Ä. À. Ãóñàðîâ, È. Â. Ñîêîëîâà, Â. Ä. Ãóñàðîâà, Å.... Ò. Â. Âîðîáüåâà, Ñ. À. Êîñàðåâ, Å. Ä. Øèáàíîâà, Ä....

© Êîëëåêòèâ àâòîðîâ, 2012
Ä. À. Ãóñàðîâ, È. Â. Ñîêîëîâà, Â. Ä. Ãóñàðîâà, Å. À. Åâòååâà,
Ò. Â. Âîðîáüåâà, Ñ. À. Êîñàðåâ, Å. Ä. Øèáàíîâà, Ä. È. Áàèðàìàøâèëè
ÐÀÇÐÀÁÎÒÊÀ ÝÔÔÅÊÒÈÂÍÎÉ ÎÏÛÒÍÎ-ÏÐÎÌÛØËÅÍÍÎÉ
ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ ÏÎËÓ×ÅÍÈß N,N-ÁÈÑÌÅÒÈÎÍÈËÃÈÑÒÎÍÀ H1.3,
ÈÑÏÎËÜÇÓÅÌÎÃÎ ÄËß ÒÅÐÀÏÈÈ ËÈÌÔÎÌ
Ôåäåðàëüíîå ãîñóäàðñòâåííîå áþäæåòíîå ó÷ðåæäåíèå íàóêè Èíñòèòóò áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè
èì. àêàäåìèêîâ Ì. Ì. Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ÷èííèêîâà ÐÀÍ, Ìîñêâà, Ðîññèÿ
 íàñòîÿùåå âðåìÿ â ìåäèöèíå âñå áîëüøåå âíèìàíèå óäåëÿåòñÿ òåðàïåâòè÷åñêîìó ëå÷åíèþ ëèìôîì ñ ïîìîùüþ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë. Îäíàêî îòñóòñòâèå â íàøåé ñòðàíå
ïðîèçâîäñòâà ïîäîáíûõ ïðåïàðàòîâ âûíóæäàåò çàêóïàòü èõ çà ðóáåæîì. Ïîêàçàíî, ÷òî
ãèñòîíû êëàññà Í1 ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû êàê êîíêóðåíòíûå àíàëîãè ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë ïî ðåçóëüòàòàì òåðàïåâòè÷åñêîãî âîçäåéñòâèÿ. Íàìè ðàçðàáîòàíà ýôôåêòèâíàÿ îòå÷åñòâåííàÿ îïûòíî-ïðîìûøëåííàÿ òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî
N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3, îïèñàííàÿ â íàñòîÿùåé ñòàòüå. Íàðàáîòàííîå êîëè÷åñòâî
ïðåïàðàòà, ÷èñòîòà è àêòèâíîñòü êîòîðîãî ïîäòâåðæäåíû ðàçëè÷íûìè òåñòàìè, ïîçâîëèëî íà÷àòü êëèíè÷åñêèå èñïûòàíèÿ â íàøåé ñòðàíå.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí, ëèìôîìà, õðîìàòîãðàôèÿ, òåõíîëîãèÿ.
Îäíèì èç íàèáîëåå îïàñíûõ îíêîëîãè÷åñêèõ çàáîëåâàíèé ÿâëÿþòñÿ ëèìôîìû, â ïðîöåññå êîòîðûõ ïðîèñõîäèò áåñêîíòðîëüíîå íàêîïëåíèå îïóõîëåâûõ ëèìôîöèòîâ. Ïî êëàññèôèêàöèè ÂÎÇ âûäåëÿþò 43 ðàçëè÷íûå ôîðìû ëèìôîì [1].  íàèáîëåå îáùåì
ðàññìîòðåíèè âñå ýòè ôîðìû âõîäÿò ëèáî â êëàññè÷åñêèå õîäæêèíñêèå (ëèìôîãðàíóëåìàòîç õîäæêèíñêîãî
òèïà), ëèáî â íåõîäæêèíñêèå ëèìôîìû.
Ëå÷åíèå òàêèõ îáðàçîâàíèé ìîæåò âêëþ÷àòü ãîðìîíàëüíóþ, ðàäèî-, õèìèî- è êîìáèíàöèîííóþ òåðàïèè,
ãåìàòîïîýçíóþ ïåðåñàäêó ñòâîëîâûõ êëåòîê, à òàêæå
òåðàïèþ ìîíîêëîíàëüíûìè àíòèòåëàìè. Ïîñëåäíåé â
íàñòîÿùåå âðåìÿ óäåëÿþò îñîáåííîå âíèìàíèå. Ïðè
òåðàïèè ìîíîêëîíàëüíûìè àíòèòåëàìè, íàèáîëåå èçâåñòíûì èç êîòîðûõ ÿâëÿåòñÿ ðèòóêñèìàá (ìàáòåðà),
ìèøåíüþ â îðãàíèçìå áîëüíîãî ÿâëÿåòñÿ ñïåöèôè÷åñêàÿ ïîâåðõíîñòíàÿ äåòåðìèíàíòà CD20, ïðåäñòàâëÿþùàÿ ñîáîé íåãëèêîçèëèðîâàííûé ôîñôîðèëèðîâàííûé áåëîê, ñîñòîÿùèé èç 297 à.ê.î. (ìîëåêóëÿðíàÿ
ìàññà 32 – 37 êÄà) [2, 3]. Îäíàêî òàêîå òåðàïåâòè÷åñêîå ëå÷åíèå èìååò ðÿä íåäîñòàòêîâ: âîçìîæíûå àíàôèëàêòè÷åñêèå ðåàêöèè [4]; îñëîæíåíèÿ, âûçûâàåìûìè ðàäèîàêòèâíûìè èçîòîïàìè (÷àùå âñåãî éîäà 131
èëè èòòðèÿ 90), êîòîðûìè ìå÷åíî ìîíîêëîíàëüíîå àíòèòåëî (íàïðèìåð, èáðèòóìîìàá, èëè çåâàëèí, à òàêæå
òîñèòóìîìàá, èëè áåêññàð).
Ïîýòîìó íàì ïðåäñòàâëÿåòñÿ áîëåå ïåðñïåêòèâíûì
èñïîëüçîâàíèå ïðåïàðàòîâ íà îñíîâå ëèíêåðíûõ ãèñòîíîâ äëÿ òåðàïèè ëèìôîì. Ãèñòîíû êëàññà Í1 è èõ
ïðîèçâîäíûå ìîãóò îáðàçîâûâàòü àãðåãàòû ñ ôîñôàòèäèëñåðèíîì ìåìáðàíû îïóõîëåâîé êëåòêè, «âûìûâàÿ»
åãî èç áèñëîÿ ôîñôîëèïèäîâ, ÷òî ïðèâîäèò ê àïîïòîçó
óæå â ñ÷èòàííûå ìèíóòû äåéñòâèÿ ãèñòîíà è ê íåêðîçó
îïóõîëè ÷åðåç íåñêîëüêî ÷àñîâ òåðàïèè [5]. Îäíàêî íà
ñîâðåìåííîì áèîôàðìàöåâòè÷åñêîì ðûíêå â íàñòîÿùåå âðåìÿ ïðèñóòñòâóþò òîëüêî ïðåïàðàòû íà îñíîâå
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012
ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë, ïðè÷åì â íàøåé ñòðàíå, íå
èìåþùåé ñîáñòâåííûõ ïðîèçâîäñòâ, íåîáõîäèìî çàêóïàòü èõ çà ñ÷åò ãîñóäàðñòâåííîãî áþäæåòà [6]. Ïðåäñòàâëÿåòñÿ ïåðñïåêòèâíûì ðàçðàáîòàòü ýôôåêòèâíóþ
îòå÷åñòâåííóþ òåõíîëîãèþ ïðîèçâîäñòâà ëåêàðñòâåííûõ ôîðì íà îñíîâå ãèñòîíîâ, êàê êîíêóðåíòíûõ çàìåñòèòåëåé ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë. Îäíèì èç òàêèõ
ãèñòîíîâ ÿâëÿåòñÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3 [7].
Öåëü íàñòîÿùåé ðàáîòû — ðàçðàáîòêà îïûòíî-ïðîìûøëåííîé òåõíîëîãèè ïðîèçâîäñòâà àêòèâíîé ôàðìàöåâòè÷åñêîé ñóáñòàíöèè (ÀÔÑ) ðåêîìáèíàíòíîãî
N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3, íà îñíîâå óæå ðàçðàáîòàííîé ëàáîðàòîðíîé òåõíîëîãèè [8].
Ýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ÷àñòü
Ïðèáîðû è ìàòåðèàëû
 êà÷åñòâå ñèñòåìû äëÿ ñèíòåçà ðåêîìáèíàíòíîãî
N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà
Í1.3
èñïîëüçîâàëñÿ
øòàìì-ïðîäóöåíò E. coli BL21/prhH1.3, ïîëó÷åííûé
îò ÇÀÎ “Êðèîíèêñ” (Ðîññèÿ).
 ýêñïåðèìåíòàõ ïî áèîñèíòåòè÷åñêîé íàðàáîòêå
áåëêà èñïîëüçîâàëèñü ñëåäóþùèå ðåàêòèâû êâàëèôèêàöèè ÷., ÷.ä.à., õ.÷: ãëþêîçà; àìèíîòîí; äðîææåâîé
ýêñòðàêò; êàëèé ôîñôîðíîêèñëûé äâóçàìåùåííûé; íàòðèé õëîðèñòûé; ìàãíèé ñåðíîêèñëûé; êàíàìèöèí; àììèàê; èçîïðîïèë-b-D-òèîãàëàêòîïèðàíîçèä (ÈÏÒÃ);
âîäà î÷èùåííàÿ. Èñïîëüçîâàëîñü ñëåäóþùåå îáîðóäîâàíèå: åìêîñòíîé òàíê âìåñòèìîñòüþ 2,5 ì3; ôåðìåíòåð âìåñòèìîñòüþ 3 ì3; ñåïàðàòîð Westfallia (GEA
Westfallia, Ãåðìàíèÿ); ïðîòî÷íûé äåçèíòåãðàòîð Gaulin
MC 211 (APV, Ãåðìàíèÿ).
 ýêñïåðèìåíòàõ ïî âûäåëåíèþ è î÷èñòêå èñïîëüçîâàíû ñëåäóþùèå ðåàêòèâû êâàëèôèêàöèè õ.÷. è ôàðìàêîïåéíîé ÷èñòîòû: õëîðíàÿ, ëèìîííàÿ êèñëîòû; ýòàíîë; õëîðèä íàòðèÿ; ãèäðîêñèä íàòðèÿ; âîäà äëÿ èíú35
NH2
Met
Ser
Glu
Thr
Ala
Pro
Leu
Ala
Pro
Thr
Ile
Pro
Ala
Pro
Ala
Glu
Lys
Thr
Pro
Val
Lys
Val
Pro
Pro
Gly
Ser
Ala
Lys
Arg
Lys
Gly
Ala
Thr
Ala
Gly
Ala
Lys
Lys
Ala
Lys
Lys
Leu
Ile
Thr
Lys
Ala
Val
Ala
Ala
Ser
Lys
Glu
Arg
Ser
Gly
Val
Ser
Leu
Ala
Ala
Ser
Glu
Leu
Leu
Arg
Ile
Arg
Ser
Asn
Asn
Lys
Glu
Val
Asp
Tyr
Gly
Ala
Ala
Ala
Leu
Ala
Lys
Lys
Lys
Ser
Leu
Val
Ser
Lys
Gly
Thr
Leu
Val
Gln
Thr
Lys
Gly
Thr
Gly
Ala
Ser
Gly
Gly
Leu
Ser
Gly
Ala
Lys
Lys
Ala
Lys
Pro
Lys
Gly
Glu
Gly
Ser
Ala
Ala
Lys
Lys
Asn
Leu
Lys
Phe
Lys
Pro
Arg
Lys
Pro
Ala
Gly
Ala
Ala
Lys
Lys
Pro
Lys
Lys
Val
Ala
Gly
Ala
Ala
Ala
Ala
Thr
Gly
Ala
Ala
Thr
Ala
Pro
Lys
Lys
Val
Lys
Lys
Pro
Thr
Lys
Lys
Ile
Ser
Lys
Lys
Pro
Lys
Val
Ala
Lys
Ser
Ala
Lys
Lys
Val
Lys
Thr
Pro
Gln
Pro
Lys
Lys
Ala
Ala
Lys
Thr
Lys
Ser
Lys
Pro
Lys
Gly
Ser
Lys
Pro
Lys
Ala
Ala
Lys
Lys
Ala
Lys
Lys
Ala
Ala
Pro
Lys
Lys
Lys
Pro
Lys
Pro
Ala
Lys
Ala
Lys
Ala
Pro
Val
Thr
COOH
Ðèñ. 1. Àìèíîêèñëîòíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÷åëîâå÷åñêîãî ãèñòîíà Í1.3.
à
1
2
á
3
Äà, ìÂò
94000
67000
43000
30000
21100
14400
6
8
10
12
14
16
18
ìèí
Ðèñ. 2. Ðåçóëüòàòû àíàëèòè÷åñêîãî êîíòðîëÿ ñòàäèè ýêñòðàêöèè öåëåâîãî áåëêà èç ñóñïåíçèè äåçèíòåãðàòà êëåòî÷íîé ìàññû: à —
ÏÀÀÃÝ, äîðîæêà 1 ñîîòâåòñòâóåò áåëêó äî ýêñòðàêöèè, äîðîæêà 2 — áåëêó ïîñëå ýêñòðàêöèè, äîðîæêà 3 — ñòàíäàðòàì ìàññ LMW;
á — îáðàùåíî-ôàçîâàÿ ÂÝÆÕ, âðåìÿ óäåðæàíèÿ öåëåâîãî áåëêà ñîñòàâëÿåò ïðèìåðíî 13,4 ìèí.
åêöèé (î÷èùåííàÿ íà äèñòèëëÿöèîííîé óñòàíîâêå
ÄÝ-25, ìîäåëü 784, Ðîññèÿ). Ðàñòâîðû âñåõ ïîäâèæ-
36
íûõ ôàç ôèëüòðîâàëè ÷åðåç ôèëüòð 0,22 ìêì, ðàñòâîðû N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà — ÷åðåç ôèëüòð 1,2 ìêì.
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012
Äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü àäñîðáåíòà, ìã/ìë
mAU
24
%Â
Ãðàäèåíòíîå ñíèæåíèå ðÍ
2500
22
20
40
30
2000
18
20
Ãðàäèåíò ïîäâèæíûõ ôàç
1500
15
16
1000
10
14
500
12
10
5
0
50
100
150
200
250
Ñêîðîñòü ïîòîêà, ñì/÷
300
350
Ìåìáðàííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (Startobind S)
Êîëîíî÷íàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (Âiopro S-75)
Ðèñ. 3. Ñðàâíåíèå äèíàìè÷åñêîé åìêîñòè êàòèîíîîáìåííûõ
ìåìáðàíû è ñîðáåíòà ïðè ðàçëè÷íûõ ëèíåéíûõ ñêîðîñòÿõ ïîòîêà.
Èñïîëüçîâàëîñü ñëåäóþùåå îáîðóäîâàíèå: õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ ñèñòåìà BioProcess 6 mm (GE
Healthcare, Øâåöèÿ), ñíàáæåííàÿ õðîìàòîãðàôè÷åñêîé
êîëîííîé äèàìåòðîì 300 ìì (GE Healthcare, Øâåöèÿ),
óïàêîâàííîé ñîðáåíòîì Macroprep S (Biorad, ÑØÀ);
ÂÝÆÕ ñèñòåìà, ñîñòîÿùàÿ èç ãðàäèåíòíîãî íàñîñà
K-1800 (Knauer, Ãåðìàíèÿ), ÓÔ-äåòåêòîðà Smartline
2500 (Knauer, Ãåðìàíèÿ), ñàìîïèñöà R-18 (GE
Healthcare, Øâåöèÿ) è êîëîííû äèíàìè÷åñêîãî àêñèàëüíîãî ñæàòèÿ äèàìåòðîì 100 ìì (Áèîõèììàê, Ðîññèÿ), óïàêîâàííîé ñîðáåíòîì Kromasil KR-300-C4-16
(Akzo Nobel Eka Chemicals Separation AB, Øâåöèÿ);
õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ ñèñòåìà, ñîñòîÿùàÿ èç èçîêðàòè÷åñêîãî íàñîñà MCP (Ismatec, Øâåéöàðèÿ), ÓÔ-äåòåêòîðà Smartline 2500 (Knauer, Ãåðìàíèÿ), ñàìîïèñöà
R-18 (GE Healthcare, Øâåöèÿ) è õðîìàòîãðàôè÷åñêîé
êîëîííû äèàìåòðîì 200 ìì (GE Healthcare, Øâåöèÿ),
óïàêîâàííîé ñîðáåíòîì Sephacryl S-100 (GE
Healthcare, Øâåöèÿ).
 îïûòàõ ïî ñðàâíèòåëüíîìó èçó÷åíèþ ìåìáðàííîé è êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèè áûëè èñïîëüçîâàíû
ìåìáðàíà Sartobind S mini (Ñàðòîðîñ, Ðîññèÿ) è êîëîíêà BioPro S-75 (YMC, Ãåðìàíèÿ); âíóòðåííèé îáúåì
îáåèõ òåñò-ñèñòåì ïðèìåðíî îäèíàêîâ è ðàâåí 7 ìë.
Ìåòîäû àíàëèçà
Ýëåêòðîôîðåç â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå (ÏÀÀÃÝ)
ïðîâîäèëè ñîãëàñíî ìåòîäó Laemmli [9]. Îêðàøèâàíèå
ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè Coomassie Brilliant Blue R-250
(Bio-Rad, USA).
×èñòîòó è êîíöåíòðàöèþ ãèñòîíà â ðàñòâîðàõ àíàëèçèðîâàëè ìåòîäîì ÎÔ ÂÝÆÕ íà õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìå Agilent 1200 (Agilent Technologies,
ÑØÀ), ñíàáæåííîé õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîíêîé
YMC Butyl 5 ìêì 30 íì, 150 ´ 2,1 ìì (YMC Co, Ãåðìàíèÿ), ÓÔ-äåòåêòîðîì (äëèíà âîëíû 214 íì) è ñèñòåìîé äîçèðîâàííîãî ââîäà ïðîáû (îáúåì ïðîáû
20 ìêë). Ïîäâèæíàÿ ôàçà ñîñòîÿëà èç àöåòîíèòðèëà,
âîäû äëÿ èíúåêöèé, 20 ìÌ ôîñôàòà íàòðèÿ, 0,1 % îðòîôîñôîðíîé êèñëîòû (ðÍ 2,5 – 3,0). Ýëþèðîâàíèå
ïðîâîäèëè â ðåæèìå ãðàäèåíòà êîíöåíòðàöèè àöåòîÕèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012
0
0
2
4
6
8
10
ë
Ðèñ. 4. Õðîìàòîãðàììà ïðîöåññà îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ
î÷èñòêè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà. Ëåâàÿ îñü îðäèíàò — îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü; ïðàâàÿ îñü — ïðîöåíòíîå ñîäåðæàíèå ïîäâèæíîé ôàçû “”.
íèòðèëà (îò 0 äî 60 îá. %). Ñêîðîñòü ïîòîêà
1,0 ìë/ìèí. Âðåìÿ àíàëèçà 20 ìèí.
Ñîäåðæàíèå ìîíîìåðíîé ôîðìû ãèñòîíà, à òàêæå
ïðîäóêòîâ åãî äåãðàäàöèè îïðåäåëÿëè ìåòîäîì âûñîêîýôôåêòèâíîé
ýêñêëþçèîííîé
õðîìàòîãðàôèè
(ÂÝÝÕ). Àíàëèç îñóùåñòâëÿëñÿ íà õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìå Agilent 1100 (Agilent Technologies,
ÑØÀ), ñíàáæåííîé õðîìàòîãðàôè÷åñêîé êîëîíêîé
YMC SEC-DIOL 5 ìêì 20 íì, 300 ´ 8 ìì (YMC Co,
Ãåðìàíèÿ), ÓÔ-äåòåêòîðîì (äëèíà âîëíû 214 íì) è
ñèñòåìîé äîçèðîâàííîãî ââîäà ïðîáû (îáúåì ïðîáû
2 ìêë). Ïîäâèæíàÿ ôàçà ñîñòîÿëà èç 5 ìÌ àöåòàòà íàòðèÿ, 5 ìÌ óêñóñíîé êèñëîòû, 250 ìÌ õëîðèäà íàòðèÿ
â âîäå äëÿ èíúåêöèé, ðÍ 4,8. Ñêîðîñòü ïîòîêà
1 ìë/ìèí. Âðåìÿ àíàëèçà 15 ìèí.
Ñîäåðæàíèå áàêòåðèàëüíûõ ýíäîòîêñèíîâ îïðåäåëÿëè ñ ïîìîùüþ ãåëü-òðîìá ËÀË-òåñòà, êàê îïèñàíî â
ðàáîòå [10], ÷óâñòâèòåëüíîñòü ËÀË-ðåàêòèâà (ïðîèçâîäèòåëü Cape Cod, Inc., ÑØÀ) 0,03 ÝÅ/ìã.  êà÷åñòâå
ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè êîíòðîëüíûé
ñòàíäàðò ýíäîòîêñèíà O113:H10 (Cape Cod, Inc.,
ÑØÀ).
Ñîäåðæàíèå îñòàòî÷íûõ áåëêîâ êëåòîê ïðîäóöåíòà
îïðåäåëÿëè ñ ïîìîùüþ ÈÔÀ (èììóííî-ôåðìåíòíîãî
àíàëèçà), êàê îïèñàíî â èíñòðóêöèè, ïðèëàãàåìîé ê
íàáîðó ELISA E.coli Host Cell Proteins (Cygnus
Technologies Inc., ÑØÀ).
Ïðîìûøëåííîå êóëüòèâèðîâàíèå ïðîäóöåíòà
è áèîñèíòåç áåëêà
Êóëüòèâèðîâàíèå êëåòîê øòàìì-ïðîäóöåíòà ïðîâîäèëè â íåñêîëüêî ýòàïîâ. Íà ïåðâîì ýòàïå âûðàùèâàëè
ïîñåâíîé ìàòåðèàë â êîëáàõ, êàê îïèñàíî ðàíåå [8]. Íà
âòîðîì ýòàïå äëÿ âûðàùèâàíèÿ ïðîäóöåíòà â ôåðìåíòåðå ãîòîâèëè è ñòåðèëèçîâàëè ïèòàòåëüíóþ ñðåäó, ñîäåðæàùóþ àìèíîòîí, äðîææåâîé ýêñòðàêò, ôîñôîðíîêèñëûé äâóçàìåùåííûé êàëèé, õëîðèñòûé íàòðèé è
ñåðíîêèñëûé ìàãíèé. Çàòåì â ïèòàòåëüíóþ ñðåäó äîáàâëÿëè ñòåðèëüíûå ãëþêîçó è êàíàìèöèí. Ïîñëå ýòîãî îñóùåñòâëÿëè çàñåâ ôåðìåíòåðà ïîñåâíûì ìàòåðèàëîì (0,2 % îá.) è âûðàùèâàëè êëåòêè ïðîäóöåíòà ïðè
òåìïåðàòóðå 37 °C äî äîñòèæåíèÿ â êóëüòóðàëüíîé
37
à
1
2
á
3
Äà, ìÂò
94000
67000
43000
30000
21100
14400
6
8
10
12
14
16
18
ìèí
Ðèñ. 5. Ðåçóëüòàòû àíàëèòè÷åñêîãî êîíòðîëÿ ñòàäèè îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ: à — ÏÀÀÃÝ, äîðîæêà 1 ñîîòâåòñòâóåò áåëêó äî
î÷èñòêè, äîðîæêà 2 — áåëêó ïîñëå î÷èñòêè, äîðîæêà 3 — ñòàíäàðòàì ìàññ LMW; á — îáðàùåíî-ôàçîâàÿ ÂÝÆÕ, âðåìÿ óäåðæàíèÿ
öåëåâîãî áåëêà ñîñòàâëÿåò ïðèìåðíî 13,4 ìèí.
æèäêîñòè îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè, ðàâíîé 10 îïòè÷åñêèì åäèíèöàì. Íà ñëåäóþùåì ýòàïå ïðîâîäèëè èíäóêöèþ ñèíòåçà ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà ïóòåì ââåäåíèÿ â ôåðìåíòåð âîäíîãî ñòåðèëüíîãî ðàñòâîðà ÈÏÒÃ.
×åðåç 2,0 – 2,5 ÷ ïîñëå ââåäåíèÿ èíäóêòîðà ïðîöåññ
áèîñèíòåçà áåëêà îñòàíàâëèâàëè, à êóëüòóðó êëåòîê
ïîäàâàëè íà ñåïàðàòîð äëÿ îòäåëåíèÿ êëåòîê îò êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè. Ïîëó÷åííóþ ñóñïåíçèþ êëåòîê
ðàçðóøàëè ñ ïîìîùüþ ïðîòî÷íîãî äåçèíòåãðàòîðà.
Ïðîìûøëåííîå âûäåëåíèå áåëêà
Öåëåâîé áåëîê âûäåëÿëè èç äåçèíòåãðàòà êëåòî÷íîé
ìàññû ñ ïîìîùüþ ýêñòðàêöèè 1,0 – 2,5 % õëîðíîé êèñëîòîé. Äëÿ ýòîãî ìåäëåííî (â òå÷åíèå 10 – 15 ìèí)
ïðè àêòèâíîì ïåðåìåøèâàíèè äîáàâëÿëè êîíöåíòðèðîâàííóþ õëîðíóþ êèñëîòó â ñóñïåíçèþ äåçèíòåãðàòà
äî óñòàíîâëåíèÿ ðÍ ìåíåå 2,0. Ïðè ýòîì ðåêîìáèíàíòíûé N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3 îêàçûâàëñÿ â íàäîñàäî÷íîé æèäêîñòè, êîòîðóþ îòäåëÿëè îò êîàãóëèðîâàííûõ ïðèìåñåé íà ñåïàðàòîðå.
Ïðîìûøëåííàÿ î÷èñòêà áåëêà
Áåëîê, âûäåëåííûé ñ ïîìîùüþ ýêñòðàêöèè õëîðíîé
êèñëîòîé, î÷èùàëè â 3 ïîñëåäîâàòåëüíûõ õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ ýòàïà. Íà ïåðâîì ýòàïå áåëîê êîíöåíòðèðîâàëè, îäíîâðåìåííî èçáàâëÿÿ îò ïðèìåñåé, ñèëüíî îòëè÷íûõ îò öåëåâîãî ïî ôèçèêî-õèìè÷åñêèì ñâîéñòâàì, ñ ïîìîùüþ êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè íà
ñîðáåíòå Macroprep S. Ïîëó÷åííûå öåëåâûå ôðàêöèè
î÷èùàëè ñ ïîìîùüþ îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ íà
ñîðáåíòå Kromasil Ñ4. Íà ýòîì ýòàïå äîñòèãàëè ôàðìàêîïåéíîé ÷èñòîòû áåëêà, ìàêñèìàëüíî óäàëÿÿ âñå ïðèìåñè, âêëþ÷àþùèå ðîäñòâåííûå áåëêè, îñòàòî÷íûå
áåëêè øòàìì-ïðîäóöåíòà, ÄÍÊ, áàêòåðèàëüíûå ýíäîòîêñèíû è ò.ä. Äàëåå ïðåäâàðèòåëüíî îñàæäåííóþ ýòèëîâûì ñïèðòîì öåëåâóþ ôðàêöèþ áåëêà èçáàâëÿëè îò
êîìïîíåíòîâ ïîäâèæíîé ôàçû ïîñëå ÂÝÆÕ ñ ïîìîùüþ ãåëü-ôèëüòðàöèè, ýëþèðóÿ âîäîé äëÿ èíúåêöèé.
Î÷èùåííóþ áåëêîâóþ ôðàêöèþ ïîñëå ãåëü-ôèëüòðàöèè çàìîðàæèâàëè è ëèîôèëèçîâàëè äëÿ ïîëó÷åíèÿ
ÀÔÑ.
Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå
Ïðîìûøëåííîå êóëüòèâèðîâàíèå ïðîäóöåíòà è
áèîñèíòåç áåëêà
Ãèñòîíû — îñíîâíîé êëàññ íóêëåîïðîòåèíîâ, ÿäåðíûõ áåëêîâ, íåîáõîäèìûõ äëÿ ñáîðêè è óïàêîâêè íèòåé ÄÍÊ â õðîìîñîìû. Äàííûå áåëêè èãðàþò âàæíóþ
ðîëü â ïîääåðæàíèè è èçìåíåíèè ñòðóêòóðû õðîìîñîì
íà ðàçíûõ ñòàäèÿõ êëåòî÷íîãî öèêëà, à òàêæå â ðåãóëÿöèè àêòèâíîñòè ãåíîâ [11].
Ãèñòîí Í1.3 ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé áåëîê ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 22,5 êÄà (221 à.ê.î.) [12]. Êàê âèäíî
èç ïðåäñòàâëåííîé àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíî-
Àíàëèòè÷åñêèé êîíòðîëü ñóáñòàíöèè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3
Ïîêàçàòåëü
×èñòîòà, %
×èñòîòà, %
Âûñîêîìîëåêóëÿðíûå ïðèìåñè, %
Íèçêîìîëåêóëÿðíûå ïðèìåñè, %
Áàêòåðèàëüíûå ýíäîòîêñèíû, ÝÅ/ìã
Áåëêè êëåòîê E. coli, íã/ìã
Îñòàòî÷íàÿ ÄÍÊ, ïã/ìã
Àêòèâíîñòü, ìêÌ
38
Ìåòîä àíàëèçà
Ðåçóëüòàò
Òðåáîâàíèå
Ñîîòâåòñòâèå
ÂÝÆÕ
ÂÝÝÕ
ÏÀÀÃÝ
ÏÀÀÃÝ
ËÀË-òåñò
ÈÔÀ
ÏÖÐ
Êëåòî÷íûé òåñò
99,6
98,1
0
<1
< 0,125
0,15
2,5
2,5
Íå ìåíåå 98
Íå ìåíåå 97
Íå áîëåå 2
Íå áîëåå 2
Íå áîëåå 0,5
Íå áîëåå 100
Íå áîëåå 5
IC50: 0,5 – 3,5
Ñîîòâåòñòâóåò
Ñîîòâåòñòâóåò
Ñîîòâåòñòâóåò
Ñîîòâåòñòâóåò
Ñîîòâåòñòâóåò
Ñîîòâåòñòâóåò
Ñîîòâåòñòâóåò
Ñîîòâåòñòâóåò
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012
ñòè (ðèñ. 1), îí î÷åíü áîãàò îñòàòêàìè ëèçèíà (61
à.ê.î.), êîòîðûå ïðèäàþò åìó ÿðêî âûðàæåííûé ïîëîæèòåëüíûé çàðÿä (pI 11,02). Ïðîèçâîäíîå ãèñòîíà
Í1.3, èìåþùåå íà N-êîíöå äîïîëíèòåëüíûé îñòàòîê
ìåòèîíèíà è íàçâàííîå ðàçðàáîò÷èêîì “N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3”, áûëî ïðåäëîæåíî èñïîëüçîâàòü
äëÿ ñîçäàíèÿ ïðåïàðàòà “Oncohist” äëÿ òåðàïèè ëèìôîì [7].
Äëÿ áèîñèíòåçà ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ ÷àñòî èñïîëüçóþòñÿ øòàììû-ïðîäóöåíòû Escherichia coli ïî
ìíîãèì ïðè÷èíàì, à èìåííî: êóëüòèâèðîâàòü ïðîêàðèîòè÷åñêèå ìèêðîîðãàíèçìû äåøåâëå ïî ñðàâíåíèþ
ñ ýóêàðèòèî÷åñêèìè êëåòêàìè, áàêòåðèè ñïîñîáíû áûñòðî ñèíòåçèðîâàòü áåëêè â áîëüøèõ êîëè÷åñòâàõ, è,
íàêîíåö, íàêîïëåí çíà÷èòåëüíûé îïûò ðàáîòû èìåííî
ñ E. coli.
 õîäå ïðîìûøëåííîãî êóëüòèâèðîâàíèÿ øòàììïðîäóöåíòà è áèîñèíòåçà ïîëó÷àëè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3, ñîäåðæàíèå êîòîðîãî â äåçèíòåãðàòå, îïðåäåëåííîå ìåòîäîì ÏÀÀÃÝ, ñîñòàâëÿëî âñåãî 10 %,
÷òî ñîîòâåòñòâîâàëî âûõîäó 160 – 180 ã öåëåâîãî áåëêà/ì3 êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè. Îïòèìèçàöèÿ óñëîâèé
ôåðìåíòàöèè íå ïðèâåëà ê çàìåòíîìó óâåëè÷åíèþ âûõîäà. Îäíàêî íåêîòîðîå óëó÷øåíèå ìîæíî áûëî ñòàòèñòè÷åñêè ïðîñëåäèòü ïðè ñíèæåíèè òåìïåðàòóðû ïðîöåññà äî ââåäåíèÿ èíäóêòîðà ÈÒÏÃ, ÷òî ñâÿçàíî ñ óâåëè÷åíèåì ðîñòà êëåòîê. Òåì íå ìåíåå ðîñò êëåòîê íå
ïðîïîðöèîíàëüíî îòðàæàëñÿ íà óâåëè÷åíèè âûõîäà,
èç ÷åãî ìîæíî çàêëþ÷èòü, ÷òî â E. coli ïîñëå íà÷àëà
èíäóêöèè â áîëüøåé ñòåïåíè áèîñèíòåçèðîâàëèñü
ïðèìåñíûå áåëêè.
Äàëüíåéøåå âûäåëåíèå áåëêà èç ñóñïåíçèè äåçèíòåãðàòà ñ ïîìîùüþ ýêñòðàêöèè õëîðíîé êèñëîòîé ïðîõîäèëî ñ äîñòàòî÷íî âûñîêèì âûõîäîì (íå ìåíåå
90 %) è ïðèâîäèëî ê ïîëó÷åíèþ ðàñòâîðà áåëêà ñ êîíöåíòðàöèåé îêîëî 2,5 ìã/ìë, çàãðÿçíåííîãî ïðèìåñÿìè
ðàçëè÷íîé ïðèðîäû. Íà ðèñ. 2 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû àíàëèòè÷åñêîãî êîíòðîëÿ ýêñòðàêöèè ñ ïîìîùüþ
ÏÀÀÃÝ è ÂÝÆÕ. Íåîáõîäèìî îòìåòèòü, ÷òî ýëåêòðîôîðåòè÷åñêàÿ ïîäâèæíîñòü ïðîèçâîäíîãî ãèñòîíà
(ðèñ. 2, à ) ñîîòâåòñòâóåò ïîäâèæíîñòè áåëêà ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé 32,5 êÄà (áûëî ïîäòâåðæäåíî ìåòîäîì
âíóòðåííåãî ñòàíäàðòà). Ýòî, ïî-âèäèìîìó, ñâÿçàíî ñ
ñèëüíûì ïîëîæèòåëüíûì çàðÿäîì ìîëåêóëû, ñíèæàþùèì ýëåêòðîôîðåòè÷åñêóþ ïîäâèæíîñòü. Êàê âèäíî
èç ðèñóíêà, â õîäå ýêñòðàêöèè áûëà óäàëåíà áîëüøàÿ
÷àñòü áàëëàñòíûõ áåëêîâ E. coli ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé âûøå 35 êÄà, à òàêæå çíà÷èòåëüíàÿ ÷àñòü áåëêîâ ñ
ìàññîé ìåíåå 21 êÄà.
Ïî äàííûì ÂÝÆÕ àíàëèçà ñîäåðæàíèå îñíîâíîãî
âåùåñòâà ïîñëå ýêñòðàêöèè ñîñòàâëÿëî 33 – 46 %
(ðèñ. 2, á ).
Äëÿ äàëüíåéøåé î÷èñòêè áåëîê íåîáõîäèìî ñêîíöåíòðèðîâàòü. Ìåòîäû êîíöåíòðèðîâàíèÿ ñ ïîìîùüþ
ñîëåâîãî îñàæäåíèÿ, êàê íè ñòðàííî, íå îêàçàëèñü ýôôåêòèâíûìè. Äàæå ïðè èñïîëüçîâàíèè ñóëüôàòà àììîíèÿ â êîíöåíòðàöèè íàñûùåíèÿ, êàê îïèñàíî â [13], íå
óäàâàëîñü îñàäèòü âåñü N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí èç
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012
ðàñòâîðà, çíà÷èòåëüíàÿ ÷àñòü áåëêà îñòàâàëàñü â íàäîñàäî÷íîé æèäêîñòè.
Äëÿ êîíöåíòðèðîâàíèÿ áåëêà ðàíåå íàìè áûëî
ïðåäëîæåíî èñïîëüçîâàòü êàòèîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ [14]. ßðêî âûðàæåííûé çàðÿä íà áåëêå, ñîçäàâàåìûé îñòàòêàìè ëèçèíà, îáåñïå÷èâàåò îòëè÷íîå ñâÿçûâàíèå ñ êàòèîíîîáìåííûì ñîðáåíòîì. Îäíàêî íà
ïðîèçâîäñòâåííîì óðîâíå ðàçäåëåíèé áåëêîâûõ ìîëåêóë âñå áîëüøåå âíèìàíèå óäåëÿåòñÿ ìåìáðàííîé õðîìàòîãðàôèè [15]. Îíà îáëàäàåò òàêèìè ïðåèìóùåñòâàìè ïåðåä êëàññè÷åñêîé êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèåé,
êàê áîëüøàÿ ïðîèçâîäèòåëüíîñòü, îáåñïå÷èâàåìàÿ çà
ñ÷åò âûñîêèõ ñêîðîñòåé ýëþèðîâàíèÿ; ïðîñòîòà âàëèäàöèè; îòñóòñòâèå òðóäîçàòðàò íà óïàêîâêó êîëîííû.
Òåì íå ìåíåå èçâåñòíîé ïðîáëåìîé èîíîîáìåííûõ
ìåìáðàí îñòàåòñÿ îòíîñèòåëüíî íèçêàÿ åìêîñòü ñâÿçûâàíèÿ áåëêîâ.
Íàìè áûëî ïðîâåäåíî ñðàâíèòåëüíîå èçó÷åíèå
ìåìáðàííîé è êëàññè÷åñêîé êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèé ïðèìåíèòåëüíî ê ïðåäâàðèòåëüíîé î÷èñòêå
N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà. Äëÿ ýòîãî ìû èñïîëüçîâàëè
îòðèöàòåëüíî çàðÿæåííóþ ñóëüôîïðîïèëüíóþ ñâåðõïîðèñòóþ ìåìáðàíó Sartobind S è êîëîíêó, óïàêîâàííóþ ïîëèìåòàêðèëàòíûì ñîðáåíòîì ñ ïðèâèòîé ñóëüôîïðîïèëüíîé ãðóïïîé, Biopro S-75. Êàæäàÿ èç ýòèõ
ñèñòåì õîðîøî çàðåêîìåíäîâàëà ñåáÿ íà ðûíêå òîâàðîâ äëÿ áèîòåõíîëîãèè è áèîôàðìàöåâòèêè è âûïóñêàåòñÿ êàê äëÿ àíàëèòè÷åñêèõ, òàê è äëÿ ïðîèçâîäñòâåííûõ íóæä; êðîìå òîãî, ñîðáåíò Biopro S-75 óæå áûë
íàìè èçó÷åí ðàíåå [14], è ðåçóëüòàòû ðàáîòû ñ íèì
îêàçàëèñü ïîëîæèòåëüíûìè. Íà êàæäóþ èç òåñò-ñèñòåì, ïðåäâàðèòåëüíî óðàâíîâåøåííóþ ïîäâèæíîé ôàçîé, ñîäåðæàùóþ 10 ìÌ ëèìîííîé êèñëîòû (ðÍ 3,0),
íàíîñèëè ðàñòâîð ýêñòðàãèðîâàííîãî áåëêà, ðÍ â êîòîðîì òàêæå áûë äîâåäåí äî 3,0 ñ ïîìîùüþ 10 Ì NaOH.
Íàíåñåíèå çàêàí÷èâàëè, êîãäà öåëåâîé áåëîê íà÷èíàë
ýëþèðîâàòüñÿ áåç ñîðáöèè, ò.å. êîãäà âñå àêòèâíûå
öåíòðû òåñò-ñèñòåìû áûëè çàíÿòû ìîëåêóëàìè áåëêà.
Áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü êîëîíêè,
óïàêîâàííîé êàòèîíèòîì, ñîñòàâèëà 18,5 ìã áåëêà/ìë
àäñîðáåíòà.  òî æå âðåìÿ åìêîñòü ìåìáðàíû îêàçàëàñü íåñêîëüêî íèæå, 15,5 ìã/ìë. Ðàíåå óæå áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ñêîðîñòü ýëþèðîâàíèÿ ìîæåò äîñòàòî÷íî
ñèëüíî âëèÿòü íà äèíàìè÷åñêóþ åìêîñòü àäñîðáåíòà,
îñîáåííî â ñëó÷àå êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèè [15].
Ïîýòîìó íàìè áûëè ïðîâåäåíû àíàëîãè÷íûå îïûòû
ïî îïðåäåëåíèþ äèíàìè÷åñêîé åìêîñòè, íî ïðè ðàçëè÷íûõ ñêîðîñòÿõ íàíåñåíèÿ. Äåéñòâèòåëüíî, êàê âèäíî èç ðèñ. 3, äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü Biopro S-75 ïðàêòè÷åñêè íåèçìåííà ïðè ñêîðîñòÿõ íèæå 200 ñì/÷, à
ïðè äàëüíåéøåì óâåëè÷åíèè ñêîðîñòè íàíåñåíèÿ îáðàçöà äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü íà÷èíàëà ñíèæàòüñÿ. Ñ
äðóãîé ñòîðîíû, ïðè èñïîëüçîâàíèè ìåìáðàí íå áûëî
çàìå÷åíî ÿâíîé çàâèñèìîñòè äèíàìè÷åñêîé åìêîñòè
îò ñêîðîñòè ïîòîêà. Ñòîèò òàêæå îòìåòèòü, ÷òî ïðè
ñêîðîñòÿõ âûøå 350 ñì/÷ äàâëåíèå â êîëîíêå Biopro
S-75 ïðåâûøàëî óñòàíîâëåííûé ïåðåäåë â 3 áàð
(èìåííî òàêîå îãðàíè÷åíèå ÷àùå âñåãî óñòàíàâëèâàåòñÿ íà ïðîèçâîäñòâåííûõ ñèñòåìàõ), äåëàÿ íåâîçìîæ39
íîé äàëüíåéøóþ ðàáîòó, ïîýòîìó îïûòû ïðè ñêîðîñòÿõ âûøå 350 ñì/÷ íå ïðîâîäèëèñü. Îäíàêî ìîæíî
îæèäàòü, ÷òî ïðè ñâåðõâûñîêèõ ñêîðîñòÿõ äèíàìè÷åñêàÿ åìêîñòü ñîðáåíòà áóäåò íèæå åìêîñòè ìåìáðàíû.
Ïîñëå íàíåñåíèÿ îáðàçöà îáå òåñò-ñèñòåìû ïðîìûâàëèñü ïîäâèæíîé ôàçîé, ñîäåðæàùåé 10 ìÌ ëèìîííîé êèñëîòû (ðÍ 3,0) è 2,0 Ì NaCl ñ òåì, ÷òîáû äåñîðáèðîâàòü öåëåâîé áåëîê ñ îäíîâðåìåííûì êîíöåíòðèðîâàíèåì.  îáîèõ ñëó÷àÿõ áåëîê ýëþèðîâàëñÿ ñ
âûñîêèìè êîíöåíòðàöèÿìè (îêîëî 20 ìã/ìë, ò.å. ôàêòîð êîíöåíòðèðîâàíèÿ ðàâåí 8) è âûõîäîì (82 – 85 %).
Òàêèì îáðàçîì, ìåìáðàííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ
N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 ÿâëÿåòñÿ äîñòàòî÷íî
ïåðñïåêòèâíîé çàìåíîé êëàññè÷åñêîé êîëîíî÷íîé õðîìàòîãðàôèè íà ïðîèçâîäñòâåííîì óðîâíå.
Ïîëó÷åííûé âûñîêîêîíöåíòðèðîâàííûé N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí äîëæåí áûòü î÷èùåí îò ðÿäà ïðèìåñåé, à èìåííî îò ðîäñòâåííûõ áåëêîâ, îñòàòî÷íûõ áåëêîâ (HCP, èëè host-cell proteins) øòàìì-ïðîäóöåíòà,
âûñîêîìîëåêóëÿðíûõ è íèçêîìîëåêóëÿðíûõ ïðèìåñåé,
áàêòåðèàëüíûõ ýíäîòîêñèíîâ, îñòàòî÷íîé ÄÍÊ E. coli.
Ïðè ýòîì íàèáîëüøóþ òðóäíîñòü äëÿ î÷èñòêè áåëêîâ
ïðåäñòàâëÿþò ïðèìåñíûå áàêòåðèàëüíûå ýíäîòîêñèíû
(ÁÝ), íàëè÷èå êîòîðûõ ÿâëÿåòñÿ íåèçáåæíûì âñëåäñòâèå èñïîëüçîâàíèÿ ïðîêàðèîòè÷åñêèõ ñèñòåì ýêñïðåññèè. ÁÝ — ýòî ëèïîïîëèñàõàðèäíûå ôðàãìåíòû âíåøíåé êëåòî÷íîé ñòåíêè âñåõ ãðàìîòðèöàòåëüíûõ áàêòåðèé, âûñîêî òîêñè÷íûå äëÿ ÷åëîâåêà. ÀÔÑ, îñîáåííî
ñëóæàùèå äëÿ ñîçäàíèÿ èíúåêöèîííûõ ëåêàðñòâåííûõ
ôîðì, äîëæíû áûòü ìàêñèìàëüíî èçáàâëåíû îò ïîäîáíûõ ïðèìåñåé. Ðàçðàáàòûâàåìàÿ íàìè òåõíîëîãèÿ
äîëæíà áûëà ïîçâîëÿòü ïîëó÷àòü ìàêñèìàëüíî î÷èùåííûé îò ÁÝ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 (ñîäåðæàíèå ÁÝ â ÀÔÑ íå áîëåå 0,5 ÝÅ/ìã), ò.ê. ïðîèçâîäèìàÿ ÀÔÑ èñïîëüçóåòñÿ äëÿ ñîçäàíèÿ ãîòîâûõ ëåêàðñòâåííûõ ôîðì äëÿ èíôóçèîííîãî ââåäåíèÿ.
Ðàíåå íàìè áûëè îïèñàíû ðàçëè÷íûå ìåòîäû î÷èñòêè áåëêîâ îò ÁÝ [16]. Ñðåäè íàèáîëåå ðàñïðîñòðàíåííûõ ñëåäóåò óêàçàòü äâóõôàçíóþ ýêñòðàêöèþ ëèïîïîëèñàõàðèäîâ äåòåðãåíòàìè, èîíîîáìåííóþ, îáðàùåíî-ôàçîâóþ è àôôèííóþ õðîìàòîãðàôèè, à òàêæå
õðîìàòîãðàôèþ ãèäðîôîáíûõ âçàèìîäåéñòâèé. Îäíàêî òîëüêî ñ ïîìîùüþ îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ íà
àíàëèòè÷åñêîì óðîâíå íàì óäàëîñü äîñòè÷ü ìàêñèìàëüíî íèçêîãî ñîäåðæàíèÿ ÁÝ â ñóáñòàíöèè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà [17]. Òðóäíîñòè, âîçíèêàþùèå ïðè
î÷èñòêå öåëåâîãî ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà, ïî-âèäèìîìó, ñâÿçàíû ñ ñèëüíûì ïîëîæèòåëüíûì çàðÿäîì ìîëåêóëû, êîòîðûé îáåñïå÷èâàåò êðàéíå óñòîé÷èâîå âçàèìîäåéñòâèå ñ îòðèöàòåëüíî çàðÿæåííûìè ëèïîïîëèñàõàðèäàìè.
Ñèëèêàãåëü,
èñïîëüçóåìûé
äëÿ
îáðàùåíî-ôàçîâîé õðîìàòîãðàôèè, âñåãäà èìååò êàêîå-òî, õîòü è íåáîëüøîå, êîëè÷åñòâî ñèëàíîëüíûõ
ãðóïï, êîòîðûå îñòàëèñü íå ïðèâèòûìè íè ëèïîôèëüíûì óãëåâîäîðîäíûì ëèãàíäîì, íè àãåíòîì ýíä-êýïïèíãà. Ýòè ãðóïïû îáëàäàþò îòðèöàòåëüíûì çàðÿäîì,
è, âîçìîæíî, êîíñòàíòà ñâÿçûâàíèÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà ñ íèìè âûøå, ÷åì êîíñòàíòà ñâÿçûâàíèÿ áåëêà
ñ ýíäîòîêñèíàìè. Ýòèì ìîæåò îáúÿñíÿòüñÿ óñïåõ ïðè40
ìåíåíèÿ îáðàùåíî-ôàçîâîé ÂÝÆÕ äëÿ î÷èñòêè
N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà îò ÁÝ, â òî âðåìÿ êàê îñòàëüíûå, äîñòàòî÷íî ïðèçíàííûå âî âñåì ìèðå ìåòîäû
íå ïîçâîëÿþò ïîëó÷èòü òðåáóåìîé ÷èñòîòû ñóáñòàíöèè.
Âñå ýêñïåðèìåíòû ìû ïðîâîäèëè íà êîëîíêàõ, óïàêîâàííûõ ñîðáåíòîì Kromasil KR-C4-300-16. Ýëþèðîâàëè â ãðàäèåíòå ïîäâèæíûõ ôàç îò ôàçû “À” äî ôàçû
“” çà 10 êîëîíî÷íûõ îáúåìîâ. Ôàçà “À” ñîäåðæàëà
10 ìÌ ëèìîííóþ êèñëîòó (ðÍ 4,0) â âîäå äëÿ èíúåêöèé è ýòèëîâîì ñïèðòå (20 % îá.). Ôàçà “Â”: 10 ìÌ
ëèìîííàÿ êèñëîòà (ðÍ 2,0) â âîäå äëÿ èíúåêöèé è ýòèëîâîì ñïèðòå (50 % îá.). Òàêèì îáðàçîì, ìû ïðèìåíèëè ñìåøàííûé ãðàäèåíò: ïîëîæèòåëüíûé ãðàäèåíò
êîíöåíòðàöèè îðãàíè÷åñêîãî ìîäèôèêàòîðà (ýòèëîâîãî ñïèðòà) è íåãàòèâíûé ãðàäèåíò ðÍ (ðèñ. 4). Ýòî ðåøåíèå ïîçâîëèëî ìèíèìèçèðîâàòü ðàñõîä îðãàíè÷åñêîãî ìîäèôèêàòîðà è ïîâûñèòü ñåëåêòèâíîñòü ïðîöåññà. Èíòåðåñíî, ÷òî ïèê îñíîâíîãî âåùåñòâà èìååò
âûðàæåííîå ïðàâîå “ïëå÷î”. Ïî ðåçóëüòàòàì ÏÀÀÃÝ
è ÂÝÆÕ â îñíîâíîé ôðàêöèè ñîäåðæàëñÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîí Í1.3 ñ ÷èñòîòîé, áëèçêîé ê 100 %, à â
“õâîñòîâîé” ôðàêöèè (ïðàâîå “ïëå÷î” ïèêà) — êîìïîíåíòû ñ ìîëåêóëÿðíûìè ìàññàìè íèæå 30 êÄà (ðèñ. 5).
Ïî äàííûì ËÀË-òåñòà îñíîâíàÿ ôðàêöèÿ N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà ñîäåðæàëà ÁÝ ìåíåå 0,125 ÝÅ/ìã.
Ëèíåéíîå ìàñøòàáèðîâàíèå ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ äî ïðîèçâîäñòâåííîãî óðîâíÿ áûëî îñíîâàíî íà
óâåëè÷åíèè âíóòðåííåãî äèàìåòðà êîëîííû ïðè íåèçìåííîé âûñîòå ñëîÿ ñîðáåíòà. Ïðè ýòîì ëèíåéíàÿ ñêîðîñòü ýëþèðîâàíèÿ îñòàåòñÿ íåèçìåííîé è, â íàøåì
ñëó÷àå, ðàâíîé 120 ñì/÷ [18]. Òàêèì îáðàçîì, ïðè ïåðåõîäå îò àíàëèòè÷åñêèõ óñëîâèé, îïèñàííûõ â [17],
äî ïðîèçâîäñòâåííûõ äèàìåòð êîëîííû áûë óâåëè÷åí
â 10 ðàç, à îáúåìíàÿ ñêîðîñòü — ñîîòâåòñòâåííî â 100
ðàç. Ïðè ýòîì ïðîèçâîäèòåëüíîñòü ïðîöåññà ñîñòàâèëà
ïðèìåðíî 2,0 ã áåëêà/ë ñîðáåíòà çà 1 ÷, ÷òî ïîçâîëèëî
çà 1 ðàáî÷óþ ñìåíó (8 ÷) î÷èùàòü äî 32 ã âåùåñòâà íà
1 ÂÝÆÕ êîëîííå îáúåìîì 2 ë.
Îñíîâíóþ ôðàêöèþ îñàæäàëè ýòèëîâûì ñïèðòîì,
îñàäîê îòäåëÿëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì (6 – 8 òûñ.
îá/ìèí) è ðàñòâîðÿëè â âîäå äëÿ èíúåêöèé äî êîíöåíòðàöèè N,N-áèñìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 30 ìã/ìë. Çàòåì
ïðîâîäèëè ôèíàëüíóþ î÷èñòêó (îò îñòàòî÷íûõ êîìïîíåíòîâ ïîäâèæíûõ ôàç ïîñëå ÂÝÆÕ è ýòèëîâîãî
ñïèðòà) îáðàçöà ãåëü-ôèëüòðàöèåé íà ñîðáåíòå
Sephacryl S-100, íàíîñÿ îáðàçåö â îáúåìå, íå ïðåâûøàþùåì 10% îò îáúåìà êîëîííû è ýëþèðóÿ âîäîé äëÿ
èíúåêöèé. Âûõîä îñíîâíîé ôðàêöèè (ñ êîíöåíòðàöèåé
N,N-áèñ-ìåòèîíèëãèñòîíà Í1.3 8 – 10 ìã/ìë) ñîñòàâèë
80 – 90 %. Çàòåì ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ëèîôèëèçîâàëè
äî ïîëó÷åíèÿ ÀÔÑ ñ âëàæíîñòüþ íå áîëåå 10 %.
Ðåçóëüòàòû êîíòðîëÿ êà÷åñòâà ïîëó÷àåìîé ÀÔÑ äåìîíñòðèðóþò âûñîêóþ ñòåïåíü ÷èñòîòû áåëêà (òàáëèöà). Ñ ïîìîùüþ ðàçðàáîòàííîé òåõíîëîãèè áûëî íàðàáîòàíî êîëè÷åñòâî ÀÔÑ, äîñòàòî÷íîå äëÿ êëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé, êîòîðûå áûëè íà÷àòû â 2010 ã.
Ïîäàíà çàÿâêà íà ïàòåíò Ðîññèéñêîé Ôåäåðàöèè.
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012
Ë È Ò Å ÐÀ Ò Ó ÐÀ
1. A. Fritz, C. Percy, A. Jack, et al. (eds.), International Clessification of Diseases for Oncology, Third Edition, World Health Organization, Geneva (2000).
2. P. Stashenko, L. M. Nadler, R. Hardy, and S. F. Schlossman, J.
Immunol., 125, 1678 – 1685 (1980).
3. J. Ernst, H. Li, H. S. Kim, et al., Biochemistry, 44,
15150 – 15158 (2005).
4. Â. Ì. Ìîèñååíêî, Ïðàêòè÷. îíêîëîãèÿ, 3(4), 253 – 261
(2002).
5. M. Zeppezauer, European Patent, EP 0973541 (2000).
6. Ä. À. Ãóñàðîâ, Áèîôàðì. æ., 2(4), 8 – 13 (2010).
7. P. Gross, H. Jornvall, M. Thiry, et al., Bis-Met Histone, World
Intellectual Property Organization Patent Application, WO
2008 / 122434 A1.2008
8. Ëàáîðàòîðíûé ðåãëàìåíò ¹ËÐ 02699487-13-01 (2009).
9. J. King and U. K. Laemmli, J. Mol. Biol., 75(2), 315 – 324
(1973).
10. Þ. Ñ. Ðÿáêî, Î. Â. Ëóêèí, Å. Í. Øåïåëü è äð., Áèîôàðì. æ.,
1(1), 34 – 37 (2009).
11. W. Albig, D. M. Runge, M. Kratzmeier, and D. Doenecke,
FEBS Let., 435, 425 – 450 (1998).
12. http: // www.ncbi.nlm.nih.gov / protein / 4885377?report=GenPept.
13. M. Kratzmeier, W. Albig, T. Meergans, and D. Doenecke, Biochem. J., 337, 319 – 327 (1999).
14. Ä. À. Ãóñàðîâ, Â. À. Ëàñìàí, Ñ. À. Êîñàðåâ è äð., Áèîôàðì.
æ., 2(1), 42 – 48 (2010).
15. Ã. Ë. Âîëêîâ, Ñ. Ï. Ãàâðèëþê, Â. Â. Ñêàëêà è äð., Áèîôàðì.
æ., 2(2), 24 – 31 (2010).
16. Ä. À. Ãóñàðîâ, Áèîôàðì. æ., 1(3), 10 – 17 (2009).
17. Í. Ñ. Áðûêîâà, Í. À. Áðàãèíà, Ä. À. Ãóñàðîâ è Ä. È. Áàèðàìàøâèëè, Áèîôàðì. æ., 2(4), 25 – 31 (2010).
18. Ä. À. Ãóñàðîâ, Â. À. Ëàñìàí, À. Ô. Ìèðîíîâ è Ä. È. Áàèðàìàøâèëè, Áèîôàðì. æ., 1(3), 30 – 35 (2009).
Ïîñòóïèëà 12.08.10
DEVELOPING EFFECTIVE EXPERIMENTAL COMMERCIAL TECHNOLOGY
FOR THE PRODUCTION OF N,N-BIS-MET-HISTONE H1.3 USED
IN THE TREATMENT OF LYMPHOMAS
D. A. Gusarov, I. V. Sokolova, V. D. Gusarova, E. A. Evteeva, T. V. Vorob’eva, S. A. Kosarev,
E. D. Shibanova, and D. I. Bairamashvili
Shemyakin – Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117997, Russia
At present, much attention is devoted to the treatment of lymphomas by means of monoclonal antibodies. Unfortunately, no preparations such as Rituximab
(Mabthera) are produced in the Russian Federation and these have to be imported from abroad. It is shown that H1 type histones possessing an activity similar to that of Rituximab can be used for such a therapy. We have developed an experimental commercial technology for the production of recombinant
N,N-bis-met-histone H1.3. The activity and purity of the obtained preparation were demonstrated in various tests. The accumulated amount of the active
pharmaceutical substance is enough to start clinical trials in Russia.
Key words: N,N-bis-Met-histone H1.3, lymphoma, chromatography, technology
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 46, ¹ 4, 2012
41