V. The acetate activating enzyme system of heart muscle // J. Biol. Chem. – 1953. – 203, N 1. – P. 35-45. 11. Rose I.A., Grunberg-Manago M., Korey S., Ochoa S. Enzymatic phosphorilation of acetate // J. Biol. Chem. – 1954. – 211, N 2. – P. 737-756. 12. Dixon G.H., Kornberg H.S. Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle // Biochem. J. – 1959. – 72, N 1. – P. 195-196. 13. Bradford M. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - 72. - P.248-254. 14. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. Т.1. 392 с. 15. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs . - New York; London: Acad. press, - 1982. - 404 p. 16. Arfman N., de Vries K.J., Moezelaar H.R., Attwood M.M., Robinson G.K., van Geel M., Dijkhuizen L. Environmental regulation of alcohol metabolism in thermotolerant methylotrophic Bacillus strains // Arch. Microbiol. – 1992. – 157, N 3. – P. 272-278. 17. Diehl A., von Wintzingerode F., Gorisch H. Quinoprotein ethanol dehydrogenase of Pseudomonas aeruginosa is a homodimer – sequense of the gene abd deduced structural properties of the enzyme // Eur. J. Biochem. – 1998. – 257, N 2. – P. 409-419. 18. Nagy I., Verheijen S., De Schrijver A., Van Damme J., Proost J., Schoofs G., Vanderleyden J., De Mot R. Characterization of the Rhodococcus sp. N186/21 gene encoding alcohol:N,N1-dimethyl-4-nitrosoaniline oxidoreductase inducible by atrazine and thiocarbamate herbicides //Arch.Microbiol. – 1995. – 163, N 6. – P. 439-446. 19. Powlovski J., Sahlman L., Shingler V. Purification and properties of the physically associated meta-cleavage pathway enzymes 4-hydro-2-ketovalerate aldolase and aldehyde dehydrogenase (acylating) from Pseudomonas sp. strain CF600 // J. Bacteriol. – 1993. – 175, N 2. – P. 377-385. 20. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Буклова В.Н., Воцелко С.К., Малашенко Ю.Р. Образование экзополисахаридов в процессе периодического 14 культивирования Acinetobacter sp. на средах с различным содержанием К // Микробиология. - 1995. - 64, N 1. - С.51-54. 21. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. - М.: Мир, 1982. - 310 с. 22. Ampe F., Lindley N.D. Acetate utilization is inhibited by benzoate in Alcaligenes eutrophus: evidence for transcriptional control of the expression of acoE coding for acetyl coenzyme A synthetase // J. Bacteriol. – 1995. – 177, N 20. – P. 5826-5833. 23. Kumari S., Tishel R., Eisenbach M., Wolfe A.J. Cloning, characterization, and functional expression of acs, the gene which encodes acetyl coenzyme A synthetase in Escherichia coli // J. Bacteriol. – 1995. – 177, N 10. – P. 2878-2886. + 15 Таблица 1 Изменение активности ключевых ферментов метаболизма этанола в процессе культивирования Acinetobacter sp. 1НГ Ферменты Активность (нмоль/мин мг белка) при культивировании бактерий в течение (ч): 24 48 72 365,7 289,5 265,3 119,5 93,7 79,8 253,7 197,3 157,1 14,7 10,9 н.о. Ацетаткиназа 9,8 7,1 н.о. Ацетил-КоА-синтетаза 135,7 (74,5) 134,1 н.о. Изоцитратлиаза 130,0 (50,5) 144,9 (7,4) 156,3 НАД+-зависимая алкогольдегидрогеназа НАД+-зависимая ацетальдегиддегидрогеназа НАДФ+-зависимая ацетальдегиддегидрогеназа Ацетальдегиддегидрогеназа ацилирующая Примечание: 1. Культивирование бактерий осуществляли на стандартной среде 1, содержащей 0,0006 % В3. 2. При определении активности ацетаткиназы, ацетил-КоАсинтетазы и изоцитратлиазы бактерии выращивали на среде 2, содержащей 0,0009% В3. В скобках приведены данные, полученные при культивировании Acinetobacter sp. 1НГ на стандартной среде 1, содержащей 0,0006 % В3 . 3. Н.о. – не определяли. 4. Состав сред 1 и 2 указан в разделе «Материалы и методы» 16 Таблица 2 Влияние длительности голодания интактных клеток Acinetobacter sp. 1НГ на скорость дыхания в присутствии этанола, ацетальдегида и ацетата Длительность голодания клеток, ч Скорость дыхания, нмоль О2/мин мг клеток Этанол Ацетальдегид Ацетат натрия Ацетат калия 1 120,6 123,3 73,4 88,5 3 132,1 139,6 53,2 65,3 20 129,9 133,5 7,5 18,3 Примечание: 1. Культивирование бактерий осуществляли на стандартной среде 1, содержащей 0,0006 % В3. 2. Для голодания клеток использовали К+, Na+-фосфатный буфер (0,05М; рН 6,8). 3. При определении скорости дыхания клетки инкубировали в К+, Na+-фосфатном буфере (0,05М; рН 6,8). 4. Концентрация этанола, ацетальдегида и ацетата составляла 10 мМ. 17 Таблица 3 Влияние Na+ и пантотеновой кислоты (витамина В3) на скорость дыхания интактных клеток Acinetobacter sp. 1НГ в присутствии ацетата Фосфатный буфер (0,05 М, рН 6,8) KH2PO4 + NaOH Концентрация В3 в буфере, % Скорость дыхания, нмоль О2/мин мг клеток Ацетат калия Ацетат натрия 0 65,3 (88,5) 53,2 (73,4) 0,0003 87,8 72, 3 0 118,2 (119,7) 91,4 (90,3) 0,0003 134,5 107,2 KH2PO4 + KOH Примечание: 1. Культивирование бактерий осуществляли на стандартной среде 1, содержащей 0,0006 % В3. 2. Длительность голодания клеток составляла 3 ч. В скобках приведены данные, полученные при голодании клеток в течение 1ч. 3. Фосфатный буфер использовали как для голодания клеток, так и для их инкубации при определении скорости дыхания. 18 Таблица 4 Влияние катионов натрия и аммония на активность ацетил-КоАсинтетазы в бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1НГ и скорость дыхания в присутствии этанола, ацетата и сукцината интактных клеток бактерий Катионы Без катионов Na+ NH4+ Концентрация катионов, мМ Активность ацетил-КоАсинтетазы в бесклеточном экстракте, нмоль/мин мг белка Скорость дыхания интактных клеток, нмоль О2/мин мг клеток Этанол Ацетат калия Сукцинат калия 0 135,7 147,8 118,2 125,3 25 103,9 145,4 91,8 124,9 50 87,5 140,9 78,6 125,0 100 63,1 138,2 59,7 122,1 25 136,4 148,5 121,9 126,0 50 133,9 146,4 120,0 128,4 100 134,8 147,0 118,2 129,3 Примечание: 1. Для определения активности ацетил-КоА-синтетазы бактерии выращивали до середины экспоненциальной фазы роста на среде 2, содержащей 0,0009% В3. 2. Для определения скорости дыхания культивирование бактерий осуществляли на стандартной среде 1, содержащей 0,0006 % В3. Длительность голодания клеток в К+-фосфатном буфере (0,05М; рН 6,8) составляла 3 ч. Скорость дыхания определяли при инкубации клеток в К+фосфатном буфере (0,05М; рН 6,8). 3. Na+ и NH4+ вносили в реакционную смесь в виде соответствующих хлоридов.
