2 302 460(13) C1

ÐÎÑÑÈÉÑÊÀß ÔÅÄÅÐÀÖÈß
(19)
RU
(11)
2 302 460
(13)
C1
(51) ÌÏÊ
C12N 15/09
C12N 15/24
(2006.01)
(2006.01)
ÔÅÄÅÐÀËÜÍÀß ÑËÓÆÁÀ
ÏÎ ÈÍÒÅËËÅÊÒÓÀËÜÍÎÉ ÑÎÁÑÒÂÅÍÍÎÑÒÈ,
ÏÀÒÅÍÒÀÌ È ÒÎÂÀÐÍÛÌ ÇÍÀÊÀÌ
(12)
ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÈÇÎÁÐÅÒÅÍÈß Ê ÏÀÒÅÍÒÓ
(21), (22) Çà âêà: 2005133963/13, 02.11.2005
(24) Äàòà íà÷àëà îòñ÷åòà ñðîêà äåéñòâè ïàòåíòà:
02.11.2005
(45) Îïóáëèêîâàíî: 10.07.2007 Áþë. ¹ 19
Àäðåñ äë ïåðåïèñêè:
630090, ã.Íîâîñèáèðñê, ïð-êò àêàä.
Ëàâðåíòüåâà, 10, ÈÖèà ÑÎ ÐÀÍ, ïàòåíòíûé îòäåë
(73) Ïàòåíòîîáëàäàòåëü(è):
Èíñòèòóò öèòîëîãèè è ãåíåòèêè Ñèáèðñêîãî
îòäåëåíè Ðîññèéñêîé àêàäåìèè íàóê (ÑÎ ÐÀÍ)
(RU),
Èíñòèòóò õèìè÷åñêîé áèîëîãèè è
ôóíäàìåíòàëüíîé ìåäèöèíû Ñèáèðñêîãî
îòäåëåíè Ðîññèéñêîé àêàäåìèè íàóê (ÑÎ ÐÀÍ)
(RU)
(54) ÐÅÊÎÌÁÈÍÀÍÒÍÀß ÏËÀÇÌÈÄÍÀß ÄÍÊ pBi101-IL18, ÊÎÄÈÐÓÞÙÀß ÑÈÍÒÅÇ
2 3 0 2 4 6 0
ôåðìåíòîì òðîìáèíîì, - 5'UTR îáëàñòè èç ãåíîìà
âèðóñà ãðàâèðîâêè òàáàêà; - äâîéíîé 35S CaMV
ïðîìîòîðà èç ãåíîìà âèðóñà ìîçàèêè öâåòíîé
êàïóñòû; - 3'UTR îáëàñòü èç ãåíîìà âèðóñà ìîçàèêè
öâåòíîé êàïóñòû. Èçîáðåòåíèå îáåñïå÷èâàåò
ïåðåíîñ íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ÈË-18
÷åëîâåêà â ãåíîìíóþ ÄÍÊ ðàñòåíèé è ïðîäóêöèþ
çðåëîé ôîðìû èíòåðëåéêèíà 18 ÷åëîâåêà,
îáëàäàþùåé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ. 2 èë., 1
òàáë.
R U
(57) Ðåôåðàò:
Èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê áèîòåõíîëîãèè, â
÷àñòíîñòè ê ãåíåòè÷åñêîé èíæåíåðèè âûñøèõ
ðàñòåíèé.
Êîíñòðóèðóþò
ðåêîìáèíàíòíóþ
ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ pBi101-IL18, ðàçìåðîì 15 ò.ï.í.,
ñîäåðæàùóþ ôðàãìåíò ÄÍÊ âåêòîðíîé ïëàçìèäû
pBi101, ðàçìåðîì 13,9 ò.ï.í; - NdeI-BamHI/BglII
ôðàãìåíòà ÄÍÊ, âë þùåãîñ ó÷àñòêîì êÄÍÊ ãåíà
ÈË-18 ÷åëîâåêà; - NcoI-NdeI ôðàãìåíòà ïëàçìèäû
ðÅÒ15b; êîäèðóþùèé N-êîíöåâîé ïîëèïåïòèä èç
øåñòè àìèíîêèñëîò ãèñòèäèíà è ñàéò ãèäðîëèçà
Ñòðàíèöà: 1
RU
C 1
C 1
ÈÍÒÅÐËÅÉÊÈÍÀ-18 ×ÅËÎÂÅÊÀ  ÒÐÀÍÑÃÅÍÍÛÕ ÐÀÑÒÅÍÈßÕ
2 3 0 2 4 6 0
(56) Ñïèñîê äîêóìåíòîâ, öèòèðîâàííûõ â îò÷åòå î
ïîèñêå: ZHANG Â, et al «Expression and
production of bioactive human interleukin-18
in transgenic tobacco plants», Biotechnol
Lett. 2003, 25(19): 1629-1635. ÑÀ 1340978,
02.05.2000. RU 1703693 A1, 07.01.1992.
R U
(72) Àâòîð(û):
Òóð÷èíîâè÷ Àíäðåé Àëåêñååâè÷ (RU),
Äåéíåêî Åëåíà Âèêòîðîâíà (RU),
Ôèëèïåíêî Ìàêñèì Ëåîíèäîâè÷ (RU),
Øóìíûé Âëàäèìèð Êîíñòàíòèíîâè÷ (RU),
Õðàïîâ Åâãåíèé Àëåêñàíäðîâè÷ (RU),
Ñåííèêîâ Ñåðãåé Âèòàëüåâè÷ (RU)
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 302 460
(13)
C1
(51) Int. Cl.
C12N 15/09
C12N 15/24
(2006.01)
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2005133963/13, 02.11.2005
(24) Effective date for property rights: 02.11.2005
(45) Date of publication: 10.07.2007 Bull. 19
Mail address:
630090, g.Novosibirsk, pr-kt akad.
Lavrent'eva, 10, ITsiG SO RAN, patentnyj otdel
(54) RECOMBINANT PLASMID DNA pBi101-IL18 ENCODING HUMAN INTERLEUKIN-18 SYNTHESIS
2 3 0 2 4 6 0
R U
hydrolysis, -5'URT region from genome of tobacco
etch virus; double 35S CaMV promoter from genome
of cauliflower mosaic virus; -3'URT region from
genome of cauliflower mosaic virus. Method of
present invention makes it possible to transfer
nucleotide sequence of human IL-18 in plant
genomic DNA.
EFFECT: method for production of mature human
IL-18 having biological activity.
2 dwg, 1 tbl, 3 ex
Ñòðàíèöà: 2
EN
C 1
C 1
IN TRANSGENIC PLANTS
(57) Abstract:
FIELD: biotechnology, in particular plant gene
engineering.
SUBSTANCE: recombinant plasmid DNA pBi101IL18 is constructed having length of 15000 n.p.
and containing DNA fragment of pBi101-IL18 vector
plasmide having length of 13900 n.p.; -NdeIBamHI/BgIII DNA fragment being cDNA site of human
IL-18 gene; -Nol-NdeI fragment of pET15b plasmide;
encoding
N-terminal
polypeptide
from
six
hystidine amino acids and site of thrombin enzyme
2 3 0 2 4 6 0
(73) Proprietor(s):
Institut tsitologii i genetiki Sibirskogo
otdelenija Rossijskoj akademii nauk (SO RAN)
(RU),
Institut khimicheskoj biologii i
fundamental'noj meditsiny Sibirskogo
otdelenija Rossijskoj akademii nauk (SO RAN) (RU)
R U
(72) Inventor(s):
Turchinovich Andrej Alekseevich (RU),
Dejneko Elena Viktorovna (RU),
Filipenko Maksim Leonidovich (RU),
Shumnyj Vladimir Konstantinovich (RU),
Khrapov Evgenij Aleksandrovich (RU),
Sennikov Sergej Vital'evich (RU)
RU 2 302 460 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê îáëàñòè áèîòåõíîëîãèè, â ÷àñòíîñòè ê ãåíåòè÷åñêîé èíæåíåðèè
âûñøèõ ðàñòåíèé, è ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî äë ñîçäàíè ðàñòèòåëüíûõ ïðîäóöåíòîâ
èíòåðëåéêèíà-18 (ÈË-18) ÷åëîâåêà. Òðàíñãåííûå ðàñòåíè -ïðîäóöåíòû ÈË-18 ÷åëîâåêà
ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû äë ïåðîðàëüíîé äîñòàâêè ÈË-18 ê ñëèçèñòûì òîíêîãî êèøå÷íèêà,
à òàêæå äë âûäåëåíè ÈË-18 â ÷èñòîì âèäå äë ôàðìàêîëîãèè. Èçâåñòíî, ÷òî ÈË-18
âë åòñ ïåðñïåêòèâíûì ïðîòèâîîïóõîëåâûì ïðåïàðàòîì, òàê êàê îáëàäàåò
íåïîñðåäñòâåííûì öèòîòîêñè÷åñêèì ýôôåêòîì ïî îòíîøåíèþ ê ðàêîâûì êëåòêàì, çà ñ÷åò
èíäóêöèè àïîïòîçà, ñòèìóëèðóåò ïðîäóêöèþ äðóãèõ öèòîêèíîâ, èãðàþùèõ êëþ÷åâóþ ðîëü
ïðè óíè÷òîæåíèè îïóõîëè, à òàêæå ïîâûøàåò öèòîòîêñè÷íîñòü Ò-êèëëåðîâ è NK-êëåòîê ïî
îòíîøåíèþ ê ðàêîâûì êëåòêàì (Dinarello Ñ. // METHODS. 1999, V.19, Ð.121-122). ÈË-18
ïîâûøàåò àíòèãåíïðåäñòàâë þùèå ñïîñîáíîñòè ìàêðîôàãîâ è ìîæåò èñïîëüçîâàòüñ êàê
àäúþâàíò ïðè èììóíèçàöèè âàêöèíàìè. Îñîáûé èíòåðåñ ïðåäñòàâë åò èñïîëüçîâàíèå ÈË18 â êà÷åñòâå ìóêîçíîãî àäúþâàíòà ïðè èììóíèçàöèè æèâîòíîãî îðãàíèçìà «ñúåäîáíûìè
âàêöèíàìè».
Èçâåñòíà ðåêîìáèíàíòíà ïëàçìèäíà ÄÍÊ, êîäèðóþùà ñèíòåç çðåëîé ôîðìû ÈË-18
÷åëîâåêà â êëåòêàõ E.coli, ñêîíñòðóèðîâàííà íà îñíîâå áàêòåðèàëüíîãî
ýêñïðåññèðóþùåãî âåêòîðà ðÊÊ223-3 (Ushio S., Namba M., Okura Ò. et al. // The J.
Immunol. 1996, V.156, P.4274-4279). Âåêòîð îáåñïå÷èâàåò âûñîêèé óðîâåíü ïðîäóêöèè ÈË18 â áàêòåðè õ. Îäíàêî â ïðîêàðèîòè÷åñêèõ êëåòêàõ íå ïðîèñõîäèò ïðàâèëüíîé óêëàäêè
ïîëèïåïòèäíîé öåïè ÈË-18, âñëåäñòâèå ÷åãî áåëîê íàêàïëèâàåòñ â âèäå íåðàñòâîðèìûõ
âíóòðèêëåòî÷íûõ àãðåãàòîâ. Äë äàëüíåéøåãî ïðåâðàùåíè ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà â
ðàñòâîðèìóþ è áèîëîãè÷åñêè àêòèâíóþ ôîðìó òðåáóþòñ äîðîãîñòî ùèå è äëèòåëüíûå
ïðîöåäóðû ðåôîëäèíãà. Äðóãèì íåäîñòàòêîì ïðîêàðèîòè÷åñêèõ ñèñòåì ýêñïðåññèè
âë åòñ âîçìîæíà êîíòàìèíàöè öåëåâîãî áåëêà áàêòåðèàëüíûìè òîêñèíàìè.
Íàèáîëåå áëèçêîé ê çà âë åìîé ïëàçìèäå - ïðîòîòèïîì, âë åòñ ðåêîìáèíàíòíà ïëàçìèäíà ÄÍÊ pBin/hIL-18, â êîòîðîé íóêëåîòèäíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ïðî-ÈË-18
âñòðîåíà â ýêñïðåññèîííûé âåêòîð pBin438, ïîä êîíòðîëü äâîéíîãî ïðîìîòîðà 35S âèðóñà
ìîçàèêè öâåòíîé êàïóñòû (Zhang Â., Yang Y.H., Lin Y.M. et al. // Biotechnol Lett.,
2003, V.25, P.1629-1635). Èçâåñòíà ïëàçìèäà pBin/hIL-18 ðàçìåðîì 14 ò.ï.í. ñîäåðæèò:
- BamHI-SalI ôðàãìåíò ÄÍÊ ïëàçìèäû pCI-18, ðàçìåðîì 0,58 ò.ï.í., êîäèðóþùèé ïðîÈË18 ÷åëîâåêà, à òàêæå ñàéòû ðåñòðèêöèè, ðåãóë òîðíûå ó÷àñòêè, ãåíåòè÷åñêèå ìàðêåðû.
- ÄÍÊ âåêòîðíîé ïëàçìèäû pBin438 ðàçìåðîì 13,5 ò.ï.í
Îñíîâíîé íåäîñòàòîê äàííîé ïëàçìèäíîé ÄÍÊ çàêëþ÷àþòñ â òîì, ÷òî â êà÷åñòâå
ïåðåíîñèìîãî ãåíà â íåé ñîäåðæèòñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÄÍÊ, êîäèðóþùà áèîëîãè÷åñêè
íåàêòèâíûé ïðåäøåñòâåííèê ÈË-18 ÷åëîâåêà (ïðîÈË-18) ñ ìîëåêóë ðíûì âåñîì 24 êÄà.
Êðîìå òîãî, â èçâåñòíîé ïëàçìèäíîé ÄÍÊ çàêîäèðîâàí áåëîê, íå ñîäåðæàùèé êàêîãî-ëèáî
ó÷àñòêà, îáëàäàþùåãî âûñîêèì ñðîäñòâîì ê èçâåñòíûì õðîìàòîãðàôè÷åñêèì ñîðáåíòàì,
÷òî çàòðóäí åò âîçìîæíîñòü âûäåëåíè òàêîãî áåëêà ìåòîäàìè àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè.
Òåõíè÷åñêîé çàäà÷åé èçîáðåòåíè âë åòñ ñîçäàíèå ðåêîìáèíàíòíîé ïëàçìèäíîé ÄÍÊ,
îáåñïå÷èâàþùåé ïðîäóêöèþ çðåëîé áèîëîãè÷åñêè àêòèâíîé ôîðìû ÈË-18 ÷åëîâåêà â
òðàíñãåííûõ ðàñòåíè õ.
Ïîñòàâëåííà çàäà÷à äîñòèãàåòñ íîâîé ñêîíñòðóèðîâàííîé ïëàçìèäíîé ÄÍÊ pBi101IL18 ðàçìåðîì 15 ò.ï.í., îáåñïå÷èâàþùåé ïåðåíîñ öåëåâîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ÄÍÊ â
ãåíîì ðàñòåíèé è ýêñïðåññèþ ãåíà ÈË-18 ÷åëîâåêà. Ñïîñîá êîíñòðóèðîâàíè çàêëþ÷àåòñ â
êëîíèðîâàíèè ó÷àñòêà êÄÍÊ ãåíà ÈË-18 ÷åëîâåêà â ïëàçìèäå ðÅÒ15b+ ñîâìåñòíî ñ
íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ øåñòè àìèíîêèñëîò ãèñòèäèíà è ñàéòà ãèäðîëèçà
ôåðìåíòîì òðîìáèíîì. Íà ñëåäóþùåì ýòàïå ôðàãìåíò ÄÍÊ, ñîñòî ùèé èç íóêëåîòèäíîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïîëèãèñòèäèíà, òðîìáèíîâîãî ñàéòà è ÈË-18 ÷åëîâåêà ïåðåíîñ ò â
ïëàçìèäó pAVA321 ïî ñàéòàì ðåñòðèêöèè NcoI/BglII. Ïëàçìèäà pAVA321 ñîäåðæèò
ôóíêöèîíàëüíûå ýëåìåíòû, íåîáõîäèìûå äë ýêñïðåññèè öåëåâîãî ãåíà â ðàñòåíèè. Íà
çàêëþ÷èòåëüíîì ýòàïå êëîíèðîâàíè Sail-BamHI ôðàãìåíò ïëàçìèäíîé ÄÍÊ pAVA321,
ñîäåðæàùèé ãåí ÈË-18 ÷åëîâåêà ïîä óïðàâëåíèåì ðàñòèòåëüíûõ ýëåìåíòîâ ýêñïðåññèè,
ñóáêëîíèðóþò â ïîëèëèíêåð Ò-ÄÍÊ îáëàñòè áèíàðíîé âåêòîðíîé ïëàçìèäû pBi101. Â
Ñòðàíèöà: 3
DE
RU 2 302 460 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ðåçóëüòàòå ïîëó÷àþò ðåêîìáèòíàíòíóþ ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ pBi101-IL18 ðàçìåðîì 15 ò.ï.í.,
îáåñïå÷èâàþùóþ ïåðåíîñ öåëåâîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ÄÍÊ â ãåíîì ðàñòåíèé è
ýêñïðåññèþ ãåíà ÈË-18 ÷åëîâåêà.
Ïëàçìèäà ñîñòîèò èç ñëåäóþùèõ ýëåìåíòîâ:
- ÄÍÊ âåêòîðíîé ïëàçìèäû pBi101 ðàçìåðîì 13,9 ò.ï.í;
- NdeI-BamHI/BglII ôðàãìåíòà ÄÍÊ, âë þùåãîñ ó÷àñòêîì êÄÍÊ ãåíà ÈË-18 ÷åëîâåêà;
- NcoI-NdeI ôðàãìåíòà ïëàçìèäû ðÅÒ15b;
- 5'UTR îáëàñòè èç ãåíîìà âèðóñà ãðàâèðîâêè òàáàêà;
- Äâîéíîãî 35S CaMV ïðîìîòîðà èç ãåíîìà âèðóñà ìîçàèêè öâåòíîé êàïóñòû;
- 3'UTR îáëàñòè èç ãåíîìà âèðóñà ìîçàèêè öâåòíîé êàïóñòû.
Ôèçè÷åñêà êàðòà ïëàçìèäû pBi101-IL18 ñ óêàçàíèåì ãåíåòè÷åñêèõ ìàðêåðîâ ïðèâåäåíà
íà ôèã.1, ãäå 6xHis - ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÄÍÊ, êîäèðóþùà øåñòü àìèíîêèñëîòíûõ
îñòàòêîâ ãèñòèäèíà; Trs - ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÄÍÊ, êîäèðóþùà ñàéò óçíàâàíè ôåðìåíòîì òðîìáèíîì; IL-18 - íóêëåîòèäíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü çðåëîé ôîðìû ÈË-18
÷åëîâåêà; 35SCaMV - äâîéíîé ïðîìîòîð ãåíà 35S ÐÍÊ âèðóñà ìîçàèêè öâåòíîé êàïóñòû;
TL - ëèäåðíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü òðàíñë öèè èç ãåíîìà âèðóñà ãðàâèðîâêè òàáàêà; TcaMV
- òåðìèíàòîð ãåíà 35S ÐÍÊ âèðóñà ìîçàèêè öâåòíîé êàïóñòû; LB, RB - ëåâà è ïðàâà ãðàíèöû Ò-ÄÍÊ îáëàñòè; PNOS - ïðîìîòîð ãåíà íîïàëèíñèíòåòàçû èç Ti-ïëàçìèäû
Agrobacterium tumefaciens; NPTII-ãåí íåîìèöèíôîñôîòðàíñôåðàçûII; TNOS - òåðìèíàòîð
ãåíà íîïàëèíñèíòåòàçû; Â-Glue - íóêëåîòèäíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü β -ãëþêóðîíèäàçû E.coli.
Îòëè÷èå ïîëó÷åííîé ðåêîìáèíàíòíîé ïëàçìèäíîé ÄÍÊ îò ïðîòîòèïà ñîñòîèò â
èñïîëüçîâàíèè íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè õèìåðíîãî áåëêà, ñîñòî ùåãî èç
áåçëèäåðíîé (çðåëîé) ôîðìû ÈË-18 ÷åëîâåêà, N-êîíöåâîãî ïåïòèäà èç øåñòè àìèíîêèñëîò
ãèñòèäèíà è ñàéòà ãèäðîëèçà ôåðìåíòîì òðîìáèíîì ìåæäó íèìè. Èñïîëüçîâàíèå òàêîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ÄÍÊ â êà÷åñòâå öåëåâîãî ãåíà ïîçâîëèò ïîëó÷àòü ðàñòåíè ïðîäóöåíòû áèîëîãè÷åñêè àêòèâíîãî ÈË-18 ÷åëîâåêà, à òàêæå ñäåëàåò âîçìîæíûì
âûäåëåíèå ðåêîìáèíàíòíîãî ÈË-18 â ÷èñòîì âèäå èç ðàñòåíèé ìåòîäàìè ìåòàëë-õåëàòíîé
àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè.
Ñóùíîñòü èçîáðåòåíè ïî ñí åòñ ñëåäóþùèìè ïðèìåðàìè.
Ïðèìåð 1. Êîíñòðóèðîâàíèå ïëàçìèäû pBi101-IL18.
10 ìêã ÄÍÊ ïëàçìèäû pBluescriptSK-IL18, ñîäåðæàùåé ôðàãìåíò êÄÍÊ ÈË-18 ÷åëîâåêà,
îáðàáàòûâàëè ðåñòðèêòàçàìè FauNDI (100 å.à.) è BamHI (100 å.à.) â òå÷åíèå 1 ÷àñà ïðè
37°Ñ â 50 ìêë áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 10 mM Tris-HCl ðÍ 7.6; 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1
mM DTT. Ãèäðîëèçàò ðàçäåë ëè ýëåêòðîôîðåçîì â 1,5% àãàðîçíîì ãåëå, ãåëü îêðàøèâàëè
ðàñòâîðîì áðîìèñòîãî ýòèäè â âîäå (1 ìêã/ìë) è ôðàãìåíò ÄÍÊ ðàçìåðîì 460 ï.í.
âûäåë ëè èç ãåë ìåòîäîì ñîðáöèè ÄÍÊ íà ñèëèêàãåëå.
10 ìêã ÄÍÊ ïëàçìèäû ðÅÒ15b ãèäðîëèçîâàëè ðåñòðèêòàçàìè FauNDI (100 å.à.) è BamHI
(100 å.à.) 1 ÷àñ ïðè 37°Ñ â 50 ìêë áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 10 mM Tris-HCl ðÍ 7.6; 10 mM
MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT. Ðåàêöèîííóþ ñìåñü ðàçäåë ëè ýëåêòðîôîðåçîì â 1,5%
àãàðîçíîì ãåëå, ãåëü îêðàøèâàëè ðàñòâîðîì áðîìèñòîãî ýòèäè â âîäå (1 ìêã/ìë) è
ôðàãìåíò ÄÍÊ ðàçìåðîì 5700 ï.í. âûäåë ëè èç ãåë ìåòîäîì ñîðáöèè ÄÍÊ íà ñèëèêàãåëå.
Ñìåøèâàëè 0.03 ìêã FauNDI - BamHI ôðàãìåíòà ïëàçìèäû ðÅÒ15b è 3 ìêã FauNDI-BamHI
ôðàãìåíòà ïëàçìèäû pBluescriptSK-IL18, ñîäåðæàùåãî íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü
ÈË-18 ÷åëîâåêà, â 10 ìêë áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 50 mM Tris-HCl ðÍ 7.8; 10 mM MgCl2; 10
mM DTT; 1 mM ÀÒÐ; 25 mkg/ml BSA. Ê ñìåñè äîáàâë ëè 100 å.à ÄÍÊ-ëèãàçû ôàãà Ò4 è
èíêóáèðîâàëè 10 ÷àñîâ ïðè 4°Ñ. 5 ìêë ëèãàçíîé ñìåñè èñïîëüçîâàëè äë òðàíñôîðìàöèè
êîìïåòåíòíûõ êëåòîê E.coli øòàììà XLBlue. Òðàíñôîðìàíòû âûñåâàëè íà ÷àøêó ñ LBàãàðîì, ñîäåðæàùåì 100 ìêã/ìë àìïèöèëëèíà. Êëîíû, íåñóùèå ðåêîìáèíàíòíûå ïëàçìèäû
ñî âñòðîåííûì ãåíîì, îòáèðàëè ìåòîäîì ÏÖÐ àíàëèçà ÄÍÊ îòäåëüíûõ êîëîíèé E.coli ñ
ïðàéìåðàìè íà íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÈË-18 ÷åëîâåêà. Ïëàçìèäíûå ÄÍÊ äâóõ
êëîíîâ èç äåñ òè îòîáðàííûõ äë àíàëèçà, äàâøèõ ñèãíàë ÏÖÐ, ñîîòâåòñòâóþùèé ïî äëèíå
íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ÈË-18 ÷åëîâåêà, äîïîëíèòåëüíî àíàëèçèðîâàëè ñ
ïîìîùüþ ãèäðîëèçà ðåñòðèêòàçàìè FauNDI è BamHI è ïîñëåäóþùèì ðàçäåëåíèåì
Ñòðàíèöà: 4
RU 2 302 460 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ïðîäóêòîâ ãèäðîëèçà ãåëü-ýëåêòðîôîðåçîì â 1,5% àãàðîçå. Â ðåçóëüòàòå ðåñòðèêöèîííîãî
àíàëèçà ïîäòâåðæäåíà âñòðîéêà ÈË-18 â îáîèõ îòîáðàííûõ ïëàçìèäàõ.
Bsp19I - BamHI ôðàãìåíò îäíîé èç òàêèõ ïëàçìèä (pET15b-IL18) èñïîëüçîâàëñ äë êîíñòðóèðîâàíè ïëàçìèäû pAVA321-IL18. Ñ ýòîé öåëüþ 2 ìêã ÄÍÊ ïëàçìèäû pAVA321
îáðàáàòûâàëè ðåñòðèêòàçàìè Bsp19I (100 å.à.) è BglII (100 å.à.) 1 ÷àñ ïðè 37°Ñ â 50 ìêë
áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 50 mM Tris-HCl ðÍ 7.6; 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT. 10
ìêã ïëàçìèäû pET15b-IL18 ãèäðîëèçîâàëè ðåñòðèêòàçàìè Bsp19I (100 å.à.) è BamHI (100
å.à.) â áóôåðå òîãî æå ñîñòàâà. Ïðîäóêòû ãèäðîëèçà ðàçäåë ëè â 1,5% àãàðîçíîì ãåëå.
Âûäåë ëè ôðàãìåíòû ÄÍÊ ðàçìåðîì 4 ò.ï.í. è 540 ï.í. èç ïëàçìèä pAVA321 è pET15b-IL18
ñîîòâåòñòâåííî, êàê îïèñàíî âûøå. 0,1 ìêã ôðàãìåíòà ïëàçìèäíîé ÄÍÊ pAVA321 è 0,5 ìêã
ôðàãìåíòà èç âåêòîðà pET15b-IL18 ñìåøèâàëè â 10 ìêë ëèãàçíîãî áóôåðà è îáðàáàòûâàëè
ÄÍÊ-ëèãàçîé, êàê îïèñàíî âûøå. Ëèãàçíîé ñìåñüþ òðàíñôîðìèðîâàëè êîìïåòåíòíûå êëåòêè
E.coli øòàììà XLBlue, òðàíñôîðìàíòû âûñåâàëè íà ÷àøêè ñ LB-àãàðîì, ñîäåðæàùèå 100
ìêã/ìë àìïèöèëèíà. Êëîíû, íåñóùèå ðåêîìáèíàíòíûå ïëàçìèäû ñî âñòðîåíûì ãåíîì ÈË-18
÷åëîâåêà îòáèðàëè ÏÖÐ-àíàëèçîì. Ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ îäíîãî êëîíà, äàâøåãî
ïîëîæèòåëüíûé ÏÖÐ-ñèãíàë, àíàëèçèðîâàëè ñ ïîìîùüþ ãèäðîëèçà ðåñòðèêòàçàìè Bsp19I è
BamHI è ïîñëåäóþùèì ðàçäåëåíèåì ïðîäóêòîâ ãèäðîëèçà ãåëü-ýëåêòðîôîðåçîì â 1,5%
àãàðîçå.
Ïî àíàëîãè÷íîé ñõåìå êëîíèðîâàíè SalI - BamHI ôðàãìåíò ÄÍÊ èç ïëàçìèäû pAVA321IL18 áûë ïåðåíåñåí â ïîëèëèíêåðíóþ îáëàñòü ïëàçìèäû pBi 101.
Ïðèìåð 2. Ïîëó÷åíèå ìîíîèíñåðöèîííûõ òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé.
Ïîëó÷åííîé ïëàçìèäíîé ÄÍÊ pBi101-IL18 òðàíñôîðìèðîâàëè êëåòêè Agrobacterium
tumefaciens (øòàìì LBA4404). Òðàíñôîðìàöèþ ðàñòåíèé òàáàêà Nicotiana tabacum (ëèíèè
SRI) ïðîâîäèëè ìåòîäîì êîêóëüòèâàöèè ëèñòîâûõ äèñêîâ ñ ñóñïåíçèåé êëåòîê
àãðîáàêòåðèé, êàê îïèñàíî â (Horsch R., Fry J., Hoffman N. et al. // Plant Molecular
Biology Manual. Dordrecht. Kluwer Academic Publishers. 1988, P. A5/1-A5/9).
Ïîëó÷åííûå ðåãåíåðàíòû âûðàùèâàëè íà ñðåäå Ìóðàøèãå è Ñêóãà (ÌÑ) (Murasige Ò., Skoog
F. // Physiol. Plant. 1962, V.15, Ð.473-497), ñîäåðæàùåé 250 ìã/ë êëàôîðàíà è 50 ìã/ë
êàíàìèöèíà.
Ïîñëå ñàìîîïûëåíè ðàñòåíèé-ðåãåíåðàíòîâ Ò0 àíàëèçèðîâàëè ñîîòíîøåíèå
óñòîé÷èâûõ è íåóñòîé÷èâûõ ê àíòèáèîòèêó ðàñòåíèé T1 ïîêîëåíè íà ñðåäå ñ êàíàìèöèíîì.
Äë ýòîãî ñåìåíà T1 ïîêîëåíè ñòåðèëèçîâàëè 10%-íûì ðàñòâîðîì ãèïîõëîðèòà íàòðè è
96° ýòàíîëîì ïî ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå è âûñåâàëè íà ÷àøêè ñî ñðåäîé ÌÑ ñ äîáàâëåíèåì
100 ìã/ë êàíàìèöèíà. ×àøêè èíêóáèðîâàëè äâå íåäåëè ïðè 25°Ñ ñî ñòàíäàðòíûì ñâåòîâûì
ðåæèìîì (16 ÷àñîâ ñâåò, 8 ÷àñîâ òåìíîòà) è ïîäñ÷èòûâàëè ñîîòíîøåíèå áåëûõ è çåëåíûõ
ïðîðîñòêîâ. Ïîêàçàíî, ÷òî ýòî ñîîòíîøåíèå áëèçêî ê 3:1 ó 6 èç 30 ïðîàíàëèçèðîâàííûõ
ëèíèé. Äë äàëüíåéøèõ èññëåäîâàíèé áûëè îòîáðàíû òîëüêî T1 ðàñòåíè , ñðåäè êîòîðûõ
íàáëþäàëîñü äîñòîâåðíîå ðàñùåïëåíèå 3:1 ïî ïðèçíàêó êàíàìèöèíóñòîé÷èâîñòè.
Íàëè÷èå íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ÈË-18 ÷åëîâåêà â ãåíîìàõ îòîáðàííûõ
ðàñòåíèé ïîäòâåðæäàëè ìåòîäîì ÏÖÐ ñ ïðàéìåðàìè íà íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü
ÈË-18. Ìîíîèíñåðöèîííîñòü ðàñòåíèé äîïîëíèòåëüíî àíàëèçèðîâàëè áëîò-ãèáðèäèçàöèåé
HindIII - ãèäðîëèçàòîâ ãåíîìíûõ ÄÍÊ ðàñòåíèé ñ 32Ð ìå÷åíûì ôðàãìåíòîì êÄÍÊ ÈË-18
÷åëîâåêà íà íèòðîöåëëþëîçíîé ìåìáðàíå.
Àíàëèç óðîâí ýêñïðåññèè ÈË-18 ÷åëîâåêà ó òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ïðîâîäèëè ìåòîäîì
Âåñòåðí-áëîòòèíãà ñ ïðèìåíåíèåì ïîëèêëîíàëüíûõ àíòèòåë êðîëèêà, ñïåöèôè÷íûõ ê ÈË-18
÷åëîâåêà.  êà÷åñòâå âòîðè÷íûõ àíòèòåë èñïîëüçîâàëè êîçüè àíòèòåëà ê IgG2 êðîëèêà,
êîíüþãèðîâàííûå ñ ùåëî÷íîé ôîñôàòàçîé. Äë äåòåêöèè ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè
ùåëî÷íîé ôîñôàòàçû èñïîëüçîâàëè íàáîð õåìèëþìèíåñöåíòíûõ ðåàêòèâîâ Immunstar
(BioRad, ÑØÀ). Ïðè ïðèãîòîâëåíèè ìàòåðèàëà äë Âåñòåðí-áëîòòèíãà ñóììàðíûé áåëîê èç
0,3 ã ëèñòüåâ òàáàêà ýêñòðàãèðîâàëè â 1 ìë Áóôåðà 1 (50 ìÌ Tris-HCl pH 8.0, 500 ìÌ
NaCl, 0.1% Tween-20, 5 ìÌ β -ÌÅ, 1 ìÌ PMSF). Êîíöåíòðàöèþ áåëêà â ýêñòðàêòàõ
îïðåäåë ëè ìåòîäîì Áðåäôîðäà. Ýêñòðàêòû ïðîïóñêàëè ÷åðåç ìèêðîêîëîíêè ñ 20 ìêë NiNTA àãàðîçû.  êà÷åñòâå ïðîìûâî÷íîãî ðàñòâîðà èñïîëüçîâàëè áóôåð 1 ñ äîáàâëåíèåì
Ñòðàíèöà: 5
RU 2 302 460 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
èìèäàçîëà äî êîíöåíòðàöèè 20 ìÌ. Ïîñëå 3-êðàòíîé ïðîìûâêè áåëîê ñ êîëîíîê ýëþèðîâàëè
â 150 ìêë áóôåðà 1 ñ äîáàâëåíèåì èìèäàçîëà äî êîíöåíòðàöèè 150 ìÌ. Äë àíàëèçà
èñïîëüçîâàëè 75 ìêë ïðèãîòîâëåííîãî ýëþàòà (30 íã áåëêà).
Íà ôèã.2 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû Âåñòåðí-áëîòòèíãà äâóõ íåçàâèñèìûõ
ìîíîèíñåðöèîííûõ òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé òàáàêà, ãäå 7 è 15 - ýëþàòû èç ýêñòðàêòîâ
òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ¹7 è ¹15 ñîîòâåòñòâåííî; Í - ýëþàò èç ýêñòðàêòà íåòðàíñãåííîãî
ðàñòåíè ; Ê+ - ýëþàò èç ýêñòðàêòà íåòðàíñãåííîãî ðàñòåíè ñ äîáàâëåííûì
ðåêîìáèíàíòíûì ÈË-18 ÷åëîâåêà, ïîëó÷åííûì èç êëåòîê E.coli, äî êîíöåíòðàöèè 0,01%
ñóììàðíîãî áåëêà (400 íã/ìë ýêñòðàêòà); Á - 700 íã ðåêîìáèíàíòíîãî ÈË-18 ÷åëîâåêà,
ïîëó÷åííîãî èç êëåòîê E.coli. Ìîë ðíà ìàññà ÈË-18 ÷åëîâåêà, ñîäåðæàùåãî
ïîëèãèñòèäèíîâóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü è ñàéò ãèäðîëèçà ôåðìåíòîì òðîìáèíîì
ñîñòàâë åò 20 êÄà, ÷òî õàðàêòåðíî èìåííî äë çðåëîé ôîðìû.
Òàêèì îáðàçîì, ó îáîèõ ðàñòåíèé ïîêàçàíî ïðèñóòñòâèå áåëêà, ñîîòâåòñòâóþùåãî ïî
ìîëåêóë ðíîé ìàññå è èììóíîëîãè÷åñêèì ñâîéñòâàì ÈË-18 ÷åëîâåêà, ïîëó÷åííîìó èç
êëåòîê E.coli.  êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîë èñïîëüçîâàëè ýëþàò, ïîëó÷åííûé èç
ýêñòðàêòà íåòðàíñãåííîãî ðàñòåíè ñ äîáàâëåííûì áàêòåðèàëüíûì ÈË-18 ÷åëîâåêà äî
êîíöåíòðàöèè 0,01% ñóììàðíîãî áåëêà. Ñðàâíèâ èíòåíñèâíîñòè ïîëîñ íà äîðîæêàõ 7, 15 è
Ê, ìîæíî çàêëþ÷èòü, ÷òî ñîäåðæàíèå ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà ó ïðîàíàëèçèðîâàííûõ
ðàñòåíèé ñîñòàâèëî áîëåå 0,01% ñóììàðíîãî áåëêà èëè â ïåðåñ÷åòå íà ñûðîé âåñ ðàñòåíè - 1,3 ìã/êã.
Ïðèìåð 3. Èññëåäîâàíèå áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè ðåêîìáèíàíòíîãî ðàñòèòåëüíîãî
õèìåðíîãî ÈË-18 ÷åëîâåêà
Ïðè ïðèãîòîâëåíèè ìàòåðèàëà äë àíàëèçà áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè ñóììàðíûé áåëîê
èç 0,3 ã ëèñòüåâ òàáàêà ýêñòðàãèðîâàëè â 1 ìë Áóôåðà 1 (50 ìÌ Tris-HCl pH 8.0, 500 ìÌ
NaCl 0.1% Tween-20, 5 ìÌ β -ME, 1 ìÌ PMSF). Êîíöåíòðàöèþ áåëêà â ýêñòðàêòàõ
îïðåäåë ëè ìåòîäîì Áðåäôîðäà. Ýêñòðàêòû ïðîïóñêàëè ÷åðåç ìèêðîêîëîíêè ñ 20 ìêë NiNTA àãàðîçû.  êà÷åñòâå ïðîìûâî÷íîãî ðàñòâîðà èñïîëüçîâàëè áóôåð 1 ñ äîáàâëåíèåì
èìèäàçîëà äî êîíöåíòðàöèè 20 ìÌ. Ïîñëå 3-êðàòíîé ïðîìûâêè áåëîê ñ êîëîíîê ýëþèðîâàëè
â 150 ìêë áóôåðà 1 ñ äîáàâëåíèåì èìèäàçîëà äî êîíöåíòðàöèè 150 ìÌ. Ýëþàò
äèàëèçîâàëè ïðîòèâ 50 ìÌ íàòðèé-ôîñôàòíîãî áóôåðà (ðÍ 7.4) ñ 0.15 Ì ñîë íîé êèñëîòû.
Äë àíàëèçà èñïîëüçîâàëè 10 ìêë ïðèãîòîâëåííîãî ýëþàòà.
Äë èçó÷åíèè áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè ðåêîìáèíàíòíîãî ðàñòèòåëüíîãî ÈË-18 ÷åëîâåêà
èññëåäîâàëîñü åãî âëè íèå íà ñïîíòàííóþ è ñòèìóëèðîâàííóþ ïðîäóêöèþ TNFα è IFNγ.
Ìîíîíóêëåàðíóþ ôðàêöèþ êëåòîê ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ïîëó÷àëè ó çäîðîâûõ äîíîðîâ
ìåòîäîì öåíòðèôóãèðîâàíè â ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîëëà. Êîëè÷åñòâåííîå
îïðåäåëåíèå TNFα è IFNγ ïðîâîäèëè ìåòîäîì ýëåêòðîõåìèëþìèíèñöåíöèè. Äë ïîëó÷åíè êàëèáðîâî÷íûõ êðèâûõ èñïîëüçîâàëè ðåêîìáèíàíòíûå TNFα è IFNγ ÷åëîâåêà (R&D
Systems, UK). Ïîëèêëîíàëüíûå è ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà ïîëó÷åíû èç Pepro Tech, Inc.
(NJ, USA). Êóëüòèâèðîâàíèå ìîíîíóêëåàðíûõ êëåòîê ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ÷åëîâåêà â
ïðèñóòñòâèè ÊîíÀ (10 ìêã/ìë) èëè ïîëó÷åííîãî ýëþàòà (10 ìêë) ïðèâîäèò ê äîñòîâåðíîìó
ïîâûøåíèþ óðîâí ïðîäóêöèè TNFα è IFNγ, ñîâìåñòíà ñòèìóë öè êëåòîê ÊîíÀ è ýëþàòà
óñèëèâàåò ýòó ïðîäóêöèþ. Äàííûå ïî èíäóêöèè TNFα (24 ÷ èíêóáàöèè) è IFNγ (48 ÷
èíêóáàöèè) â ìîíîíóêëåàðíûõ êëåòêàõ ÷åëîâåêà ïðåäñòàâëåíû â òàáëèöå.
Òàáëèöà
45
50
control Con A (10 mkg/ml) Ýëþàò Con A (10 mkg/ml) + Ýëþàò
IFNγ, pg/ml 280±57
869±152
624±112
1986±268
TNFα, pg/ml 248±56
510±134
460 ±85
2238±427
Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî ýëþàò, îáîãàùåííûé â îòíîøåíèè
ñîäåðæàíè ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà, íåñóùåãî ïîëèãèñòèäèíîâóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü,
ñïîñîáåí ñòèìóëèðîâàòü ñèíòåç TNFα è IFNγ â ìîíîíóêëåàðíîé ôðàêöèè ÷åëîâåêà ïðè
êîñòèìóë öèè Con À, ÷òî õàðàêòåðíî äë áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè çðåëîé ôîðìû
èíòåðåëåéêèíà 18 ÷åëîâåêà.
Ñòðàíèöà: 6
RU 2 302 460 C1
Òàêèì îáðàçîì, ïðèâåäåííûå äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî ñêîíñòðóèðîâàííà ïëàçìèäíà ÄÍÊ pBi101-IL18 îáåñïå÷èâàåò ïåðåíîñ íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè
õèìåðíîãî ÈË-18 ÷åëîâåêà â ãåíîìíóþ ÄÍÊ ðàñòåíèé è ïðîäóêöèþ çðåëîé ôîðìû
èíòåðëåéêèíà 18 ÷åëîâåêà, îáëàäàþùåé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ.
5
10
Ôîðìóëà èçîáðåòåíè Ðåêîìáèíàíòíà ïëàçìèäíà ÄÍÊ pBi101-IL18, êîäèðóþùà ñèíòåç èíòåðëåéêèíà-18
÷åëîâåêà â òðàíñãåííûõ ðàñòåíè õ, èìåþùà ðàçìåð 15 ò.ï.í è ñîäåðæàùà ñëåäóþùèå
êîíñòðóêòèâíûå ýëåìåíòû: ôðàãìåíò ÄÍÊ âåêòîðíîé ïëàçìèäû pBi101, ðàçìåðîì 13,9 ò.ï.í;
NdeI-BamHI/BglII ôðàãìåíòà ÄÍÊ, âë þùèéñ ó÷àñòêîì êÄÍÊ ãåíà ÈË-18 ÷åëîâåêà; NcoINdeI ôðàãìåíò ïëàçìèäû ðÅÒ15b, êîäèðóþùèé N-êîíöåâîé ïîëèïåïòèä èç øåñòè
àìèíîêèñëîò ãèñòèäèíà è ñàéò ãèäðîëèçà ôåðìåíòîì òðîìáèíîì; 5'UTR îáëàñòü èç ãåíîìà
âèðóñà ãðàâèðîâêè òàáàêà; äâîéíîé 35S CaMV ïðîìîòîð èç ãåíîìà âèðóñà ìîçàèêè öâåòíîé
êàïóñòû; 3'UTR îáëàñòü èç ãåíîìà âèðóñà ìîçàèêè öâåòíîé êàïóñòû.
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòðàíèöà: 7
CL
RU 2 302 460 C1
Ñòðàíèöà: 8
DR