регуляция с2-метаболизма в условиях миксотрофного роста

РЕГУЛЯЦИЯ С2-МЕТАБОЛИЗМА В УСЛОВИЯХ МИКСОТРОФНОГО РОСТА
ПРОДУЦЕНТА ПОЛИСАХАРИДА ЭТАПОЛАНА НА СМЕСИ С2-С6СУБСТРАТОВ
Т.П.Пирог, Н.В.Лащук
Национальный университет пищевых технологий, Киев, Украина, tapirog@usuft.kiev.ua
Ранее нами была показана возможность увеличения синтеза микробного
экзополисахаридного препарата (ЭПС) этаполана при выращивании Acinetobacter sp.
УКМ В-7005 на смеси энергетически-неравноценных субстратов. На основе
теоретических расчетов энергетических потребностей синтеза биомассы и ЭПС на
энергетически-дефицитном
субстрате
(глюкоза)
определена
"дополняющая"
концентрация энергетически-избыточного субстрата (этанол), позволяющая восполнить
потери углерода глюкозы при окислении ее до СО2 с целью получения энергии для
процессов конструктивного метаболизма. Введение этанола в среду с глюкозой в
молярном соотношении 3,1:1 сопровождалось увеличением в 1,5-2 раза количества
синтезированных ЭПС, а также их выхода от субстрата по сравнению с выращиванием
продуцента на моносубстратах.
Недостатком технологии получения этаполана на смеси этанола и глюкозы
является необходимость поддержания нейтрального значения рН в процессе
культивирования продуцента, что достигалось введением в среду
высокой
концентрации солей (11 г/л) для создания достаточно емкого фосфатного буфера (0,05
М). При выращивании Acinetobacter sp. УКМ В-7005 на незабуференной среде с
этанолом и глюкозой наблюдалось снижения рН до 4-5, прекращение роста бактерий и
синтеза ЭПС.
Цель данной работи – выяснение причин лимитирования метаболизма при
выращивании Acinetobacter sp. УКМ В-7005 на смеси С2-С6-субстратов, разработка
подходов к их устранению и
реализация биосинтеза этаполана в условиях
миксотрофного роста продуцента на незабуференной среде.
Энзимологические исследования Acinetobacter sp. УКМ В-7005 показали, что С2С6-метаболизм у данных бактерий лимитирован коэнзимом А. Так, при
культивировании продуцента этаполана на среде с моносубстратами (глюкоза или
этанол) без пантотената кальция (предшественника коэнзима А) наблюдали снижения
рН культуральной жидкости, обусловленное накоплением пирувата (40-50 мМ) или
ацетата (50-65 мМ)
соответственно. Установлено, что снижения рН при
культивировании бактерий на незабуференной среде
с этанолом и глюкозой
обусловлено накоплением ацетата. Пируват в культуральной жидкости не обнаружен.
Лимитирование метаболизма ацетата при выращивании Acinetobacter sp. УКМ В-7005
на смеси этанола и глюкозы может быть связано с ингибированием активности ацетилКоА-синтетазы продуктами окисления этанола (НАДН и НАДФН) или с
ингибированием синтеза этого фермента глюкозой, как установлено для Saccharomyces
cerevisiae и Bacillus subtilis.
Показано, что активатором ацетил-КоА-синтетазы у продуцента этаполана
является пантотеновая кислота. Повышение концентрации этого витамина в среде до
0,0009% и снижение концентрации азотного источника питания до 0,3 г/л
сопровождалось увеличением синтеза ЭПС на смеси С2-С6-субстратов в 1,5-1,7 раза.
Однако при этом рН увеличивалось незначительно, а в культуральной жидкости был
обнаружен ацетат.
191
Известно, что ацетил-КоА-синтетаза, функционирующая в клетках многих про- и
эукариот, является индуцибельным ферментом (индуктор - ацетат). Мы предположили,
что использование инокулята, выращенного на ацетате или этаноле в присутствии
ацетата, даст возможность частично снять лимитирование С2-метаболизма в условиях
миксотрофного роста Acinetobacter sp. УКМ В-7005 на смеси этанола и глюкозы.
Установлено, что при использовании инокулята, выращенного на ацетате, показатели
синтеза ЭПС увеличивались, при этом активность НАД+- зависимой
алкогольдегидрогеназы снижалась в 3 раза, в то время как активность ацетил-КоАсинтетазы, ацетаткиназы, изоцитратлиазы и малатсинтазы повышалась в 1,8-2 раза по
сравнению с использованием посевного материала, полученного на этаноле. Таким
образом, энзимологические исследования свидетельствуют об устранении
лимитирования метаболизма ацетата при культивировании Acinetobacter sp. В-7005 на
незабуференной среде с этанолом и глюкозой.
Кроме пантотеновой кислоты, активаторами ацетил-КоА-синтетази у
Acinetobacter sp. В-7005 являются катионы калия и магния. Так, максимальная
активность этого фермента в бесклеточном экстракте наблюдалась в присутствии 100
мМ К+ или 5-10 мМ Mg2+. Повышение в среде культивирования продуцента этаполана
концентрации катионов калия и магния сопровождалось увеличением количества
синтезированных ЭПС на 20-27% и выхода ЭПС от субстрата в 1,3 раза, то есть
практически до уровня, получаемого в условиях миксотрофного роста на среде с
високой емкостью буфера - 8,3-9,2 г/л.
Еще одним подходом для интенсификации синтеза этаполана на смеси этанола и
глюкозы может быть дробное внесение субстратов в среду. По нашему мнению, такой
прием позволит, с одной стороны, снизить или устранить ингибирующее действие
продуктов окисления этанола и ацетальдегида на активность ацетил-КоА-синтетазы, а с
другой - частично снять возможное репрессирующее влияние глюкозы на синтез этого
фермента. В пользу этого предположения свидетельствовали результаты определения
скорости дыхания интактных клеток в присутствии С2-С6-субстратов. Так, скорость
окисления ацетата клетками, выращенными на среде с повышенным содержанием
глюкозы и этанола, была в 1,3-1,7 раза ниже, чем у клеток, культивируемых при более
низкой концентрации субстратов. При этом скорость дыхания в присутствии этанола,
ацетальдегида, глюкозы и пирувата была практически одинаковой независимо от
концентрации этанола и глюкозы в среде культивирования.
Установлено, что снижение начальной концентрации субстратов в среде до 0,5 и
0,25% (с последующим дробным внесением порциями по 0,25% в процессе
культивирования бактерий) сопровождалось повышением показателей синтеза ЭПС в
1,2-1,4 раза.
Таким образом, в результате проведенной работы показана возможность
устранения лимитирования С2-метаболизма при выращивании продуцента этаполана на
смеси этанола и глюкозы. Уменьшение содержания нитратно-аммонийного источника
азота в среде до 0,3 г/л и замена его на нитратный, повышение концентрации
пантотената кальция до 0,0009%, катионов калия и магния до 100 и 5-10 мМ
соответственно, использование посевного материала, выращенного на ацетате,
снижение начальной концентрации этанола и глюкозы до 0,25-0,5 % с последующим
дробным их внесением дало возможность предупредить накопление ацетата в
культуральной жидкости и реализовать без снижения показателей синтез этаполана в
условиях миксотрофного роста продуцента на незабуференной среде.
192