фарма-2020: теõнолоãические аспектû производства некоторûõ

Ôóíäàìåíòàëüíûå èññëåäîâàíèÿ
Å. Ê. Êóðáàíîâà1,2,3, Ò. Þ. ×óëêîâà1, Ä. Â. Áûðèõèíà1, À. Î. Äàíî1,
Â. À. Íèêîëàåâà1, Ä. À. Ãóñàðîâ1,2
ÔÀÐÌÀ-2020: ÒÅÕÍÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÅ ÀÑÏÅÊÒÛ
ÏÐÎÈÇÂÎÄÑÒÂÀ ÍÅÊÎÒÎÐÛÕ ÆÍÂËÏ
È ÑÒÐÀÒÅÃÈ×ÅÑÊÈÕ ËÅÊÀÐÑÒÂÅÍÍÛÕ
ÑÐÅÄÑÒÂ (îáçîð)
Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 05.05.12. Ïðèíÿòà ê ïå÷àòè 26.05.12.
 ðàìêàõ ñòðàòåãèè ðàçâèòèÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîé ïðîìûøëåííîñòè ÐÔ íà ïåðèîä äî 2020 ã. â
Ðîññèè äîëæíî áûòü îðãàíèçîâàíî ïðîèçâîäñòâî øèðîêîé íîìåíêëàòóðû ëåêàðñòâåííûõ
ñðåäñòâ, çíà÷èòåëüíóþ ÷àñòü êîòîðûõ ñîñòàâëÿþò ïðîäóêòû áèîôàðìàöåâòè÷åñêîé îòðàñëè. Â
äàííîì îáçîðå ïðåäñòàâëåíû ñîâðåìåííûå òåõíîëîãèè ïðîèçâîäñòâà òàêèõ áèîôàðìàöåâòè÷åñêèõ ïðåïàðàòîâ, êàê ïðîèçâîäíûå èíñóëèíà, èíòåðôåðîí áåòà, ýðèòðîïîýòèí, ôîëëèòðîïèí àëüôà, ôàêòîð ñâ¸ðòûâàíèÿ êðîâè IX, ôåðìåíòû èìèãëþöåðàçà è àëüòåïëàçà è ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà ãåðöåïòèí, öåòóêñèìàá, ðèòóêñèìàá.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: ðåêîìáèíàíòíûé áåëîê, áèîàíàëîã, òåõíîëîãèÿ ïðîèçâîäñòâà, õðîìàòîãðàôèÿ.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ â íàøåé ñòðàíå ðåàëèçóåòñÿ
ñòðàòåãèÿ ðàçâèòèÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîé ïðîìûøëåííîñòè íà ïåðèîä äî 2020 ã., ïðèçâàííàÿ
îáåñïå÷èòü ëåêàðñòâåííóþ íåçàâèñèìîñòü Ðîññèéñêîé Ôåäåðàöèè. Îäíîé èç ãëàâíûõ öåëåé
ýòîé ñòðàòåãèè ñòàëî èìïîðòîçàìåùåíèå, íåîáõîäèìîñòü êîòîðîãî ïðîäèêòîâàíà òîòàëüíîé
çàâèñèìîñòüþ âíóòðåííåãî ðûíêà îò çàðóáåæíûõ ïðåïàðàòîâ, äîëÿ êîòîðûõ íà ðûíêå ñîñòàâëÿåò ïîðÿäêà 80 %. Íà ïåðâûé ïëàí â ýòîé ãîñóäàðñòâåííîé ïðîãðàììå âûäâèãàåòñÿ ñîçäàíèå
óñëîâèé äëÿ ðàçâèòèÿ èííîâàöèîííîé îòðàñëè
ôàðìïðîìûøëåííîñòè, îäíàêî áîëåå ðåàëèñòè÷íûì è íàä¸æíûì âàðèàíòîì èìïîðòîçàìåùåíèÿ, ñïîñîáíûì ñóùåñòâåííî ðàñøèðèòü
äîëþ îòå÷åñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ íà âíóòðåííåì
ðûíêå, ÿâëÿåòñÿ ñîçäàíèå ïðîèçâîäñòâ ýôôåêòèâíûõ ïðåïàðàòîâ-äæåíåðèêîâ (biosimilars,
èëè áèîàíàëîãîâ).
Ãîñóäàðñòâîì ïîñòàâëåíà çàäà÷à îðãàíèçîâàòü ïðîèçâîäñòâî íå ìåíåå 85 % ïðåïàðàòîâ ïî
íîìåíêëàòóðå èç ïåðå÷íÿ ñòðàòåãè÷åñêè âàæ1
2
3
Ìîñêîâñêèé ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò òîíêèõ
õèìè÷åñêèõ òåõíîëîãèé èì. Ì. Â. Ëîìîíîñîâà,
119571 Ìîñêâà (Ðîññèÿ), ïð-ò Âåðíàäñêîãî, 86.
Ôåäåðàëüíîå ãîñóäàðñòâåííîå áþäæåòíîå ó÷ðåæäåíèå íàóêè Èíñòèòóò áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èì.
Àêàäåìèêîâ Ì. Ì. Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ÷èííèêîâà
ÐÀÍ, 117997 Ìîñêâà (Ðîññèÿ), óë. Ìèêëóõî-Ìàêëàÿ,
16/10.
june90@yandex.ru
íûõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ. Çíà÷èòåëüíóþ
÷àñòü ýòîãî ïåðå÷íÿ ñîñòàâëÿþò áèîôàðìàöåâòè÷åñêèå ïðåïàðàòû, ñðåäè êîòîðûõ ïðîòèâîîïóõîëåâûå ñðåäñòâà, âàêöèíû, ïðåïàðàòû äëÿ
ëå÷åíèÿ çàáîëåâàíèé ðàññåÿííîãî ñêëåðîçà è
áîëåçíè Ãîøå.
 äàííîé ñòàòüå ïðåäñòàâëåí îáçîð ñîâðåìåííûõ òåõíîëîãèé ïðîèçâîäñòâà ïðåïàðàòîâ,
âõîäÿùèõ â ñïèñîê æèçíåííî íåîáõîäèìûõ è
âàæíåéøèõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ (ÆÍÂËÏ),
à òàêæå ÷àñòè÷íî â ïåðå÷åíü ñòðàòåãè÷åñêèõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ.
1. ÏÐÎÈÇÂÎÄÍÛÅ ÈÍÑÓËÈÍÀ
Èíñóëèí — ïîëèïåïòèäíûé ãîðìîí, âûðàáàòûâàåìûé â-êëåòêàìè îñòðîâêîâ Ëàíãåðãàíñà ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû. Èíñóëèí âûïîëíÿåò â îðãàíèçìå âàæíûå ôóíêöèè êîíòðîëÿ ìåòàáîëèçìà è ãîìåîñòàçà ãëþêîçû, îêàçûâàÿ âëèÿíèå íà
ýêñïðåññèþ áîëüøîãî ÷èñëà ãåíîâ, âîâëå÷åííûõ
â ýòè ïðîöåññû [1]. Äåôèöèò èíñóëèíà ìîæåò
áûòü âûçâàí ðàçíîîáðàçíûìè ôàêòîðàìè, ñîïðîâîæäàåòñÿ ðàçâèòèåì òÿæåëûõ ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèé îðãàíèçìà, õàðàêòåðèçóþùèõñÿ
ïîâûøåíèåì óðîâíÿ ãëþêîçû â ïëàçìå êðîâè,
ïîëó÷èâøèõ íàçâàíèå äèàáåòà. Ïî äàííûì Âñåìèðíîé îðãàíèçàöèè çäðàâîîõðàíåíèÿ (ÂÎÇ),
áîëåå 340 ìëí ÷åëîâåê âî âñåì ìèðå áîëüíû
äèàáåòîì. Ïî ïðîãíîçàì ÂÎÇ, çà ïåðèîä
2005 – 2030 ãã. ÷èñëî ñëó÷àåâ ñìåðòè îò äèàáåòà
óäâîèòñÿ [2].
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
21
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
Ðèñ. 1. Ñòðóêòóðíàÿ ôîðìóëà èíñóëèíà ëèçïðî.
Ðèñ. 2. Ñòðóêòóðíàÿ ôîðìóëà èíñóëèíà àñïàðò.
Ðàçâèòèå áèîòåõíîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ ïîçâîëèëî â ïîñëåäíèå 10 ëåò ñîçäàòü è ââåñòè â
ëå÷åáíóþ ïðàêòèêó íîâûå àíàëîãè èíñóëèíà
÷åëîâåêà, îáëàäàþùèå äîïîëíèòåëüíûìè òåðàïåâòè÷åñêèìè ïðåèìóùåñòâàìè ïðè ñîõðàíåíèè ïîëíîöåííîé ãèïîãëèêåìè÷åñêîé àêòèâíîñòè. Ïðèìåðàìè òàêèõ âíåäðåíèé ÿâëÿþòñÿ
àíàëîãè èíñóëèíà ñâåðõáûñòðîãî (ëèçïðî è àñïàðò) è ïðîëîíãèðîâàííîãî (ãëàðãèí, äåòåìèð)
äåéñòâèÿ.
Ëèçïðî — áûñòðîäåéñòâóþùèé àíàëîã èíñóëèíà ÷åëîâåêà, ó êîòîðîãî â àìèíîêèñëîòíîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè B-öåïè èíâåðòèðîâàíû îñòàòêè Pro29 è LysB29 (ðèñ. 1). Êîíôîðìàöèîííûå èçìåíåíèÿ C-êîíöåâîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè B-öåïè ãîðìîíà çàìåòíî ñíèçèëè äèìåðèçàöèþ ìîëåêóë áåëêà, õàðàêòåðíóþ äëÿ èíñóëèíà
÷åëîâåêà. Óìåíüøåíèå ñêëîííîñòè áåëêà ê îáðàçîâàíèþ àãðåãàòîâ óâåëè÷èëî ñêîðîñòü àáñîðáöèè èíñóëèíà ëèçïðî ïîñëå èíúåêöèè,
îáåñïå÷èëî áîëåå âûñîêèé óðîâåíü ñîäåðæàíèÿ
ïðåïàðàòà â ïëàçìå è ñíèçèëî ïðîäîëæèòåëüíîñòü äåéñòâèÿ [3].
Àñïàðò — åùå îäèí èñïîëüçóåìûé â êëèíè÷åñêîé ïðàêòèêå ãåííî-èíæåíåðíûé àíàëîã èí-
22
ñóëèíà áûñòðîãî äåéñòâèÿ. Â ìîëåêóëå àñïàðòà
îñòàòîê ïðîëèíà â ïîëîæåíèè 28 B-öåïè çàìåíåí îñòàòêîì àñïàðàãèíîâîé êèñëîòû (ðèñ. 2).
Ýòà çàìåíà ñíèçèëà òåíäåíöèþ ìîíîìåðíûõ
ìîëåêóë èíñóëèíà ê àãðåãàöèè èç-çà íàðóøåíèÿ
âçàèìîäåéñòâèÿ ìåæäó îñòàòêàìè Pro28 è
GlyB23 [4].
Ãëàðãèí — ïðîëîíãèðîâàííûé àíàëîã èíñóëèíà ÷åëîâåêà, â ñòðóêòóðå êîòîðîãî îñòàòîê àñïàðàãèíà À21 çàìåíåí íà îñòàòîê ãëèöèíà, à
Â-öåïü óäëèíåíà íà äâà ïîëîæèòåëüíî çàðÿæåííûõ îñòàòêà àðãèíèíà ArgB31, ArgB32, áëàãîäàðÿ ÷åìó pI ñìåùàåòñÿ äî 6,7. Èçìåíåíèå
èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷êè â èòîãå ïðèâîäèò ê
ïðîëîíãàöèè äåéñòâèÿ ïðåïàðàòà.
Äåòåìèð — åùå îäèí ãåííî-èíæåíåðíûé
àíàëîã èíñóëèíà ïðîëîíãèðîâàííîãî äåéñòâèÿ.
Ìîëåêóëÿðíàÿ ñòðóêòóðà äåòåìèðà îòëè÷àåòñÿ
îò ñòðóêòóðû ÷åëîâå÷åñêîãî èíñóëèíà îòñóòñòâèåì òðåîíèíà â ïîëîæåíèè Â30 è ïðèñîåäèíåíèåì ê ëèçèíó â ïîëîæåíèè Â29 ìèðèñòèíîâîé
êèñëîòû — æèðíîêèñëîòíîãî îñòàòêà èç 14 àòîìîâ óãëåðîäà [5]. Àöèëèðîâàíèå ìîëåêóëû èíñóëèíà æèðíîé êèñëîòîé îáåñïå÷èâàåò ñâÿçûâàíèå ñ àëüáóìèíîì è ïðîëîíãèðóåò âñàñûâàíèå
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
èç ïîäêîæíî-æèðîâîãî ñëîÿ [6], à òàêæå îáåñïå÷èâàåò ðàñòâîðåííîå ñîñòîÿíèå ïðåïàðàòà ïîñëå èíúåêöèè.
Íàèáîëüøèé ïðîãðåññ â ïðîèçâîäñòâå èíñóëèíà, êàê è äðóãèõ òåðàïåâòè÷åñêèõ áåëêîâ,
áûë äîñòèãíóò ñ ïðèìåíåíèåì ãåííî-èíæåíåðíûõ ìåòîäîâ äëÿ ñîçäàíèÿ ñîîòâåòñòâóþùèõ
òðàíñãåííûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ [7]. Ðàçâèòèå
ãåííî-èíæåíåðíûõ ìåòîäîâ ïðèâåëî ê áîëüøîìó âûáîðó ñèñòåì ýêñïðåññèè, ê ïðèìåðó, àíàëîãè èíñóëèíà ìîæíî ïîëó÷àòü, ïðèìåíÿÿ òàêèå
ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû, êàê Escherichia coli,
Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, êëåòêè CHO è äð. [8].
1.1. Ñòàäèè òåõíîëîãè÷åñêîãî ïðîöåññà
Ïðîöåññ ïîëó÷åíèÿ èíñóëèíà è åãî àíàëîãîâ â
áàêòåðèàëüíûõ ýêñïðåññèîííûõ ñèñòåìàõ ìîæíî óñëîâíî ðàçäåëèòü íà ñëåäóþùèå ñòàäèè:
l ôåðìåíòàöèÿ (âûðàùèâàíèå øòàììà-ïðîäóöåíòà â ôåðìåíòåðå);
l îòäåëåíèå áèîìàññû è äåçèíòåãðàöèÿ êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè ñ âûäåëåíèåì òåë âêëþ÷åíèÿ;
l âûäåëåíèå è î÷èñòêà ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà;
l ôåðìåíòàòèâíîå ðàñùåïëåíèå ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà;
l õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ î÷èñòêà èíñóëèíà èëè
åãî àíàëîãîâ;
l ïîëó÷åíèå êðèñòàëëè÷åñêîãî èíñóëèíà èëè
åãî àíàëîãîâ.
Ïðè èñïîëüçîâàíèè ðåêîìáèíàíòíûõ êëåòîê E. coli äëÿ ïîëó÷åíèÿ àíàëîãîâ èíñóëèíà
ïîñëåäíèå íàêàïëèâàþòñÿ â ñîñòàâå ãèáðèäíûõ
áåëêîâ â òåëàõ âêëþ÷åíèÿ [9].
Íàèáîëåå îáùàÿ ñòðàòåãèÿ, èñïîëüçóåìàÿ
äëÿ ðåíàòóðàöèè íåðàñòâîðèìûõ áåëêîâ, âêëþ÷àåò òðè ýòàïà: 1) âûäåëåíèå è îòìûâêà òåë
âêëþ÷åíèÿ; 2) ñîëþáèëèçàöèÿ àãðåãèðîâàííîãî
áåëêà; 3) ðåôîëäèíã ñîëþáèëèçèðîâàííîãî áåëêà. Êîíå÷íûé âûõîä öåëåâîãî áåëêà ëèìèòèðóåòñÿ ïîâòîðíîé óêëàäêîé áåëêîâîé ìîëåêóëû
(ðåôîëäèíã, èëè ðåíàòóðàöèÿ), ÷òî ñâÿçàíî ñ
âîçìîæíîñòüþ îáðàçîâàíèÿ íåàêòèâíûõ ôîðì
(ïðîäóêòû íåïðàâèëüíîãî ôîëäèíãà), à òàêæå
âûñîêîìîëåêóëÿðíûõ àãðåãàòîâ ïðè ïðèîáðåòåíèè áåëêîì íàòèâíîé êîíôîðìàöèè. Äëÿ ìàñøòàáèðîâàíèÿ íà ïðîèçâîäñòâåííîì óðîâíå
ïðîöåññà ðåíàòóðàöèè áåëêîâ íåîáõîäèìûìè
óñëîâèÿìè ÿâëÿþòñÿ äîñòèæåíèå âûñîêîé ñòåïåíè ïðàâèëüíî ñâåðíóòîãî (ôîëäèðîâàííîãî)
ïðîäóêòà ïðè âûñîêîé êîíöåíòðàöèè; êðîìå
òîãî, ïðîöåññ äîëæåí áûòü áûñòðûì, íåäîðîãèì
è âûñîêîýôôåêòèâíûì [10].
1.2. Âûäåëåíèå è î÷èñòêà
ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ëèçïðî
 ðàáîòå [11] ïðèâåäåíà îáùàÿ ñõåìà îäíîãî èç
âîçìîæíûõ ìåòîäîâ âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ëèçïðî.
Áèîñèíòåç öåëåâîãî áåëêà îñóùåñòâëÿåòñÿ
÷åðåç ãèáðèäíûé ïðåäøåñòâåííèê, ïîëó÷àåìûõ
â ïðîäóöåíòå E. coli, òðàíñôîðìèðîâàííîì êîäèðóþùèì àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü àíàëîãà ïðîèíñóëèíà ÷åëîâåêà âåêòîðîì.
Âûðàùåííóþ è èíäóöèðîâàííóþ áèîìàññó êëåòîê ðàçðóøàþò ñ öåëüþ âûäåëåíèÿ òåëà âêëþ÷åíèÿ ãèáðèäíîãî áåëêà, ðåñóñïåíäèðóþò â
Òðèñ-ñîëåâîì áóôåðå, èñïîëüçóÿ ãîìîãåíèçàòîð
Niro Soavi. Ïðèìåñíûå áåëêè óäàëÿþò ïîñðåäñòâîì äâóõ ïîñëåäóþùèõ îòìûâîê òåë âêëþ÷åíèÿ Òðèñ/Triton X-100 áóôåðîì, çà êîòîðûìè
ñëåäóåò äâå îòìûâêè Òðèñ/Tween-20 áóôåðîì è
ôèíàëüíàÿ îòìûâêà Òðèñ/NaCl áóôåðîì.
Çàòåì òåëà âêëþ÷åíèÿ ðàñòâîðÿþò â 8 Ì ìî÷åâèíå, ñîäåðæàùåé âîññòàíàâëèâàþùèå àãåíòû (äèòèîòðåèòîë èëè b-ìåðêàïòîýòàíîë). Ïîëíîå ðàñòâîðåíèå äîñòèãàåòñÿ ïðè èçìåíåíèè pH
äî 10,5 ñ ïîìîùüþ NaOH.
Ïîñëå ðàñòâîðåíèÿ òåë âêëþ÷åíèÿ ïðîâîäÿò
ðåôîëäèíã ãèáðèäíîãî áåëêà ðàçáàâëåíèåì â
ðåíàòóðèðóþùåì áóôåðå (5 ìÌ CAPS, pH 10,5,
ïðè 4 °Ñ) äî ôèíàëüíîé êîíöåíòðàöèè 0,5 ìã/ìë.
Ïðîöåññ ïðîâîäÿò â òå÷åíèå 48 ÷ ïðè 2 – 10 °Ñ.
Îêèñëåííûé ãëóòàòèîí äîáàâëÿþò â êîëè÷åñòâå, ðàâíîì èñõîäíîìó êîëè÷åñòâó âîññòàíàâëèâàþùåãî àãåíòà â áóôåðå, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿþò
5 Ì NaCl è 1 Ì ôîñôàò íàòðèÿ äî êîíå÷íîé
êîíöåíòðàöèè 250 ìÌ è 25 ìÌ ñîîòâåòñòâåííî.
Äîâîäÿò pH äî 7,9 ñ ïîìîùüþ 6 Ì HCl.
Ðåôîëäèðîâàííûé áåëîê î÷èùàþò àôôèííîé õðîìàòîãðàôèåé ñ èñïîëüçîâàíèåì èììîáèëèçîâàííûõ ìåòàëëîâ: íàíîñÿò ðàñòâîðåííûé
ãèáðèäíûé ïðåäøåñòâåííèê àíàëîãà èíñóëèíà
íà êîëîíêó, óïàêîâàííóþ ìåòàëë-õåëàòíûì
ñîðáåíòîì Ni-sepharose (GE Healthcare, Øâåöèÿ); ýëþèðóþò ãðàäèåíòîì èìèäàçîëà 0 – 400 ìÌ
â òå÷åíèå 15 îáúåìîâ êîëîíêè (CV); èñïîëüçóÿ
îáðàùåííî-ôàçîâóþ ÂÝÆÕ (ÎÔ ÂÝÆÕ), ïðîâîäÿò âíóòðèïðîèçâîäñòâåííûé êîíòðîëü, îáúåäèíÿÿ ïîäõîäÿùèå ôðàêöèè ñ áåëêîì òðåáóåìîãî óðîâíÿ ÷èñòîòû.
 î÷èùåííûõ ôðàêöèÿõ áåëêà ñìåíÿþò áóôåð, äëÿ ÷åãî ê îáúåäèíåííûì ôðàêöèÿì äîáàâëÿþò ÝÄÒÀ äî êîíöåíòðàöèè 10 ìÌ è äèàôèëüòðóþò íà ìåìáðàíå ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ
ïî ìîëåêóëÿðíîé ìàññå (ÏÎÌÌ) 3000 Äà. Ôèíàëüíûé áóôåð äîëæåí áûòü çàìåíåí êàê ìèíèìóì íà 97 % áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 20 ìÌ
Òðèñ-HCl, pH 8,0, ïðè 2 – 10 °Ñ. Êîíå÷íàÿ êîí-
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
23
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
öåíòðàöèÿ
áåëêà
ñîñòàâëÿåò
ïðèìåðíî
20 – 25 ìã/ìë.
Äëÿ ïîëó÷åíèÿ öåëåâîãî èíñóëèíîâîãî àíàëîãà ãèáðèäíûé ïðåäøåñòâåííèê ïîäâåðãàþò
ôåðìåíòàòèâíîìó ðàñùåïëåíèþ, äîáàâëÿÿ â ðàñòâîð áåëêà òðèïñèí (áåëîê:ôåðìåíò = 2000:1) è
êàðáîêñèïåïòèäàçó Â (áåëîê:ôåðìåíò = 1000:1).
Ïî îêîí÷àíèè ãèäðîëèç îñòàíàâëèâàþò äîáàâëåíèåì óêñóñíîé êèñëîòû ³700 ìÌ äî pH 3,5.
Ïðîöåññ êîíòðîëèðóþò ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ (÷èñòîòà ïîëó÷àåìîãî ëèçïðî — îêîëî 54 %).
Ïîëó÷åííûé â ðåçóëüòàòå ãèäðîëèçà èíñóëèí ëèçïðî íàíîñÿò íà êîëîíêó ñ îáðàùåííî
ôàçîâûì ñèëèêàãåëåì (Ñ18) è ýëþèðóþò â èçîêðàòè÷åñêîì ðåæèìå áóôåðîì, ñîäåðæàùåì
23 % àöåòîíèòðèëà, 200 ìÌ ñóëüôàòà íàòðèÿ è
0,16 % ôîñôîðíîé êèñëîòû. Àëüòåðíàòèâíûé
âàðèàíò — êîëîíêà ñ ñèëèêàãåëåì Ñ4 è ýëþöèÿ
ñ èñïîëüçîâàíèåì áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 22 %
àöåòîíèòðèëà, 200 ìÌ ñóëüôàòà íàòðèÿ è
0,16 % ôîñôîðíîé êèñëîòû.
Î÷èùåííûå ôðàêöèè áåëêà êîíöåíòðèðóþò
è ïåðåáóôåðèâàþò ñ ïîìîùüþ óëüòðàôèëüòðàöèè íà ìåìáðàíàõ ñ ÏÎÌÌ 3000 Äà. Ôèíàëüíûé áóôåð äîëæåí áûòü çàìåíåí êàê ìèíèìóì
íà 97 % ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 0,1 N ëèìîííóþ êèñëîòó; îáðàçåö äîëæåí áûòü ñêîíöåíòðèðîâàí äî 8 – 12 ìã/ìë.
Êðèñòàëëèçàöèÿ: ê èíñóëèíó ëèçïðî äîáàâëÿþò ðàâíûé îáúåì áóôåðà (2,4 Ì NaCl, 0,1 N
ëèìîíàÿ êèñëîòà, 6 ìÌ ZnCl2), pH 6,3, îáðàçåö
èíêóáèðóþò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Çàâåðøåíèå êðèñòàëëèçàöèè îïðåäåëÿþò ñ ïîìîùüþ ÓÔ-ñïåêòðîìåòðè÷åñêîãî àíàëèçà íàäîñàäî÷íîé æèäêîñòè. Êðèñòàëëû èíñóëèíà ñîáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì èëè ôèëüòðàöèåé,
îòìûâàþò ýòàíîëîì è âûñóøèâàþò â âàêóóìå
äî ïîëó÷åíèÿ ñóõîé àêòèâíîé ôàðìàöåâòè÷åñêîé ñóáñòàíöèè (ÀÔÑ).
1.3. Ïîëó÷åíèå èíñóëèíà àñïàðòà
Ïðåäøåñòâåííèêè èíñóëèíà àñïàðòà ìîãóò
áûòü
áèîñèíòåçèðîâàíû
ìåòèëîòðîôíûìè
äðîææàìè Pichia pastoris. Èñïîëüçîâàíèå ìåòèëîòðîôíûõ äðîææåé â êà÷åñòâå ýêñïðåññèîííûõ ñèñòåì äëÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíûõ
áåëêîâ èìååò ïðåèìóùåñòâî, ïîçâîëÿÿ äîñòèãàòü âûñîêèõ âûõîäîâ ïðîäóêòà è âûñîêîé
ïëîòíîñòè êóëüòóðû â ôåðìåíòåðå [12]. Ïðè
ýòîì âûñîêîé ïëîòíîñòè êóëüòóðû êëåòîê ìîæíî äîáèòüñÿ ïðè ìèíèìàëüíîì ðàñõîäå ïèòàòåëüíûõ âåùåñòâ. Òàêæå â ýòèõ ñèñòåìàõ îòñóòñòâóåò íåîáõîäèìîñòü ïðîâåäåíèÿ ðåàêöèé
òðàíñïåïòèäàöèè, òàê êàê B-öåïü ñèíòåçèðóåòñÿ ïîëíîñòüþ.
Êðîìå òîãî, äðîææè íå ñîäåðæàò òîêñè÷íûõ
ýíäîòîêñèíîâ è ïèðîãåíîâ êëåòî÷íîé ñòåíêè â
24
îòëè÷èå îò ïðîêàðèîòîâ; âî-âòîðûõ, ñèíòåçèðîâàííûå ðåêîìáèíàíòíûå áåëêè áîëåå äîñòóïíû
äëÿ âûäåëåíèÿ, òàê êàê îíè íàêàïëèâàþòñÿ â
öèòîïëàçìå ëèáî ñåêðåòèðóþòñÿ â ïèòàòåëüíóþ
ñðåäó [12]. Ïðè ýòîì ñåêðåòîðíàÿ ñèñòåìà äðîææåé äåìîíñòðèðóåò áîëüøîå ñõîäñòâî ñ ñîîòâåòñòâóþùåé ñèñòåìîé ìëåêîïèòàþùèõ, îáåñïå÷èâàÿ ïðàâèëüíûé ôîëäèíã è ïðîòåîëèòè÷åñêèé
ïðîöåññèíã ñåêðåòèðóåìûõ áåëêîâ [13]. Òàêèì
îáðàçîì, ïðè èñïîëüçîâàíèè äðîææåâûõ ñèñòåì
îòñóòñòâóåò íåîáõîäèìîñòü ïðèìåíåíèÿ ñòàäèé
ðåíàòóðàöèè, ÷òî ÿâëÿåòñÿ ñóùåñòâåííûì äîñòîèíñòâîì ïðèìåíåíèÿ ïîñëåäíèõ.
Îïèñàíà òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ íîâîãî
øòàììà-ïðîäóöåíòà ðåêîìáèíàíòíîãî ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà àñïàðòà â P. pastoris [14].
Íîâûé øòàìì-ïðîäóöåíò ïîëó÷àþò ìåòîäàìè
îäíîâðåìåííîé è ïîñëåäîâàòåëüíîé òðàíñôîðìàöèè øòàììà-ðåöèïèåíòà GS115 P. pastoris
(His4)
ïëàçìèäàìè
pPIC9InsAspRWR
è
pPICZaAInsAspRWR.
Ïðîìûøëåííóþ ôåðìåíòàöèþ ýòîãî øòàììà ïðîâîäÿò ñëåäóþùèì îáðàçîì. Íà ïåðâîì
ýòàïå êîëáû, ñîäåðæàùèå 0,4 ìë ïîñåâíîãî ìàòåðèàëà, îòòàèâàþò è çàòåì êóëüòèâèðóþò â ïèòàòåëüíîé ñðåäå YPD (20 ã/ë ãëþêîçû, 20 ã/ë
ïåïòîíà, 10 ã/ë äðîææåâîãî ýêñòðàêòà). Êóëüòóðó èíêóáèðóþò â îðáèòàëüíîì øåéêåðå â òå÷åíèå 8 ÷ ïðè 30 °Ñ.
Ïðîìûøëåííàÿ ôåðìåíòàöèÿ ñîñòîèò èç
òðåõ ðàçëè÷íûõ ôàç: ïåðèîäè÷åñêîé ïîäà÷è
ãëèöåðèíà, ñìåøàííîé ïîäïèòêè (àäàïòàöèè ê
ìåòàíîëó) è èíäóêöèè ìåòàíîëîì. Èíîêóëÿò ïåðåíîñÿò â 2,5 ë ôåðìåíòåð, ñîäåðæàùèé 1,5 ë
îñíîâíîé ñîëåâîé ïèòàòåëüíîé ñðåäû, ñëåäîâûå
ñîëåé PTM4 è ðàñòâîðà D-áèîòèíà. Äëÿ áîðüáû
ñî âñïåíèâàíèåì ïåðèîäè÷åñêè äîáàâëÿþò
ðàñòâîð ïåíîãàñèòåëÿ. Íà âñåì ïðîòÿæåíèè
ôåðìåíòàöèè ðàñòâîðåííûé êèñëîðîä ïîääåðæèâàþò íà óðîâíå 35 % äîáàâëåíèåì âîçäóõà ñ
ïîñòîÿííîé ñêîðîñòüþ, èñïîëüçîâàíèåì ïðîòèâîäàâëåíèÿ è ïåðåìåøèâàíèÿ.
 ïåðâóþ ôàçó ôåðìåíòàöèè, ôàçó ïåðèîäè÷åñêîé ïîäà÷è ãëèöåðèíà, ôîðìèðóåòñÿ áèîìàññà. Ôåðìåíòåð ðàáîòàåò äî èñ÷åðïàíèÿ ãëèöåðèíà â ïèòàòåëüíîé ñðåäå, ÷òî îáíàðóæèâàþò ïî
ïèêó êèñëîðîäà, âûçâàííîìó ïðåêðàùåíèåì
ìåòàáîëèçìà ãëèöåðèíà.
Ïîñëå çàâåðøåíèÿ ïåðâîé ôàçû íàñòóïàåò
ôàçà ñìåøàííîé ïîäïèòêè: äîáàâëÿþò ñìåñü
43,5 % îá. ãëèöåðèíà è 5 % îá. ìåòàíîëà, à òàêæå ñëåäîâûå êîëè÷åñòâà ñîëè PTM4 è ðàñòâîðà
D-áèîòèíà. Âî âðåìÿ ïðîâåäåíèÿ ñòàäèè ñêîðîñòü ðîñòà êóëüòóðû ñîñòàâëÿåò 0,065 ë/÷. Ïîñëå 15 ÷ ïåðèîäè÷åñêîé ôåðìåíòàöèè ñ ïîäïèòêîé ââîäÿò èíäóêòîð. Âî âðåìÿ ôàçû èíäóêöèè
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
êîëè÷åñòâî äîáàâëÿåìîé ñìåñè ãëèöåðèíà è ìåòàíîëà óìåíüøàþò, ÷òîáû äîñòèãíóòü ñêîðîñòè
ðîñòà êóëüòóðû 0,005 ë/÷.  òî æå âðåìÿ íà÷èíàþò ïîäïèòêó ÷èñòûì ìåòàíîëîì ñ äîáàâëåíèåì
ñëåäîâûõ êîëè÷åñòâà ñîëåé PTM4 è ðàñòâîðà
D-áèîòèíà. Ïðè ïîäà÷å ìåòàíîëà ïðèäåðæèâàþòñÿ êîíöåíòðàöèè 0,2 % îá., êîòîðûå îïðåäåëÿþò ìåòîäîì ãàçîâîé õðîìàòîãðàôèè. Ôàçà èíäóêöèè äëèòñÿ 24 ÷, è îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü
áèîìàññû ñîñòàâëÿåò ÷óòü ìåíüøå 200 îïò. åä.
ïðè l=600 íì.
Ïðîäóêöèþ êîíòðîëèðóþò, îïðåäåëÿÿ êîíöåíòðàöèþ â íàäîñàäêå æèäêîé ïèòàòåëüíîé
ñðåäû, èçìåðåííóþ îáðàùåííî-ôàçîâûìè Ñ8 è
Ñ18 êîëîíêàìè. Â ðåçóëüòàòå äîñòèãàþò âûõîä
ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà àñïàðòà ïîðÿäêà
400 ìã/ë.
Âî âðåìÿ âûäåëåíèÿ ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà àñïàðòà îò ôðàãìåíòîâ êëåòîê ðàçáàâëåííûé ïðîäóêò ïðîïóñêàþò ÷åðåç êàòèîíîîáìåííóþ êîëîíêó ñ SP-Sepharose FF (GE Healthcare, Øâåöèÿ) èëè êîëîíêó ñ ñîðáåíòîì
ãèäðîôîáíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ ïðè ñêîðîñòè îò
60 äî 100 ñì/÷ è pH îò 3 äî 6.
Æèäêóþ ñðåäó ôåðìåíòàöèè ðàçáàâëÿþò
î÷èùåííîé âîäîé äî òåõ ïîð, ïîêà ïðîâîäèìîñòü íå äîñòèãàåò £12 ìÑì/ñì. Êîëîíêó óðàâíîâåøèâàþò 2 CV ñîëåâîãî áóôåðà, êîòîðûé
èìååò ïðîâîäèìîñòü 6 – 12 ìÑì/ñì. Ýëþèðóþò
óâåëè÷åíèåì êîíöåíòðàöèè ñîëè â ýëþèðóþùåì áóôåðå îò 0,1 äî 1 Ì NaCl.
Àâòîðû ïðåäëàãàþò äâà ñïîñîáà ïðîâåäåíèÿ
ôåðìåíòàòèâíîãî ðàñùåïëåíèÿ ïðåäøåñòâåííèêà àñïàðòà.
Ôåðìåíòàòèâíûé ïðîöåññ ïðè îäíîâðåìåííîé îáðàáîòêå ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà àñïàðòà òðèïñèíîì è êàðáîêñèïåïòèäàçîé B. Êîíöåíòðàöèþ ïðåäøåñòâåííèêà óñòàíàâëèâàþò
(ðàçáàâëÿÿ èëè êîíöåíòðèðóÿ óëüòðàôèëüòðàöèåé) îò 1 äî 10 ìã/ìë ïðè äîáàâëåíèè òðèïñèíà â êîíöåíòðàöèè îò 0,001 äî 0,01 ìã/ìë è êàðáîêñèïåïòèäàçû B â êîíöåíòðàöèè îò 1:500 äî
1:2000, òåìïåðàòóðå îò 20 äî 30°C, pH 9 – 11,5, è
ïðîâîäèìîñòè îò 10 äî 25 ìÑì/ñì.
Ðåàêöèþ êîíòðîëèðóþò ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ è
ñ÷èòàþò çàâåðøåííîé, êîãäà ñîäåðæàíèå öåëåâîãî âåùåñòâà ñîñòàâëÿåò ïî êðàéíåé ìåðå 75 %.
Äâóõýòàïíûé ôåðìåíòàòèâíûé ïðîöåññ.
Ïðåäøåñòâåííèê èíñóëèíà àñïàðòà (â êîíöåíòðàöèè îò 1 äî 10 ìã/ìë) îáðàáàòûâàþò âîäíûì
ðàñòâîðîì òðèïñèíà â êîíöåíòðàöèè îò 0,01 äî
0,1 ìã/ìë ïðè òåìïåðàòóðå îò 15 äî 30 °Ñ, pH
9 – 11,5, è ïðîâîäèìîñòè îò 10 äî 25 ìÑì/ñì. Ðåàêöèþ êîíòðîëèðóþò ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ; çàâåðøàþò åå äîáàâëåíèåì 7,5 Ì óêñóñíîé êèñëîòû,
êîãäà ñîäåðæàíèå ÷àñòè÷íî ãèäðîëèçîâàííîãî
ïîëóïðîäóêòà ñîñòàâëÿåò ïî êðàéíåé ìåðå 75 %.
×àñòè÷íî ãèäðîëèçîâàííûé ïîëóïðîäóêò
íàíîñÿò íà êîëîíêó ñ ñèëüíîé êàòèîíîîáìåííîé
ñìîëîé è ýëþèðóþò ñ óâåëè÷åíèåì êîíöåíòðàöèè ñîëè â ýëþèðóþùåì áóôåðå îò 0,1 äî 1 Ì
NaCl.
Ïðîäóêò ãèäðîëèçóþò ðàñòâîðîì êàðáîêñèïåïòèäàçû B ïðè ñîîòíîøåíèè ôåðìåíò – ñóáñòðàò îò 1:200 äî 1:2000. Ðåàêöèþ ïðîâîäÿò îò
4 äî 12 ÷ ïðè òåìïåðàòóðå îò 15 äî 30 °Ñ, pH
9 – 11, è ýëåêòðîïðîâîäíîñòè îò 10 äî 25 ìÑì/ñì.
Ãèäðîëèç êîíòðîëèðóþò ÂÝÆÕ è ñ÷èòàþò çàâåðøåííûì, êîãäà ñîäåðæàíèå öåëåâîãî âåùåñòâà ñîñòàâëÿåò 85 – 95 %.
Çàòåì àñïàðò î÷èùàþò îò âîçìîæíûõ ïðèìåñíûõ êîìïîíåíòîâ. Ðàñòâîð îáðàçöà íàíîñÿò
íà êîëîíêó ñ ñèëüíûì àíèîíèòîì è ýëþèðóþò
óâåëè÷åíèåì êîíöåíòðàöèè ñîëè îò 0,1 äî 1 Ì
NaCl. Ýëþöèþ êîíòðîëèðóþò ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ïðè 280 íì è ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ, ïîñëå
÷åãî âûáèðàþò ôðàêöèè íåîáõîäèìîé ñòåïåíè
÷èñòîòû.
Î÷èùåííûå ôðàêöèè êðèñòàëëèçóþò äîáàâëåíèåì 6 % îá. ýòàíîëà, 50 % óêñóñíîé êèñëîòû
â ñîîòíîøåíèè 6 ìë íà êàæäûé ãðàìì ïðîäóêòà, pH ïðèäåðæèâàþò îò 6,5 äî 7,2. Çàòåì äîáàâëÿþò 0,2 ã ZnCl2 íà 1 ã ïðîäóêòà. Êðèñòàëëû îòìûâàþò ýòàíîëîì, âûñóøèâàþò ïîä âàêóóìîì
äî ïîëó÷åíèÿ ñóõîé ÀÔÑ.
1.4. Òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ
ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ãëàðãèíà
Îïèñàíà òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ãëàðãèíà ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåòèëîòðîôíûõ äðîææåé Pichia pastorus â êà÷åñòâå ïðîäóöåíòà [15]. Åãî ïîëó÷àþò ìåòîäàìè
òðàíñôîðìàöèè øòàììà-ðåöèïèåíòà GS115
P. pastorus ïëàçìèäàìè pPIC9K. Ïëàçìèäà ñîäåðæèò ãåí óñòîé÷èâîñòè ê ãåíèòèöèíó äëÿ ïîñëåäóþùåé ñåëåêöèè òðàíñôîðìàíòîâ.
Øòàìì êóëüòèâèðóþò â ñðåäå, ñîñòîÿùåé èç
îðòîôîñôîðíîé êèñëîòû, ñóëüôàòà êàëèÿ, ãèäðîêñèäà êàëèÿ, ñóëüôàòà ìàãíèÿ, ñóëüôàòà
êàëüöèÿ, ãëèöåðèíà è áèîòèíà, â êà÷åñòâå èíäóêòîðà èñïîëüçóþò ìåòàíîë.
 õîäå îòäåëåíèÿ ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà ãëàðãèíà îò ôðàãìåíòîâ êëåòîê ðàçáàâëåííûé ïðîäóêò ïðîïóñêàþò ÷åðåç êîëîííó, óïàêîâàííóþ ñîðáåíòîì SP Sepharose FF (GE Healthcare, Øâåöèÿ) è óðàâíîâåøåííóþ 50 ìÌ óêñóñíîé êèñëîòîé ïðè çíà÷åíèè pH â îáðàçöå 3,8.
Ýëþèðóþò àöåòàòîì àììîíèÿ.
Öåëåâîé ãëàðãèí ïîëó÷àþò èç ïðåäøåñòâåííèêà ìåòîäîì ôåðìåíòàòèâíîãî ðàñùåïëåíèÿ.
Ãèäðîëèç ïðîâîäÿò â ïðèñóòñòâèè âîäîðàñòâîðèìûõ îðãàíè÷åñêèõ ðàñòâîðèòåëåé, òàêèõ êàê
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
25
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
ÄÌÑÎ, ÄÌÔÀ, ýòàíîë, àöåòîí, àöåòîíèòðèë,
ýòèëàöåòàò è äð. (íàèëó÷øèõ ðåçóëüòàòîâ äîáèâàþòñÿ â ÄÌÔÀ è ÄÌÑÎ). Ñîäåðæàíèå îðãàíè÷åñêîãî ðàñòâîðèòåëÿ ñîñòàâëÿåò 40 – 60 % ïî
îáúåìó ðåàêöèîííîé ñìåñè. Êîíöåíòðàöèþ
ïðåäøåñòâåííèêà ïîääåðæèâàþò ðàâíîé 10 ã/ë
(ðàçáàâëÿÿ èëè êîíöåíòðèðóÿ óëüòðàôèëüòðàöèåé) ïðè äîáàâëåíèè òðèïñèíà ñ êîíöåíòðàöèåé 50 ìã/ë. Ïðîöåññ âåäóò ïðè òåìïåðàòóðå
6 ± 2 °Ñ ïðè ìåäëåííîì ïåðåìåøèâàíèè.
Ïðåâðàùåíèå êîíòðîëèðóþò êàæäûé ÷àñ,
îöåíèâàÿ ïðîöåíòíîå ñîäåðæàíèå ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ãëàðãèíà è íåïðîðåàãèðîâàâøåãî ïðåäøåñòâåííèêà ñ ïîìîùüþ àíàëèòè÷åñêîãî ìåòîäà ÎÔ ÂÝÆÕ (Ñ18). Ðåàêöèÿ
ïðîòåêàåò ìåíåå ÷åì çà 10 ÷. Ãèäðîëèç îñòàíàâëèâàþò äîâåäåíèåì pH äî 5,0 ëåäÿíîé óêñóñíîé
êèñëîòîé, êîãäà ïðîöåíò íåãèäðîëèçîâàííîãî
ïðåäøåñòâåííèêà ñîñòàâëÿåò ìåíåå 5 %.
Âñå òðè ñòàäèè õðîìàòîãðàôè÷åñêîé î÷èñòêè ïðîâîäÿò íà ÂÝÆÕ êîëîííå, óïàêîâàííîé
ñîðáåíòîì C8 Daisogel (Daiso, ßïîíèÿ).
Íà ïåðâîì ýòàïå î÷èñòêè êîëîííó óðàâíîâåøèâàþò 10 % àöåòîíèòðèëîì (áóôåð Â) â
250 ìÌ óêñóñíîé êèñëîòå (áóôåð À). Ðàñòâîð ïîñëå îáðàáîòêè òðèïñèíîì ðàçáàâëÿþò â 5 ðàç âîäîé. Äëÿ ýëþöèè èñïîëüçóþò ëèíåéíûé ãðàäèåíò ñ ïîâûøåíèåì ñîäåðæàíèÿ áóôåðà Â.
Íà âòîðîé ñòàäèè êîëîííó ïðåäâàðèòåëüíî
óðàâíîâåøèâàþò 10 % àöåòîíèòðèëîì (áóôåð
Â) â 200 ìÌ àöåòàòå íàòðèÿ äî pH 5 (áóôåð À).
Ýëþàò ïîñëå ïðåäûäóùåé ñòàäèè äîëæåí ñîäåðæàòü 10 % àöåòîíèòðèëà äëÿ íàíåñåíèÿ íà êîëîííó (äëÿ ÷åãî îáðàçåö ðàçáàâëÿþò áóôåðîì
À). Áåëîê ýëþèðóþò áóôåðîì Â â ëèíåéíîì ãðàäèåíòå.
Äëÿ çàâåðøàþùåé ñòàäèè î÷èñòêè êîëîííó
óðàâíîâåøèâàþò 6 % ýòàíîëîì (áóôåð Â) â
50 ìÌ óêñóñíîé êèñëîòå (áóôåð À). Ýëþàò ïîñëå
ïðåäûäóùåé ñòàäèè ðàçáàâëÿþò â 3 ðàçà âîäîé.
Ýëþèðóþò áåëîê â ëèíåéíîì ãðàäèåíòå áóôåðà
Â. Ïîëó÷àþò öåëåâîé áåëîê ñ âûõîäîì ïðèìåðíî 85 % è ÷èñòîòîé 99,4 % è âûøå.
Î÷èùåííûé ñ ïîìîùüþ òðåõ ñòàäèé ÂÝÆÕ
ãëàðãèí îñàæäàþò äîáàâëåíèåì áóôåðà ëèìîííîé êèñëîòû (15,4 ã/ë ëèìîííàÿ êèñëîòà, 90 ã/ë
ãèäðîôîñôàò íàòðèÿ) è ðàñòâîðà ZnCl2. Äîâîäÿò ðÍ äî 6,3. Ïîñëå îñàæäåíèÿ îñàäîê áåëêà îòäåëÿþò îò íàäîñàäêà öåíòðèôóãèðîâàíèåì è
âûñóøèâàþò ïîä âàêóóìîì.
Âûõîä âñåãî ïðîöåññà ñîñòàâëÿåò 85 – 90 %;
÷èñòîòà ÀÔÑ îêîëî 99 %.
1.5. Ïîëó÷åíèå èíñóëèíà äåòåìèðà
Îïèñàíà òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà äåòåìèðà áèîñèíòåçîì â äðîææàõ S. cerevisiae [16].
26
Äëÿ ýêñïðåññèè öåëåâîãî áåëêà èñïîëüçóþò
ïëàçìèäû òèïà Ñ-POT, ñîäåðæàùèå Schizosaccharomyces pombe TPI (triose phosphate isomerase) ãåí c öåëüþ îòáîðà ïëàçìèä, S. cerevisiae
TPI ïðîìîòîð è òåðìèíàòîð. Ôðàãìåíò EcoRIXbaI ïëàçìèäû pKFN1003 çàìåíÿåòñÿ íà ôðàãìåíò, êîäèðóþùèé æåëàåìûé ïðåäøåñòâåííèê
èíñóëèíà. Øòàìì S. cerevisiae MT663 ñ ïëàçìèäîé âûðàùèâàþò íà ñðåäå YPD â òå÷åíèå 72 ÷
ïðè 30 °Ñ. Âûõîä ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà
êîëè÷åñòâåííî îöåíèâàþò ñ ïîìîùüþ ÎÔ
ÂÝÆÕ, èñïîëüçóÿ â êà÷åñòâå ñòàíäàðòà ÷åëîâå÷åñêèé èíñóëèí.
Âûäåëåíèå îäíîöåïî÷å÷íîãî ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà. Ïîñëå ôåðìåíòàöèè óäàëÿþò
êëåòêè äðîææåé öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Ïðåäøåñòâåííèê âûäåëÿëè ïîñðåäñòâîì êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè: îáðàçåö íàíîñÿò ïðè
pH íèæå pI, ýëþèðóþò ïðè pH âûøå pI; pI
ïðåäøåñòâåííèêà 4,5 – 5,5, ñâÿçûâàíèå ñ ñîðáåíòîì ïðîèñõîäèò ïðè pH îêîëî 3, à ýëþöèÿ
ïðè pH îêîëî 6 (ýëþåíò — ñìåñü âîäû è ýòàíîëà). Äàëåå ïðîâîäÿò èçîýëåêòðè÷åñêîå îñàæäåíèå èç 17 % ýòàíîëà.
Äàëüíåéøåå âûäåëåíèå öåëåâîãî äåòåìèðà
âêëþ÷àåò ñëåäóþùèå ñòàäèè: ðàñùåïëåíèå îäíîöåïî÷å÷íîãî ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà ïî
îñòàòêó ëèçèíà Â29 ñ ïîìîùüþ ïðîòåàçû
Achromobacter lyticus, àöèëèðîâàíèå äâóõöåïî÷å÷íîãî èíòåðìåäèàòà, ðàñùåïëåíèå òðèïñèíîì.
Ðàñùåïëåíèå ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà
ïðîâîäÿò ñëåäóþùèì îáðàçîì. Âíà÷àëå áåëîê
äèñïåðãèðóþò â âîäå ñ äîáàâëåíèåì NaOH ïðè
pH 9,7. Ê ðàñòâîðó äîáàâëÿþò ïðîòåàçó Achromobacter lyticus (ìàññîâîå ñîîòíîøåíèå áåëêà ê
ôåðìåíòó 200:1). Ïîääåðæèâàþò pH â èíòåðâàëå 9,7 – 10,0. Ïðîöåññ ïðîòåêàåò 5 ÷, êîíòðîëèðóþò ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ.
Äëÿ î÷èñòêè ðàñòâîð íàíîñÿò êîëîíêó, ñîäåðæàùóþ ñèëèêàãåëü Ñ18. Ýëþèðóþò â ãðàäèåíòå ýòàíîëà îò 25 äî 33 % îá. çà 12 CV. Äëÿ ðàñòâîðåíèÿ èñïîëüçóþò áóôåð (0,2 Ì KCl, 0,02 Ì
CaCl2, 0,01 Ì òðèýòàíîëàìèí, pH 7,4). Öåëåâîé
êîìïîíåíò ýëþèðóþò ïîñëå øåñòè CV ýëþåíòà.
Öåëåâûå ôðàêöèè îñàæäàþò ïðè pH 5,0 ïðè
4 °Ñ, îñàäîê îòäåëÿþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì.
Äâóõöåïî÷å÷íûé èíòåðìåäèàò ðàñòâîðÿþò
â ñèñòåìå âîäà–àöåòîíèòðèë (50/50 ïî îáúåìó),
pH äîâîäÿò äî 10,4, äîáàâëÿþò N-ãèäðîêñèñóêöèíèìèäíûé ýôèð ìèðèñòèíîâîé êèñëîòû
(0,354 ìÌ). Ðåàêöèþ àöèëèðîâàíèÿ îñòàíàâëèâàþò äîáàâëåíèåì ýòàíîëàìèíà. Àíàëèç ÂÝÆÕ
ñâèäåòåëüñòâóåò î òîì, ÷òî 94 % ñîåäèíåíèé
èìååò çàìåùåíèå â ïîëîæåíèè Â29.
Ñâèíîé òðèïñèí (0,5 % ïî îáúåìó ïî îòíîøåíèþ ê äâóõöåïî÷å÷íîìó èíòåðìåäèàòó) ðàñ-
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
òâîðÿþò â âîäå è äîáàâëÿþò ê ðåàêöèîííîé ñìåñè. Äëÿ àíàëèçà ïðîòåêàíèÿ ïðîöåññà èñïîëüçóþò ÎÔ ÂÝÆÕ ïðè íåéòðàëüíûõ çíà÷åíèÿõ pH.
Öåëåâîå âåùåñòâî (80 %) ýëþèðîâàëîñü ïîñëå
ìîíîçàìåùåííîãî èíòåðìåäèàòà èíñóëèíà â ïîëîæåíèè Â29 è ïåðåä äèçàìåùåííûìè ïðîèçâîäíûìè. Íå áûëè îáíàðóæåíû ïðîäóêòû ðàñùåïëåíèÿ ìåæäó àðãèíèíîì â ïîëîæåíèè Â22 è
ãëèöèíîì â ïîëîæåíèè Â23.
Ôèíàëüíóþ î÷èñòêó öåëåâîãî áåëêà ïðîâîäÿò ñ ïîìîùüþ àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè. Îáðàçåö áåëêà íàíîñÿò íà êîëîíêó, óïàêîâàííóþ ñîðáåíòîì Source 30Q (GE Healthcare,
Øâåöèÿ). Ýëþèðóþò áóôåðîì (42,5 % îá. ýòàíîë, 0,02 Ì Òðèñ-HCl, pH 7,5) ñ ëèíåéíûì ãðàäèåíòîì àöåòàòà àììîíèÿ îò 0,03 äî 0,16 Ì. Äåòåìèð ýëþèðóþò ïî÷òè â ñàìîì êîíöå ãðàäèåíòà. ×èñòîòà ïðîäóêòà 99 %.
Ê î÷èùåííîìó áåëêó äîáàâëÿþò ðàñòâîð, ñîäåðæàùèé 0,02 Ì àììèàê, 0,06 % ïî îáúåìó ôåíîë, 1 ìÌ àöåòàò öèíêà; äîâîäÿò pH äî 8,0; îñàæäàþò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå
18 ÷ è çàòåì ïðè 4 °Ñ â òå÷åíèå 18 ÷. Ïðîäóêò
îòäåëÿþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì, îòìûâàþò õîëîäíîé âîäîé è âûñóøèâàþò ïîä âàêóóìîì. Âûõîä ïîñëå òðåõ ñòàäèé ñîñòàâëÿåò 50 %; ÷èñòîòà
îêîëî 99,5 %.
2. ÈÍÒÅÐÔÅÐÎÍ ÁÅÒÀ
×åëîâå÷åñêèé èíòåðôåðîí áåòà (ðÈÍÔ áåòà)
ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ãëèêîïðîòåèí ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 20 êÄà. Ïåïòèäíàÿ ÷àñòü
ðÈÍÔ áåòà ïðåäñòàâëåíà 166 à.î. è ñîäåðæèò
òðè öèñòåèíîâûõ àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêà, äâà
èç êîòîðûõ îáðàçóþò îäèí âíóòðèìîëåêóëÿðíûé äèñóëüôèäíûé ìîñòèê. ðÈÍÔ áåòà îáëàäàåò èììóíîìîäóëèðóþùåé, àíòèïðîëèôåðàòèâíîé, àíòèâèðóñíîé è àíòèìèêðîáíîé àêòèâíîñòüþ.
Ñóùåñòâóþò ëåêàðñòâåííûå ôîðìû íà îñíîâå ðÈÍÔà áåòà-1à, â ÷àñòíîñòè Àâîíåêñ (Gedeon Richter, Âåíãðèÿ). ÐÈÍÔ áåòà-1à ïîëíîñòüþ
èäåíòè÷åí ïðèðîäíîìó ðÈÍÔ áåòà, îí ãëèêîçèëèðîâàí è èìååò ïðèðîäíóþ ÀÊ-ïîñëåäîâàòåëüíîñòü.
Óñòàíîâëåíî, ÷òî ãëèêîçèëèðîâàíèå íå ÿâëÿåòñÿ îáÿçàòåëüíûì äëÿ áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè ðÈÍÔ áåòà, ïîýòîìó ãîðàçäî âûãîäíåå
èñïîëüçîâàíèå áàêòåðèàëüíîé ýêñïðåññèè âçàìåí äîðîãîñòîÿùåé ýêñïðåññèè â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ.
ÐÈÍÔ áåòà-1b ÷åëîâåêà — ýòî èñêóññòâåííî
ñîçäàííàÿ, àäàïòèðîâàííàÿ äëÿ ýêñïðåññèè â
áàêòåðèÿõ, íåãëèêîçèëèðîâàííàÿ ôîðìà ðÈÍÔ
áåòà. Îò ïðèðîäíîãî áåëêà îí îòëè÷àåòñÿ çàìåíîé öèñòåèíà â ïîëîæåíèè 17 íà ñåðèí è äåëå-
öèåé N-êîíöåâîãî ìåòèîíèíà. Òàêàÿ çàìåíà
óñòðàíÿåò ïðè÷èíó îáðàçîâàíèÿ äèìåðîâ çà
ñ÷åò äèñóëüôèäíûõ ñâÿçåé, ÷òî ñóùåñòâåííî óïðîùàåò òåõíîëîãèþ ïîëó÷åíèÿ ëåêàðñòâåííûõ
ïðåïàðàòîâ íà åãî îñíîâå [17]. Íà ìèðîâîì ðûíêå íàèáîëüøåå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èë ïðåïàðàò ðåêîìáèíàíòíîãî ðÈÍÔà áåòà-1b ïîä
òîðãîâîé ìàðêîé Áåòàôåðîí (Schering AG, Ãåðìàíèÿ).
2.1. Ïðîöåññ «up-stream»
Ñóùåñòâóåò íåñêîëüêî ñïîñîáîâ ïîëó÷åíèÿ
ðÈÍÔ áåòà, è âñå îíè íå ëèøåíû íåäîñòàòêîâ.
Íàïðèìåð, ïîëó÷åíèå ðåêîìáèíàíòíîãî ðÈÍÔà áåòà-1à â êëåòêàõ ÿè÷íèêà êèòàéñêèõ õîìÿ÷êîâ õàðàêòåðèçóåòñÿ äëèòåëüíûì âðåìåíåì ýêñïðåññèè (4 – 6 ñóòîê) è íèçêèì âûõîäîì öåëåâîãî áåëêà (200 – 600 ìëí Åä/ë êóëüòóðû êëåòîê)
[18].
Èçâåñòåí ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ðÈÍÔà áåòà-1b
ïîñðåäñòâîì êîíñòðóèðîâàíèÿ ïëàçìèäû pSY2501
è ïðîäóöåíòà, ïîëó÷åííîãî òðàíñôîðìàöèåé
øòàììà E. coli MM294 ýòîé ïëàçìèäîé [19, 20].
Ïëàçìèäà pSY2501 íåñåò ïîä òðèïòîôàíîâûì
ïðîìîòîðîì ïðèðîäíûé ãåí ðÈÍÔ áåòà ñ çàìåíîé Ò ® À äëÿ çàìåíû öèñòåèíà 17 íà ñåðèí.
Íåäîñòàòêàìè ïëàçìèäû pSY2501 è ïðîäóöåíòà
íà åå îñíîâå ÿâëÿþòñÿ ìóòèðîâàííûé ïðèðîäíûé ãåí ðÈÍÔ áåòà è òðèïòîôàíîâûé ïðîìîòîð. Ïðèðîäíûé ãåí ñîäåðæèò ðåäêî âñòðå÷àþùèåñÿ â ãåíàõ Escherichia coli (ìèíîðíûå) êîäîíû, ÷òî ïðèâîäèò ê ñíèæåíèþ óðîâíÿ áèîñèíòåçà áåëêà, ñîñòàâëÿþùåãî 600 ìëí Åä/ë êóëüòóðû êëåòîê. Èñïîëüçîâàíèå òðèïòîôàíîâîãî
ïðîìîòîðà îãðàíè÷èâàåò èñïîëüçîâàíèå ïèòàòåëüíûõ ñðåä äëÿ ôåðìåíòàöèè òîëüêî ñðåäàìè,
íå ñîäåðæàùèìè òðèïòîôàí, è çíà÷èòåëüíî
óâåëè÷èâàåò âðåìÿ ôåðìåíòàöèè (äî 15 – 25 ÷).
Èçâåñòåí ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ðÈÍÔ áåòà-1b ñ
ïîìîùüþ âûñîêîïðîäóêòèâíîãî øòàììà E. ñoli
BDEES6, òðàíñôîðìèðîâàííîãî ðåêîìáèíàíòíîé ïëàçìèäíîé ÄÍÊ pES6-1 (ðèñ. 3), ïîçâîëÿþùåãî ïîëó÷àòü öåëåâîé áåëîê ñ âûñîêèì âûõîäîì (170 – 200 ìã, 5,3 – 6,4 ìëðä Åä/ë êóëüòóðû êëåòîê) è ïî óïðîùåííîé òåõíîëîãèè çà ñ÷åò
óìåíüøåíèÿ îáùåãî âðåìåíè ôåðìåíòàöèè äî
8 ÷ [21].
Ïîäîáíûõ ðåçóëüòàòîâ óäàëîñü äîñòè÷ü ñ
ïîìîùüþ êîíñòðóèðîâàíèÿ ïëàçìèäû, ñîäåðæàùåé îïòèìàëüíûå ðåãóëÿòîðíûå ýëåìåíòû,
êîíòðîëèðóþùèå ýêñïðåññèþ áåëêà. Îíà ñîñòîèò èç èñêóññòâåííîãî ãåíà ðÈÍÔ áåòà-1b, ôëàíêèðîâàííîãî ñàéòàìè ðåñòðèêòàç NdeI è HindIII,
NdeI/HindIII-ôðàãìåíòà
ÄÍÊ
ïëàçìèäû
ðÅÒ22b(+), ñîäåðæàùåãî ïðîìîòîð è âûñîêîýôôåêòèâíûé òåðìèíàòîð òðàíñêðèïöèè Ò7-ÐÍÊïîëèìåðàçû è óñèëèòåëü òðàíñëÿöèè ãåíà 10
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
27
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
Ðèñ. 3. Ñõåìà ðåêîìáèíàíòíîé ïëàçìèäû pES6-1.
ôàãà Ò7, à òàêæå ãåí áåòà-ëàêòàìàçû, äåòåðìèíèðóþùåé óñòîé÷èâîñòü òðàíñôîðìèðîâàííûõ
ïëàçìèäîé pES6-1 êëåòîê Å. coli ê àìïèöèëëèíó.
Êëåòêè ïðîäóöåíòà âûðàùèâàþò ïðè 37 °Ñ
â 100 ìë YT-áóëüîíà (ðÍ 7,0) ñ 50 ìêã/ìë àìïèöèëëèíà â òå÷åíèå 2 ÷ íà êà÷àëêå ñî ñêîðîñòüþ
âðàùåíèÿ 190 îá./ìèí äî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè
À550 0,7 – 0,8, çàòåì ââîäÿò èíäóêòîð (èçîïðîïèëòèî-áåòà-D-ãàëàêòîçèä, ÈÏÒÃ) äî êîíöåíòðàöèè 0,2 ìÌ è ïðîäîëæàþò ïðîöåññ åùå 6 ÷;
òàêèì îáðàçîì, îáùåå âðåìÿ ôåðìåíòàöèè
ñîñòàâëÿåò 8 ÷. Øòàìì-ïðîäóöåíòà E. coli
BDEES6/pES6-1 îáåñïå÷èâàåò ñèíòåç ðåêîìáèíàíòíîãî ðÈÍÔà áåòà-1b â êîëè÷åñòâå 10 – 12 %
îò ñóììàðíîãî ñîäåðæàíèÿ áåëêà êëåòîê.
2.2. Ýòàïû «downstream»
Èçâåñòåí ñïîñîá î÷èñòêè ðÈÍÔ áåòà-1b ñ èñïîëüçîâàíèåì äåòåðãåíòà äîäåöèëñóëüôàòà íàòðèÿ ïðè ïîëó÷åíèè áåëêà â âèäå òåë âêëþ÷åíèÿ [22]. Îäíàêî äàííîå ñîåäèíåíèå âûçûâàåò
çíà÷èòåëüíóþ äåíàòóðàöèþ öåëåâîãî áåëêà, åãî
íå óäàåòñÿ óäàëèòü èç ðàñòâîðà, ÷òî â ñâîþ î÷åðåäü äåëàåò íåâîçìîæíîé ïîñëåäóþùóþ èîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ, íåîáõîäèìóþ äëÿ
äàëüíåéøåé î÷èñòêè áåëêà. Èñïîëüçîâàíèå â
êà÷åñòâå äåòåðãåíòà öâèòòåðãåíòà 3 – 14 ïîçâîëÿåò èçáåæàòü óêàçàííûõ íåäîñòàòêîâ [23].
Çàÿâëÿåìûé â ðàáîòå [24] ñïîñîá î÷èñòêè
ðåêîìáèíàíòíîãî ðÈÍÔ áåòà-1b èç òåë âêëþ÷åíèÿ E. coli ïðåäóñìàòðèâàåò îïòèìèçàöèþ ñòàäèé îòìûâêè òåë âêëþ÷åíèÿ, ðàñòâîðåíèÿ è ðåôîëäèíãà öåëåâîãî áåëêà, äàëåå ìíîãîñòàäèéíóþ õðîìàòîãðàôè÷åñêóþ î÷èñòêó.
 õîäå îòìûâêè ðàçìîðîæåííûå òåëà âêëþ÷åíèÿ ðåñóñïåíäèðóþò â 2 %-íîì âîäíîì ðàñòâîðå öâèòòåðãåíòà 3 – 14 ñ ïîñëåäóþùèì óäàëåíèåì íåðàñòâîðèâøåãîñÿ ìàòåðèàëà öåíòðè-
28
ôóãèðîâàíèåì. Â ïðîöåññå ðàñòâîðåíèÿ òåë
âêëþ÷åíèÿ èñïîëüçóþò áóôåð ñëåäóþùåãî ñîñòàâà: 7 Ì ãóàíèäèí-ãèäðîõëîðèä, 20 ìÌ äèòèîòðåèòîë (DTT) è 0,5 ìÌ ôåíèëìåòàíñóëüôîíèëôòîðèä (PMSF). Ðàñòâîð äëÿ ðåôîëäèíãà
öåëåâîãî áåëêà ñîäåðæàë 20 ìÌ Òðèñ-HCl,
pH 9,0, 0,2 % ïîëèýòèëåíãëèêîëü (PEG) 3550,
300 ìÌ NaCl, 2 ìÌ âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà (GSH), 1 ìÌ îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà
(GSSG), 2 ìÌ ýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíîé êèñëîòû (ÝÄÒÀ), 0,05 % öâèòòåðãåíòà 3 – 14. Ðàñòâîðåííûå òåëà âêëþ÷åíèÿ èíêóáèðóþò â ïîëó÷åííîì ðàñòâîðå ïðè 10 °Ñ â òå÷åíèå íî÷è.
 õîäå ïðåäõðîìàòîãðàôè÷åñêîé ïîäãîòîâêè îáðàçöà èñïîëüçóþò áóôåð ñëåäóþùåãî ñîñòàâà: 25 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 8,0, 0,05 % öâèòòåðãåíò 3 – 14, 0,5 ìÌ PMSF, äëÿ ðàçâåäåíèÿ îáðàçöà ïåðåä íàíåñåíèåì íà êîëîíêó.  ïðîöåññå
õðîìàòîãðàôèðîâàíèÿ èñïîëüçóþò áóôåðû:
à) 25 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 8,0, 0,05 % öâèòòåðãåíò
3 – 14, 0,5 ìÌ PMSF; á) 25 ìÌ Òðèñ-HCl,
pH 8,0, 50 ìÌ NaCl, 0,05 % öâèòòåðãåíò 3 – 14,
0,5 ìÌ PMSF; â) 25 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 8,0, 1 Ì
NaCl, 0,05 % öâèòòåðãåíò 3 – 14, 0,5 ìÌ PMSF.
Õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ î÷èñòêà ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà âêëþ÷àåò â ñåáÿ íåñêîëüêî ñòàäèé:
êàòèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà HyperD
Ceramic S (Pall, ÑØÀ), çàòåì íà Source S30 (GE
Healthcare, Øâåöèÿ); ãåëü-ôèëüòðàöèÿ îêèñëåííîãî áåëêà íà Superdex 75 Prep grade (GE
Healthcare, Øâåöèÿ); àíèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà Source Q30 (GE Healthcare, Øâåöèÿ)
è ôèíàëüíàÿ ãåëü-ôèëüòðàöèÿ íà Sephacryl
S200HR (GE Healthcare, Øâåöèÿ).
Ïîäãîòîâëåííûé îáðàçåö ðàñòâîðåííûõ òåë
âêëþ÷åíèÿ íàíîñÿò (3 ìë/ìèí) íà êîëîíêó
HyperD Ceramic S, óðàâíîâåøåííóþ 10 CV áóôåðà (à). Îïòè÷åñêóþ ïëîòíîñòü ýëþàòà êîíòðîëèðóþò ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ïðè äëèíå âîëíû 280 íì. Ïðîñêîê â îáúåìå íàíåñåííîãî îáðàçöà ñîáèðàþò, è ñâÿçàâøèåñÿ ïðèìåñíûå
âåùåñòâà óäàëÿþò ïðîìûâêîé 3 CV áóôåðà (â).
Ïîðöèþ îáðàçöà íàíîñÿò íà êîëîíêó Source
S30 (10/100 ìì, ìàêñèìàëüíîå äàâëåíèå 30 àòì,
2,5 ìë/ìèí), óðàâíîâåøåííóþ 10 îáúåìàìè áóôåðà (à), ñîáèðàÿ ïðîñêîê. Êîëîíêó ïðîìûâþò
2 – 5 îáúåìàìè áóôåðà (à) è ýëþèðóþò ñâÿçàâøèéñÿ ìàòåðèàë ãðàäèåíòîì êîíöåíòðàöèè
NaCl (0 – 500 ìÌ, 5 îáúåìîâ êîëîíêè, 3 ìë/ìèí).
Ñîáèðàþò ôðàêöèþ, âûõîäÿùóþ â 150 – 200 ìÌ
NaCl. Ïåðåä íàíåñåíèåì ñëåäóþùåé ïîðöèè îáðàçöà êîëîíêó ðåãåíåðèðóþò 1 îáúåìîì 100 ìÌ
NaOH è óðàâíîâåøèâàþò ñòàðòîâûì áóôåðîì
(à). Ïðîöåäóðó ïîâòîðÿþò äëÿ îáúåäèíåííîãî
ïðîñêîêà ñ êîëîíêè Source S30.
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
Ñîáðàííûå ôðàêöèè ðÈÍÔ áåòà-1b îáúåäèíÿþò è â ïîëó÷åííûé ðàñòâîð äîáàâëÿþò öèñòåàìèí/öèñòàìèí äî êîíöåíòðàöèè 1/0,1 ìÌ.
Îáðàçåö èíêóáèðóþò â òå÷åíèå íî÷è ïðè 4 °Ñ,
öåíòðèôóãèðóþò (12000g, 4 °Ñ, 10 ìèí), è ñóïåðíàòàíò êîíöåíòðèðóþò íà óëüòðàôèëüòðàöèîííîé ìåìáðàíå ÐÌ-10 (Amicon, ÑØÀ).
Îáðàçåö îêèñëåííîãî ðÈÍÔ áåòà-1b íàíîñÿò
íà êîëîíêó Superdex 75 Prep grade (16/500 ìì,
13000 ò.ò./ì, ìàêñèìàëüíîå äàâëåíèå 5 àòì),
óðàâíîâåøåííóþ áóôåðîì (á). Ãåëü-ôèëüòðàöèþ ïðîâîäÿò â áóôåðå (á) ïðè ñêîðîñòè 30 ñì/÷.
Îáðàçåö ðÈÍÔ áåòà-1b íàíîñÿò íà êîëîíêó
Source Q30 (10/100 ìì, ìàêñèìàëüíîå äàâëåíèå
30 àòì, 2,5 ìë/ìèí), óðàâíîâåøåííóþ 10 CV áóôåðà (á), ñîáèðàÿ ïðîñêîê. Êîëîíêó ïðîìûâàþò
2 – 5 CV áóôåðà (á) è ýëþèðóþò ñâÿçàâøèéñÿ
ìàòåðèàë ãðàäèåíòîì êîíöåíòðàöèè NaCl
(50 – 1000 ìÌ, 10 îáúåìîâ êîëîíêè, 4 ìë/ìèí).
Ñîáèðàþò ôðàêöèþ, âûõîäÿùóþ â 200 – 300 ìÌ
NaCl. Ñîáðàííóþ ôðàêöèþ êîíöåíòðèðóþò íà
óëüòðàôèëüòðàöèîííîé ìåìáðàíå ÐÌ-10.
Îáðàçåö ðÈÍÔ áåòà-1b (1 ìë) íàíîñÿò íà êîëîíêó Sephacryl S200HR (16/600 ìì, >5000 ò.ò./ì,
ìàêñèìàëüíîå äàâëåíèå 1,5 àòì), óðàâíîâåøåííóþ áóôåðîì (á). Ðàçäåëåíèå ïðîâîäÿò â áóôåðå
(á) ïðè ñêîðîñòè 15 ñì/÷.
Ïðîäåìîíñòðèðîâàíî, ÷òî òàêîé ñïîñîá î÷èñòêè ïîçâîëÿåò ïîëó÷èòü ñóáñòàíöèþ ðÈÍÔ áåòà-1b ñî ñëåäóþùèìè ïîêàçàòåëÿìè: âûõîä öåëåâîãî áåëêà — 10 %; ñîäåðæàíèå àãðãåãàòîâ
(àíàëèç: ãåëü-ôèëüòðàöèÿ) — <5 %; ðîäñòâåííûå áåëêè (àíàëèç: ÎÔ ÂÝÆÕ, ÄÑÍ-ÏÀÀÃ) —
<5 %; áåëêè øòàììà-ïðîäóöåíòà (àíàëèç:
ÈÔÀ) — <5 íã/ìã; ýíäîòîêñèíû (àíàëèç:
ËÀË-òåñò) — <5 ÝÅ/ìã; óäåëüíàÿ àêòèâíîñòü —
32 ìëí ÌÅ/ìã.
3. ÈÌÈÃËÞÖÅÐÀÇÀ
Áîëåçíü Ãîøå — íàèáîëåå ÷àñòàÿ ôîðìà íàñëåäñòâåííûõ ôåðìåíòîïàòèé, îáúåäèíåííûõ â
ãðóïïó ëèçîñîìíûõ áîëåçíåé íàêîïëåíèÿ [25].
 îñíîâå çàáîëåâàíèÿ — íàñëåäñòâåííûé äåôèöèò àêòèâíîñòè b-ãëþêîöåðåáðîçèäàçû — ëèçîñîìíîãî ôåðìåíòà, ó÷àñòâóþùåãî â äåãðàäàöèè
ïðîäóêòîâ êëåòî÷íîãî ìåòàáîëèçìà. Îòñóòñòâèå
èëè íèçêàÿ àêòèâíîñòü êèñëîé b-ãëþêîöåðåáðîçèäàçû ïðèâîäèò ê íàêîïëåíèþ â ëèçîñîìàõ
ìàêðîôàãîâ íåóòèëèçèðîâàííûõ ëèïèäîâ è îáðàçîâàíèþ õàðàêòåðíûõ êëåòîê íàêîïëåíèÿ,
èëè êëåòîê Ãîøå. Êëèíè÷åñêèå ñèìïòîìû
âêëþ÷àþò ñåðüåçíóþ ãåïàòîñïëåíîìåãàëèþ,
àíåìèþ, òðîìáîöèòîïåíèþ è ïîâðåæäåíèå ñêåëåòà. Ëå÷åíèå áîëåçíè Ãîøå çàêëþ÷àåòñÿ â ïîæèçíåííîì íàçíà÷åíèè çàìåñòèòåëüíîé ôåð-
ìåíòíîé
òåðàïèè
ðåêîìáèíàíòíîé
ãëþêîöåðåáðîçèäàçîé (rGCR, èìèãëþöåðàçà,
Öåðåçèì™).
Ïîñêîëüêó ôàãîöèòû èìåþò ðåöåïòîðû
ìàííîçû, êîòîðûå ðàñïîçíàþò ãëèêîïðîòåèíû
è ãëèêîïåïòèäû ñ îëèãîñàõàðèäíûìè öåïÿìè,
íà êîíöå êîòîðûõ ðàñïîëîæåíû îñòàòêè ìàííîçû, óãëåâîäíîå ìîäèôèöèðîâàíèå ãëþêîöåðåáðîçèäàçû (íåçàùèùåííûå êîíöåâûå îñòàòêè
ìàííîçû) óëó÷øèëî íàöåëèâàíèå ôåðìåíòà íà
äàííûå êëåòêè [26].
Ãëèêîçèëèðîâàíèå èãðàåò ðåøàþùóþ ðîëü
â ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè GCR. Îíî îêàçûâàåò ÷ðåçâû÷àéíîå âëèÿíèå íà àêòèâíîñòü,
ñêëàä÷àòîñòü, ñòàáèëüíîñòü, ðàñòâîðèìîñòü,
âîñïðèèì÷èâîñòü ê ïðîòåàçàì, ñêîðîñòü âûâåäåíèÿ èç êðîâè è àíòèãåííûé ïîòåíöèàë áåëêîâ.
Ôåðìåíò GCR ÷åëîâåêà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé
ìîíîìåðíûé ãëèêîïðîòåèí, â ñîñòàâ êîòîðîãî
âõîäÿò 497 à. î. è 4 ñàéòà ãëèêîçèëèðîâàíèÿ [27].
Áåëêè äëÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ
òðàäèöèîííî ïðîäóöèðóþòñÿ â ñèñòåìàõ ýêñïðåññèè ìëåêîïèòàþùèõ è áàêòåðèé. Óñòàíîâëåíî, ÷òî GCR, ýêñïðåññèðóåìûé â E. coli, íå ÿâëÿåòñÿ àêòèâíûì èç-çà îòñóòñòâèÿ ïîñòòðàíñëÿöèîííûõ ìîäèôèêàöèé â ýòîé ñèñòåìå.
 ïîñëåäíåå äåñÿòèëåòèå ðàçðàáîòàíà íîâàÿ
ñèñòåìà ýêñïðåññèè â ðàñòåíèÿõ. Â äàííîé ìåòîäîëîãèè èñïîëüçóåòñÿ Agrobacterium — áàêòåðèÿ, ñïîñîáíàÿ âñòðàèâàòü ìîëåêóëû îòäåëüíûõ öåïåé ÄÍÊ (òÄÍÊ) â ðàñòèòåëüíûé ãåíîì.
Âñëåäñòâèå îòíîñèòåëüíîé ïðîñòîòû ââåäåíèÿ
ãåíîâ äëÿ ìàññîâîãî ïðîäóöèðîâàíèÿ áåëêîâ è
ïåïòèäîâ äàííàÿ ìåòîäîëîãèÿ ñòàíîâèòñÿ âñå
áîëåå ïîïóëÿðíîé â êà÷åñòâå àëüòåðíàòèâíîé
ñèñòåìû ýêñïðåññèè áåëêà [28]. Íî ïðè ïðîäóöèðîâàíèè â ðàñòåíèÿõ ñëåäóåò ïðèíèìàòü âî
âíèìàíèå ïîòåíöèàëüíûå ðàçâåòâëåíèÿ ðàñòèòåëüíîãî ãëèêîçèëèðîâàíèÿ [26]. Îïèñàí ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ èç òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê
ìîðêîâè, òàêæå èçâåñòíû ñïîñîáû ïîëó÷åíèÿ
èìèãëþöåðàçû èç ìåæêëåòî÷íîé æèäêîñòè òàáàêà, â êëåòêàõ íàñåêîìûõ (ñ äàëüíåéøåé ìîäèôèêàöèåé îëèãîñàõàðèäîì), â êëåòêàõ ÿè÷íèêîâ êèòàéñêîãî õîìÿ÷êà.
3.1. Ïðîèçâîäñòâî èìèãëþöåðàçû
èç òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê ìîðêîâè
Âåêòîð ýêñïðåññèè öåëåâîãî áåëêà ñîñòîèò èç
ôðàãìåíòà ïëàçìèäû pGREENII, ñîäåðæàùåãî
ãåí NPTII, ïðèäàþùåãî óñòîé÷èâîñòü ê êàíàìèöèíó è êàññåòû ýêñïðåññèè CE-T, ñîäåðæàùåé
èñêóññòâåííûé ãåí GCR è òàêèå ðåãóëÿòîðíûå
ýëåìåíòû, êàê NOS (íîïàëèí-ñèíòåòàçà) ïðîìîòîð, ýíõàíñåð è òåðìèíàòîð òðàíñêðèïöèè [26].
Òðàíñôîðìàöèþ êëåòîê ìîðêîâè ïðåäâàðèòåëüíî ïðîâîäÿò ñ èñïîëüçîâàíèåì Agrobacteri-
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
29
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
um â êà÷åñòâå íîñèòåëÿ âåêòîðà ýêñïðåññèè
[29]. Ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûå êëåòêè
ìîðêîâè âûñåâàþò íà àãàðîâîé ñðåäå Murashige
è Skoog, ñîäåðæàùåé àíòèáèîòèêè äëÿ îòáîðà
òðàíñôîðìàíòîâ.
Ñðåäè ðàçëè÷íûõ ïðîòåñòèðîâàííûõ êàëëóñîâ îäèí áûë îòîáðàí äëÿ ìàñøòàáèðîâàííîãî
ðîñòà è î÷èñòêè áåëêà. Êëåòêè êóëüòèâèðóþò
ïðè âñòðÿõèâàíèè â êîëáàõ Ýðëåíìåéåðà äî òåõ
ïîð, ïîêà îáùèé îáúåì íå îêàçûâàåòñÿ äîñòàòî÷íûì äëÿ èíîêóëèðîâàíèÿ áèîðåàêòîðà. Íà
17-é äåíü êóëüòèâèðîâàíèÿ, êîãäà êîëè÷åñòâî
ïðîäóöèðîâàíèÿ rGCR â êëåòêàõ ìîðêîâè äîñòèãàåò ìàêñèìóìà, êëåòêè ñîáèðàþò, ôèëüòðóÿ
êóëüòóðó ÷åðåç ñåòêó ñ äèàìåòðîì ÿ÷ååê
150 ìêì (òàêæå ìîæíî èñïîëüçîâàòü öåíòðèôóãèðîàâíèå). Îñàäîê êëåòîê, ñîäåðæàùèõ rGCR,
ìîæíî õðàíèòü â çàìîðîæåííîì ñîñòîÿíèè.
3.2. Ñòàäèè î÷èñòêè
Óñòàíîâëåíî, ÷òî rGCR, ýêñïðåññèðóåìàÿ â
òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòêàõ ìîðêîâè, ñâÿçàíà ñ âíóòðåííèìè ìåìáðàíàìè êëåòîê è íå âûäåëÿåòñÿ â ñðåäó [26]. Ìåõàíè÷åñêè ðàçðóøåííûå êëåòêè îñòàâëÿþò rGCR, ñâÿçàííóþ ñ íåðàñòâîðèìûìè äåáðèñàìè ìåìáðàíû; rGCR
ðàñòâîðÿþò ñ èñïîëüçîâàíèåì ìÿãêèõ äåòåðãåíòîâ è îòäåëÿþò îò êëåòî÷íûõ äåáðèñîâ è äðóãèõ
íåðàñòâîðèìûõ êîìïîíåíòîâ öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Ðàñòâîðèìûé ôåðìåíò äàëåå î÷èùàþò ñ
èñïîëüçîâàíèåì êàòèîíîîáìåííîé è ãèäðîôîáíîé õðîìàòîãðàôèè.
Äëÿ îòäåëåíèÿ ñðåäû îò íåðàñòâîðèìîé
rGCR çàìîðîæåííûé îñàäîê êëåòîê îòòàèâàþò ñ
ïîñëåäóþùèì öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 17000g
â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 4 °Ñ. Íåðàñòâîðèìûå ìàòåðèàëû è íåðàçðóøåííûå êëåòêè ïðîìûâàþò ñ
ïîìîùüþ ïîâòîðíîãî ñóñïåíäèðîâàíèÿ â áóôåðå (20 ìÌ ôîñôàòà íàòðèÿ, pH 7,2, 20 ìÌ
ÝÄÒÀ) è îñàæäåíèÿ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè
17000g â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 4 °Ñ; rGCR ýêñòðàãèðóþò è ñîëþáèëèçèðóþò ãîìîãåíèçàöèåé
îñàäêà â ýêñòðàãèðóþùåì áóôåðå (20 ìÌ ôîñôàòà íàòðèÿ, pH 7,2, 20 ìÌ ÝÄÒÀ, 1 ìÌ PMSF,
20 ìÌ àñêîðáèíîâîé êèñëîòû, 3,8 ã ïîëèâèíèëïèððîëèäîíà (PVPP), 1 ìÌ DTT, 1 % Tritonx-100). Ãîìîãåíàò âñòðÿõèâàþò â òå÷åíèå
30 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è îñâåòëÿþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 17000g â òå÷åíèå
20 ìèí ïðè 4 °Ñ; pH ñóïåðíàòàíòà äîâîäÿò äî
5,5 äîáàâëåíèåì êîíöåíòðèðîâàííîé ëèìîííîé
êèñëîòû. Ìóòíîñòü, âîçíèêàþùóþ ïîñëå äîâåäåíèÿ pH, óáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òåõ
æå óñëîâèÿõ, êàê îïèñàíî âûøå.
Íà ïåðâîé ñòàäèè î÷èñòêè îñâåòëåííûé ýêñòðàêò íàíîñÿò íà êîëîíêó (2,6 ´ 20 ñì), ñîäåðæàùóþ ñèëüíûé êàòèîíèò Macro-Prep high-S
30
(Bio-Rad, ÑØÀ), óðàâíîâåøåííûé ñèñòåìîé
(25 ìÌ öèòðàò íàòðèÿ, pH 5,5). Êîíòðîëü ïðîâîäèìîñòè, pH è ïîãëîùåíèÿ ïðîâîäÿò ïðè
280 íì. Îáðàçåö íàíîñÿò ïðè ñêîðîñòè 20 ìë/ìèí,
ïîñëå ÷åãî êîëîíêó ïðîìûâàþò óðàâíîâåøèâàþùèì áóôåðîì (25 ìÌ áóôåð öèòðàòà íàòðèÿ, pH 5,5) ïðè ñêîðîñòè ïîòîêà 12 ìë/ìèí.
Ýëþèðóþò rGCR ñ èñïîëüçîâàíèåì áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 600 ìÌ NaCl.
Ñîáðàííûå ôðàêöèè ðàçáàâëÿþò âîäîé
(1:5), ñîäåðæàùåé 5 % ýòàíîëà, è äîâîäÿò pH äî
6,0 ñ èñïîëüçîâàíèåì NaOH. Äàëåå îáðàçåö íàíîñÿò íà âòîðóþ êîëîíêó (1,6 ´ 20 ñì), óïàêîâàííóþ òåì æå ñîðáåíòîì. Êîëîíêó óðàâíîâåøèâàþò 20 ìÌ öèòðàòíîãî áóôåðà, pH 6,0,
ñîäåðæàùåãî 5 % ýòàíîëà. Ïîñëå çàãðóçêè îáðàçöà êîëîíêó ïðîìûâàþò óðàâíîâåøèâàþùèì
áóôåðîì è rGCR ýëþèðóþò áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 20 ìÌ öèòðàòíîãî áóôåðà, pH 6,0, 5 % ýòàíîëà è 1 Ì NaCl.
Ñîáðàííûå ôðàêöèè ïîñëå âòîðîé ñòàäèè
î÷èñòêè íàíîñÿò íà êîëîíêó (1,6 ´ 20 ñì), óïàêîâàííóþ ñîðáåíòîì Toypearl Phenyl-650C
(Tosoh, ßïîíèÿ). Êîëîíêó óðàâíîâåøèâàþò
10 ìÌ öèòðàòíîãî áóôåðà, pH 6,0, ñîäåðæàùåãî
5 % ýòàíîëà. Îáðàçåö íàíîñÿò ïðè ñêîðîñòè
6 ìë/ìèí ñ ïîñëåäóþùåé ïðîìûâêîé óðàâíîâåøèâàþùèì áóôåðîì. rGCR ýëþèðóþò 10 ìÌ
öèòðàòíûì áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 50 % ýòàíîëà, îáúåäèíÿþò ÷èñòûå ôðàêöèè è õðàíÿò ïðè
–20 °Ñ.
×èñòîòà ïîëó÷åííîãî áåëêà ñîñòàâëÿëà áîëåå 95 %.
4. ÀËÜÒÅÏËÀÇÀ
Àëüòåïëàçà — íåïàòåíòîâàííîå ìåæäóíàðîäíîå íàèìåíîâàíèå ðåêîìáèíàíòíîãî ÷åëîâå÷åñêîãî òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà, îñíîâíûìè ïðîèçâîäèòåëÿìè êîòîðîãî ÿâëÿþòñÿ
íåìåöêàÿ ôèðìà Boehringer Ingelheim Chemicals
Inc. (êîììåð÷åñêèé ïðåïàðàò «Actilyse») è àìåðèêàíñêàÿ ôèðìà Genentech, Inc. («Activase»).
Àëüòåïëàçà ïðèìåíÿåòñÿ ïðè òðîìáîëèòè÷åñêîé òåðàïèè îñòðîãî èíôàðêòà ìèîêàðäà,
îñòðîé ìàññèâíîé ýìáîëèè ëåãî÷íîé àðòåðèè,
ñîïðîâîæäàþùåéñÿ íåñòàáèëüíîé ãåìîäèíàìèêîé, è ïðè òðîìáîëèòè÷åñêîé òåðàïèè îñòðîãî
èøåìè÷åñêîãî èíñóëüòà.
Òêàíåâîé àêòèâàòîð ïëàçìèíîãåíà (tissue
plasminogen activator, äàëåå â òåêñòå t-PA) ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ôåðìåíò, ñèíòåçèðóåìûé ýíäîòåëèåì è ñïîñîáíûé ïðåâðàùàòü ïëàçìèíîãåí â
ïëàçìèí â ïðèñóòñòâèè ôèáðèíà, îò êîòîðîãî
çàâèñèò àêòèâíîñòü ôåðìåíòà. Ïðè ââåäåíèè
t-PA íå âûðàáàòûâàþòñÿ àíòèòåëà, åãî ìîæíî
ââîäèòü ïîâòîðíî.
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
Íà äàííûé ìîìåíò õîðîøî èçâåñòíû àìèíîêèñëîòíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÷åëîâå÷åñêîãî
t-PA è íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîäèðóþùåé ÄÍÊ. Áåëîê âïåðâûå áûë âûäåëåí êàê
îäíîöåïî÷å÷íàÿ ñåðèí-ïðîòåàçà ñ ìàññîé îêîëî
70 êÄà, ñîñòîÿùàÿ èç 527 à.î. ñ ñåðèíîì â êà÷åñòâå N-òåðìèíàëüíîãî à.î. Ìîëåêóëà èìååò
17 äèñóëüôèäíûõ ñâÿçåé è äîïîëíèòåëüíûé
ñâîáîäíûé öèñòåèíîâûé à.î. â ïîçèöèè 83 [30].
4.1. Êóëüòèâèðîâàíèå
4.1.1. Ýêñïðåññèÿ â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ
Îäèí èç îñíîâíûõ êðóïíîìàñøòàáíûõ ïðîèçâîäèòåëåé àëüòåïëàçû — êîìïàíèÿ Genentech
Inc. — äëÿ ïðîèçâîäñòâà èñïîëüçóåò ëèíèþ êëåòîê ìëåêîïèòàþùèõ CHO (chinese hamster
ovary cells, êëåòêè ÿè÷íèêîâ êèòàéñêîãî õîìÿ÷êà). Êîäèðóþùàÿ ÄÍÊ ïðèðîäíîãî ÷åëîâå÷åñêîãî t-PA ãåíåòè÷åñêè èíòåãðèðîâàíà â êëåòêè
CHO. Â ïðîöåññå ïîëóíåïðåðûâíîãî êóëüòèâèðîâàíèÿ àëüòåïëàçà ñåêðåòèðóåòñÿ â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó, ñîäåðæàùóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó è àíòèáèîòèê ãåíòàìèöèí â êîíöåíòðàöèè
100 ìã/ë. Ïðè ýòîì ïðèñóòñòâèå àíòèáèîòèêà â
êîíå÷íîì ïðîäóêòå íå äåòåêòèðóåòñÿ [31].
 íàñòîÿùåå âðåìÿ îïèñàí ìåòîä íàðàùèâàíèÿ êëåòîê CHO íà ìàêðîïîðèñòûõ ìèêðîíîñèòåëÿõ äëÿ ïðîèçâîäñòâà ðåêîìáèíàíòíîãî òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà [32].
Ìèêðîíîñèòåëè ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé ìèêðîñôåðû, ñïîñîáíûå ïðîèçâîäèòü óëó÷øåííûé
ñóáñòðàò äëÿ «çàÿêîðåííûõ» êëåòîê â ïåðåìåøèâàþùåéñÿ êóëüòóðå. Íàèáîëåå ÷àñòî èñïîëüçóåòñÿ öèòîäåêñ, âêëþ÷àþùèé â ñåáÿ äåêñòðàíîâóþ ìàòðèöó ñ ïðèêðåïëåííûìè N,N-äèýòèë-àìèíîýòèëîâûìè ãðóïïàìè [33]. Ìàêðîïîðèñòûå íîñèòåëè ïîçâîëÿþò êëåòêàì ïðîíèêàòü
âíóòðü ìàòðèöû è çàùèùàþò èõ îò ëþáûõ ñäâèãîâûõ ñèë, ñîçäàâàåìûõ â áèîðåàêòîðàõ. Ìèêðîíîñèòåëè óâåëè÷èâàþò ïðîèçâîäñòâî t-PA â
2,5 ðàçà â ïåðåñ÷åòå íà åäèíèöó îáúåìà ïî ñðàâíåíèþ ñ ñóñïåíçèîííûìè êóëüòóðàìè êëåòîê
CHO [34].
Òàêæå ñóùåñòâóåò ðÿä äðóãèõ ðàáîò, îïèñûâàþùèõ ýêñïðåññèþ â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ
äëÿ ïðîèçâîäñòâà ðåêîìáèíàíòíîãî t-PA è åãî
àíàëîãîâ è ïðîèçâîäíûõ [35, 36].
4.1.2. Áàêòåðèàëüíàÿ ýêñïðåññèÿ
Äëÿ óñòðàíåíèÿ ïðîáëåì, ñâÿçàííûõ ñ ñîëþáèëèçàöèåé è ðåôîëäèíãîì â ïðîöåññå âûäåëåíèÿ
ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ èç òåë âêëþ÷åíèÿ, èíîãäà èñïîëüçóåòñÿ ñïîñîáíîñòü áàêòåðèàëüíûõ
êëåòîê ñåêðåòèðîâàòü áåëêè â ïåðèïëàçìàòè÷åñêîå ïðîñòðàíñòâî. Îäíàêî t-PA, ñåêðåòèðóåìûé â ïåðèïëàçìó E. coli, íåïðàâèëüíî ñâåðíóò
è ïðàêòè÷åñêè íåàêòèâåí.
 ðàáîòå R&D îòäåëà ôèðìû Genentech
ïðèâîäèòñÿ èíòåðåñíûé ñïîñîá ðåøåíèÿ ýòîé
ïðîáëåìû[37]. Íà ïåðâîé ñòàäèè êÄÍÊ, êîäèðóþùóþ ïîëíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÷åëîâå÷åñêîãî t-PA, ñøèëè ñ ëèäèðóþùèì ïåïòèäîì stII,
îáåñïå÷èâàþùèì ïåðèïëàçìàòè÷åñêóþ ýêñïðåññèþ áåëêîâ â E. coli, è ïîìåñòèëè ïîä ðåãóëÿöèþ pBAD ïðîìîòîðà, èíäóöèðóåìîãî àðàáèíîçîé. Êëåòêè, òðàíñôîðìèðîâàííûå òàêèì
âåêòîðîì, èìåëè äîâîëüíî íèçêèé óðîâåíü ýêñïðåññèè t-PA, ïðè÷åì áîëüøàÿ ÷àñòü áåëêà íàêàïëèâàëàñü âíóòðèêëåòî÷íî â ðàñòâîðèìîé, íî
íåàêòèâíîé ôîðìå.
Äëÿ óâåëè÷åíèÿ âûõîäà àêòèâíîé ôîðìû
t-PA èñïîëüçóþò êîýêñïðåññèþ ñ èçîìåðàçîé äèñóëüôèäíûõ ñâÿçåé DsbC (disulfide bond isomerases) ïîä ðåãóëÿöèåé trc ïðîìîòîðà, èíäóöèðóåìîãî ÈÏÒÃ (èçîïðîïèë-b-D-1-òèîãàëàêòîïèðàíîçèä). Èíäóêöèÿ ýêñïðåññèè èçîìåðàçû
ïîä âîçäåéñòâèåì 0,05 ìÌ ÈÏÒà è ïîñëåäóþùàÿ (÷åðåç 30 ìèí) èíäóêöèÿ ýêñïðåññèè t-PA ñ
0,1 % àðàáèíîçû ïðèâîäèëè ê ìàêñèìàëüíîìó
çíà÷åíèþ àêòèâíîñòè t-PA ÷åðåç 2,5 ÷ ïîñëå èíäóêöèè.  ðåçóëüòàòå êîýêñïðåñèè àêòèâíîñòü
t-PA ïîâûøàëàñü áîëåå ÷åì â 100 ðàç [38].
4.1.3. Äðóãèå ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû
Ïîïûòêè ïðîèçâåñòè àêòèâíûé t-PA â Saccharomyces cerevisiae èëè â êëåòêàõ íàñåêîìûõ íå
óâåí÷àëèñü óñïåõîì èç-çà ãèïåðãëèêîçèëèðîâàíèÿ, íèçêîãî ýêñïîðòà è íåïðàâèëüíîãî ñâîðà÷èâàíèÿ [39, 40].
Äëÿ ïðîèçâîäñòâà òêàíåâîãî àêòèâàòîðà
ïëàçìèíîãåíà òàêæå ñóùåñòâóåò ìåòîä, çàêëþ÷àþùèéñÿ â èñïîëüçîâàíèè âåêòîðà ýêñïðåññèè, ñîäåðæàùåãî êîðîâûé ïðîìîòîð, êÄÍÊ è
ñèãíàëüíûé ïåïòèä BLG äëÿ ïîäãîòîâêè òðàíñãåííîé ìûøè; îòáèðàþò ëèìôîöèòû èëè ýïèòåëèàëüíûå êëåòêè ìîëî÷íîé æåëåçû òðàíñãåííîé ìûøè è îáúåäèíÿþò ñ ðàêîâûìè êëåòêàìè
äëÿ ïîëó÷åíèÿ ãèáðèäîìû. Òðàíñãåííàÿ ãèáðèäîìà t-PA èíäóöèðóåòñÿ ïðîëàêòèíîì è ñíîâà
îòáèðàåòñÿ äëÿ ïîëó÷åíèÿ âûñîêî-ýêñïðåññèðîâàííîãî êëåòî÷íîãî øòàììà. Çàòåì ýêñïðåññèðîâàííûå êëåòêè ïîäâåðãàþò òðàíñôåêöèè è
ñíîâà îòáèðàþò äëÿ òîãî, ÷òîáû ïîëó÷èòü âûñîêî-ýêñïðåññèðîâàííûé
øòàìì
ãèáðèäîìû.
Êëåòêè ñ âûñîêèì óðîâíåì ýêñïðåññèè ïðèâèâàþò â áðþøíóþ ïîëîñòü BALB/C ìûøè â ïåðèîä
ëàêòàöèè, çàòåì àñöèòíóþ æèäêîñòü îòáèðàþò
äëÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà. Òàêèì îáðàçîì, ñåáåñòîèìîñòü ïðîèçâîäñòâà çíà÷èòåëüíî ñíèæàåòñÿ ïî ñðàâíåíèþ ñ ìåòîäîì ñ èñïîëüçîâàíèåì
êëåòî÷íûõ êóëüòóð è óïðîùàåòñÿ ïðîèçâîäñòâî
[41].
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
31
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
Òàêæå ïðîâîäÿòñÿ ïîïûòêè ýêñïðåññèè t-PA
â òðàíñãåííûõ ðàñòåíèÿõ (òàáàê) [42].
Òàêèì îáðàçîì, íåñìîòðÿ íà ìíîãîîáðàçèå
ñîâðåìåííûõ ðåêîìáèíàíòíûõ òåõíîëîãèé ïðîèçâîäñòâà òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà,
åãî îñíîâíûå ïðîèçâîäèòåëè, êîìïàíèè Genentech Inc. è Boehringer Ingelheim Chemicals
Inc, èñïîëüçóþò ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû â
CHO è E coli, ðàçðàáîòàííûå â íà÷àëå 90-õ ãîäîâ ïðîøëîãî ñòîëåòèÿ.
4.2. Âûäåëåíèå è î÷èñòêà
Ñïåöèàëèñòû êîìïàíèè GENENTECH Inc. öåëåâîé ãëèêîïðîòåèí t-PA âûäåëÿþò èç êóëüòóðàëüíîé ñðåäû ñ èñïîëüçîâàíèåì õîðîøî èçâåñòíûõ ìåòîäîâ [43]. Íà ïåðâîì ýòàïå ïîñëå
êóëüòèâèðîâàíèÿ ïðèìåíÿþò òàíãåíöèàëüíóþ
ôèëüòðàöèþ ïðè âûñîêîì äàâëåíèè, ÷òîáû îòäåëèòü ñðåäó, ñîäåðæàùóþ t-PA, îò êëåòîê è îäíîâðåìåííî ñêîíöåíòðèðîâàòü.
Ðàñòâîð, ïîëó÷åííûé ïîñëå ìèêðîôèëüòðàöèè, íàíîñÿò íà àôôèííóþ êîëîíêó, ñïîñîáíóþ
ñåëåêòèâíî ñâÿçûâàòü t-PA, çàòåì t-PA ýëþèðóþò áóôåðîì ïðè pH 5,0 – 9,0. Ïîäõîäÿùèìè êîëîíêàìè ìîãóò áûòü: Lysinec CPG™ (Bioprocessing, ÑØÀ), ECH Lysine CL™ (GE Healthcare, Øâåöèÿ) è Lysine Hyper D™ (Pall, Ãåðìàíèÿ).
Êîëîíêó ïðåäâàðèòåëüíî óðàâíîâåøèâàþò ðàñòâîðîì 50 ìÌ NaH2PO4 èëè K2HPO4 (pH 7,5).
Ýëþèðóþùèé áóôåð îáû÷íî ñîäåðæèò 200 ìÌ
àðãèíèíà, 50 ìÌ NaH2PO4 èëè K2HPO4 (pH 7,5).
Æåëàòåëüíî, ÷òîáû ýëþèðóþùèé áóôåð òàêæå
ñîäåðæàë ïðîïèëåíãëèêîëü â êîíöåíòðàöèè
ïðèáëèçèòåëüíî îò 2,5 äî 20 %.
Äàííàÿ î÷èñòêà íå ïîçâîëÿåò èçáàâèòüñÿ îò
âûñîêîé êîíöåíòðàöèè ÄÍÊ êëåòîê-õîçÿèíà,
ïîýòîìó äàëüíåéøóþ î÷èñòêó ïðîâîäÿò ñ ïîìîùüþ àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè íà DEAESepharose Fast Flow (GE Healthcare, Øâåöèÿ).
Íà ñëåäóþùåì ýòàïå ïðîèñõîäèò èíàêòèâàöèÿ ðåòðîâèðóñîâ, êîòîðûå ìîãóò íàõîäèòüñÿ â
èñïîëüçóåìîé êëåòî÷íîé êóëüòóðå ìëåêîïèòàþùèõ. Äëÿ ýòàïà óäàëåíèÿ âèðóñîâ ñóùåñòâóåò
çíà÷èòåëüíîå ÷èñëî äîñòóïíûõ ìåòîäîâ: íàíîôèëüòðàöèÿ; îáðàáîòêà õàîòðîïíûìè àãåíòàìè,
íàïðèìåð ìî÷åâèíîé èëè ãóàíèäèí-ãèäðîõëîðèäîì; êðèòè÷åñêèå çíà÷åíèÿ pH; äåòåðãåíòû;
íàãðåâàíèå; õèìè÷åñêàÿ äåðèâàòèçàöèÿ, íàïðèìåð ôîðìàëüäåãèäîì; îáðàáîòêà ïðîòåàëèòè÷åñêèìè ôåðìåíòàìè; òðàäèöèîííûå ðàçäåëåíèÿ,
òàêèå êàê èîíîîáìåííàÿ èëè ýêñêëþçèîííàÿ
õðîìàòîãðàôèÿ, îðãàíè÷åñêèìè ðàñòâîðèòåëÿìè è ò. ä. Ïî ñóòè, íå òàê âàæíî, êàêèå øàãè âûáðàíû äëÿ óäàëåíèÿ âèðóñîâ, à âàæíî èñïîëíåíèå ñëåäóþùèõ óñëîâèé:
32
1. t-PA äîëæåí áûòü óñòîé÷èâ ê âîçäåéñòâèÿì, òîãäà êàê öåëåâîé âèðóñ äîëæåí áûòü ÷óâñòâèòåëåí ê âîçäåéñòâèÿì.
2. Ïîêàçàòåëè äîñòèãàåìîé ÷èñòîòû äîëæíû áûòü ìàêñèìàëüíûìè.
Îïèñàííûì ìåòîäîì ðåêîìáèíàíòíûé t-PA
ìîæíî âûäåëèòü è î÷èñòèòü ñ ÷èñòîòîé îêîëî
97 – 99 %. Åñëè íåîáõîäèìî, äàëüíåéøàÿ î÷èñòêà ìîæåò áûòü îñóùåñòâëåíà äîïîëíèòåëüíûì
ýòàïîì êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè. Òàêèì îáðàçîì ïîëó÷àþò ïðåïàðàò àëüòåïëàçû,
ãîòîâûé ê òåðàïåâòè÷åñêîìó èñïîëüçîâàíèþ.
Äî íåäàâíåãî âðåìåíè t-PA î÷èùàëè, èñïîëüçóÿ ðàçëè÷íûå òèïû àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè. Íàïðèìåð, ýêñïðåññèðóåìûé E. coli â
âèäå òåë âêëþ÷åíèÿ è çàòåì ïåðåâåäåííûé â
ðàñòâîðèìóþ ôîðìó ïîñëå ðåôîëäèíãà t-PA
îáû÷íî âûäåëÿþò ïðè ïîìîùè ëèçèí-àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè. Äðóãèå òèïû àôôèííîé
õðîìàòîãðàôèè, ïðèìåíÿåìûå äëÿ âûäåëåíèÿ
t-PA, âêëþ÷àþò êîíêàíàâàëèí À — ñåôàðîçó;
ñåôàðîçó, èììîáèëèçîâàííóþ èíãèáèòîðîì
òðèïñèíà êîðàëëîâîãî äåðåâà (erythrina trypsin
inhibitor); IgG àíòèòåëà ê t-PA, èììîáèëèçîâàííûå íà ñåôàðîçå è ôèáðèí-ñåôàðîçå [35, 38,
44 – 46]. Îäíàêî èñïîëüçîâàíèå àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè â ïðîèçâîäñòâå ôàðìàöåâòè÷åñêèõ
ïðåïàðàòîâ ñâÿçàíî ñ èçâåñòíûìè çàòðóäíåíèÿìè, òàêèìè êàê ñìûâàíèå èììîáèëèçîâàííîãî
ëèãàíäà è ïîÿâëåíèå íåæåëàòåëüíûõ ãåòåðîàíòèãåííûõ áåëêîâ.  äîïîëíåíèå ê ýòîìó â íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ èçìåíåíèÿ pH èëè òåìïåðàòóðû
â ïðîöåññå àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè ïðèâîäÿò
ê äåíàòóðàöèè öåëåâûõ áåëêîâ [47].
 ïàòåíòå [48] ïðåäñòàâëåíà óëó÷øåííàÿ
ìåòîäèêà î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî t-PA, êîòîðàÿ ïîçâîëÿåò èçáåæàòü ïðîáëåì, âîçíèêàþùèõ
ïðè èñïîëüçîâàíèè òðàäèöèîííûõ ìåòîäîâ î÷èñòêè ýòîãî áåëêà. Ïðåäëîæåí îäíîñòàäèéíûé
õðîìàòîãðàôè÷åñêèé ïðîöåññ î÷èñòêè t-PA, ñâÿçàííûé ñ èçìåíåíèåì êîíöåíòðàöèè àðãèíèíà
â áóôåðå äëÿ ðåôîëäèíãà è áóôåðàõ, èñïîëüçóåìûõ äëÿ õðîìàòîãðàôèè; ïîäîáðàíà îïòèìàëüíàÿ êîíöåíòðàöèÿ àðãèíèíà äëÿ èîíîîáìåííîé
õðîìàòîãðàôèè.
Òàêèì îáðàçîì, ïðÿìîé ðåôîëäèíã, ñëåäóþùèé ñðàçó çà ðàñòâîðåíèåì òåë âêëþ÷åíèÿ áåç
êàêèõ-ëèáî õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ ýòàïîâ, ñîêðàùàåò ïîòåðþ áåëêà. Ïîñëå ðåôîëäèíãà ýôôåêòèâíåå èñïîëüçîâàòü îäíîøàãîâóþ èîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ âìåñòî àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè â íåñêîëüêî ýòàïîâ. Èñïîëüçîâàíèå
àðãèíèíà â êîíöåíòðàöèè 0,5 Ì îáåñïå÷èâàåò
âûñîêóþ ïðîâîäèìîñòü ïðè êàòèîíîîáìåííîé
õðîìàòîãðàôèè, íî íå ïðåïÿòñòâóåò ñâÿçûâà-
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
íèþ áåëêîâ è óìåíüøàåò ïîòåðè áåëêà â ïðîöåññå ïðåöèïèòàöèè.
ïàòèòà è ÂÈ×, ïîâûøàåòñÿ âîçìîæíîñòü àëëåðãèçàöèè.
5.1. «Up-stream» ïðîöåññ
5. ÝÐÈÒÐÎÏÎÝÒÈÍ
Ýðèòðîïîýòèí (ÝÏÎ) — ãîðìîí, êîíòðîëèðóþùèé ïðîäóêöèþ êðàñíûõ êðîâÿíûõ òåëåö, íàçûâàåìóþ ýðèòðîïîýçîì. Îí ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ãëèêîïðîòåèí ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé
30,4 êÄà, ñîñòîèò èç 165 à.î. è óãëåâîäíîé ÷àñòè, ê êîòîðîé ïðèñîåäèíåíû îòðèöàòåëüíî çàðÿæåííûå îñòàòêè N-àöåòèëíåéðàìèíîâîé êèñëîòû. Ìîëåêóëû áåëêà ñ ìàêñèìàëüíûì ñîäåðæàíèåì ñèàëîâûõ êèñëîò ëó÷øå ñòèìóëèðóþò
ýðèòðîïîýç.  çàâèñèìîñòè îò ñòåïåíè ãëèêîçèëèðîâàíèÿ ðàçëè÷àþò íåñêîëüêî ôîðì ÝÏÎ.
Íàèáîëüøåå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èëè àëüôà
è áåòà ôîðìû ÝÏÎ, êîòîðûå îáëàäàþò ïðèìåðíî îäèíàêîâîé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ [49].
ÝÏÎ — ÷ðåçâû÷àéíî àêòèâíûé ãîðìîí, îêàçûâàþùèé ñâîå äåéñòâèå â îðãàíèçìå â ïèêîìîëÿðíûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Ïîêàçàíèÿìè ê ïðèìåíåíèþ ìîãóò ñëóæèòü àíåìèÿ ó áîëüíûõ ñ õðîíè÷åñêîé ïî÷å÷íîé íåäîñòàòî÷íîñòüþ, â òîì
÷èñëå íàõîäÿùèõñÿ íà ãåìîäèàëèçå, ïðîôèëàêòèêà è ëå÷åíèå àíåìèé ó áîëüíûõ ñ ñîëèäíûìè
îïóõîëÿìè, ÂÈ×-èíôèöèðîâàííûõ áîëüíûõ
(ÑÏÈÄ), áîëüíûõ ñ ìèåëîìíîé áîëåçíüþ, íåõîäæñêèíñêèìè ëèìôîìàìè íèçêîé ñòåïåíè
çëîêà÷åñòâåííîñòè, õðîíè÷åñêèì ëèìôîëåéêîçîì, ó áîëüíûõ ñ ðåâìàòîèäíûì àðòðèòîì, ó íåäîíîøåííûõ äåòåé, à òàêæå äëÿ óìåíüøåíèÿ
îáúåìîâ ïåðåëèâàåìîé êðîâè ïðè îáøèðíûõ
õèðóðãè÷åñêèõ âìåøàòåëüñòâàõ è îñòðûõ êðîâîïîòåðÿõ, ïðè ïîäãîòîâêå ê îáøèðíûì õèðóðãè÷åñêèì âìåøàòåëüñòâàì ñ öåëüþ óìåíüøåíèÿ
îáúåìîâ ïåðåëèâàåìîé êðîâè; óâåëè÷åíèå îáúåìà êðîâè, ïðåäíàçíà÷åííîé äëÿ àóòîòðàíñôóçèè.
ÝÏÎ ÿâëÿåòñÿ ýôôåêòèâíûì òåðàïåâòè÷åñêèì ñðåäñòâîì, îäíàêî ïîëó÷åíèå åãî â äîñòàòî÷íûõ êîëè÷åñòâàõ èç ïðèðîäíûõ èñòî÷íèêîâ
(ñûâîðîòêà êðîâè æèâîòíûõ ñ èíäóöèðîâàííîé
àíåìèåé è äð.) ÿâëÿåòñÿ íåðåàëèçóåìîé çàäà÷åé
â ñâÿçè ñ êðàéíå íèçêèì ñîäåðæàíèåì ãîðìîíà â
ñûðüå è ñëîæíîñòüþ òåõíîëîãèè î÷èñòêè. Àëüòåðíàòèâîé ÿâëÿåòñÿ ïðîèçâîäñòâî ÝÏÎ ñ ïîìîùüþ ãåííî-èíæåíåðíîé òåõíîëîãèè.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ìåòîäîì ãåííîé èíæåíåðèè äëÿ êëèíè÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ ïîëó÷åí ðÿä
ðåêîìáèíàíòíûõ ïðåïàðàòîâ ÝÏÎ ÷åëîâåêà.
Íàèáîëüøåå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èë ð÷ÝÏÎàëüôà è ð÷ÝÏÎ-áåòà. Ðåêîìáèíàíòíàÿ àëüôàôîðìà îòëè÷àåòñÿ îò áåòà-ôîðìû ñîäåðæàíèåì
ñûâîðîòî÷íîãî àëüáóìèíà ÷åëîâåêà.  ýòîì ñëó÷àå ïðèñóòñòâóåò ðèñê çàðàæåíèÿ âèðóñàìè ãå-
Øèðîêîå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èëè òåõíîëîãèè èçãîòîâëåíèÿ ýêçîãåííîãî ÝÏÎ ñ ïîìîùüþ
ðåêîìáèíàíòíûõ êëåòî÷íûõ ëèíèé æèâîòíûõ,
ñïîñîáíûõ ñåêðåòèðîâàòü ÷åëîâå÷åñêèé ÝÏÎ
ïðè êóëüòèâèðîâàíèè èõ in vitro íà ñèíòåòè÷åñêèõ ïèòàòåëüíûõ ñðåäàõ. Ïðè ýòîì óðîâåíü
ïðîäóêöèè ýðèòðîïîýòèíà îáû÷íî ñîñòàâëÿåò
åäèíèöû èëè äåñÿòêè ìèêðîãðàììîâ â ìèëëèëèòðå ïèòàòåëüíîé ñðåäû, à ñîäåðæàíèå ïîñòîðîííåãî áåëêà â íåé âî ìíîãî ðàç âûøå ñîäåðæàíèÿ ÝÏÎ.  ñèëó ýòîãî äëÿ ïîëó÷åíèÿ ñóáñòàíöèè ÝÏÎ, ïðèãîäíîé äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ
ïðåïàðàòà ìåäèöèíñêîãî íàçíà÷åíèÿ, òðåáóåòñÿ
ïðîâåäåíèå ãëóáîêîé î÷èñòêè [50].
Äëÿ ïîëó÷åíèÿ æèäêîé ëåêàðñòâåííîé ôîðìû ðåêîìáèíàíòíîãî ÝÏÎ ÷åëîâåêà èñïîëüçóþò âûñîêîî÷èùåííûé ïðåïàðàò, âûäåëåííûé
èç êîíäèöèîíèðîâàííîé êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè êëåòîê ÑÍÎ è íå ñîäåðæàùèé çàìåòíûõ
ïðèìåñåé îëèãîìåðíûõ ôîðì, ïðîäóêòîâ ïðîòåîëèçà è ïðèìåñåé áåëêîâ êëåòîê-ïðîäóöåíòîâ.
Ïðåäâàðèòåëüíî íàêîïëåííóþ ñóñïåíçèþ êëåòîê êóëüòèâèðóþò â ðîñòîâîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå (50/50 ñìåñü ãîòîâûõ ñðåä RPMI 1640 è
DMEM, ñîäåðæàùèõ ýìáðèîíàëüíóþ ñûâîðîòêó
òåëÿò, ãëóòàìèí è ãåíòàìèöèí) â êóëüòóðàëüíûõ ôëàêîíàõ. Ôëàêîíû èíêóáèðóþò ïðè 37 °C
â òå÷åíèå 3 ñóòîê â ñòàöèîíàðíûõ óñëîâèÿõ. Ïî
îêîí÷àíèè èíêóáàöèè ðîñòîâóþ ïèòàòåëüíóþ
ñðåäó âî ôëàêîíàõ çàìåíÿþò íà ýêâèâàëåíòíûé
îáúåì íàêîïèòåëüíîé ñðåäû (Fetaclone II, ãëóòàìèí, HEPES, ñìåñü ðàâíûõ äîëåé ñðåä RPMI
1640 è DMEM), èíêóáàöèþ ôëàêîíîâ ïðè 37 °C
ïðîäîëæàþò åùå 2 ñóòîê. Ïî îêîí÷àíèè èíêóáàöèè íàêîïèòåëüíóþ ñðåäó èç ôëàêîíîâ ñîáèðàþò â åìêîñòü, äîáàâëÿþò ôåíèëìåòèëñóëüôîíèëôòîðèä (PMSF) è ïîìåùàþò íà õðàíåíèå
ïðè 4 °Ñ. Âî ôëàêîíû ñ êëåòî÷íîé êóëüòóðîé
âíîñÿò ñâåæóþ ïîðöèþ íàêîïèòåëüíîé ñðåäû, è
âåñü öèêë íàêîïëåíèÿ ÝÏÎ ïîâòîðÿþò. Ñîáðàííóþ íàêîïèòåëüíóþ ñðåäó ñîõðàíÿþò òàê æå,
êàê è íà ïðåäûäóùåì öèêëå, ïðîâîäÿò íåñêîëüêî öèêëîâ. Ïî îêîí÷àíèè íàêîïèòåëüíîãî ïåðèîäà êëåòêè èç êàæäîãî ôëàêîíà ñîáèðàþò ïîñëå îáðàáîòêè êëåòî÷íîãî ìîíîñëîÿ ñìåñüþ
òðèïñèí/âåðñåí (50/50) ðåñóñïåíäèðîâàíèåì â
íàêîïèòåëüíîé ñðåäå è èõ êîíöåíòðàöèþ îïðåäåëÿþò ñ ïîìîùüþ ãåìîöèòîìåòðà. Ñîáðàííóþ
íàêîïèòåëüíóþ ñðåäó ïîäâåðãàþò î÷èñòêå. Äëÿ
ýòîãî êóëüòóðàëüíóþ æèäêîñòü î÷èùàþò ìèêðîôèëüòðàöèåö ÷åðåç ìåìáðàííûå ôèëüòðû ñ
ðàçìåðîì ïîð 0,8 ìêì äî ãîìîãåííîãî ñîñòîÿíèÿ [51].
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
33
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
5.2. Õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ î÷èñòêà ÝÏÎ
6. ÔÀÊÒÎÐ IX
Î÷èñòêà áåëêà ìîæåò ïðîâîäèòüñÿ ïðè ïîìîùè
ïîäõîäÿùåé êîìáèíàöèè õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ
ìåòîäîâ, òàêèõ êàê èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà íîñèòåëå Q-Sepharose FF (GE Healthcare, Øâåöèÿ) â ñèñòåìå óêñóñíàÿ êèñëîòà – ãëèöèí – ìî÷åâèíà ñ ïîñëåäóþùåé ýëþöèåé ðàñòâîðîì õëîðèäà íàòðèÿ; õðîìàòîãðàôèÿ ãèäðîôîáíûõ âçàèìîäåéñòâèé, îñàæäåíèå ñóëüôàòîì
àììîíèÿ, ãåëü-ôèëüòðàöèÿ, àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (ñ èñïîëüçîâàíèåì íèêåëåâûõ è êîáàëüòîâûõ ñîðáåíòîâ, ñîðáåíòîâ ñ èììîáèëèçîâàííûìè àíòèòåëàìè è/èëè ñîðáåíòîâ ñ èììîáèëèçîâàííûìè ëèãàíäàìè è ðåöåïòîðàìè)
[52].  êà÷åñòâå àíòèòåë â èììóíîàôôèííîé
õðîìàòîãðàôèè èñïîëüçóþò ìîíîêëîíàëüíûå
àíòèòåëà, êîòîðûå èììîáèëèçóþò íà áèîñîâìåñòèìîé íåðàñòâîðèìîé ìàòðèöå Sepharose
FF, àêòèâèðîâàííîé áðîìöèàíîì, óðàâíîâåøåííîé ôîñôàòíûì áóôåðîì. ×åðåç êîëîíêó ïðîïóñêàþò ïðåäâàðèòåëüíî îñâåòëåííóþ ìèêðîôèëüòðàöèåé êóëüòóðàëüíóþ æèäêîñòü, ñîäåðæàùóþ ðåêîìáèíàíòíûé ÝÏÎ. ÝÏÎ, ñîðáèðîâàííûé íà èììóíîñîðáåíòå, ýëþèðóþò êèñëûì
áóôåðíûì ðàñòâîðîì, íàïðèìåð 0,1 Ì ðàñòâîðîì ëèìîííîé êèñëîòû, 0,1 Ì ãëèöèíîâûì áóôåðîì, pH 3,5. Ýëþåíò è ðàñòâîðû äëÿ ïðîìûâêè ìîãóò ñîäåðæàòü 0,01 — 0,05 % íåèîííîãî äåòåðãåíòà Tween-20 èëè Nonidet Ð-40.
Òàêæå èçâåñòåí ñïîñîá î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî ÝÏÎ ÷åëîâåêà, âêëþ÷àþùèé ñòàäèè
îñàæäåíèÿ áåëêà ýòàíîëîì, ôðàêöèîíèðîâàíèÿ
íà ÄÝÀÝ-àãàðîçå, ðàçäåëåíèÿ íà ñèëüíîì êàòèîíèòå SP-Sephadex (GE Healthcare, Øâåöèÿ),
ãåëü-ôèëüòðàöèè íà Sephadex G-100 (GE
Healthcare, Øâåöèÿ), õðîìàòîãðàôèè íà ãèäðîêñèàïàòèòå, êîíöåíòðèðîâàíèÿ ëèîôèëèçàöèåé
è ÎÔ ÂÝÆÕ íà Vydac Ñ-4 (Grace, Ãåðìàíèÿ) â
ñèñòåìå âîäà – òðèôòîðóêñóñíàÿ êèñëîòà – àöåòîíèòðèë [53].
Äëÿ ïîëó÷åíèÿ ñòàáèëüíîé ÃËÔ èñïîëüçóþò äîáàâêè ìî÷åâèíû è ðàçëè÷íûõ àìèíîêèñëîò. Ìî÷åâèíà èñïîëüçóåòñÿ â êîëè÷åñòâå
5 – 50 ã/ë, ïðåäïî÷òèòåëüíî 10 – 15 ã/ë.  êà÷åñòâå àìèíîêèñëîò ïðèìåíÿþò, íàïðèìåð, ãëèöèí, L-àëàíèí, L-àðãèíèí, L-ëåéöèí, L-èçîëåéöèí, L-2-ôåíèëàëàíèí, L-ãëóòàìèíîâóþ êèñëîòó èëè L-òðåîíèí â êîëè÷åñòâàõ 0,5 – 50 ã/ë,
ïðè÷åì îáùåå êîëè÷åñòâî äîëæíî ñîñòàâëÿòü
ïðåäïî÷òèòåëüíî 5 – 25 ã/ë. Áèîëîãè÷åñêóþ àêòèâíîñòü êîíòðîëèðóþò in vitro ìåòîäîì îöåíêè
ñòèìóëÿöèè ïðîëèôåðàöèè êëåòîê êðîâè ïîëèöèòåìè÷åñêèõ ìûøåé â ïðèñóòñòâèè ÝÏÎ.
Ãåìîôèëèÿ òèïà Â — íàñëåäñòâåííîå çàáîëåâàíèå, îáóñëîâëåííîå äåôèöèòîì ïëàçìåííîãî
ôàêòîðà ñâåðòûâàíèÿ IX è õàðàêòåðèçóþùååñÿ
êðîâîòî÷èâîñòüþ ãåìàòîìíîãî òèïà.  2005 ã.
Âñåìèðíàÿ ôåäåðàöèÿ ãåìîôèëèè îïóáëèêîâàëà îò÷åò î ïîïóëÿöèîííîì èññëåäîâàíèè, âêëþ÷èâøåì 98 ñòðàí íà âñåõ êîíòèíåíòàõ è 88 %
âñåãî íàñåëåíèÿ Çåìëè. Áûëî âûÿâëåíî
131264 áîëüíûõ ãåìîôèëèåé òèïîâ À è Â [54].
Ïðåïàðàòû IX ôàêòîðà ñâåðòûâàíèÿ ïëàçìû êðîâè ÷åëîâåêà ïðèìåíÿþò äëÿ ëå÷åíèÿ ãåìîôèëèè òèïà B, èõ ïîëó÷åíèå ÿâëÿåòñÿ îäíîé
èç îñíîâíûõ öåëåé ïðîìûøëåííîãî ôðàêöèîíèðîâàíèÿ ïëàçìû êðîâè âî âñåì ìèðå.
Êîàãóëÿöèîííûé ôàêòîð IX (FIX, àíòèãåìîôèëè÷åñêèé ôàêòîð B, ôàêòîð Êðèñòìàñà) —
âèòàìèí Ê-çàâèñèìûé ïëàçìåííûé ãëèêîïðîòåèí, öèðêóëèðóþùèé â êðîâè, êàê çèìîãåí ñåðèíîâîé ïðîòåàçû [55, 56]. Âèòàìèí Ê íóæåí
äëÿ âíåäðåíèÿ âòîðîé êàðáîêñèëüíîé ãðóïïû â
íåêîòîðûå îñòàòêè ãëóòàìèíîâîé êèñëîòû ìîëåêóëû ôàêòîðà IX. Ýòà ïîñòòðàíñëÿöèîííàÿ
ìîäèôèêàöèÿ îáåñïå÷èâàåò ñâÿçûâàíèå èîíîâ
êàëüöèÿ è àäñîðáöèþ íà ôîñôîëèïèäíûõ ìåìáðàíàõ.
Ôàêòîð IX ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé îäíîöåïî÷å÷íûé ïðîôåðìåíò, ìîëåêóëÿðíûé âåñ êîòîðîãî,
ïî äàííûì ðàçíûõ àâòîðîâ, âàðüèðóåòñÿ îò
55 äî 57 êÄà.
Äëÿ ëå÷åíèÿ ãåìîôèëèè èñïîëüçóþò ïîñòîÿííîå ââåäåíèå íåäîñòàþùåãî ôàêòîðà ñâåðòûâàíèÿ. Íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíûì äëÿ ëå÷åíèÿ êðîâîòå÷åíèé ïðè ãåìîôèëèè ÿâëÿåòñÿ
ïðèìåíåíèå êîíöåíòðàòîâ ôàêòîðîâ ñâåðòûâàíèÿ. Èõ èçãîòàâëèâàþò èç ïðåïàðàòîâ äîíîðñêîé êðîâè, à òàêæå ãåííî-èíæåíåðíûì ñïîñîáîì.
34
6.1. Ïîëó÷åíèå ôàêòîðà IX èç ïëàçìû êðîâè
Ñóùíîñòü èñïîëüçóåìîãî â íàñòîÿùåå âðåìÿ ìåòîäà çàêëþ÷àåòñÿ â ïîëó÷åíèè êîíöåíòðàòà
ôàêòîðà IX ñâåðòûâàíèÿ êðîâè, ïðåäñòàâëÿþùåãî ñîáîé ïðîòðîìáèíîâûé êîìïëåêñ. Òåõíè÷åñêèì ðåçóëüòàòîì ÿâëÿåòñÿ ïîëó÷åíèå î÷èùåííîãî êîíöåíòðàòà ôàêòîðà IX ñâåðòûâàíèÿ
êðîâè, îáëàäàþùåãî âûñîêîé óäåëüíîé ñïåöèôè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ, êîòîðûé ìîæåò áûòü
èñïîëüçîâàí äëÿ ëå÷åíèÿ áîëüíûõ ãåìîôèëèåé.
Ñïîñîá îñóùåñòâëÿþò ñëåäóþùèì îáðàçîì [57].
Êðèîñóïåðíàòàíò ïîëó÷àþò èç ñâåæåçàìîðîæåííîé ïëàçìû êðîâè åå ðàçìîðîçêîé ïðè
êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, ãîìîãåíèçàöèè â õèìè÷åñêîì ðåàêòîðå ñ ìåøàëêîé è òåïëîîáìåííèêîì, ãäå ïëàçìà ðàçîãðåâàåòñÿ äî 0,5 °Ñ. Ðàñòîïëåííóþ ïëàçìó öåíòðèôóãèðóþò íà ïðîòî÷íîé
öåíòðèôóãå, â ðåçóëüòàòå ïîëó÷àÿ êðèîñóïåð-
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
íàòàíò (íàäîñàäî÷íàÿ ôðàêöèÿ) è êðèîïðåöèïèòàò (îñàäîê); pH êðèîñóïåðíàòàíòà äîâîäÿò
äî 7,2 – 7,8 ðàñòâîðîì NaOH è Òðèñ-HCl ñòàðòîâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì òðåõçàìåùåííûé öèòðàò íàòðèÿ è ãëèöèí, äî êîíöåíòðàöèè áåëêà 5 – 6 %. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð
öåíòðèôóãèðóþò, ïðîïóñêàþò ÷åðåç êàñêàä
ôèëüòðîâ ñ ðàçìåðîì ïîð 2, 1 è 0,22 ìêì è ïîäàþò ñ ëèíåéíîé ñêîðîñòüþ 50 – 90 ñì/÷ íà êîëîíêó ñ àíèîíîîáìåííèêîì DEAE-Toyopearl (Tosoh, ßïîíèÿ), óðàâíîâåøåííóþ ñòàðòîâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì. Íåñâÿçàííûå áåëêè óäàëÿþòñÿ ïðè íàíåñåíèè è ïåðåóðàâíîâåøèâàíèè.
Ýëþèðóþò ïðîòðîìáèíîâûé êîìïëåêñ â ñòóïåí÷àòîì ãðàäèåíòå èîííîé ñèëû 200 – 360 ìÌ
Na+/ë Òðèñ-HCl ýëþèðóþùèì áóôåðíûì ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì ãëèöèí è òðåõçàìåùåííûé öèòðàò íàòðèÿ. Çàòåì îòáèðàþò ôðàêöèè
ñî ñïåöèôè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ íå íèæå
2 ÌÅ/ìë. Ïîëó÷åííûé ñóììàðíûé ýëþàò ðàçâîäÿò ñòàðòîâûì áóôåðîì äî êîíöåíòðàöèè áåëêà
0,3 – 0,5 %.
Íå ñòîèò çàáûâàòü ïðî âàæíûé ýòàï — âèðóñíóþ èíàêòèâàöèþ. Ìåòîä âèðóñíîé èíàêòèâàöèè — ñîëüâåíò-äåòåðãåíòíûé (S/D ìåòîä).
Ýòîò ìåòîä ÿâëÿåòñÿ íåñïåöèôè÷åñêèì è ïîçâîëÿåò èíàêòèâèðîâàòü âñå âèðóñû ñ ëèïèäíîé
îáîëî÷êîé, â ÷àñòíîñòè ÂÈ×, âèðóñû ãåïàòèòà
Ñ è Â, à òàêæå âîçìîæíûå íåèçâåñòíûå âèðóñû
ñ ëèïèäíîé îáîëî÷êîé. Âèðóñû ÂÈ×-èíôåêöèè,
ãåïàòèòîâ Â è Ñ ÿâëÿþòñÿ íàèáîëåå ïàòîãåííûìè, ïîñêîëüêó èìåþò îòíîñèòåëüíî ñëîæíîå
ñòðîåíèå è ëåã÷å ïðåîäîëåâàþò èììóííûé
áàðüåð. Îäíàêî S/D îáðàáîòêà ñòîëü äåéñòâåííà, ÷òî âèðóñíàÿ íàãðóçêà â 1 000 000 000 ÷àñòèö/ìë óñòðàíÿåòñÿ ìåíåå ÷åì çà 2 ìèí. Ïðèìåíÿåìûå äåòåðãåíòû Tween-80 èëè Òðèòîí-Õ-100 â ñî÷åòàíèè ñ ãèäðîôîáíûì ðàñòâîðèòåëåì òðè-í-áóòèëôîñôàòîì (TNBP) ðàçðóøàþò ëèïîïðîòåèíîâûå ìåìáðàíû. Îñòàâøèåñÿ ôðàãìåíòû íóêëåèíîâîé êèñëîòû íå îáëàäàþò ïàòîãåííûì äåéñòâèåì.  ïðèñóòñòâèè äåòåðãåíòà íåâîçìîæíû îáðàòíûå ñîåäèíåíèÿ
èëè ðåãåíåðàöèÿ ìåìáðàí. Ýôôåêòèâíîñòü S/D
ìåòîäà çàâèñèò îò òåìïåðàòóðû è âðåìåíè âîçäåéñòâèÿ [58, 59].  îñíîâó îáåñïå÷åíèÿ âèðóñíîé áåçîïàñíîñòè ïîëó÷àåìûõ ïðåïàðàòîâ òàêæå ïîëîæåíà ñèñòåìà ìåð, âêëþ÷àþùàÿ îáñëåäîâàíèå äîíîðîâ ïåðåä äîíàöèåé, ïîñëåäóþùóþ êàðàíòèíèçàöèþ çàãîòîâëåííîé ñâåæåçàìîðîæåííîé ïëàçìû, ïîâòîðíûé âèðóñîëîãè÷åñêèé êîíòðîëü êàæäîé äîçû ïóëèðóåìîé ñâåæåçàìîðîæåííîé ïëàçìû è âèðóñîëîãè÷åñêèé êîíòðîëü ãîòîâîé ëåêàðñòâåííîé ôîðìû.
Ïîñëå îòäåëåíèÿ äåòåðãåíòà ïîëó÷åííóþ
ôðàêöèþ ïîäâåðãàþò ãåïàðèí-àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè.
Ñïåöèôè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ôàêòîðà IX, ïîëó÷åííîãî äàííûì ñïîñîáîì, ñîñòàâëÿåò
13 – 20 ÌÅ/ìë, âûõîä äîñòèãàåò 74 – 81 %. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ïîäâåðãàþò ñòåðèëèçóþùåé
ôèëüòðàöèè ÷åðåç ïîðèñòûå ôèëüòðû, ðîçëèâó
â ñòåðèëüíûå ôëàêîíû ïî 20 ìë è ëèîôèëèçàöèè [57].
Ãèáêîñòü õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ òåõíîëîãèé
ïîçâîëÿåò ðàçðåøèòü ïðîáëåìó ñíèæåíèÿ ñòîèìîñòè ïðåïàðàòîâ ïëàçìû, âî-ïåðâûõ, ïîëó÷åíèåì âîçìîæíî áîëüøåãî êîëè÷åñòâà ïðåïàðàòîâ èç åäèíèöû ñûðüÿ; âî-âòîðûõ, ïîâûøåíèåì
âûõîäà áåëêà â ïðîöåññå âûäåëåíèÿ. Ýòè ìåðû
òåîðåòè÷åñêè äîëæíû ñîêðàòèòü ïðîèçâîäñòâåííûå ïîòåðè äîðîãîñòîÿùèõ áåëêîâûõ ñóáñòàíöèé ïîëó÷àåìûõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ è
ïîâûñèòü ýôôåêòèâíîñòü èñïîëüçîâàíèÿ äîðîãîñòîÿùåãî óíèêàëüíîãî ñûðüÿ, êàêîâûì ÿâëÿåòñÿ ïëàçìà äîíîðñêîé êðîâè.
6.2. Ïîëó÷åíèå ôàêòîðà IX
ñ ïîìîùüþ òåõíîëîãèè ðåêîìáèíàíòíûõ ÄÍÊ
Ñ ðàçâèòèåì áèîòåõíîëîãèè ñòàëè êîììåð÷åñêè
äîñòóïíû áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûå ïðåïàðàòû
êîàãóëÿöèîííîãî ôàêòîðà êðîâè, ïîëó÷åííûå ñ
ïîìîùüþ òåõíîëîãèè ðåêîìáèíàíòíûõ ÄÍÊ.
Ïðè èñïîëüçîâàíèè ðåêîìáèíàíòíûõ ôàêòîðîâ
ïî÷òè îòñóòñòâóåò âîçìîæíîñòü ïåðåäà÷è èíôåêöèé ÷åëîâåêà.
Ïðè ïîëó÷åíèè ôàêòîðà IX òåõíîëîãèåé ðåêîìáèíàíòíîé ÄÍÊ èñïîëüçóþò ðàçíîîáðàçíûå
ýêñïðåññèîííûå
ñèñòåìû:
áàêòåðèàëüíûå,
äðîææåâûå è òàêèå ýóêàðèîòè÷åñêèå ñèñòåìû,
êàê êëåòêè íàñåêîìûõ è ìëåêîïèòàþùèõ.
Ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû íà îñíîâå êëåòîê
ìëåêîïèòàþùèõ ÿâëÿþòñÿ íàèáîëåå ÷àñòî ïðèìåíÿåìûìè ñèñòåìàìè äëÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX. Ïðèìåðàìè òàêèõ êëåòî÷íûõ ëèíèé ÿâëÿþòñÿ VERO è HeLa êëåòêè, êëåòî÷íûå ëèíèè CHO, MDCK è äð. Ýêñïðåññèîííûå âåêòîðà äëÿ ïîäîáíûõ ñèñòåì îáû÷íî âêëþ÷àþò ó÷àñòîê èíèöèàöèè ðåïëèêàöèè, ïðîìîòîð, ðåãóëèðóþùèé ýêñïðåññèþ ãåíà ôàêòîðà
IX, ó÷àñòîê ñâÿçûâàíèÿ ðèáîñîìû, à òàêæå ðåãóëÿòîðíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ñîäåðæàùèå
ñàéòû òåðìèíàöèè è ïîëèàäåíèëèðîâàíèÿ. Ýêñïðåññèîííûå âåêòîðà, èñïîëüçóåìûå äëÿ òðàíñôîðìàöèè êëåòîê ìëåêîïèòàþùèõ, çà÷àñòóþ
èìåþò âèðóñíóþ ïðèðîäó. Íàïðèìåð, øèðîêî
èñïîëüçóþòñÿ òàêèå ïðîìîòîðû, ïîëó÷åííûå èç
ãåíîìîâ âèðóñîâ, êàê âèðóñ ïîëèîìû, àäåíîâèðóñ è âèðóñ SV40. Âåêòîðíûå ÄÍÊ òàêæå äîëæíû ñîäåðæàòü ñåëåêòèâíûå ìàðêåðíûå ãåíû:
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
35
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
äåãèäðîôîëàòðåäóêòàçû èëè òèìèäèíêèíàçû [60].
Íà äàííûé ìîìåíò åäèíñòâåííûì ïðåïàðàòîì ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX, èìåþùèìñÿ
â ïðîäàæå, ÿâëÿåòñÿ ÁåíåÔÈÊÑ (Pfizer, ÑØÀ).
Ýòîò ïðåïàðàò ïðîèçâîäèòñÿ ïî òåõíîëîãèè ðåêîìáèíàíòíûõ ÄÍÊ ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðîöåññîâ ïðîèçâîäñòâà è î÷èñòêè áåç ýêçîãåííûõ ïðîäóêòîâ ÷åëîâå÷åñêîãî è æèâîòíîãî ïðîèñõîæäåíèÿ. Ê îñíîâíûì õàðàêòåðíûì ÷åðòàì äàííîãî
ïðîèçâîäñòâà ìîæíî îòíåñòè ñëåäóþùèå: â êëåòî÷íîé êóëüòóðå è êîíå÷íîì ïðîäóêòå îòñóòñòâóåò àëüáóìèí, îòñóòñòâóåò íåîáõîäèìîñòü â ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåëàõ, â ïðîöåññàõ î÷èñòêè
ïðèìåíÿåòñÿ ìíîãîñòàäèéíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ è
íàíîôèëüòðàöèÿ [61].
Êëþ÷åâûìè ñòàäèÿìè ïðîèçâîäñòâà ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX (ÁåíåÔÈÊÑ) ÿâëÿþòñÿ:
l ñòàáèëüíîå âíåäðåíèå ãåíîâ ôàêòîðà IX â
êëåòêè CHO;
l îòáîð êëåòî÷íîé ëèíèè, ñïîñîáíîé ýêñïðåññèðîâàòü áîëüøèå êîëè÷åñòâà àêòèâíîãî ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX ïðè ðîñòå â áèîðåàêòîðàõ â ïèòàòåëüíîé ñðåäå, ïîëíîñòüþ
ñâîáîäíîé îò ïðîäóêòîâ êðîâè èëè ïëàçìû;
l ñòàäèè õðîìàòîãðàôèè, íè îäíà èç êîòîðûõ
íå òðåáóåò ïðèìåíåíèÿ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë; ñòàäèÿ î÷èñòêè íàíîôèëüòðàöèåé
âêëþ÷åíà êàê äîïîëíèòåëüíûé óðîâåíü âèðóñíîé áåçîïàñíîñòè. Ê ïðèìåðó, íà äàííîì
ýòàïå ìîãóò áûòü ïðèìåíåíû ôèëüòðû ñ
ìåìáðàíîé ðàçìåðîì 70, îòôèëüòðîâûâàþùèå êðóïíûå áåëêè è âèðóñíûå ÷àñòèöû
>70 êÄà.
Ïðè ïîëó÷åíèè âèòàìèí K-çàâèñèìûõ áåëêîâ ðåêîìáèíàíòíûìè òåõíîëîãèÿìè äîñòèæåíèå âûñîêèõ óðîâíåé àêòèâíûõ áåëêîâ ëèìèòèðóåòñÿ ñòðóêòóðíîé ñëîæíîñòüþ ýòèõ áåëêîâ è
îòñóòñòâèåì êëåòî÷íûõ ñèñòåì, îáåñïå÷èâàþùèõ ýôôåêòèâíóþ è ïîëíîöåííóþ ïîñòòðàíñëÿöèîííóþ ìîäèôèêàöèþ. Ïðåïàðàòû ôàêòîðà
IX, ïîëó÷åííûå â êëåòêàõ CHO, íå ñòîëü ýôôåêòèâíû äëÿ ëå÷åíèÿ ãåìîôèëèè B, ïîñêîëüêó â
ýòîé ñèñòåìå íå ïðîèñõîäèò íàäëåæàùåãî ïðîöåññèíãà è, ñëåäîâàòåëüíî, áèîäîñòóïíîñòü ïðåïàðàòà õàðàêòåðèçóåòñÿ âàðèàáåëüíîñòüþ. Íèçêîå ñîäåðæàíèå àêòèâíîé ôîðìû ôàêòîðà IX
ïðè åãî ïîëó÷åíèè â êëåòêàõ CHO îáóñëîâëåíî
îãðàíè÷åííîé ñïîñîáíîñòüþ ýòèõ êëåòîê ê ïîëíîöåííîìó ãàììà-êàðáîêñèëèðîâàíèþ ïåðâûõ
12 à.î. N-êîíöåâîãî ó÷àñòêà áåëêà. Ïîòåðÿ òðåõ
êàðáîêñèëüíûõ ãðóïï ïðèâîäèò ê çíà÷èòåëüíîìó óìåíüøåíèþ àêòèâíîñòè ôàêòîðà IX.
 ðàáîòå [60] îïèñàí ìåòîä ïîëó÷åíèÿ áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ ðåêîìáèíàíòíûõ âèòàìèí
K-çàâèñèìûõ áåëêîâ, â ÷àñòíîñòè ôàêòîðà IX.
36
Ýêñïðåññèîííûìè ñèñòåìàìè, ïðèìåíÿåìûìè â
ýòîì ìåòîäå, ÿâëÿþòñÿ êëåòî÷íûå ëèíèè CHO è
HEK 293. Ìåòîä îñíîâàí íà êîýêñïðåññèè îäíîãî èëè áîëåå ôàêòîðîâ ïðîöåññèíãà, íàïðèìåð,
âèòàìèí K-ýïîêñèä-ðåäóêòàçû è âèòàìèí Ê-çàâèñèìîé ãàììà-ãëóòàìèë êàðáîêñèëàçû.
Ýïîêñèä-ðåäóêòàçà âèòàìèíà K ïåðåâîäèò
íåàêòèâíóþ (îêèñëåííóþ) ôîðìó âèòàìèíà K,
ïîñòóïàþùóþ â îðãàíèçì, â àêòèâíóþ (ðåäóöèðîâàííóþ) ôîðìó, ó÷àñòâóþùóþ â ïîñòòðàíñëÿöèîííîì êàðáîêñèëèðîâàíèè âèòàìèí K-çàâèñèìûõ áåëêîâ. Âèòàìèí K-çàâèñèìàÿ ãàììàãëóòàìèë êàðáîêñèëàçà — ôåðìåíò, êàðáîêñèëèðóþùèé îñòàòêè ãëóòàìèíîâîé êèñëîòû.
Òàêèì îáðàçîì, äàííûé ìåòîä îáåñïå÷èâàåò
ýôôåêòèâíóþ ïîñòòðàíñëÿöèîííóþ ìîäèôèêàöèþ âèòàìèí K-çàâèñèìûõ áåëêîâ ðåêîìáèíàíòíûìè êëåòêàìè è ïîçâîëÿåò ïîëó÷àòü ôàêòîð IX ñ âûñîêèì ñîäåðæàíèåì àêòèâíîé ôîðìû.
Î÷èñòêó ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX ïðîâîäÿò ñòàíäàðòíûìè õðîìàòîãðàôè÷åñêèìè ìåòîäàìè. Ïîñëå ïðîöåññà ôåðìåíòàöèè êëåòêè
îòäåëÿþò îò êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè ìåòîäîì
òàíãåíöèàëüíîé ôèëüòðàöèè. Îñíîâíûìè ýòàïàìè ïðîöåññà âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè â ðàáîòå
[62] ÿâëÿþòñÿ:
l î÷èñòêà ôàêòîðà IX ïñåâäî-àôôèííîé õðîìàòîãðàôèåé íà Q-Sepharose FF (GE
Healthcare, Øâåöèÿ), ïðè êîòîðîé ñîðáöèÿ
îñóùåñòâëÿåòñÿ â êëàññè÷åñêîì ðåæèìå èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè íà àíèîíèòå, à
äåñîðáöèÿ - çà ñ÷åò êîíôîðìàöèîííûõ èçìåíåíèé ìîëåêóëû ôàêòîðà IX ïðè ñíèæåíèè
êîíöåíòðàöèè õëîðèäà êàëüöèÿ äî 10 ìÌ;
l äëÿ íàèáîëåå ïîëíîé î÷èñòêè ôàêòîðà IX îò
ïðèìåñíûõ áåëêîâ èñïîëüçóþò õðîìàòîãðàôèþ íà ñîðáåíòå Matres Cellufine Sulfate
(Chisso, ßïîíèÿ), êîòîðûé ÿâëÿåòñÿ àíàëîãîì ñîðáåíòà ñ èììîáèëèçîâàííûì ãåïàðèíîì;
l õðîìàòîãðàôèÿ íà ãèäðîêñèàïàòèòíîé êåðàìèêå, ïðèìåíÿåìàÿ äëÿ îòäåëåíèÿ íåàêòèâíûõ ôîðì ôàêòîðà IX è îñòàâøèõñÿ ïðèìåñåé, à òàêæå äëÿ çàìåíû áóôåðà;
l îêîí÷àòåëüíàÿ î÷èñòêà áåëêà ìåòîäîì ìåòàëë-õåëàòíîé àôôèíîé õðîìàòîãðàôèè;
l ñî÷åòàíèå ñòàäèé óëüòðàôèëüòðàöèè/äèàôèëüòðàöèè äëÿ êîíöåíòðèðîâàíèÿ è ïåðåáóôåðèðîâàíèÿ ôàêòîðà IX.
Òàêèì îáðàçîì, ðåêîìáèíàíòíûå ïðåïàðàòû áåçîïàñíû ñ ýïèäåìèîëîãè÷åñêîé òî÷êè çðåíèÿ, çíà÷èòåëüíî ñíèæàþò ðèñê ïàòîãåííûõ
êîíòàìèíàöèé, âîçíèêàþùèé â ñëó÷àå êîììåð÷åñêèõ ïðåïàðàòîâ âûñîêîé ÷èñòîòû, ïîëó÷åííûõ èç äîíîðñêîé êðîâè.
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
7. ÔÎËËÈÒÐÎÏÈÍ
Ôîëëèêóëîñòèìóëèðóþùèé ãîðìîí (ôîëëèòðîïèí, ÔÑÃ) — ãëèêîïðîòåèä ñ ìîëåêóëÿðíîé
ìàññîé îêîëî 30 êÄà. Åãî ìîëåêóëà ñîñòîèò èç
a- è b-öåïåé (ñóáúåäèíèö): a-öåïü àíàëîãè÷íà
a-öåïè ëþòåèíèçèðóþùåãî ãîðìîíà (ËÃ) è íå
îáëàäàåò ãîðìîíàëüíîé àêòèâíîñòüþ. Ñïåöèôè÷åñêîå ãîðìîíàëüíîå äåéñòâèå ñâÿçàíî ñ b-öåïüþ, îäíàêî äëÿ ïðîÿâëåíèÿ ãîðìîíàëüíîé àêòèâíîñòè íåîáõîäèìû îáå ñóáúåäèíèöû.
ÔÑÃ ñåêðåòèðóåòñÿ áàçîôèëüíûìè êëåòêàìè àäåíîãèïîôèçà â îòâåò íà ñåêðåöèþ ãîíàäîòðîïèí-ðèëèçèíã ôàêòîðîâ ãèïîòàëàìóñà. Ó
æåíùèí ÔÑà êîíòðîëèðóåò öèêëè÷åñêèå èçìåíåíèÿ ÿè÷íèêîâ âî âðåìÿ íîðìàëüíîãî ìåíñòðóàëüíîãî öèêëà. Ñòåðîèäû ÿè÷íèêîâ ìîäåëèðóþò ñåêðåöèþ ÔÑÃ, êîòîðàÿ â ñâîþ î÷åðåäü ðåãóëèðóåò ìåíñòðóàëüíûé öèêë. Ó ìóæ÷èí ÔÑÃ,
ËÃ è òåñòîñòåðîí ñòèìóëèðóþò ñïåðìàòîãåíåç â
ñåìåííûõ êàíàëüöàõ ÿè÷åê.
Ôîëëèòðîïèí-a — ðåêîìáèíàíòíûé ÔÑÃ,
ïîëó÷åííûé ìåòîäîì ãåííîé èíæåíåðèè èç êëåòîê ÑÍÎ, ñòèìóëèðóåò îáðàçîâàíèå ôîëëèêóëîâ. Îäíèì èç ïðèìåðîâ ýêñïðåññèè ÔÑà ñ èñïîëüçîâàíèåì ðåêîìáèíàíòíîé òåõíîëîãèè ÿâëÿåòñÿ òðàíñôåêöèÿ ýóêàðèîòè÷åñêèõ êëåòîê ñ
ÄÍÊ ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ, êîäèðóþùåé a- è
b-ñóáúåäèíèöû ÔÑÃ.
7.1. Âåêòîð ýêñïðåññèè
ðåêîìáèíàíòíîãî ôîëëèòðîïèíà
Òàê êàê ÔÑÃ ñîñòîèò èç a- è b-ñóáúåäèíèö, òî
äëÿ ýêñïðåññèè îáåèõ ñóáúåäèíèö íåîáõîäèì
ëèáî îäèí âåêòîð, ñîäåðæàùèé ïðîìîòîð äëÿ
êàæäîé èç íèõ, ëèáî äâà âåêòîðà äëÿ êàæäîé
ñóáúåäèíèöû â îòäåëüíîñòè.
Êðîìå òîãî, êàæäûé âåêòîð ýêñïðåññèè ìëåêîïèòàþùèõ ñîäåðæèò ýëåìåíòû, êîòîðûå ìîãóò ïðèñóòñòâîâàòü íà îäíîì èëè íåñêîëüêèõ
âåêòîðàõ, âêëþ÷àÿ ýíõàíñåðû è ïðîìåæóòî÷íûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè â îêðóæåíèè äîíîðíûõ è àêöåïòîðíûõ ñàéòîâ ñïëàéñèíãà äëÿ
ÐÍÊ [63].
Âûñîêîýôôåêòèâíàÿ òðàíñêðèïöèÿ ìîæåò
áûòü äîñòèãíóòà ïî ñðåäñòâàì ïðîìîòîðîâ èç
SV40, äëèííûõ êîíöåâûõ ïîâòîðîâ îò ðåòðîâèðóñîâ, íàïðèìåð, RSV, HTLVI, HIVI è ïðîìîòîðà öèòîìåãàëîâèðóñà (ÖÌÂ). Òàêæå ìîãóò áûòü
èñïîëüçîâàíû êëåòî÷íûå ýëåìåíòû (íàïðèìåð,
÷åëîâå÷åñêèé ïðîìîòîð àêòèíà).  êà÷åñòâå
êëåòîê-õîçÿèíà ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû êëåòêè ìëåêîïèòàþùèõ, ñîäåðæàùèå ÷åëîâå÷åñêèé
Hela 293, H9 è Jurkat, ìûøèíûé NIH3T3 è
C127, êëåòêè Cos 1 Cos 7 è CV 1, ïåðåïåëèíûå
QC1 – 3, êëåòêè ìûøåé L è êëåòêè ÑÍÎ.
Òðàíñôåêòíàÿ ÄÍÊ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü
äëÿ ñóáúåäèíèö ìîæåò áûòü óñèëåíà äëÿ òîãî,
÷òîáû òðàíñëèðîâàòü áîëüøåå êîëè÷åñòâî çàêîäèðîâàííîãî ïîëèïåïòèäà. Ìàðêåð DHFR (äèãèäðîôîëàòðåäóêòàçà) íåîáõîäèì äëÿ ðàçðàáîòêè êëåòî÷íûõ ëèíèé, êîòîðûå ïåðåíîñÿò íåñêîëüêî ñîòåí èëè äàæå íåñêîëüêî òûñÿ÷ êîïèé
ÄÍÊ. Ôåðìåíò ãëþòàìèí ñèíòàçû (GS) òàêæå
ÿâëÿåòñÿ íåîáõîäèìûì [64]. Èñïîëüçóÿ ýòè ìàðêåðû, êëåòêè ìëåêîïèòàþùèõ ðàñòóò â ñåëåêòèâíûõ ñðåäàõ, à çàòåì èç íèõ âûäåëÿþòñÿ
êëåòêè ñ âûñîêîé ðåçèñòåíòíîñòüþ. Ýòè êëåòî÷íûå ëèíèè ñîäåðæàò óñèëåííûé ãåí, èíòåãðèðîâàííûé â õðîìîñîìó. Êëåòêè ÑÍÎ ÷àñòî èñïîëüçóåòñÿ äëÿ ïðîèçâîäñòâà áåëêîâ è ïîëèïåïòèäîâ.
Ýêñïðåññèîííàÿ ïëàçìèäà äëÿ ÔÑÃ ïðîèçâîäèòñÿ
êëîíèðîâàíèåì
êîìïëåìåíòàðíîé
ÄÍÊ, êîäèðóþùåé ÔÑÃ â âåêòîð ýêñïðåññèè
pcDNAI / Amp èëè pcDNAIII (êîòîðàÿ ìîæåò
áûòü ïîëó÷åíà îò Invitrogen, Inc., ÑØÀ) Êàê
óïîìèíàëîñü ðàíåå, êàæäàÿ ñóáúåäèíèöà òðåáóåò ýêñïðåññèè äëÿ ïîëó÷åíèÿ ôóíêöèîíàëüíîãî
ãåòåðîäèìåðà ëèáî èç íåçàâèñèìîãî ââåäåíèÿ
îòäåëüíûõ âåêòîðîâ â êëåòêè-õîçÿèíà, ëèáî èç
îäíîãî âåêòîðà, ýêñïðåññèðóþùåãî a- è b-ñóáúåäèíèöû.
Êàññåòà âåêòîðà ýêñïðåññèè ñîäåðæèò êîäèðóþùèå ÄÍÊ ïîñëåäîâàòåëüíîñòè äëÿ a-ñóáúåäèíèöû — SEQ ID NO: 5; äëÿ a-ñóáúåäèíèöû —
SEQ ID NO: 11 è íàõîäÿòñÿ ïîä êîíòðîëåì äâóõ
ðàçíûõ ïðîìîòîðîâ: CMV äëÿ b-ñóáúåäèíèöû è
EF1 äëÿ á-ñóáúåäèíèöû. Êàæäàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü a- è b-ñóáúåäèíèöû èñïîëüçóåò áû÷èé ãîðìîí ðîñòà ïîëèÀ. Êðîìå òîãî, âåêòîð ñîäåðæèò ãåí ãëóòàìèí ñèíòåòàçû, óïðàâëÿåìûé
ïðîìîòîðîì SV40 è ñîäåðæàùèé õâîñò ïîëèÀ
SV40, è èñïîëüçóåòñÿ â êà÷åñòâå ñåëåêòèâíîãî
ìàðêåðà. Ýòîò âåêòîð áûë èñïîëüçîâàí äëÿ
òðàíñôåêöèè CHO-Ê1 êëåòîê [65].
Ëèíèÿ êëåòîê âûðàùèâàåòñÿ â GibcoBRL
CD ÑÍÎ ïîä ñåëåêòèâíûì äàâëåíèåì L-ìåòèîíèí ñóëüôîêñèìèíà. ÈÔÀ èñïîëüçóåòñÿ äëÿ îïðåäåëåíèÿ ÔÑÃ.
7.2. Î÷èñòêà ðåêîìáèíàíòíîãî ÔÑÃ
Î÷èñòêà ãåòåðîäèìåðà ÔÑÃ, ñîñòîÿùåãî èç a- è
b-ñóáúåäèíèö, ìîæåò áûòü îñóùåñòâëåíà èç ìîíîñëîÿ èëè ñóñïåíçèîííîé êóëüòóðû êëåòîê
CHO-Ê1 ðÿäîì ìåòîäîâ. Óêàçàííûì íèæå ñïîñîáîì î÷èñòêè ìîæíî ïîëó÷èòü ðåêîìáèíàíòíûé ÔÑà ìàêñèìàëüíî âûñîêîé ÷èñòîòû, êîòîðûé ìîæåò áûòü ïðåäñòàâëåí â ãîòîâîì ëåêàðñòâåííîì
ñðåäñòâå,
íàïðèìåð,
Ãîíàë-Ô
(Serono-Merck, Ãåðìàíèÿ, Øâåéöàðèÿ). Ýòîò
ìåòîä èìååò ïðåèìóùåñòâî îáåñïå÷èâàòü âûñî-
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
37
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
êóþ ñòåïåíü ÷èñòîòû áåç èñïîëüçîâàíèÿ èììóíîàôôèííîé õðîìàòîãðàôèè [66].
Àíòèîêñèäàíò ïðèñóòñòâóåò â ëþáîì èç áóôåðîâ, èñïîëüçóåìûõ äëÿ î÷èñòêè è / èëè êîíöåíòðàöèè è / èëè ôèëüòðîâàíèè ÔÑÃ. Àíòèîêñèäàíò ïðåäîòâðàùàåò îêèñëåíèå ÔÑà âî âðåìÿ
îáðàáîòêè. Ïðåäïî÷òèòåëüíûì àíòèîêñèäàíòîì ÿâëÿåòñÿ L-ìåòèîíèí, êîòîðûé ïðåäïî÷òèòåëüíî
èñïîëüçîâàòü
â
êîíöåíòðàöèè
10 – 100 ìÌ. Òàêæå â êà÷åñòâå àíòèîêñèäàíòîâ
ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí òðåò-áóòèë-4-ìåòîêñèôåíîë, 2,6-áèñ(1,1-äèìåòèëýòèë)-4-ìåòèëôåíîë,
áèìåòàáèñóëüôèò íàòðèÿ èëè êàëèÿ, áèñóëüôèò
íàòðèÿ. Ïðèìåðàìè ñâîáîäíûõ àìèíîêèñëîò è
äèïåïòèäîâ ñ àíòèîêñèäàíòíûì ýôôåêòîì ÿâëÿþòñÿ ãèñòèäèí, òàóðèí, ãëèöèí, àëàíèí, êàðíîçèí, 1-ìåòèëãèñòèäèí èëè èõ êîìáèíàöèè [67].
Êàê ïðàâèëî, èñõîäíûé ìàòåðèàë î÷èùàþò,
à çàòåì, ïî âîçìîæíîñòè, êîíöåíòðèðóþò, íàïðèìåð, óëüòðàôèëüòðàöèåé è äèàôèëüòðàöèåé.
Íà ñòàäèè î÷èñòêè ïðèìåíÿþò àôôèííóþ
õðîìàòîãðàôèþ ñ èñïîëüçîâàíèåì êðàñèòåëÿ
ãîëóáîãî (íàïðèìåð, Blue Dye Sepharose, GE
Healthcare, Øâåöèÿ), õðîìàòîãðàôèþ ãèäðîôîáíûõ âçàèìîäåéñòâèé (ÕÃÂ) è ÎÔ ÂÝÆÕ.
Ïåðâûì ýòàïîì ÿâëÿåòñÿ àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì êðàñèòåëÿ.  äàííîì ñëó÷àå îíà îñóùåñòâëÿåòñÿ ñ ïîìîùüþ ìàòðèöû, èìåþùåé â êà÷åñòâå èììîáèëèçîâàííûõ
ëèãàíäîâ øèðîêî èçâåñòíîå êðàñÿùåå ñîåäèíåíèå, Cibacron Ñèíèé F3G-A.
Õðîìàòîãðàôèÿ òàêæå ìîæåò áûòü âûïîëíåíà ñ àëüòåðíàòèâíûìè âèäàìè ìàòðèö, èìåþùèìè àíàëîãè÷íûå õàðàêòåðèñòèêè. Ïðèìåðàìè àëüòåðíàòèâíûõ ìàòðèö ÿâëÿþòñÿ: Toyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh, ßïîíèÿ), Toyopearl SuperButyl 550 (Tosoh), Toyopearl Phenyl
650 (Tosoh), ñèíèé Cellthru BigBead (Sterogene,
ÑØÀ), SwellGel Blue (Pierce, ÑØÀ), Cibachrome
Blue3GA-àãàðîçû 100 (Sigma, Ãåðìàíèÿ), AffiGel Blue (Bio-Rad, ÑØÀ), Econo-Pac blue cartridges (Bio-Rad), Blue sepharose HP (GE Healthcare), Cibacron Ñèíèé 3GA (Sigma).
Êóëüòóðó êëåòîê, ñîäåðæàùóþ ÔÑÃ, íàíîñÿò íåïîñðåäñòâåííî íà ìàòðèöó. Ïîñëå íàíåñåíèÿ ñîðáåíò ïðîìûâàþò óðàâíîâåøèâàþùèì
áóôåðîì, à çàòåì ýëþèðóþò ôîñôàòíûì áóôåðîì, ïðåäïî÷òèòåëüíåå ôîñôàòîì íàòðèÿ;
pH ýëþåíòà ïîääåðæèâàþò 6,0 – 8,0. Áóôåð äëÿ
ýëþèðîâàíèÿ äîëæåí ñîäåðæàòü ñîëè, ïðåäïî÷òèòåëüíî NaCl, äëÿ óâåëè÷åíèÿ ïðîâîäèìîñòè,
à òàêæå àíòèîêñèäàíò, íàïðèìåð L-ìåòèîíèí.
Ïåðâûé ýòàï î÷èñòêè îñóùåñòâëÿåòñÿ ïðè
2 – 8 °Ñ.
Âòîðîé øàã — ÕÃÂ. Â ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå ÕÃÂ îñóùåñòâëÿþò íà ñîðáåíòå áóòèë
38
Toyopearl 650M (Tosoh) ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå.
Òàêæå ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû àëüòåðíàòèâíûå òèïû ìàòðèö, èìåþùèå àíàëîãè÷íûå
õàðàêòåðèñòèêè: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow;
Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl Sepharose 4
Fast Flow; Source 15PHE (GE Healthcare).
Ñâÿçûâàíèå â ÕÃÂ ïðîâîäÿò â áóôåðå ñ âûñîêîé ïðîâîäèìîñòüþ (âûñîêîé êîíöåíòðàöèåé
NaCl, (NH4)2SO4 èëè Na2SO4). Ýëþèðóþò íà ýòàïå Õàïðåèìóùåñòâåííî çà ñ÷åò ñíèæåíèÿ
ïðîâîäèìîñòè ïîäâèæíîé ôàçû (ñíèæåíèÿ êîíöåíòðàöèè ñîëåé) áóôåðîì ñ pH 6 – 8, ïðè÷åì
íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíî çíà÷åíèå äëÿ
pH îêîëî 7,0.  êà÷åñòâå áóôåðà èñïîëüçóþò
ôîñôàò íàòðèÿ èëè ñóëüôàò àììîíèÿ, òàêæå áóôåð äîëæåí ñîäåðæàòü àíòèîêñèäàíò, íàïðèìåð
L-ìåòèîíèí.
Çàêëþ÷èòåëüíûì ýòàïîì ÿâëÿåòñÿ ÎÔ
ÂÝÆÕ, êîòîðóþ ïðåäïî÷òèòåëüíî ïðîâîäèòü íà
ñîðáåíòå SOURCE 30 RPC (GE Healthcare) ïðè
êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå ñ èñïîëüçîâàíèåì ñëåãêà ùåëî÷íîé ìîáèëüíîé áóôåðíîé ôàçû, íàïðèìåð àöåòàòà àììîííèÿ, pH 7,0 – 8,5. Áóôåðíûé ðàñòâîð íà äàííîì ýòàïå î÷èñòêè ñîäåðæèò
îðãàíè÷åñêèå ìîäèôèêàòîðû, êîíöåíòðàöèÿ
êîòîðûõ èçìåíÿåòñÿ äëÿ ðàçëè÷íûõ ýòàïîâ õðîìàòîãðàôèè (óðàâíîâåøèâàíèå êîëîíêè, íàíåñåíèå îáðàçöà, ýëþèðîâàíèå è ðåãåíåðàöèÿ). Â
êà÷åñòâå îðãàíè÷åñêèõ ìîäèôèêàòîðîâ èñïîëüçóþò âîäîðàñòâîðèìûå îðãàíè÷åñêèå ðàñòâîðèòåëè, íàïðèìåð ñïèðòû (ìåòàíîë, ýòàíîë è äð.),
÷àùå âñåãî èçîïðîïàíîë.
Äîïîëíèòåëüíî òàêæå ïðîâîäÿò î÷èñòêó ìåòîäîì àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè, ãäå â
êà÷åñòâå ñîðáåíòà èñïîëüçóþò Q Sepharose FF
(GE Healthcare).
Èîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ ïðåäïî÷òèòåëüíî ïðîâîäèòü ñ èñïîëüçîâàíèåì áóôåðà ñ
óìåðåííî ùåëî÷íîé ñðåäîé (pH îêîëî 8,5). Ïîäõîäÿùèìè áóôåðàìè ÿâëÿþòñÿ, íàïðèìåð, áîðàòíûé áóôåð, òðèýòàíîëàìèí/Tris, àöåòàò àììîíèÿ, áèöèí, TES, HEPES. Íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíûì ÿâëÿåòñÿ áîðàòíûé áóôåð, pH 8,5.
Ýëþèðîâàíèå äîñòèãàåòñÿ çà ñ÷åò óâåëè÷åíèÿ
ýëåêòðîïðîâîäíîñòè ïîäâèæíîé ôàçû çà ñ÷åò
äîáàâëåíèÿ ñîëè NaCl.
Äî øàãà èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè, ìîæåò áûòü ïðîâåäåíà óëüòðàôèëüòðàöèÿ (èëè
äèàôèëüòðàöèÿ), êîòîðóþ ïðåäïî÷òèòåëüíî
ïðîâîäèòü ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåìáðàí ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 8 êÄà ïðè 2 – 8 °Ñ.
Äîïîëíèòåëüíî ïðîâîäÿò åùå îäèí øàã î÷èñòêè — âòîðîé ýòàï àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè.
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
 êà÷åñòâå ïîëèìåðà èñïîëüçóþò Fractogel
EMD TMAE HICAP (Merck, Ãåðìàíèÿ). Êðîìå
òîãî, âòîðîé ýòàï àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè
ìîæåò áûòü îñóùåñòâëåí íà Q Sepharose FF.
Äîïîëíèòåëüíûì ýòàïîì âûäåëåíèÿ ÿâëÿåòñÿ óëüòðàôèëüòðàöèÿ/äèàôèëüòðàöèÿ [68].
 îäíîì èç ìåòîäîâ î÷èñòêè ïîñëå ëþáîé èç
ñòóïåíåé õðîìàòîãðàôèè (îñîáåííî ïîñëå ÎÔ
ÂÝÆÕ) îáðàçåö ÔÑÃ ïîäâåðãàþò êîíöåíòðèðîâàíèþ ïðåäïî÷òèòåëüíî óëüòðàôèëüòðàöèåé,
ïðîâîäèìîé ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåìáðàí ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 5 êÄà.
Âñå ïåðå÷èñëåííûå ýòàïû î÷èñòêè ÔÑà æåëàòåëüíî ïðîâîäèòü â ñëåäóþùåì ïîðÿäêå:
1. Óëüòðàôèëüòðàöèÿ (ìåìáðàíà ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 8 êÄà).
2. Àíèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (ñ èñïîëüçîâàíèåì Q Sepharose FF).
3. Àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì êðàñèòåëÿ (Blue Dye Sepharose FF).
4. ÕÃÂ ñ èñïîëüçîâàíèåì Phenyl Toyoperl
650M.
5. ÎÔ ÂÝÆÕ (Source 30RPC).
6. Àíèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (Fractogel END TMAE HICAP).
7. Óëüòðàôèëüòðàöèÿ (ìåìáðàíà ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 5 êÄà).
Äëÿ óäàëåíèÿ âèðóñîâ, ñíèæåíèÿ ðèñêà çàãðÿçíåíèÿ ÔÑà âèðóñàìè èç êëåòî÷íîé êóëüòóðû íåîáõîäèìî ïðîâîäèòü íàíîôèëüòðàöèþ. Åå
ìîæíî ñäåëàòü íà ëþáîé ñòàäèè ïðîöåññà î÷èñòêè ïðè 2 – 8 °Ñ, îäíàêî ëîãè÷íåå âñåãî ïîñëå
2-ãî ýòàïà èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè èëè
ïîñëå ÎÔ ÂÝÆÕ [67].
Î÷èùåííûå ôðàêöèè ÔÑà çàìîðàæèâàþò è
ëèîôèëèçèðóþò äëÿ ïîëó÷åíèÿ ïîëíîöåííîé
ÀÔÑ [69].
èçáàâèòñÿ îò ïðèìåñåé, ñâÿçàííûõ ñ òåõíîëîãè÷åñêèì ïðîöåññîì [73].
8. ÌÎÍÎÊËÎÍÀËÜÍÛÅ ÀÍÒÈÒÅËÀ
8.1.1 Ïîëó÷åíèå ÌÀÁ
Îñîáóþ ãðóïïó òåðàïåâòè÷åñêèõ áåëêîâ ñîñòàâëÿþò ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà (ÌÀÁ) áëàãîäàðÿ îñîáåííîñòÿì èõ ñòðîåíèÿ è ïðîèçâîäñòâà.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ðàçðàáîòàí îáùèé ïîäõîä ê
ïðîèçâîäñòâó è î÷èñòêå ÌÀÁ, êîòîðûå ìîãóò
áûòü ïîëó÷åíû ñ èñïîëüçîâàíèåì ãèáðèäîìíîé
òåõíîëîãèè (êàê, íàïðèìåð, Öåòóêñèìàá), à òàêæå ñ ïîìîùüþ ëèíèé êëåòîê ÑÍÎ, ñîäåðæàùèõ
âåêòîð ýêñïðåññèè öåëåâîãî áåëêà (Ðèòóêñèìàá,
Ãåðöåïòèí).
Î÷èñòêà îñóùåñòâëÿåòñÿ ñî÷åòàíèåì ìåòîäîâ âèðóñíîé àêòèâàöèè è õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ
ìåòîäîâ. Ïðåæäå âñåãî ýòî àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ äëÿ çàõâàòà ðåêîìáèíàíòíûõ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë èç êóëüòóðàëüíîé ñðåäû è
èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ, ïîçâîëÿþùàÿ
8.1. Öåòóêñèìàá
Öåòóêñèìàá (ëàòèíñêîå íàçâàíèå Erbitux ) ðàçðàáîòàí Merck KGaA (Ãåðìàíèÿ) è ImClone
Systems Incorporated/Bristol-Myers Squibb (ÑØÀ)
äëÿ ëå÷åíèÿ íåêîòîðûõ âèäîâ ðàêà ó ÷åëîâåêà, â
òîì ÷èñëå êîëîðåêòàëüíîãî ðàêà, ïëîñêîêëåòî÷íîãî ðàêà ãîëîâû è øåè, ðàêà íîñîãëîòêè, ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû, ðàêà ÿè÷íèêîâ è íåìåëêîêëåòî÷íîãî ðàêà ëåãêîãî. Ñòîèìîñòü ëå÷åíèÿ
äàííûì ïðåïàðàòîì îáõîäèòñÿ ïàöèåíòàì ïðèìåðíî â 30 000$ â òå÷åíèå âîñüìè íåäåëü êîìïëåêñíîãî ëå÷åíèÿ [69].
Öåòóêñèìàá ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ðåêîìáèíàíòíûå ÌÀÁ, êîòîðûå ñïåöèôè÷åñêè ñâÿçûâàþòñÿ ñ âíåêëåòî÷íûì äîìåíîì ÷åëîâå÷åñêîãî
ðåöåïòîðà ýïèäåðìàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà
(EGFR, HER1, ErbB1) [70, 71]. Ðåöåïòîð ýïèäåðìàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà ÿâëÿåòñÿ êëèíè÷åñêè ïîäòâåðæäåííîé ìîëåêóëÿðíîé «ìèøåíüþ». Ñâÿçûâàíèå Öåòóêñèìàáà ñ ðåöåïòîðîì
âûçûâàåò äèìåðèçàöèþ ðåöåïòîðà, ýíäîöèòîç è
ðàçðóøåíèå êîìïëåêñà àíòèòåëî–àíòèãåí, â ðåçóëüòàòå ÷èñëî ðåöåïòîðîâ íà ïîâåðõíîñòè îïóõîëåâîé êëåòêè óìåíüøàåòñÿ [72].
Öåòóêñèìàá ñîñòîèò èç âàðèàáåëüíûõ ôðàãìåíòîâ ìûøèíûõ àíòèòåë è òÿæåëûõ è ëåãêèõ
öåïåé ÷åëîâå÷åñêîãî IgGl è ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé
÷åòûðå ïîëèïåïòèäíûå öåïè: äâå èäåíòè÷íûå
òÿæåëûå (g) öåïè, êàæäàÿ èç êîòîðûõ ñîñòîèò èç
449 à.î.; äâå èäåíòè÷íûå ëåãêèå (k) öåïè, êàæäàÿ èç êîòîðûõ ñîñòîèò èç 214 à.î.  ñòðóêòóðå
öåïåé ïðèñóòñòâóåò ôóíêöèîíàëüíûé äîìåí
ìûøèíîãî àíòèòåëà (Ì225) ê ðåöåïòîðó ýïèäåðìàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà ÷åëîâåêà. Ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà àíòèòåëà îêîëî 152 êÄà.
Öåòóêñèìàá ïðîèçâîäÿò â êëåòî÷íîé ëèíèè ìûøèíîé ìèåëîìû. Ãèáðèäíàÿ êëåòî÷íàÿ ëèíèÿ,
ïîëó÷åííàÿ â ðåçóëüòàòå ñëèÿíèÿ êëåòîê äâóõ
âèäîâ, ñïîñîáíûõ ê îáðàçîâàíèþ àíòèòåë, òàêèõ
êàê Â-ëèìôîöèòû èììóíèçèðîâàííîãî æèâîòíîãî è ðàêîâûõ êëåòîê ìèåëîìû, ïîëó÷èëà íàçâàíèå ãèáðèäîìà.
Êëåòêè ïîñëå ñëèÿíèÿ ïîääåðæèâàþò â ñðåäå, ñîäåðæàùåé ÍÀÒ, â òå÷åíèå 10 – 14 äíåé.
Àìèíîïòåðèí áëîêèðóåò ñèíòåç íóêëåîòèäîâ,
ïîýòîìó êëåòêè ìàòåðèíñêîé ìèåëîìû ïîãèáàþò.  îòëè÷èå îò ìèåëîìû, ãèáðèäíûå êëåòêè è
Â-ëèìôîöèòû, èìåþùèå ãåí ã-ãëóòàìèëòðàíñôåðàçû, âûæèâàþò çà ñ÷åò èñïîëüçîâàíèÿ ãèïîêñàíòèíà êàê èñòî÷íèêà ïóðèíîâ, íî ïîñêîëüêó ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè îáû÷íûõ ëèìôîöèòîâ îãðàíè÷åíà, ÷åðåç íåñêîëüêî íåäåëü â
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
39
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
äû áîëüøåé åìêîñòè äëÿ ðàçìíîæåíèÿ,
õðàíåíèÿ â æèäêîì àçîòå è ïîëó÷åíèÿ áîëüøåãî
êîëè÷åñòâà àíòèòåë äëÿ äàëüíåéøèõ èññëåäîâàíèé. Èç êóëüòóðàëüíîé ñðåäû ìîæíî ïîëó÷èòü
îò 1 äî 60 ìã/ìë ÌÀÁ. Áîëüøåå êîëè÷åñòâî
ìîæíî ïîëó÷èòü ââåäåíèåì êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè â áðþøíóþ ïîëîñòü ìûøåé, ãäå ãèáðèäîìà
ðàçìíîæàåòñÿ ïîäîáíî ðàêîâûì êëåòêàì ìàòåðèíñêîé ìèåëîìû, ñåêðåòèðóÿ àíòèòåëà âî
âíóòðèïîëîñòíóþ æèäêîñòü ñ îáðàçîâàíèåì àñöèòà.
 îáùåì âèäå ãèáðèäîìíàÿ òåõíîëîãèÿ ïîêàçàíà íà ðèñ. 4.
8.1.2. Âûäåëåíèå è î÷èñòêà öåëåâîãî ïðîäóêòà
Ðèñ. 4. Ñõåìà ãèáðèäîìíîé òåõíîëîãèè: 1 — èììóíèçàöèÿ æèâîòíûõ; 2 — âûäåëåíèå Â-ëèìôîöèòîâ èç ñåëåçåíêè; 3 — êóëüòóðà êëåòîê ìèåëîìû; 4 — ñëèÿíèå
Â-ëèìôîöèòîâ è êëåòîê ìèåëîìû; 5 — ñåãðåãàöèÿ
êëåòî÷íûõ ëèíèé; 6 — ñêðèíèíã è ñåëåêöèÿ ëèíèé,
ïðîèçâîäÿùèõ àíòèòåëà; 7 — ðàçìíîæåíèå ãèáðèäîìû in vitro èëè in vivo; 8 — ïîëó÷åíèå àíòèòåë.
êóëüòóðå îñòàþòñÿ òîëüêî êëåòêè ãèáðèäîìû.
Ïîñêîëüêó íå âñå èç íèõ îáðàçîâàíû ñëèÿíèåì
ìèåëîìû ñ ëèìôîöèòàìè, ïðîèçâîäÿùèìè íóæíûå àíòèòåëà, êëåòêè äåëÿò íà ëèíèè, êîòîðûå
ïîääåðæèâàþò â îòäåëüíûõ ÿ÷åéêàõ 96-ëóíî÷íûõ ïëàøåê. Äàëåå îòáðàêîâûâàþò êëåòî÷íûå
ëèíèè, íå ïðîèçâîäÿùèå àíòèòåëà èëè íåäîñòàòî÷íî áûñòðî ðàçìíîæàþùèåñÿ. Ïðè äîñòàòî÷íî õîðîøåì ðàçâåäåíèè êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè â
îäíó ëóíêó ïîïàäàåò íå áîëåå îäíîé ãèáðèäíîé
êëåòêè, íî äëÿ ãàðàíòèðîâàííîãî êà÷åñòâà è
ñòàáèëüíîñòè êóëüòóðû îòîáðàííûå êëåòî÷íûå
ëèíèè ìîãóò åùå ðàç êëîíèðîâàíû ñ òåì, ÷òîáû
àíòèòåëà ïðîèçâîäèëèñü ïîòîìêàìè îäíîé ãèáðèäíîé êëåòêè, ò.å. áûëè ìîíîêëîíàëüíûìè.
Êëîíèðîâàííóþ êóëüòóðó ãèáðèäîìû çàòåì ïåðåñåâàþò èç ëóíêè 96-ëóíî÷íîé ïëàøêè â ñîñó-
40
Êëåòî÷íóþ êóëüòóðó î÷èùàþò ñ ïîìîùüþ ïîäõîäÿùèõ îäíîðàçîâûõ öåëëþëîçíûõ ôèëüòðîâ
ñ ýôôåêòèâíîé ïëîùàäüþ ôèëüòðàöèè 650 –
1000 ñì2 è ñ ðàáî÷èì äàâëåíèåì íå áîëåå 2 áàð.
Ôèëüòðàò ïðîâåðÿþò íà ìóòíîñòü è ñîäåðæàíèå
öåëåâîãî áåëêà. Äëÿ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè
èñïîëüçóþò ñîðáåíò ñ èììîáèëèçîâàííûì áåëêîì À, àôôèííûì ê ëþáîìó IgG-ïîäîáíîìó àíòèòåëó. Ïîñëå òîãî êàê îáðàçåö íàíåñëè íà
êîëîíêó, åå ïðîìûâàþò óðàâíîâåøèâàþùèì áóôåðîì (Òðèñ-ÍÑl, pH 7,2 – 7,6), çàòåì áóôåðíûì ðàñòâîðîì 50 ìÌ Òðèñ-ÍCl, 250 ìÌ NaCl,
pH 7,4. Áåëîê ýëþèðóþò öèòðàòíûì áóôåðîì,
ýëþàò âûäåðæèâàþò ïðè êèñëîì çíà÷åíèè pH â
òå÷åíèå 45 – 60 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå äëÿ âèðóñíîé èíàêòèâàöèè, çàòåì íåéòðàëèçóþò. Àíèîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ ïðîâîäÿò äëÿ óäàëåíèÿ ïðèìåñåé, ñâÿçàííûõ ñ òåõíîëîãè÷åñêèì ïðîöåññîì, òàêèõ êàê áåëîê À,
âûìûâøèéñÿ ñ ñîðáåíòà â õîäå àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè, ÄÍÊ è áåëêè êëåòîê-õîçÿèíà. Êîëîíêó óðàâíîâåøèâàþò Òðèñ-áóôåðîì, pH
6,8 – 7,2. Äàëåå ñëåäóåò ñòàäèÿ íàíîôèëüòðàöèè äëÿ óäàëåíèÿ âèðóñîâ è ïåðåáóôåðèðîâàíèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì òàíãåíöèàëüíîé ôèëüòðàöèè íà 50 êÄà ìåìáðàíàõ. Äëÿ óëüòðàôèëüòðàöèè èñïîëüçóþò Òðèñ-áóôåð, pH 6,8 – 7,2.
Çàòåì ïðîâîäÿò êàòèîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ áåëêîâîãî ðàñòâîðà ïîñëå óðàâíîâåøèâàíèÿ êîëîíêè Òðèñ-áóôåðîì, pH 6,8 – 7,2. Áåëîê
ýëþèðóþò áóôåðîì ñ èñïîëüçîâàíèåì ãðàäèåíòà NaCl äëÿ óäàëåíèÿ ïðèìåñåé, ñâÿçàííûõ ñ
òåõíîëîãè÷åñêèì ïðîöåññîì. ×èñòûå ôðàêöèè
îáúåäèíÿþò, ïåðåáóôåðèðóþò è êîíöåíòðèðóþò ñ èñïîëüçîâàíèåì òàíãåíöèàëüíîé ôèëüòðàöèè íà ìåìáðàíàõ ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 50 êÄà.
8.2. Ãåðöåïòèí
Ãåðöåïòèí (òðàñòóçóìàá, ðãÌÀò HER2) — ãóìàíèçèðîâàííîå ÌÀÁ ê ðåöåïòîðó 2 äëÿ ýïèäåðìàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). Ãåðöåïòèí ñïî-
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
ñîáåí óãíåòàòü ãèïåðýêñïðåññèþ HER2, íàáëþäàþùóþñÿ ó áîëüíûõ îíêîëîãèåé, ÷òî ïðèâîäèò
ê ïîäàâëåíèþ ïðîöåññîâ ïðîëèôåðàöèè îïóõîëåâûõ êëåòîê, èõ ìåòàñòàçèðîâàíèÿ, èíäóêöèè
ìåõàíèçìà àïîïòîçà êëåòîê-ìèøåíåé [74].
Ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà ãåðöåïòèíà îêîëî
145 êÄà. Ãåðöåïòèí îáû÷íî ñîñòîèò èç ñìåñè
íåñêîëüêèõ âèäîâ àíòèòåë è ðàçëè÷íûõ èõ
ôîðì, â îñîáåííîñòè êèñëûõ âàðèàíòîâ (äåçàìèäèðîâàííûõ ôîðì). Æåëàòåëüíî, ÷òîáû êîëè÷åñòâî òàêèõ êèñëîòíûõ ôîðì â ñîñòàâå íå
ïðåâûøàëî 25 % [75, 76].
Ñóùåñòâóåò ìåòîä ïðîèçâîäñòâà ãåðöåïòèíà
ñ èñïîëüçîâàíèåì ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûõ ðàñòåíèé. Ýòîò ìåòîä ïîçâîëÿåò îáåñïå÷èâàòü íèçêóþ ñåáåñòîèìîñòü, áåçîïàñíîñòü ïðîäóêòà, îäíàêî äàííûé ìåòîä ñëîæåí ââèäó íåîáõîäèìîñòè ïåðåðàáîòêè áîëüøîãî êîëè÷åñòâà
áèîìàññû [77].
Äðóãîé ìåòîä ïîëó÷åíèÿ àíòèòåëà îñíîâàí
íà èñïîëüçîâàíèè ãåííî-èíæåíåðíîé êóëüòóðû
êëåòîê CHO â áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäå. Ïðè ïîëó÷åíèè òðàñòóçóìàáà ñ ïîìîùüþ êëåòîê CHO
ãëàâíûé è ðàáî÷èé êëåòî÷íûå áàíêè àäàïòèðîâàíû ê ðîñòó â áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäå. Äëÿ ââåäåíèÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ÄÍÊ, êîäèðóþùåé
ïðîäóêöèþ òðàñòóçóìàáà, â êëåòêè CHO èñïîëüçóþò ñòàíäàðòíóþ ðåêîìáèíàíòíóþ ìåòîäèêó.
Ýôôåêòèâíî î÷èñòèòü ÌÀÁ ê HER-2 èç ñóïåðíàòàíòà êóëüòóðû êëåòîê ìîæíî ñ ïîìîùüþ
ñëåäóþùåé êîìáèíàöèè õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ
ìåòîäîâ [78]. Ïåðâûì ýòàïîì âûäåëåíèÿ ÿâëÿåòñÿ ñåëåêòèâíîå ñâÿçûâàíèå öåëåâîãî ñîåäèíåíèÿ ñî ñïåöèôè÷åñêèì àôôèííûì ñîðáåíòîì
(èììîáèëèçàöèÿ ãåëÿ áåëêîì À), çàòåì ýëþèðóþò öèòðàòíûì áóôåðîì ïðè pH 3,0 – 3,8 äëÿ
èíàêòèâàöèè âèðóñîâ ñ ïîñëåäóþùåé íåéòðàëèçàöèåé. Ïîñëå âûïîëíÿþò ïåðåáóôåðèðîâàíèå ñ ïðèìåíåíèåì òàíãåíöèàëüíîé ôèëüòðàöèè íà 50 êÄà ìåìáðàíàõ, äëÿ ýòîãî èñïîëüçóþò
Òðèñ-áóôåð ñ pH 6,8 – 7,2. ÌÀÁ ïîäâåðãàþò
äàëüíåéøåé î÷èñòêå ñ ïîìîùüþ èîíîîáìåííîé
õðîìàòîãðàôèè: èñïîëüçóþò êîëîíêó ñ àíèîíîîáìåííèêîì è Òðèñ-áóôåð â êà÷åñòâå ýëþåíòà,
pH 6,8 – 7,2, ïîñëå ÷åãî óäàëÿþò âèðóñû ñ ïîìîùüþ ñòàäèè íàíîôèëüòðàöèè. Çàâåðøàþùèì
ýòàïîì î÷èñòêè ÿâëÿåòñÿ èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà SP-Sepharose FF (GE Healthcare,
Øâåöèÿ).
Ñóùåñòâóåò ïîäõîä, âêëþ÷àþùèé â ñåáÿ
Õàäëÿ óäàëåíèÿ àãðåãàòîâ, ôðàãìåíòîâ è îñòàòî÷íûõ áåëêîâ CHO [79], ýëþèðóþò ãèñòèäèíîì è ïîëèñîðáàòîì, ïîñëå ÷åãî ôèëüòðóþò ÷åðåç 0,2 ìêì ïîëèýôèðñóëüôîíîâóþ ìåìáðàíó.
Ïîëó÷åííóþ ìàññó õðàíÿò â àñåïòè÷åñêèõ óñëî-
âèÿõ ïðè 2 – 8 °Ñ èëè â çàìîðîæåííîì ñîñòîÿíèè ïðè –20 °Ñ äî íà÷àëà ïðîöåññà ïåðåðàáîòêè
â ãîòîâóþ ïðîäóêöèþ. Äàëåå èçìåðÿþò êîíöåíòðàöèþ áåëêà, àíàëèçèðóþò ôèçè÷åñêóþ ñòàáèëüíîñòü, ñîäåðæàíèå ýíäîòîêñèíîâ, îñòàòêè
áåëêà À è ÄÍÊ êëåòîê-õîçÿèíà.
8.3. Ðèòóêñèìàá
Ðèòóêñèìàá — àêòèâíàÿ ôàðìàöåâòè÷åñêàÿ
ñóáñòàíöèÿ, âõîäÿùàÿ â ñîñòàâ êîììåð÷åñêîãî
ïðåïàðàòà MabThera®. Îíà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé
õèìåðíûå ÌÀÁ, ñîñòîÿùèå èç ãëèêîçèëèðîâàííîãî lgG1/k èììóíîãëîáóëèíà, ñîäåðæàùåãî
ëåãêèå è òÿæåëûå öåïè âàðèàáåëüíîãî ðåãèîíà
(Fab-äîìåíà) ìûøèíîãî ïðîèñõîæäåíèÿ è k/g1ïîñòîÿííîãî ðåãèîíà (Fc-äîìåí) ÷åëîâå÷åñêîãî
ïðîèñõîæäåíèÿ. Ðèòóêñèìàá ñâÿçûâàåòñÿ ñ
CD20 òðàíñìåìáðàííûì áåëêîì, ðàñïîëîæåííûì íà ïîâåðõíîñòè ïðå-B è çðåëûõ Â-êëåòîê,
÷òî âåäåò ê èõ ðàçðóøåíèþ è òåì ñàìûì îáóñëàâëèâàåò åãî áèîëîãè÷åñêîå äåéñòâèå. Ïðåïàðàò àïðîáèðîâàí äëÿ ëå÷åíèÿ çàáîëåâàíèé, õàðàêòåðèçóþùèõñÿ áîëüøèì êîëè÷åñòâîì àêòèâíûõ è äèñôóíêöèîíàëüíûõ B-êëåòîê, òàêèõ êàê
ëèìôîìû (íàïðèìåð, ôîëëèêóëÿðíàÿ CD20+
íåõîäæêèíñêàÿ ëèìôîìà) è àóòîèììóííûå çàáîëåâàíèÿ (íàïðèìåð, ðåâìàòîèäíûé àðòðèò).
MabThera ÿâëÿåòñÿ ýôôåêòèâíûì, êîììåð÷åñêè óñïåøíûì ïðåïàðàòîì, âûïóñêàåìûì
êîìïàíèåé «Ô. Õîôôìàíí-Ëÿ Ðîø Ëòä.», Øâåéöàðèÿ.
8.3.1. Ïîëó÷åíèå øòàììà-ïðîäóöåíòà
õèìåðíûõ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòè-CD20 àíòèòåë
Õèìåðíûå àíòè-CD20 àíòèòåëà íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíî ïîëó÷àòü ñ ïîìîùüþ CHO ëèíèé
êëåòîê, ïîäâåðãøèõñÿ òðàíñôåêöèè ñ ïîìîùüþ
ïðîöåäóðû ýëåêòðîïîðàöèè äëÿ ââåäåíèÿ âåêòîðà ýêñïðåññèè öåëåâîãî ïðîäóêòà [80].  êà÷åñòâå âåêòîðà ýêñïðåññèè ìîæåò áûòü âûáðàí
TCAE-âåêòîð (tandem chimeric antibody expression) [81], ñõåìà êîòîðîãî ïðåäñòàâëåíà íà
ðèñ. 5. Îí ñîäåðæèò NEO-ãåí, îòâå÷àþùèé çà
óñòîé÷èâîñòü êëåòîê ê àíòèáèîòèêó G418 è èñïîëüçóþùèéñÿ äëÿ îòáîðà ìóòàíòíûõ êëîíîâ, è
DHFR-ãåí äëÿ ðîñòà êëåòîê â ïðèñóòñòâèè ìåòîòðåêñàòà. Íàëè÷èå õèìåðíûõ àíòèòåë â êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè êîíòðîëèðóåòñÿ ñ ïîìîùüþ ìåòîäà ÈÔÀ; êîëîíèè êëåòîê, ïðîèçâîäÿùèå íàèáîëüøåå ÷èñëî àíòèòåë, âûñåâàþò íà
÷àøêè, ñîäåðæàùèå ïèòàòåëüíóþ ñðåäó ïëþñ
ìåòîòðåêñàò, ïîäïèòûâàþò êàæäûå äâà-òðè
äíÿ. Õèìåðíûå àíòè-CD20 àíòèòåëà î÷èùàþò
îò ñóïåðíàòàíòà ñ ïîìîùüþ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè; î÷èùåííûå àíòèòåëà àíàëèçèðóþò ñ
ïîìîùüþ ýëåêòðîôîðåçà â ïîëèàêðèëàìèäíîì
ãåëå.
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
41
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
Ðèñ. 5. Ñõåìàòè÷íîå èçîáðàæåíèå TCAE-âåêòðà ýêñïðåññèè, èñïîëüçóþùåãîñÿ äëÿ ïîëó÷åíèÿ àíòè-CD20 àíòèòåë â CHO-êëåòêàõ.
Íà äàííûé ìîìåíò â ëèòåðàòóðå ìîæíî íàéòè íåñêîëüêî ìåòîäîâ î÷èñòêè ìîíîêëîíàëüíûõ
àíòè-CD20 àíòèòåë. Âñå îíè âêëþ÷àþò â ñåáÿ
èììîáèëèçîâàííóþ áåëêîì À àôôèííóþ õðîìàòîãðàôèþ äëÿ ïåðâè÷íîãî âûäåëåíèÿ àíòèòåë
èç êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè è èîíîîáìåííóþ
õðîìàòîãðàôèþ äëÿ óäàëåíèÿ ïðèìåñåé, ñâÿçàííûõ ñ òåõíîëîãè÷åñêèì ïðîöåññîì.
Àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ ïîçâîëÿåò âûäåëèòü öåëåâîé ïðîäóêò èç êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè ñ ÷èñòîòîé 95 % [82].  êà÷åñòâå ñîðáåíòà
ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí áåëîê À, èììîáèëèçîâàííûé íà ñåôàðîçíîé ìàòðèöå ñ ðàçìåðîì ïîð
50 íì [83].
Êàòèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ äëÿ î÷èñòêè õèìåðíûõ àíòè-CD20 àíòèòåë ïîçâîëÿåò
èçáàâèòüñÿ îò òàêèõ ïðèìåñåé, êàê ÑÍÎ-áåëêè,
ñîäåðæàùèåñÿ â êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè; áåëîê A, âûìûâøèéñÿ ñ ñîðáåíòà â ïðîöåññå àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè; ÄÍÊ êëåòîê-õîçÿèíà;
àãðåãèðîâàííûõ àíòèòåë [84]. Îíà âêëþ÷àåò â
ñåáÿ â îáùåì âèäå íåñêîëüêî ïîñëåäîâàòåëüíûõ
øàãîâ:
à) íàíåñåíèå îáðàçöà â êîëîííó ïðè ïåðâîì
çíà÷åíèè pH;
42
á) ïðîìûâêà ìàòåðèàëà ïåðâûì áóôåðíûì
ðàñòâîðîì, pH êîòîðîãî âûøå, ÷åì â ï. à;
â) ïðîìûâêà ìàòåðèàëà âòîðûì áóôåðíûì
ðàñòâîðîì ñî çíà÷åíèåì pH ìåíüøå, ÷åì â ï. á;
ã) ýëþöèÿ àíòèòåë ñ ñîðáåíòà áóôåðîì ñî
çíà÷èòåëüíî áîëüøåé ïðîâîäèìîñòüþ, ÷åì â ï. â.
Äëÿ î÷èñòêè Ðèòóêñèìàáà ïðåäëàãàåòñÿ ñëåäóþùåå: íàíåñåíèå ïðè pH îò 4,0 äî 6,0, ïðîìûâêà ïåðâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì ïðè pH îò
6,8 äî 9,0 ñ ïðîâîäèìîñòüþ îò 0,01 äî 3,0 ìÑì/ñì,
ïðîìûâêà âòîðûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì ïðè
pH îò 5,0 äî 6,0 ñ ïðîâîäèìîñòüþ 0,05 – 3,0 ìÑì/ñì
è ýëþöèÿ àíòèòåë ñ êàòèîííîãî ñîðáåíòà áóôåðîì ñ pH 5,0 – 6,0 è ïðîâîäèìîñòüþ îò 10 äî
100 ìÑì/ñì, ïðåäïî÷òèòåëüíî ñ ïðîâîäèìîñòüþ
îò 12 – 20 ìÑì/ì, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò 150 – 200 ìÌ
NaCl. Ïðåäëàãàåòñÿ òàêæå èñïîëüçîâàòü äëÿ
õðàíåíèÿ Ðèòóêñèìàáà áóôåð, ñîäåðæàùèé
25 ìÌ HEPES ïðè pH îêîëî 7,8.
Äëÿ øàãà á ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû òàêèå
áóôåðû, êàê HEPES, MES, àöåòàòíûé áóôåð,
Òðèñ/HCl, òðèýòàíîëàìèíîãèäðîõëîðèä/NaOH,
Bicine/HCl, Tricine/HCl, íàïðèìåð, 25 ìÌ HEPES,
pH 7,8.
Äëÿ øàãà â: MES, óêñóñíàÿ êèñëîòà/àöåòàò
íàòðèÿ, äèãèäðîôîñôàò/ãèäðîôîñôàò íàòðèÿ
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
NaH2PO3/Na2HPO4, Bis. Tris/HCl, íàïðèìåð,
19 ìÌ MES, 10 ìÌ NaCl, pH 5,5.
Ïîäîáíàÿ î÷èñòêà ïîçâîëÿåò èçáàâèòñÿ îò
ÑÍÎ-áåëêîâ, áåëêà A, ãàðàìèöèíà, àãðåãàòîâ è
âèðóñîâ.
Êîììåð÷åñêè äîñòóïíûå ñîðáåíòû äëÿ êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè âêëþ÷àþò â
ñåáÿ êàðáîêñèìåòèëöåëëþëîçó (íàïðèìåð, Bakerbond ABX, Baker&Bond, Ãîëëàíäèÿ), ñóëüôîïðîïèë-àãàðîçó (íàïðèìåð, SP Sepharose,
GE Healthcare, Øâåöèÿ), ñóëüôîíèë-àãàðîçó
(S Sepharose, GE Healthcare).
Òùàòåëüíàÿ âèðóñíàÿ èíàêòèâàöèÿ äîñòèãàåòñÿ ñòàäèåé íàíîôèëüòðàöèè [85, 86]. Äàííàÿ òåõíîëîãèÿ ÿâëÿåòñÿ, âîçìîæíî, ñàìîé íàäåæíîé äëÿ óäàëåíèÿ âèðóñîâ â íàñòîÿùåå âðåìÿ. Óäàëåíèå äîñòèãàåòñÿ èñïîëüçîâàíèåì
ôèëüòðà, ïîðû êîòîðîãî ìåíüøå ýôôåêòèâíîãî
äèàìåòðà âèðóñîâ, ôèëüòðû ïîäðàçäåëÿþòñÿ íà
äâà âèäà â çàâèñèìîñòè îò ðàçìåðîâ ïîð: 50 è
20 íì. Õîòÿ íàíîôèëüòðàöèÿ — ýòî äîâîëüíî-òàêè ìÿãêèé ìåòîä, àíòèòåëà ïîäâåðãàþòñÿ
âîçäåéñòâèþ ïîïåðå÷íûõ ñèë ñäâèãà è ìîãóò
áûòü ïîâðåæäåíû [87].
Çàêëþ÷èòåëüíîé ñòàäèåé î÷èñòêè ÿâëÿåòñÿ
èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà Q-ñåôàðîçå è
äèàôèëüòðàöèÿ ïðîòèâ áóôåðà õðàíåíèÿ, â êà÷åñòâå êîòîðîãî ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí
HEPES [83, 85, 86].
ÇÀÊËÞ×ÅÍÈÅ
 ñòàòüå ðàññìîòðåíû ñîâðåìåííûå ñïîñîáû ïîëó÷åíèÿ òàêèõ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë, êàê
ãåðöåïòèí, öåòóêñèìàá, ðèòóêñèìàá, è òåðàïåâòè÷åñêèõ áåëêîâ, êàê ïðîèçâîäíûå èíñóëèíà,
èíòåðôåðîí áåòà, ýðèòðîïîýòèí, ôîëëèòðîïèí
àëüôà, ôàêòîð ñâåðòûâàíèÿ êðîâè IX, ôåðìåíòû èìèãëþöåðàçà è àëüòåïëàçà.
Ðÿä âåùåñòâ, ê ïðèìåðó, ôàêòîð IX, èìèãëþöåðàçà, âûäåëÿþò èç ïëàçìû è ñûâîðîòêè
êðîâè. Íåäîñòàòêîì äàííîãî ìåòîäà ÿâëÿåòñÿ
êðàéíå íèçêîå ñîäåðæàíèå öåëåâîãî áåëêà â
ñûðüå, à òàêæå ñëîæíîñòü òåõíîëîãè÷åñêîé î÷èñòêè.
Äëÿ ïðîèçâîäñòâà àêòèâíûõ òåðàïåâòè÷åñêèõ ñóáñòàíöèé ñóùåñòâóåò áîëüøîé âûáîð
ñèñòåì ýêñïðåññèè áëàãîäàðÿ ðàçâèòèþ ãåííîèíæåíåðíûõ ìåòîäîâ. Íåñìîòðÿ íà àëüòåðíàòèâíûå ñèñòåìû ýêñïðåññèè (òðàíñãåííûå ðàñòåíèÿ è æèâîòíûå), ïðîèçâîäèòåëè ïî-ïðåæíåìó èñïîëüçóþò õîðîøî èçó÷åííûå è ðàçðàáîòàííûå ëèíèè êëåòîê ÑÍÎ è E. coli. Îäíàêî èõ
íåëüçÿ íàçâàòü èäåàëüíûìè, òàê êàê â ñëó÷àå
ñèíòåçà â E. coli âûõîä öåëåâîãî áåëêà ëèìèòèðóåòñÿ ñòàäèåé ðåôîëäèíãà, à â ñëó÷àå êëåòîê
ÑÍÎ ôèçèîëîãè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü êîíå÷íîãî
áåëêà çàâèñèò îò ïðîòåîëèòè÷åñêîãî ïðîöåññèíãà.
Äëÿ î÷èñòêè áåëêîâ èñïîëüçóþò ñòàíäàðòíûå õðîìàòîãðàôè÷åñêèå ìåòîäû, ñàìûìè ðàñïðîñòðàíåííûìè ñðåäè êîòîðûõ ÿâëÿþòñÿ èîíîîáìåííàÿ, ãèäðîôîáíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ, îáðàùåííî-ôàçîâàÿ ÂÝÆÕ è ãåëü-ôèëüòðàöèÿ.
Ïðîèçâîäèòåëè ñòàðàþòñÿ èçáåãàòü àôôèííîé
õðîìàòîãðàôèè ââèäó åå ñëîæíîñòè è äîðîãîâèçíû. Îäíàêî â ñëó÷àå ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ, êàê ïðàâèëî,
ïðîñòî íåîáõîäèìà äëÿ ýôôåêòèâíîé ïåðâè÷íîé î÷èñòêè àíòèòåë èç êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè, à âûñîêàÿ ñòîèìîñòü òàêèõ ïðåïàðàòîâ íà
ðûíêå âî ìíîãî ðàç îêóïàåò âñå ïðîèçâîäèòåëüíûå çàòðàòû.
Ïðîèçâîäñòâî ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë ÿâëÿåòñÿ ñàìûì êîììåð÷åñêè óñïåøíûì â íàñòîÿùåå âðåìÿ, òàê êàê îíè ñîñòàâëÿþò óíèêàëüíûé
ñåãìåíò íà ðûíêå ïðåïàðàòîâ è íàõîäÿòñÿ ïîä
ïàòåíòíîé çàùèòîé. Ñðîêè ïàòåíòîâ íà ðàññìîòðåííûå â ñòàòüå ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà
çàêàí÷èâàþòñÿ â 2013 – 2014 ãã.
ÑÏÈÑÎÊ ÑÑÛËÎÊ
1. Áàèðàìàøâèëè Ä. È. / Ðîñ. õèì. æ. 2005. Ò. 49.
¹ 1. Ñ. 34 – 45.
2. URL:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/
ru/index.html.
3. Alastair J. J., Wood M. D. / N. Engl. Med. 1997.
V. 337. P. 176 – 183.
4. Setter S. M., Corbett C. F., Campbell P. K., White J. R.
/ Ann. Pharmacother. 2000. V. 34. P. 1423 – 1431.
5. Markussen J., et al. / Diabetologia. 1996. V. 39.
P. 281 – 288.
6. Whittingham J. L., et al. / Biochemistry. 1997.
V. 36. P. 2826 – 2831.
7. Chance R. E.,
DiMarchi R. D.,
Frank B. H.,
Shields J. E. Insulin Analogs Modified at Position
29 of the B Chain, United States Patent
No. 5514646, 1996.
8. Graumann K., Premstaller A. / J. Biotechnol. 2006.
V. 1(2). P. 164 — 186.
9. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R.
/ J. Boitechnol. 2000. V. 84. P. 175 – 185.
10. Ãèëü÷óê Ï. Â. / Áèîïîëèìåðû è êëåòêè. 2004.
Ò. 20. Ñ. 182 – 192.
11. Zimmerman, et al. / Insulin production methods
and pro-insulin constructs, United States Patent
No. 7790677 B2, 2010.
12. Cregg J. M., et al. / Mol. Cell Biol. 1985. V. 5. No. 12.
P. 3376 – 3385.
13. Ïàòðóøåâ Ë. È., Ïàòðóøåâà Í. Ë., Áàèðàìàøâèëè Ä. È., Ìèðîøíèêîâ À. È. / Áèîôàðì. æ.
2010. Ò. 2. ¹ 3. Ñ. 20 – 27.
14. Annibali, et al. Process for obtaining aspart insulin
using Pichia pastoris yeast strain, United States
Patent No. 0117600 A1, 2011.
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
43
Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ
15. Hazra Partha, et al. A process for preparation of
insulin compounds, World Intellectual Property
Organization Patent Apllication, WO 2009/104199
A1, 2009.
16. Bogsnes A., et al. Process for preparing insulin
compounds, World Intellectual Property Organization Patent Apllication, WO 03/044210 A2, 2003.
17. Derynck R., Content J., DeClercq E., Volckaert G.,
Tavernier J., Devos R., Fiers W. / Nature. 1980.
V. 285. P. 542 – 547.
18. Lin L. / Dev. Biol. Stand. 1998. V. 96, P. 97 – 104.
19. McCormick F. P., et al. Human interferon-b produced in chinese hamster ovary (CHO) cells, United
States Patent No. 5795779, 1998.
20. Mark D. F., et al. Structural genes, plasmids and
transformed cells for producing cysteinr depleted
muteins of interferon-b, United States Patent
No. 4737462, 1988.
21. Áàèðàìàøâèëè Ä. È., Âîðîáüåâ È. È., Ãàáèáîâ À. Ã.,
Äåìèí À. Â., Ìèðîøíèêîâ À. È., Ìàðòüÿíîâ Â. À.,
Ïîíîìàðåíêî Í. À., Øóñòåð À. Ì. Ðåêîìáèíàíòíàÿ ïëàçìèäíàÿ ÄÍÊ pES6-1, êîäèðóþùàÿ ïîëèïåïòèä èíòåðôåðîí áåòà-1b ÷åëîâåêà, è øòàìì
Escherichia coli BDEES6 — ïðîäóöåíò ðåêîìáèíàíòíîãî èíòåðôåðîíà áåòà-1b ÷åëîâåêà, Ïàòåíò
ÐÔ ¹ 2261913, 2004.
22. Ze’ev Shaked, Wolfe S. N. Controlled oxidation of
microbially produced cysteine-containing proteins,
United States Patent No. 4530787, 1985.
23. Russell-Harde D., Knauf M., Croze E. / J. Interferon
Cytokine Res. 1995. V. 15. P. 31 – 37.
24. Âîðîáüåâ È. È., Ïîíîìàðåíêî Í. À., Ìèðîøíèêîâ À. È., Ñìèðíîâ È. Â. Ñïîñîá î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî
èíòåðôåðîíà-1b,
Ïàòåíò
ÐÔ
¹ 2392282, 2008.
25. Ëóêèíà Å. À. / Êëèí. îíêîãåìàòîë. 2009. Ò. 2. ¹ 2.
Ñ. 196 – 200.
26. Øààëòèåë É., Áàóì Ã., Áàðòôåëä Ä. è äð. Ïðîäóöèðîâàíèå âûñîêîìàííîçíûõ áåëêîâ â ðàñòèòåëüíûõ êóëüòóðàõ, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2385928, 2004.
27. Furbish F. S., Blair H. E., Shiloacht J., et al. / Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 74. ¹ 8. P. 3560 – 3563.
28. Friedman B., Hayes M. Enhanced in vivo uptake of
glucocerebrosidase,
United
States
Patent
No. 5549892, 1996.
29. Ma J. K. C., Drake P. M. W., Christou P. / Nature
Rev. Genet. 2003. V. 4. P. 794 – 805.
30. Pennica D., Holmes W. E., et al. / Nature. 1983.
V. 301. P. 214–221.
31. Goeddel D. V., Kohr W. J., Pennica D., Vehar G. A.
Human tissue plasminogen activator, United States
Patent No. 5702938, 1997.
32. Tharmalingam T., et al. / Mol. Biotechnol. 2008.
V. 39. P. 167 – 177.
33. Ng Y. C., Berry J. M., Butler M. / Biotech. Bioeng.
1996. V. 50. P. 627 – 635.
34. Tharmalingam T., et al. / Mol. Biotechnol. 2011.
V. 49. P. 263 – 276.
35. Patell V. M. Method for production of a
bioengineered form of tissue plasminogen activator,
United States Patent No. 0246188, 2009.
36. Prior C. P., Hope J., Tolbert W. R. A process for
obtaining higher yields of unaggregated tissue
plasminogen activator from cell culture, Eur. Pat.
Applic. No. 0309111, 1989.
44
37. Qiu J., Swartz J. R., Georgiou G. / Appl. Environ.
Microbiol. 1998. V. 64. P. 4891 – 4896.
38. Rijken D. C., Collen D. / J. Biol. Chem. 1981. V. 256.
P. 7035–7041.
39. Furlong A. M., Thomsen D. R., et al. / Biotechnol.
Appl. Biochem. 1988. V. 10. P. 454 – 464.
40. Ogrydziak D. M. / Crit. Rev. Biotechnol. 1993. V. 13.
P. 1 – 55.
41. Yong Cheng. Method for producing human tissue
plasmin activator, Chin. Pat. Applic. No. 101492662,
2009.
42. Hunh Bum Soo, Kim Yong Hwan, et al. Vector
comprising tissue-type plasminogen activator gene,
hairy root transformed thereby and method for
preparing tissue-type plasminogen activator using
the same, Patent KR No. 100887367, 2007.
43. Heussen C., Joubert F., Dowdle E. B. / J. Biol. Chem.
1984. V. 259. P. 11635–11638.
44. Randy et. al. / FEBS Lett. 1982. V. 146. P. 289 – 292.
45. Mori T., Yoshizaki H., Hasegawa A. Purified plasminogen activator, process for its production and
thrombolytiñ composition containing it, United
States Patent No. 4505893, 1985.
46. Morii M., Kawashima N., Mori K., Ohoka M.
Method for purifying a crude tissue plasminogen
activator preparation, United States Patent
No. 5158882, 1992.
47. Sudip K. M., Gita A., Bhavesh S. Process for purufucation of human tissue type plasminogen activator, Eur. Pat. Applic. No. 2193197, 2009.
48. Çàê Ê. Ï., Ãðûöþê Ñ. Í. / Îíêîëîãèÿ. 2001. Ò. 3.
¹ 2 – 3. Ñ. 107 – 109.
49. Áåëÿêîâ Í. Â., Êîðîáèöûí Ë. Ï., Ïèâîâàðîâ À. Ì.,
Ïðîêîïüåâ À. À. Ñïîñîá î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî ýðèòðîïîýòèíà ÷åëîâåêà, Ïàòåíò ÐÔ
¹ 2145610, 2000.
50. Ãîñóäàðñòâåííûé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò îñîáî ÷èñòûõ áèîïðåïàðàòîâ, Òîâàðèùåñòâî ñ îãðàíè÷åííîé îòâåòñòâåííîñòüþ «Ïðîòåèíîâûé êîíòóð». Ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî
÷åëîâå÷åñêîãî ýðèòðîïîýòèíà, øòàìì êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê ÿè÷íèêà êèòàéñêî õîìÿêà — ïðîäóöåíò ýðèòðîïîýòèíà, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2125093,
1999.
51. Artymiuk P., Ross R., Sayers J. Erythropoietin,
United States Patent No. 0275564 A1, 2011.
52. Fu-Kuen Lin. Production of erythropoietin, United
States Patent No. 5547933, 1995.
53. URL: http://www.medicusamicus.com/index.php?
action=2x1854x1
54. Ïîêðîâñêèé Â. Ì., Êîðîòüêî Ã. Ô. / Ôèçèîëîãèÿ
÷åëîâåêà. — Ì.: Ìåäèöèíà, 2003. C. 261 – 271.
55. Owren P. A., Stormorken H. / The Mechanism of
Blood Coagulation. — Springer-Verlag, 1973. —
53 p.
56. Äåðåçà Ò. Ë., Ôåòèñîâà Ë. Â., Âÿçîâà Å. Ï., Àæèãèðîâà Ì. À. Êîíöåíòðàò ôàêòîðà IX ñèñòåìû
ñâåðòûâàíèÿ êðîâè è ñïîñîá åãî ïîëó÷åíèÿ, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2163140, 2001.
57. Teitel J. M. / Haemophilia. 1998. V. 4. P. 393 – 401.
58. Ðóñàíîâ Â. Ì. / Âåñòíèê ñëóæáû êðîâè Ðîññèè.
2008. Ò. 2. Ñ. 34 – 37.
59. Drohan W. N., et al. Method of producing biologically active vitamin K dependent proteins by
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
recombinant methods, United States Patent
No. 0045453 A1, 2008
Colvin B. / Âñåðîñ. íàó÷.-ïðàêò. êîíô. ïî ãåìîôèëèè — Ì., 2009.
Foster B. W., et al. Factor IX purification methods,
United States Patent No. 6627737 B1, 2003.
Hoffman J. A., Lu J. FSH and FSH variant formulations, products and methods, United States
Patent No. 7563763, 2009.
Murphy G., Cockett M. I., Ward R. V., Docherty A. J.
/ Biochem. J. 1991. V. 227. P. 277 – 279.
Muda M., Jiang X., McKenna S. D. FSH mutants,
United States Patent No. 7740862, 2010.
Lustbader J. Long-acting follicle stimulating hormone analogues and uses thereof, United States
Patent No. 7807620, 2010.
Samaritani F., Donati P. Liquid pharmaceutical
formulations of FSH and LH together with a
non-ionic, United States Patent No. 7741268, 2010.
Rossi M. Method of purifying FSH, United States
Patent No. 7754860, 2010.
Samaritani F., Donati P. Freeze-dried FSH / LH
formulations, United States Patent No. 7740884,
2010.
URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR-Scientific_Discussion/human/
000558/WC500029113.pdf.
Ciardiello F., Bianco R., Damiano V., et al. / Clin.
Cancer Res. 1999. V. 5. ¹ 4. P. 909 – 916.
Goldstein N. S., Armin M. / Cancer. 2001. V. 92.
¹ 5. P. 1331 – 1346.
Orton R. J., Sturm O. E., Vyshemirsky V., et al. /
Biochem. J. 2005. V. 392. P. 249 – 261.
Patell V. M., Guzder S. N., Maity S., Shekar S. A
highly efficient process of purification of recombinant cetuximab, World Intellectual Property Organization Patent Apllication, WO 2011/015921 A1,
2011.
Vogel C. L., Cobleigh M. A., Tripathy D., et al. / J.
Clin. Oncol. 2002. V. 3. Ð. 719 – 726.
Basey C. D., Blank G. S. Protein purification,
United States Patent No. 6339142, 2002.
Bryant J. L. Herceptin aduvant therapy, United
States Patent No. 0003217, 2012.
77. McLean M. D., Chen R., Yu D., Mah K. Z., Teat J. /
Transgenic
research.
2012.
—
electronic
supplementary material (http://www.springerlink.com/content/mu7k002428255jr4/).
78. Patell V. M., Guzder S. N., Maity S., Shekar S. A
highly efficient process of purificatiom and
production of recombinant trastuzumab, World
Intellectual
Property
Organization
Patent
Apllication, WO 2011/015920, 2011.
79. Adler M., Grauschopf U., Mahler H. C., Stauch O. B.
Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations
and uses thereof, United States Patent No. 0044977
A1, 2011.
80. Anderson D. R., Hanna N., Newman R. A., Reff M. E.,
Rastetter W. H. Expression and use of anti-CD20
antibodies, United States Patent No. 7381560,
2008.
81. Reff M., Carner K., Chambers K., et al. / Blood.
1994. V. 83. ¹ 2. P. 435 – 445.
82. Anderson D. R., Hanna N., Leonard J. E., Newman R. A., et al. Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment
of B cell lymphoma, United States Patent
No. 5736137, 1998.
83. Berthold W., et al. / The Rituxan Story: The Journey
of a chimeric antibody at a conference entitled
«Recovery of biological products 10: Learning for
the future». — Cancun, Mexico, 2001.
84. Lebreton B. A., O’Connor D. A., Safta A., Sharma M.
Antibody purification bu cation exchange chromatography, United States Patent No. 0148435,
2009.
85. Adler M., Mahler H., Stauch O. B. Highly concentrated pharmaceutical formulation comprising
anti-CD20 antibody, World Intellectual Property
Organization Patent Apllication, WO 2011/029892,
2011.
86. Gottschalk U. / Process scale purification of antibodies. — Wiley, 2011.
87. Zhou J. Methods for Removing Viral Contaminants
During Protein Purification, United States Patent
No. 0132688, 2008.
PHARMA-2020: TECHNOLOGICAL ASPECTS OF PRODUCTION
OF SOME STRATEGICAL BIOPHARMACEUTICALS (Review)
E. K. Kurbanova1,2,3, T. Y. Chulkova1, D. V. Byrikhina1, A. O. Dano1,
V. A. Nikolaeva1, D. A. Gusarov1,2
1
2
3
Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technology, 119571 Moscow (Russia), Vernadskogo av., 86
M. M. Shemyakin and Yu. A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences Institute,
117997 Moscow (Russia), Mikloukho-Maklaya st., 16/ 10
june90@yandex.ru
Due to the strategy of the pharmaceutical industry of the Russian Federation for the period up to
2020 the production of a wide range of medicines, many of which are products of Biopharma,
should be organized in Russia. This review provides modern technologies of production of
biopharmaceuticals, such as derivatives of insulin, interferon beta, erythropoietin, follitropin
alfa, coagulation factor IX, alteplase, imiglucerase and monoclonal antibodies herceptin,
cetuximab, rituximab.
Keywords: recombinant protein, biosimilar, production process, chromatography.
ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45
45