Система глутатиона участвует в регуляции апоптоза опухолевых

Оригинальные статьи
ìÑä 616-006-018-091.818:577.15
СИСТЕМА ГЛУТАТИОНА УЧАСТВУЕТ В РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ
КЛЕТОК
Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Степовая Е.А., Закирова Е.В., Наумова А.И., Веснина О.Н.,
Шахристова Е.В., Орлов Д.С., Якушина В.Д., Новицкий В.В.
Îðãàíèçàöèÿ, ã. Ñèáèðñêèé ãîñóäàðñòâåííûé ìåäèöèíñêèé óíèâåðñèòåò, ã. Òîìñê
РЕЗЮМЕ
Öåëü èññëåäîâàíèÿ – âûÿâèòü ðîëü êîìïîíåíòîâ ñèñòåìû ãëóòàòèîíà â ðåàëèçàöèè ðåöåïòîðíîãî
ïóòè àïîïòîçà îïóõîëåâûõ êëåòîê ëèíèè Jurkat.
Îöåíêó ðåàëèçàöèè àïîïòîçà ïðîâîäèëè ìåòîäîì ïðîòî÷íîé öèòîôëþîðèìåòðèè ñ èñïîëüçîâàíèåì
FITS-ìå÷åííîãî àííåêñèíà V è ïðîïèäèÿ èîäèäà, êîëè÷åñòâà TNF R1- è Fas-ïðåçåíòèðóþùèõ êëåòîê; àêòèâíîñòü êàñïàçû-3 ðåãèñòðèðîâàëè ñïåêòðîôëþîðèìåòðè÷åñêèì ìåòîäîì. Îïðåäåëåíèå
ñîäåðæàíèÿ âîññòàíîâëåííîãî è îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà îñóùåñòâëÿëè ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèì
ìåòîäîì.
Ìàòåðèàëîì äëÿ èññëåäîâàíèÿ ñëóæèëè îïóõîëåâûå êëåòêè ëèíèè Jurkat: èíòàêòíûå è èíêóáèðîâàííûå â ïðèñóòñòâèè ñåëåêòèâíîãî èíãèáèòîðà êëþ÷åâîãî ôåðìåíòà ñèíòåçà ãëóòàòèîíà – áóòèîíèí-ñóëüôîêñèìèíà.
Èññëåäîâàíèå ïîêàçàëî, ÷òî ñèñòåìà ãëóòàòèîíà èãðàåò âàæíóþ ðåãóëÿòîðíóþ ðîëü â àêòèâàöèè
ðåöåïòîðíîãî ïóòè àïîïòîçà îïóõîëåâûõ êëåòîê ëèíèè Jurkat.
Êîìïîíåíòû ñèñòåìû ãëóòàòèîíà ÿâëÿþòñÿ ìèøåíÿìè äëÿ àêòèâàöèè ïðîãðàììèðîâàííîé ãèáåëè
ïðè îïóõîëåâîì ðîñòå.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: îïóõîëåâûå êëåòêè ëèíèè Jurkat, àïîïòîç, TNF, Fas, ñèñòåìà ãëóòàòèîíà.
Введение
Èäåíòèôèêàöèÿ ìîëåêóëÿðíûõ ìåõàíèçìîâ ðåãóëÿöèè àïîïòîçà ÿâëÿåòñÿ àêòóàëüíûì íàïðàâëåíèåì
ôóíäàìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé. Èçâåñòíî, ÷òî ïàòîãåíåç îïóõîëåâîãî ðîñòà ñîïðîâîæäàåòñÿ íå òîëüêî
äèçðåãóëÿöèåé àïîïòîçà, íî è ôîðìèðîâàíèåì îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà â êëåòêàõ [1, 2]. Àêòèâíûå ôîðìû
êèñëîðîäà ìîãóò ðàññìàòðèâàòüñÿ íå òîëüêî ñ ïîçèöèè
ïîâðåæäàþùèõ àãåíòîâ, íî è êàê ðåãóëÿòîðíûå ìîëåêóëû. Ðåãóëÿöèÿ ïåðåäà÷è ñèãíàëà â êëåòêàõ ñâÿçàíà ñ
èçìåíåíèÿìè ðåäîêñ-ñîñòîÿíèÿ òèîëîâûõ ãðóïï â áåëêàõ è ãëóòàòèîíà. Òðàíñïîðò ýëåêòðîíîâ ïî áîêîâûì
öåïÿì ôóíêöèîíàëüíûõ –ÑÍ2–SH-ãðóïï êîíñåðâàòèâíûõ îñòàòêîâ öèñòåèíà áåëêîâ îáóñëîâëèâàåò èõ ðåäîêñ-÷óâñòâèòåëüíîñòü [3]. ×èñëî óñòàíîâëåííûõ ðåäîêñ-÷óâñòâèòåëüíûõ ïóòåé ïåðåäà÷è ñèãíàëà â êëåòêàõ
ïîñòîÿííî âîçðàñòàåò. Èññëåäîâàíèÿ ïîñëåäíèõ ëåò
Íîñàðåâà Îëüãà Ëåîíèäîâíà, òåë. 8-923-411-19-51;
e-mail: [email protected]
ñâÿçàíû ñ âûÿñíåíèåì ðîëè ãëóòàòèîíà â ýêñïðåññèè
ãåíîâ, àêòèâàöèè ôàêòîðîâ òðàíñêðèïöèè, âíóòðèêëåòî÷íîé ñèãíàëèçàöèè, ðåãóëÿöèè àêòèâíîñòè ôåðìåíòîâ, àïîïòîçà è äðóãèõ ïðîöåññàõ [4, 5]. Òàê, ïîâûøåíèå âíóòðèêëåòî÷íîãî óðîâíÿ âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà èíãèáèðóåò ýêñïðåññèþ ñóáúåäèíèö c-Fos è Jun
òðàíñêðèïöèîííîãî ôàêòîðà ÀÐ-1, ó÷àñòâóþùåãî â
àïîïòîçå è êëåòî÷íîé ïðîëèôåðàöèè [6]. Îäíîâðåìåííî ãëóòàòèîí ó÷àñòâóåò â ðàáîòå ãëóòàòèîí-çàâèñèìûõ
ôåðìåíòîâ, êîòîðûì ïðèíàäëåæèò âåäóùàÿ ðîëü íå
òîëüêî â îáåñïå÷åíèè àíòèîêñèäàíòíûõ ïðîöåññîâ, íî
è â ðåãóëÿöèè ñòðóêòóðû è ôóíêöèé áèîëîãè÷åñêèõ
ìåìáðàí, îáåñïå÷èâàÿ àäåêâàòíîå ñðàáàòûâàíèå ðåöåïòîðíîãî àïïàðàòà êëåòêè. Âîññòàíîâëåííûé ãëóòàòèîí
ïðåäîòâðàùàåò îêèñëåíèå SH-ãðóïï èëè âîññòàíàâëèâàåò S–S-ñâÿçè, èíäóöèðîâàííûå îêèñëèòåëüíûì
ñòðåññîì, èíàêòèâèðóåò ñâîáîäíûå ðàäèêàëû [7].
Öåëü èññëåäîâàíèÿ – âûÿñíèòü ðîëü êîìïîíåíòîâ
ñèñòåìû ãëóòàòèîíà â ðåàëèçàöèè ðåöåïòîðíîãî ïóòè
àïîïòîçà îïóõîëåâûõ êëåòîê ëèíèè Jurkat.
Бюллетень сибирской медицины, 2014, том 13, № 5, с. 73–78
73
Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Степовая Е.А. и др.
Система глутатиона участвует в регуляции апоптоза опухолевых клеток
Материал и методы
 ðàáîòå èñïîëüçîâàëèñü êëåòêè ëèíèè Jurkat (Òëèìôîáëàñòíûé ëåéêîç ÷åëîâåêà), ïîëó÷åííûå èç Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ (Ðîññèÿ, ã. Ñàíêò-Ïåòåðáóðã).
Êóëüòèâèðîâàíèå îïóõîëåâûõ êëåòîê ëèíèè Jurkat
ïðîâîäèëè ñóñïåíçèîííûì ìåòîäîì â ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå (90% RPMI-1640 (Âåêòîð-Áåñò, Ðîññèÿ),
10% ýìáðèîíàëüíîé òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêè (Invitrogen,
ÑØÀ), 0,3 ìã/ìë L-ãëóòàìèíà (Âåêòîð-Áåñò, Ðîññèÿ),
2 ììîëü Hepes (Flow, Âåëèêîáðèòàíèÿ) è 100 ìêã/ìë
ãåíòàìèöèíà). Æèçíåñïîñîáíîñòü êëåòîê îöåíèâàëè ñ
ïîìîùüþ 0,5%-ãî ðàñòâîðà òðèïàíîâîãî ñèíåãî
(ÄÈÀÝÌ, Ãåðìàíèÿ). Äëÿ ïîñòàíîâêè ýêñïåðèìåíòà
èñïîëüçîâàëèñü êóëüòóðû êëåòîê, ñîäåðæàùèå íå áîëåå 5% ïîãèáøèõ êëåòîê. Äëÿ âûÿâëåíèÿ ó÷àñòèÿ ãëóòàòèîíà â ðåàëèçàöèè ðåöåïòîðíîãî ïóòè ïðîãðàììèðîâàííîé ãèáåëè îïóõîëåâûå êëåòêè èíêóáèðîâàëè â
òå÷åíèå 18 ÷ ïðè 37 °Ñ è â 5%-é àòìîñôåðå ÑÎ2 â ïðèñóòñòâèè áóòèîíèí-ñóëüôîêñèìèíà (BSO) (Sigma,
ÑØÀ) – èíãèáèòîðà êëþ÷åâîãî ôåðìåíòà ñèíòåçà òèîëà γ-ãëóòàìèë-öèñòåèíñèíòåòàçû â êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 1 ììîäü [8]. Ïîñëå èíêóáàöèè êëåòêè òðèæäû
îòìûâàëè 0,01 ìîëü íàòðèé-ôîñôàòíûì áóôåðîì
(ðÍ = 7,4) è èñïîëüçîâàëè äëÿ îïðåäåëåíèÿ ïðîöåíòà
TNF R1-, Fas-ïîçèòèâíûõ, àïîïòîòè÷åñêè èçìåíåííûõ
êëåòîê ëèáî ðåñóñïåíäèðîâàëè â áóôåðå ñ äîáàâëåíèåì
1% òðèòîíà X-100, âûäåðæèâàëè íà ëüäó è ãîòîâèëè
ëèçàò ñ ñîõðàíåíèåì ñòàíäàðòíîé êîíöåíòðàöèè êëåòîê äëÿ îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè êàñïàçû-3. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñîäåðæàíèÿ êîìïîíåíòîâ ñèñòåìû ãëóòàòèîíà
ëèçàò îïóõîëåâûõ êëåòîê äåïðîòåèíèðîâàëè ñ 5%-ì
ðàñòâîðîì ñóëüôîñàëèöèëîâîé êèñëîòû [9]. Äàëåå
îöåíèâàëè ñîäåðæàíèå âîññòàíîâëåííîãî (GSH) è
îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà (GSSG) ìåòîäîì ôåðìåíòàòèâíîé ðåöèðêóëÿöèè è áëîêèðîâàíèÿ SH-ãðóïï GSH
âèíèëïèðèëèäèíîì (Walko, ßïîíèÿ). Äëÿ ðàñ÷åòà êîíöåíòðàöèè ãëóòàòèîíà ñòðîèëè êàëèáðîâî÷íûé ãðàôèê,
èñïîëüçóÿ ðàñòâîð GSH è GSSG (Sigma, ÑØÀ) ñ êîíöåíòðàöèÿìè îò 3 äî 100 ìêìîëü [10]. Ðåçóëüòàòû
ïðåäñòàâëÿëè â íìîëü/ìã áåëêà. Äîïîëíèòåëüíî ðàññ÷èòûâàëè âåëè÷èíó ñîîòíîøåíèÿ GSH/GSSG êàê ïîêàçàòåëü ðåäîêñ-ñòàòóñà êëåòêè.
Êîíöåíòðàöèþ áåëêà â ïðîáàõ îïðåäåëÿëè ìåòîäîì Ì.Ì. Áðåäôîðäà [11], èñïîëüçóÿ êàëèáðîâî÷íûé
ãðàôèê, ïîñòðîåííûé íà îñíîâå ñòàíäàðòíûõ ðàñòâîðîâ áû÷üåãî ñûâîðîòî÷íîãî àëüáóìèíà ñ êîíöåíòðàöèÿìè îò 1 äî 10 ìêã íà 100 ìë.
Îöåíêó àïîïòîçà îïóõîëåâûõ êëåòîê ïðîâîäèëè
ìåòîäîì ïðîòî÷íîé öèòîôëþîðèìåòðèè ñ èñïîëüçîâàíèåì FITC-ìå÷åííîãî àííåêñèíà V è ïðîïèäèÿ èîäèäà
(BD, Íèäåðëàíäû) ñîãëàñíî èíñòðóêöèè ôèðìû-ïðî74
èçâîäèòåëÿ. Ìåòîä îñíîâàí íà ñïåöèôè÷åñêîì ñâÿçûâàíèè FITC-ìå÷åííîãî àííåêñèíà V ñ ôîñôàòèäèëñåðèíîì è ñïîñîáíîñòè ïðîïèäèÿ èîäèäà (PI) èíòåðêîëèðîâàòü ñ ìîëåêóëîé ÄÍÊ. Ïîäñ÷åò êîëè÷åñòâà
FITC+/PI–- è FITC+/PI+-ìå÷åííûõ êëåòîê îñóùåñòâëÿëè ê îáùåìó ÷èñëó èçó÷àåìûõ êëåòîê è âûðàæàëè â
ïðîöåíòàõ.
Îöåíêó êîëè÷åñòâà TNF R1- è Fas-ïðåçåíòèðóþùèõ
îïóõîëåâûõ êëåòîê ïðîâîäèëè ìåòîäîì ïðîòî÷íîé
öèòîôëþîðèìåòðèè ñ èñïîëüçîâàíèåì ìîíîêëîíàëüíûõ
àíòèòåë ê ÷åëîâå÷åñêîìó àíòèãåíó CD120 è CD95 (R&D
Systems, ÑØÀ) ñîãëàñíî èíñòðóêöèè ôèðìû-ïðîèçâîäèòåëÿ.
Àêòèâíîñòü êàñïàçû-3 îïðåäåëÿëè ñïåêòðîôëþîðèìåòðè÷åñêèì ìåòîäîì ïî ñïîñîáíîñòè èçáèðàòåëüíîãî ãèäðîëèçà ñèíòåòè÷åñêîãî òåòðàïåïòèäíîãî
ôëþîðèãåííîãî ñóáñòðàòà N-acetyl-(Asp-Glu-Val-Asp)7-amino-4-methylcoumarin (Ac-DEVD-AMC) (Sigma,
ÑØÀ) ñ îáðàçîâàíèåì ÀÌÑ, êîòîðûé ôëþîðåñöèðîâàë â äèàïàçîíå äëèí âîëí 430–460 íì (ìàêñèìóì âîçáóæäåíèÿ ôëþîðåñöåíöèè ïðè äëèíå âîëíû 380 íì).
Àêòèâíîñòü êàñïàçû-3 âûðàæàëè â ïèêîìîëÿõ îñâîáîæäàåìîãî àìèíî-4-ìåòèëêóìàðèíà â ìèíóòó íà 1 ìã
áåëêà â ïðîáå [12, 13].
Ñòàòèñòè÷åñêóþ îáðàáîòêó ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè ïðîãðàììû SPSS 13.0.
Ïðîâåðêó íîðìàëüíîñòè ðàñïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâåííûõ ïîêàçàòåëåé îñóùåñòâëÿëè ñ èñïîëüçîâàíèåì êðèòåðèÿ Øàïèðî–Óèëêà. Äîñòîâåðíîñòü ðàçëè÷èé îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ íåïàðàìåòðè÷åñêîãî êðèòåðèÿ Ìàííà–Óèòíè. Äàííûå ïðåäñòàâëåíû â âèäå ìåäèàíû Ìå,
âåðõíåãî è íèæíåãî êâàðòèëåé (Q1–Q3). Íàëè÷èå ñâÿçè
ìåæäó ïîêàçàòåëÿìè ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì
êîððåëÿöèîííîãî àíàëèçà ïî ìåòîäó Ñïèðìåíà. Ñòàòèñòè÷åñêè çíà÷èìûìè ñ÷èòàëèñü ðàçëè÷èÿ ïðè ð < 0,05.
Результаты и обсуждение
Äîáàâëåíèå â ñðåäó èíêóáèðîâàíèÿ îïóõîëåâûõ êëåòîê BSO âûçûâàëî áûñòðîå èñòîùåíèå ïóëà GSH è ñîïðîâîæäàëîñü ñòàòèñòè÷åñêè çíà÷èìûì ñíèæåíèåì åãî
êîíöåíòðàöèè â 5,1 ðàç (ð < 0,05). Îäíàêî êîíöåíòðàöèÿ
äèñóëüôèäà ãëóòàòèîíà èìåëà ñîïîñòàâèìûå çíà÷åíèÿ
ïî ñðàâíåíèþ ñ èíòàêòíûìè îïóõîëåâûìè êëåòêàìè (ðèñóíîê). GSH ñóùåñòâóåò â êëåòêå â ðàâíîâåñèè ñ ãëóòàòèîíîì äèñóëüôèäîì (GSSG), à îòíîøåíèå êîíöåíòðàöèé GSH/GSSG ñëóæèò ïîêàçàòåëåì ðåäîêñ-ñîñòîÿíèÿ
êëåòêè [7, 14].  èíòàêòíûõ îïóõîëåâûõ êëåòêàõ âåëè÷èíà ñîîòíîøåíèÿ GSH/GSSG èìåëà çíà÷åíèÿ, ðàâíûå 13,1
(11,4–14,2), à ïðè äîáàâëåíèè èíãèáèòîðà ñèíòåçà òèîëà
de novo äîñòèãàëñÿ ñäâèã îòíîøåíèÿ GSH/GSSG â ñòîðîíó âîçðàñòàíèÿ äèñóëüôèäà è ïîêàçàòåëü áûë ðàâåí
çíà÷åíèÿì 3,3 (2,5–4,1) (òàáëèöà). Èçâåñòíî, ÷òî GSSG
Бюллетень сибирской медицины, 2014, том 13, № 5, с. 73–78
Оригинальные статьи
ÿâëÿåòñÿ áîëåå ðåàêöèîííî-ñïîñîáíîé ìîëåêóëîé ïî
ñðàâíåíèþ ñ GSH è ñïîñîáåí âñòóïàòü â òèîëäèñóëüôèäíûé îáìåí ñ àêòèâíûìè SH-ãðóïïàìè áåëêîâ
ñ îáðàçîâàíèåì ñìåøàííîãî äèñóëüôèäíîãî êîìïëåêñà
èëè ìîæåò îêèñëÿòü ýíäîãåííûå SH-ãðóïïû ñ îáðàçîâàíèåì äèñóëüôèäîâ [7]. Ïîýòîìó óâåëè÷åíèå êîíöåíòðàöèè GSSG, ñîïðÿæåííîå ñ èñòîùåíèåì ïóëà GSH,
ñïîñîáíî âûçûâàòü ãëóòàòèîíèëèðîâàíèå ðåäîêñ÷óâñòâèòåëüíûõ áåëêîâ ñ ôåðìåíòàòèâíîé è ðåöåïòîðíîé ôóíêöèåé, â êàòàëèòè÷åñêîì äîìåíå êîòîðûõ
èìåþòñÿ ôóíêöèîíàëüíî âàæíûå îñòàòêè öèñòåèíà.
3, 0
Âîññòàíîâëåííûé ãëóòàòèîí
Îêèñëåííûé ãëóòàòèîí
2, 5
Ìåäèàíà
25%–75%
нмоль/ мг белка
2, 0
Min–max
1, 5
1, 0
*
0, 5
0, 0
- 0, 5
J ur kat
J ur kat +BSO
Óðîâåíü âîññòàíîâëåííîãî è îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà (íìîëü/ìã
áåëêà) â èíòàêòíûõ îïóõîëåâûõ êëåòêàõ ëèíèè Jurkat è ïðè äåéñòâèè ñåëåêòèâíîãî èíãèáèòîðà ñèíòåçà ãëóòàòèîíà – áóòèîíèíñóëüôîêñèìèíà (BSO); * – óðîâåíü ñòàòèñòè÷åñêîé çíà÷èìîñòè
ðàçëè÷èé ïî ñðàâíåíèþ ñ èíòàêòíûìè îïóõîëåâûìè êëåòêàìè
ëèíèè Jurkat ïðè p < 0,05
Ïðîâåäåíèå îöåíêè êîëè÷åñòâà àïîïòîòè÷åñêè èçìåíåííûõ êëåòîê ëèíèè Jurkat â óñëîâèÿõ èõ êóëüòèâèðîâàíèÿ ñî ñïåöèôè÷åñêèì èíãèáèòîðîì ñèíòåçà
ãëóòàòèîíà BSO ïîêàçàëî ñòàòèñòè÷åñêè çíà÷èìîå óâåëè÷åíèå ïðîöåíòà àííåêñèí-ïîëîæèòåëüíûõ êëåòîê â
8,8 ðàçà (ð < 0,05) ïî ñðàâíåíèþ ñ èíòàêòíîé êóëüòóðîé (òàáëèöà). Ïîâûøåííûé óðîâåíü âîññòàíîâëåííîé
ôîðìû ãëóòàòèîíà ïîäàâëÿåò ïðîãðàììèðîâàííóþ êëåòî÷íóþ ãèáåëü, òàê êàê äàííûé òèîë ðåãóëèðóåò ðåäîêñ-ãîìåîñòàç îïóõîëåâîé êëåòêè è àêòèâíîñòü ìíîãèõ òðàíñêðèïöèîííûõ ôàêòîðîâ, ñïîñîáñòâóþùèõ
âûæèâàíèþ îïóõîëåâûõ êëåòîê [6, 15].
Äëÿ îöåíêè ìîëåêóëÿðíûõ ìåõàíèçìîâ ðåöåïòîðíîé
ðåãóëÿöèè àïîïòîçà îïóõîëåâûõ êëåòîê â óñëîâèÿõ äåéñòâèÿ áëîêàòîðà ñèíòåçà ãëóòàòèîíà áûëè îöåíåíû
TNF R1, FAS è êàñïàçà-3. Áûëî ïîêàçàíî, ÷òî äîáàâëåíèå BSO â êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 1 ììîëü óâåëè÷èâàëî
â 5,8 ðàçà (ð < 0,05) è â 18,4 ðàçà (ð < 0,05) êîëè÷åñòâî
êëåòîê, ïðåçåíòèðóþùèõ íà ñâîåé ïîâåðõíîñòè TNF R1
è Fas, ïî ñðàâíåíèþ ñ èíòàêòíûìè êëåòêàìè (òàáëèöà).
ëÓ‰ÂʇÌË ‡ÌÌÂÍÒËÌ-, TNF R1-, Fas-ÔÓÎÓÊËÚÂθÌ˚ı ÍÎÂÚÓÍ,
‡ÍÚË‚ÌÓÒÚ¸ ͇ÒÔ‡Á˚-3 Ë ‚Â΢Ë̇ ÒÓÓÚÌÓ¯ÂÌËfl ‚ÓÒÒÚ‡ÌÓ‚ÎÂÌÌÓ„Ó
„ÎÛÚ‡ÚËÓ̇ Í ÓÍËÒÎÂÌÌÓÏÛ „ÎÛÚ‡ÚËÓÌÛ ‚ ËÌÚ‡ÍÚÌ˚ı ÓÔÛıÓ΂˚ı
ÍÎÂÚ͇ı ÎËÌËË Jurkat Ë ÔË ‰ÂÈÒÚ‚ËË ÒÂÎÂÍÚË‚ÌÓ„Ó ËÌ„Ë·ËÚÓ‡
ÒËÌÚÂÁ‡ „ÎÛÚ‡ÚËÓ̇ – ·ÛÚËÓÌËÌ-ÒÛθÙÓÍÒËÏË̇ (BSO), Må (Q1–Q3)
Jurkat
Jurkat + BSO
Êîëè÷åñòâî àííåêñèíïîëîæèòåëüíûõ êëåòîê, %
5,2
(4,0–5,6)
45,9
(37,5–67,1) ð < 0,05
Êîëè÷åñòâî TNF-R1ïîëîæèòåëüíûõ êëåòîê, %
9,5
(7,3–14,2)
55,4
(52,7–70,0) ð < 0,05
Êîëè÷åñòâî Fasïîëîæèòåëüíûõ êëåòîê, %
4,3
(2,1–8,9)
78,9
(77,5–87,2) ð < 0,05
Êàñïàçà 3, ïìîëü/(ìèí · ìã
áåëêà)
36,6
(22,7–43,9)
134,2
(129,5–140,2) ð < 0,05
Âîññòàíîâëåííûé
ãëóòàòèîí/îêèñëåííûé ãëóòàòèîí
13,1
(11,4–14,2)
3,3
(2,5–4,1) ð < 0,05
Ï ð è ì å ÷ à í è å. ð – óðîâåíü ñòàòèñòè÷åñêîé çíà÷èìîñòè ðàçëè÷èé ïî ñðàâíåíèþ ñ èíòàêòíûìè îïóõîëåâûìè êëåòêàìè ëèíèè
Jurkat.
Óâåëè÷åíèå êîëè÷åñòâà TNF R1- è FAS-ïðåçåíòèðóþùèõ êëåòîê, âåðîÿòíî, ñâÿçàíî ñî ñíèæåíèåì ðåäîêñïîòåíöèàëà îïóõîëåâûõ êëåòîê ëèíèè Jurkat â ïðèñóòñòâèè BSO. Ýòî ïîäòâåðæäàåò íàëè÷èå îòðèöàòåëüíîé
êîððåëÿöèîííîé ñâÿçè ìåæäó âåëè÷èíîé ñîîòíîøåíèÿ
GSH/GSSG è êîëè÷åñòâîì TNF R1- (r = –0,5, ð < 0,05)
è FAS-ïðåçåíòèðóþùèõ êëåòîê (r = –0,5, ð < 0,05)
ïðè äîáàâëåíèè èíãèáèòîðà ñèíòåçà òèîëà de novo.
Ðåàëèçàöèÿ TNF R1- è FAS-îïîñðåäîâàííîãî ïóòè
àïîïòîçà âêëþ÷àåò â ñåáÿ àêòèâàöèþ êèíàç. Êðîìå
ýòîãî, àêòèâèðîâàííûå ðåöåïòîðû ñâÿçûâàþòñÿ ñ áåëêàìè, èìåþùèìè äîìåíû SH2, ðàñïîçíàþùèìè ôîñôîòèðîçèí-ñîäåðæàùèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè àêòèâèðîâàííîãî ðåöåïòîðà. Ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ïðåîáëàäàíèå GSSG ìîãëî ïîâëå÷ü ãëóòàòèîíèëèðîâàíèå
îñòàòêîâ öèñòåèíà â áåëêàõ, îáåñïå÷èâàþùèõ ñèãíàëüíóþ òðàíñäóêöèþ. Ðÿäîì àâòîðîâ áûëà ïîêàçàíà ñïîñîáíîñòü GSSG îêàçûâàòü ðåöåïòîðîïîñðåäîâàííîå
âëèÿíèå íà âíóòðèêëåòî÷íûå ïðîöåññû [16, 17].
Áëîêèðîâàíèå ñèíòåçà ãëóòàòèîíà de novo â îïóõîëåâîé êëåòêå ïðîÿâëÿëîñü àêòèâàöèåé ýôôåêòîðíîé
êàñïàçû-3. Òàê, â ïðèñóòñòâèè BSO â îïóõîëåâûõ
êëåòêàõ ïðîèñõîäèëî ñòàòèñòè÷åñêè çíà÷èìîå óâåëè÷åíèå àêòèâíîñòè ôåðìåíòà â 3,7 ðàçà (ð < 0,05), ïî
ñðàâíåíèþ ñ èíòàêòíûìè êëåòêàìè (òàáëèöà). Èçâåñòíî,
÷òî ïðè âîâëå÷åíèè êëåòêè â TNF R1- è FAS-îïîñðåäîâàííûé ïóòü àïîïòîçà ïðîèñõîäèò ïðÿìàÿ àêòèâàöèÿ
êàñïàçû-3 ïîñðåäñòâîì êàñïàçû-8 [18]. Èñõîäÿ èç ïîëó÷åííûõ äàííûõ, ìîæíî çàêëþ÷èòü, ÷òî êîìïîíåíòû
ñèñòåìû ãëóòàòèîíà âëèÿþò íà àêòèâàöèþ ýôôåêòîðíîé êàñïàçû-3. Â ñâÿçè ñ ýòèì ìîæíî ïðåäïîëîæèòü,
÷òî ñîîòíîøåíèå âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà ê îêèñëåííîìó ãëóòàòèîíó ðåãóëèðóåò ðåöåïòîðíûé ïóòü
ðåàëèçàöèè àïîïòîçà íå òîëüêî ÷åðåç ÀÐ-1, NFk-B,
Бюллетень сибирской медицины, 2014, том 13, № 5, с. 73–78
75
Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Степовая Е.А. и др.
Система глутатиона участвует в регуляции апоптоза опухолевых клеток
Bcl-2, p53 [6, 14, 15], íî è íàïðÿìóþ, èíãèáèðóÿ ïðåâðàùåíèå ïðîêàñïàçû-8 â àêòèâíóþ ôîðìó, ñóáñòðàòîì
êîòîðîé ÿâëÿåòñÿ êàñïàçà-3.
Заключение
Äåéñòâèå ñåëåêòèâíîãî èíãèáèòîðà êëþ÷åâîãî
ôåðìåíòà ñèíòåçà òèîëà γ-ãëóòàìèë-öèñòåèíñèíòåòàçû
ñïîñîáñòâóåò ïðîâåäåíèþ «ñìåðòåëüíûõ» ñèãíàëîâ
âíóòðü êëåòêè ñ ïîâûøåíèåì àêòèâíîñòè ýôôåêòîðíûõ
êàñïàç, ÷òî íåèçáåæíî ïðèâîäèò ê óâåëè÷åíèþ ÷èñëà
êëåòîê, âñòóïèâøèõ â àïîïòîç.  ñâÿçè ñ ýòèì, ñ ïðàêòè÷åñêîé òî÷êè çðåíèÿ, âîçìîæíîñòü âëèÿíèÿ íà ïðîòèâîàïîïòîòè÷åñêóþ ðîëü âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà â îïóõîëåâûõ êëåòêàõ ñ ïîìîùüþ áëîêèðîâàíèÿ åãî
ñèíòåçà de novo ïðåäñòàâëÿåò áîëüøîé èíòåðåñ äëÿ
ðàçðàáîòêè íîâûõ ïîäõîäîâ äëÿ òàðãåòíîé òåðàïèè
îíêîëîãè÷åñêèõ çàáîëåâàíèé.
Èññëåäîâàíèå âûïîëíåíî ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå ãðàíòà Ñîâåòà ïðè Ïðåçèäåíòå Ðîññèéñêîé Ôåäåðàöèè äëÿ ãîñóäàðñòâåííîé ïîääåðæêè âåäóùèõ íàó÷íûõ
øêîë (ñîãëàøåíèå ¹ ÍØ-4184.2014.7); â ðàìêàõ Ôåäåðàëüíîé öåëåâîé ïðîãðàììû «Íàó÷íûå è íàó÷íîïåäàãîãè÷åñêèå êàäðû èííîâàöèîííîé Ðîññèè íà 2009–
2013 ãã.» (ñîãëàøåíèÿ ¹ 8302 è 8487).
Литература
1. Ìåíüùèêîâà Å.Á., Çåíêîâ Í.Ê., Ëàíêèí Â.Ç. Áîíäàðü È.À.,
Òðóôàêèí Â.À. Îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ: Ïàòîëîãè÷åñêèå
ñîñòîÿíèÿ è çàáîëåâàíèÿ. Íîâîñèáèðñê: ÀÐÒÀ, 2008.
284 ñ.
2. Ðÿçàíöåâà Í.Â., Íîâèöêèé Â.Â., ×àñîâñêèõ Í.Þ., Êàéãîðîäîâà Å.Â., Ñòàðèêîâà Å.Ã., Ñòàðèêîâ Þ.Â. Ðîëü ðåäîêñ-çàâèñèìûõ ñèãíàëüíûõ ñèñòåì â ðåãóëÿöèè àïîïòîçà
ïðè îêèñëèòåëüíîì ñòðåññå // Öèòîëîãèÿ. 2009. Ò. 51,
¹ 4. Ñ. 329–334.
3. Êóðèëîâà Ë.Ñ., Êðóòåöêàÿ Ç.È., Ëåáåäåâ Î.Å., Àíòîíîâ Â.Ã.
Âëèÿíèå îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà è åãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî àíàëîãà ïðåïàðàòà ãëóòîêñèì íà âíóòðèêëåòî÷íóþ
êîíöåíòðàöèþ Ñà2+ â ìàêðîôàãàõ // Öèòîëîãèÿ. 2008.
Ò. 50, ¹ 5. Ñ. 452–461.
4. Aslan M., Canatan D. Modulation of redox pathways in
neutrophils from sickle cell disease patients // Exp. Hema-
tol. 2008. V. 36 (11). Ð. 1535–1544.
5. Desideri E., Filomeni G., Ciriolo M.R. Glutathione participates in the modulation of starvation-induced autophagy
in carcinoma cells // Autophagy. 2012. V. 8 (12). Ð. 1769–
1781.
6. Îêòÿáðüñêèé Î.Í., Ñìèðíîâà Ã.Â. Ðåäîêñ-ðåãóëÿöèÿ
êëåòî÷íûõ ôóíêöèé // Áèîõèìèÿ. 2007. Ò. 72. Âûï. 2.
Ñ. 158–174.
7. Êóëèíñêèé Â.È., Êîëåñíè÷åíêî Ë.Ñ. Ãëóòàòèîí ÿäðà
êëåòêè è åãî ôóíêöèè // Áèîìåäèöèíñêàÿ õèìèÿ. 2010.
Ò. 56. Âûï. 6. Ñ. 657–662.
8. Laragione T., Gianazza E., Tonelli R., Bigini P., Mennini T.,
Casoni F., Massignan T., Bonetto V., Ghezzi P. Regulation of
redox-sensitive exofacial protein thiols in CHO cells // Biol.
Chem. 2006. V. 387 (10–11). P. 1371–1376.
9. Àðóòþíÿí À.Â., Äóáèíèíà Å.Å., Çûáèíà Í.Í. Ìåòîäû
îöåíêè ñâîáîäíîðàäèêàëüíîãî îêèñëåíèÿ è àíòèîêñèäàíòíîé çàùèòû îðãàíèçìà. ÑÏá., 2000. 103 c.
10. Kojima S., Nakayama K., Ishida H. Low dose gammarays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth // J. Radiat. Res. 2004.
V. 45, ¹ 1. P. 33–39.
11. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analyt. Biochem. 1976. V. 7,
¹ 1, 2. P. 248–254.
12. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem. J. 1997. V. 326. P. 1–16.
13. Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates,
and function during apoptotic cell death // Cell Death and
Differentiation. 1999. V. 6. P. 1028–1042.
14. Çåíêîâ Í.Ê., Ìåíüùèêîâà Å.Á., Òêà÷åâ Â.Î. Íåêîòîðûå
ïðèíöèïû è ìåõàíèçìû ðåäîêñ-ðåãóëÿöèè // Êèñëîðîä è
àíòèîêñèäàíòû. 2009. Âûï. 1. Ñ. 3–64.
15. Raza H., John A., Howarth F.C. Alterations in glutathione redox metabolism, oxidative stress, and mitochondrial function in the left ventricle of elderly zucker
diabetic Fatty rat heart // Int. J. Mol. Sci. 2012.
V. 13 (12). P. 16241–16254.
16. Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M.R. Disulfide relays
and phosphorylative cascades: partners in redox-mediated
signaling pathways // Cell Death Differ. 2005. V. 12 (12).
Ð. 1555–1563.
17. Áóðîâà Å.Á., Âàñèëåíêî Ê.Ï., Àíòîíîâ Â.Ã., Íèêîëüñêèé Í.Í. Òðàíñàêòèâàöèÿ ðåöåïòîðà ýïèäåðìàëüíîãî
ôàêòîðà ðîñòà îêèñëåííûì ãëóòàòèîíîì è åãî ôàðìàêîëîãè÷åñêèì àíàëîãîì Ãëóòîêñèì â êëåòêàõ À431 // Äîêë.
ÐÀÍ. 2005. Ò. 404 (1). Ñ. 122–124.
18. Áåëåíè÷åâ È.Ô., ×åðíèé Â.È., Êîëåñíèê Þ.Ì. è äð. Ðàöèîíàëüíàÿ íåéðîïðîòåêöèÿ. Äîíåöê: Èçäàòåëü Çàñëàâñêèé À.Þ., 2009. 262 ñ.
Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 05.05.2014 ã.
Óòâåðæäåíà ê ïå÷àòè 09.10.2014 ã.
êflÁ‡ÌˆÂ‚‡ ç.Ç. – ä-ð ìåä. íàóê, çàâ. êàôåäðîé ìîëåêóëÿðíîé ìåäèöèíû è êëèíè÷åñêîé ëàáîðàòîðíîé äèàãíîñòèêè ÑèáÃÌÓ (Òîìñê).
çÓÒ‡‚‡ é.ã. () – êàíä. ìåä. íàóê, êàôåäðà áèîõèìèè è ìîëåêóëÿðíîé ìåäèöèíû ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
ëÚÂÔÓ‚‡fl Ö.Ä. – ä-ð ìåä. íàóê, ïðîôåññîð, ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
á‡ÍËÓ‚‡ Ö.Ç., ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
ç‡ÛÏÓ‚‡ Ä.à., ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
ÇÂÒÌË̇ é.ç., ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
ò‡ıËÒÚÓ‚‡ Ö.Ç. – êàíä. ìåä. íàóê, ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
76
Бюллетень сибирской медицины, 2014, том 13, № 5, с. 73–78
Оригинальные статьи
éÎÓ‚ Ñ.ë., ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
üÍÛ¯Ë̇ Ç.Ñ., ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
çӂˈÍËÈ Ç.Ç. – ä-ð ìåä. íàóê, ïðîôåññîð, àêàäåìèê ÐÀÍ, çàâ. êàôåäðîé ïàòîôèçèîëîãèè ÑèáÃÌÓ (ã. Òîìñê).
çÓÒ‡‚‡ é脇 ãÂÓÌˉӂ̇, òåë. 8-923-411-19-51; e-mail: [email protected]
THE GLUTATHIONE SYSTEM IS INVOLVED IN REGULATION OF TUMOR
CELLS APOPTOSIS
Ryazantseva N.V., Nosareva O.L., Stepovaya Ye.A., Zakirova Ye.V., Naumova A.I.,
Vesnina O.N., Shakhristova Ye.V., Orlov D.S., Yakushina V.D., Novitsky V.V.
Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation
ABSTRACT
The research objective is to determine the role of the gluthatione system components in realization of
the receptor pathway of Jukart tumor cell apoptosis.
Apoptosis realization using FITC-labeled annexin V and propidium iodide as well as the amount of
TNF R1- and Fas-presenting cells has been evaluated by flow cytofluorometry; activity caspase-3 registered a spektroflyuorimetrichesky method. The concentration of reduced and oxidated gluthatione has
been determined by spectrophotometry.
The material for the research was intact Jukart tumor cells and the ones incubated in the presence of a
selective inhibitor of the key gluthatione synthesis enzyme – buthionine-sulfoximine.
The research has shown that the gluthatione system plays an important regulatory role in activation of
the receptor pathway of Jukart tumor cell apoptosis.
The gluthatione system components are targets for activation of programmed cell death in tumor
growth.
KEY WORDS: Jukart tumor cells, apoptosis, TNF, Fas, gluthatione system.
Bulletin of Siberian Medicine, 2014, vol. 13, no. 5, pp. 73–78
References
1. Men'shhikova E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z. Bondar' I.A.,
Trufakin V.A. Oxidizing stress: Pathological states and diseases. Novosibirsk, ARTA Publ., 2008. 284 p.
2. Ryazantseva N.V., Novicky V.V., Chasovskikh N.Yu., Kajgorodova Ye.V., Starikova Ye.G., Starikov Yu.V. Role of
redoks-dependent alarm systems in regulation of apoptosis
at an oxidizing stress. Tsitologiya – Cytology, 2009, vol. 51,
no. 4, pp. 329–334 (in Russian).
3. Kurilova L.S., Kruteckaja Z.I., Lebedev O.E., Antonov V.G.
Influence of the oxidized glutathione and its pharmacological analog of a preparation glutoksy on intracellular concentration of Ca2+ in macrophages. Tsitologiya – Cytology,
2008, vol. 50, no. 5, pp. 452–461 (in Russian).
4. Aslan M., Canatan D. Modulation of redox pathways in
neutrophils from sickle cell disease patients. Exp. Hematol.,
2008, vol. 36 (11), pp. 1535–1544.
5. Desideri E., Filomeni G., Ciriolo M.R. Glutathione participates in the modulation of starvation-induced autophagy in
carcinoma cells. Autophagy, 2012, vol. 8 (12), pp. 1769–
1781.
6. Oktjabr'sky O.N., Smirnova G.V. Redoks-regulyation cellular functions Biokhimiya – Biochemistry, 2007, vol. 72,
vyp. 2, pp. 158–174 (in Russian).
7. Kulinsky V.I., Kolesnichenko L.S. Glutation of a kernel of a
cage and its function. Biomeditsinskaya khimiya – Biochemistry, 2010, vol. 56, vyp. 6, pp. 657–662 (in Russian).
8. Laragione T., Gianazza E., Tonelli R., Bigini P., Mennini
T., Casoni F., Massignan T., Bonetto V., Ghezzi P. Regulation of redox-sensitive exofacial protein thiols in CHO cells.
Biol Chem., 2006, vol. 387 (10–11), pp. 1371–1376.
9. Arutyunyan A.V., Dubinina E.E., Zyibina N.N. Methods of
an assessment of free radical oxidation and antioxidant protection of an organism. St. Petersburg, 2000. 103 ð. (in Russian).
10. Kojima S., Nakayama K., Ishida H. Low dose gamma-rays
activate immune functions via induction of glutathione and
delay tumor growth. J. Radiat. Res., 2004, vol. 45, no. 1,
pp. 33–39.
11. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem., 1976, vol. 7,
no. 1–2, pp. 248–254.
Бюллетень сибирской медицины, 2014, том 13, № 5, с. 73–78
77
Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Степовая Е.А. и др.
Система глутатиона участвует в регуляции апоптоза опухолевых клеток
12. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem. J., 1997, vol. 326, pp. 1–16.
13. Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates,
and function during apoptotic cell death. Cell Death and
Differentiation, 1999, vol. 6, pp. 1028–1042.
14. Zenkov N.K., Men'shhikova E.B., Tkachev V.O. Some principles and mechanisms of redoks-regulation. Kislorod i antioksidanty – Oxygen and antioxidants, 2009, vol. 1, pp. 3–64 (in
Russian).
15. Raza H., John A., Howarth F.C. Alterations in glutathione redox metabolism, oxidative stress, and mitochondrial function
in the left ventricle of elderly zucker diabetic Fatty rat heart.
Int. J. Mol. Sci., 2012, vol. 13 (12), pp. 16241–16254.
16. Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M.R. Disulfide relays and
phosphorylative cascades: partners in redox-mediated signaling pathways. Cell Death Differ., 2005, vol. 12 (12),
pp. 1555–1563.
17. Burova E.B., Vasilenko K.P., Antonov V.G., Nikol'sky N.N.
Transaktivation of a receptor of an epidermalny factor of
growth by the oxidized glutathione and its pharmacological
analog Glutoksy A431 in cages. Dokl. Russian Academy of
Sciences, 2005, vol. 404 (1), pp. 122–124. (in Russian).
18. Belenichev I.F., Cherniy V.I., Kolesnik Yu.M. et al. Rational neuropatronage. Donetsk, Izdatel Zaslavskiy A.Yu.
Publ., 2009. 262 ð. (in Russian).
Ryazantseva N.V., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Nosareva O.L. (), Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Stepovaya Ye.A., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Zakirova Ye.V., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Naumova A.I., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Vesnina O.N., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Shakhristova Ye.V., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Orlov D.S., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Yakushina V.D., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Novitsky V.V. Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Nosareva O.L., Ph. +7-923-411-19-51; e-mail: [email protected]
78
Бюллетень сибирской медицины, 2014, том 13, № 5, с. 73–78