ÖÈÒÎÒÎÊÑÈ×ÅÑÊÎÅ ÄÅÉÑÒÂÈÅ ÊÎÐÎÒÊÎÖÅÏÎ×Å×ÍÛÕ ÏÐÎÈÇÂÎÄÍÛÕ ÂÈÒÀÌÈÍÀ Å ÍÀ ÒÈÌÎÖÈÒÛ ÊÐÛÑÛ

ÓÄÊ 577.352.3
ÖÈÒÎÒÎÊÑÈ×ÅÑÊÎÅ ÄÅÉÑÒÂÈÅ ÊÎÐÎÒÊÎÖÅÏÎ×Å×ÍÛÕ
ÏÐÎÈÇÂÎÄÍÛÕ ÂÈÒÀÌÈÍÀ Å ÍÀ ÒÈÌÎÖÈÒÛ ÊÐÛÑÛ
Ã. Â. ÏÅÒÐÎÂÀ, Ã. Â. ÄÎÍ×ÅÍÊÎ
Èíñòèòóò áèîõèìèè èì. À. Â. Ïàëëàäèíà ÍÀÍ Óêðàèíû, Êèåâ;
e-mail: [email protected]
Óñòàíîâëåíî, ùî α-òîêîôåðîë, α-òîêîôåðèëàöåòàò ³ òîêîôåðèëõ³íîí ç óêîðî÷åíèìè äî 6 àòîì³â
âóãëåöþ á³÷íèìè ëàíöþãàìè äîçîçàëåæíî ³íã³áóþòü æèòòºçäàòí³ñòü ïåðâèííî¿ êóëüòóðè òèìîöèò³â
ùóð³â. ³äñóòí³ñòü ì³æíóêëåîñîìíî¿ äåãðàäàö³¿ ÄÍÊ õðîìàòèíó ïîðÿä ç âèõîäîì ³ç êë³òèí öèòîçîëüíî¿
ëàêòàòäåã³äðîãåíàçè ñâ³ä÷èòü ïðî íåêðîòè÷íèé øëÿõ çàãèáåë³ òèìîöèò³â. Âèõ³ä ³ç êë³òèí êèñëî¿ ôîñôàòàçè – ìàðêåðíîãî ôåðìåíòó ë³çîñîì ï³äòâåðäæóº äåñòàá³ë³çàö³þ äîñë³äæóâàíèìè ðå÷îâèíàìè ë³çîñîìíî¿ ìåìáðàíè. Çàïðîïîíîâàíî ìîæëèâèé ìåõàí³çì öèòîòîêñè÷íî¿ ä³¿ êîðîòêîëàíöþãîâèõ àíàëîã³â â³òàì³íó
Å â êóëüòóðàõ êë³òèí, à ñàìå: ¿õíÿ ï³äâèùåíà ïðîíèêí³ñòü ÷åðåç ïëàçìàòè÷íó ìåìáðàíó äîçâîëÿº ñòâîðèòè â ñåðåäèí³ êë³òèíè êîíöåíòðàö³þ, ÿêà äîñòàòíÿ äëÿ äåòåðãåíòïîä³áíî¿ äåñòàá³ë³çàö³¿ ìåìáðàí ë³çîñîì, ùî ïðèçâîäèòü äî âèõîäó â öèòîçîëü ë³çîñîìíèõ ôåðìåíò³â ³ çàãèáåë³ êë³òèíè øëÿõîì íåêðîçó.
Ê ë þ ÷ î â ³ ñ ë î â à: êîðîòêîëàíöþãîâ³ àíàëîãè â³òàì³íó Å, àïîïòîç, íåêðîç, òèìîöèòè, ë³çîñîìè.
È
çâåñòíî, ÷òî ïðèðîäíûé âèòàìèí Å ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ñìåñü ðàçëè÷íûõ ïðîèçâîäíûõ òîêîôåðîëà, ñðåäè êîòîðûõ íàèáîëüøåé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ, òðàäèöèîííî îïðåäåëÿåìîé â òåñòå íà ïðåäîòâðàùåíèå
ðåçîðáöèè ïëîäà ó êðûñ [1], îáëàäàåò α-òîêîôåðîë.  ñâÿçè ñ ýòèì áèîëîãè÷åñêèå ôóíêöèè ìèíîðíûõ êîìïîíåíòîâ âèòàìèíà Å – β-, γ- è
δ-òîêîôåðîëîâ, ñîîòâåòñòâóþùèõ òîêîòðèåíîëîâ,
à òàêæå ïðîäóêòîâ èõ ìåòàáîëèçìà, äîëãîå âðåìÿ
îñòàâàëèñü âíå ïîëÿ çðåíèÿ èññëåäîâàòåëåé. Îäíàêî äàííûå ëèòåðàòóðû ïîñëåäíèõ ëåò ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî ìèíîðíûå êîìïîíåíòû âèòàìèíà Å, íå îáëàäàþùèå èëè îáëàäàþùèå ìåíüøåé ïî ñðàâíåíèþ ñ α-òîêîôåðîëîì áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ, ÿâëÿþòñÿ áîëåå ýôôåêòèâíûìè â ïëàíå ïðîòèâîâîñïàëèòåëüíûõ, àíòèíåîïëàñòè÷åñêèõ è ïðîòèâîîïóõîëåâûõ ôóíêöèé [2].
Îñîáîå çíà÷åíèå äàííîå îáñòîÿòåëüñòâî ïðèîáðåëî ïîñëå îáíàðóæåíèÿ ó÷àñòèÿ âèòàìèíà Å â
ðåãóëÿöèè çàïðîãðàììèðîâàííîé êëåòî÷íîé ãèáåëè – àïîïòîçå.
Óñòàíîâëåíî, ÷òî α-òîêîôåðîë ñïîñîáåí èíãèáèðîâàòü ãèáåëü êëåòîê, èíäóöèðîâàííóþ ðàçëè÷íûìè ïðîàïîïòè÷åñêèìè ôàêòîðàìè, ÷òî ïîçâîëÿåò îòíåñòè åãî ê ðÿäó àíòèàïîïòè÷åñêèõ àãåíòîâ [3].  òî æå âðåìÿ ñèíòåòè÷åñêèå àíàëîãè è
ïðèðîäíûå ìåòàáîëèòû âèòàìèíà Å îáëàäàþò öèòîòîêñè÷åñêèìè ñâîéñòâàìè è ñïîñîáíû âûçûâàòü êàê àïîïòè÷åñêóþ, òàê è íåêðîòè÷åñêóþ ãèáåëü êëåòîê. Òàê, ýôèðíûå ïðîèçâîäíûå α-òîêîôåðîëà (òîêîôåðèëñóêöèíàò, òîêîôåðèëîêñàëàò,
íåãèäðîëèçóåìîå ïðîèçâîäíîå àöåòàòà) âûçûâà-
þò àïîïòè÷åñêóþ ãèáåëü ðàçëè÷íûõ êëåòî÷íûõ
êóëüòóð [4,5]. Âûðàæåííûìè öèòîòîêñè÷åñêèìè
ñâîéñòâàìè îáëàäàþò β-, γ-, δ-òîêîôåðîëû è ñîîòâåòñòâóþùèå èì òîêîòðèåíîëû [6].
Èçâåñòíî, ÷òî â ïðîöåññå äåãðàäàöèè â êëåòêå
áîêîâàÿ öåïü òîêîôåðîëîâ ïîäâåðãàåòñÿ ïîñëåäîâàòåëüíî ω- è β-îêèñëåíèþ [7], â ðåçóëüòàòå
÷åãî, î÷åâèäíî, â êëåòêå ïîñòîÿííî ïðèñóòñòâóþò ìåòàáîëèòû ñ ðàçëè÷íîé äëèíîé áîêîâîé öåïè.
Óñòàíîâëåíî, ÷òî ñèíòåòè÷åñêèå ïðîèçâîäíûå
α-òîêîôåðîëà ñ óêîðî÷åííîé äî 6 è 1 àòîìîâ óãëåðîäà áîêîâîé öåïüþ ïðàêòè÷åñêè ïîëíîñòüþ
èíãèáèðóþò ðîñò êóëüòóð êëåòîê îñòðîé ëåéêåìèè ÑÅÌ-Ñ-1 è ýïèòåëèîèäíîé êàðöèíîìû
HeLa – S3K [8], îäíàêî ìåõàíèçìû äàííîãî ôåíîìåíà íå èññëåäîâàíû. Â ñâÿçè ñ ýòèì öåëüþ
íàñòîÿùåé ðàáîòû áûëî èçó÷åíèå öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ òðåõ ïðîèçâîäíûõ α-òîêîôåðîëà ñ
óêîðî÷åííîé äî 6 àòîìîâ óãëåðîäà áîêîâîé öåïüþ – α-òîêîôåðèëàöåòàòà (ÒÀö-Ñ6), α-òîêîôåðîëà (ÒÔ-Ñ6) è òîêîôåðèëõèíîíà (ÒÕ-Ñ6) íà òèìîöèòû êðûñû.
Ðåàêòèâû. Â ðàáîòå èñïîëüçîâàëè ÌÒÒ
(3-[4,5-äèìåòèëòèàçîë-2-èë]-2,5-äèôåíèë-òåòðàçîëèé áðîìèä), 4-íèòðî-ôåíèëôîñôàò, NAD+,
àãàðîçó äëÿ ýëåêòðîôîðåçà, ïðîòåèíàçó Ê («Sigma»,
ÑØÀ), ñðåäó RPMI-1640, HEPES («Serva», ÑØÀ).
Îñòàëüíûå ðåàêòèâû áûëè îòå÷åñòâåííîãî ïðîèçâîäñòâà ñ êâàëèôèêàöèåé õ. ÷. è ÷. ä. à.
α-Òîêîôåðîë, α-òîêîôåðèëàöåòàò è òîêîôåðèëõèíîí ñ óêîðî÷åííûìè äî 6 àòîìîâ óãëåðîäà
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
77
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ
áîêîâûìè öåïÿìè áûëè ñèíòåçèðîâàíû â Èíñòèòóòå îðãàíè÷åñêîé õèìèè ÍÀÍ Óêðàèíû. Ïðåïàðàòû ïðåäâàðèòåëüíî ïîäâåðãàëè î÷èñòêå ñ ïîìîùüþ òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàôèè íà ñèëèêàãåëå â ñèñòåìå ãåêñàí: äèýòèëîâûé ýôèð (70 : 30).
Ðàáîòà ïðîâîäèëàñü íà áåëûõ êðûñàõ-ñàìêàõ 3-ìåñÿ÷íîãî âîçðàñòà ñ ìàññîé òåëà 100–150 ã.
Ïîëó÷åíèå òèìîöèòîâ è ïîäñ÷åò êîëè÷åñòâà
êëåòîê ïî èñêëþ÷åíèþ òðèïàíîâîãî ñèíåãî ïðîâîäèëè êàê îïèñàíî ðàíåå [9].
Èíêóáàöèÿ êëåòîê. Îêîëî 2 ⋅ 106 êëåòîê ðåñóñïåíäèðîâàëè â 1 ìë ñðåäû RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10 ìÌ HEPES-NaOH áóôåð, ðÍ 7,3; 0,1%
ÁÑÀ, 100 U/ìë ïåíèöèëëèíà, 100 ìêã/ìë ñòðåïòîìèöèíà è 50 ìêÌ β-ìåðêàïòîýòàíîë. Èññëåäóåìûå àíàëîãè òîêîôåðîëà äîáàâëÿëè èç ìàòî÷íûõ
ñïèðòîâûõ ðàñòâîðîâ, ïðåäâàðèòåëüíî ðàçâåäåííûõ ñðåäîé èíêóáàöèè. Êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ
ýòàíîëà â ñðåäå íå ïðåâûøàëà 0,1%. Êëåòêè èíêóáèðîâàëè ïðè 37 °Ñ 18 ÷, ïîñëå ÷åãî îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì (200 g, 5 ìèí) è îòìûâàëè
1 ìë PBS (136,9 ìÌ NaCl, 2,7 ìÌ KCl, 8,1 ìÌ
Na2HPO4, 1,5 ìÌ KH2PO4, ðÍ 7,2).
Îöåíêó æèçíåñïîñîáíîñòè êëåòîê ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ÌÒÒ-òåñòà. Ïðèíöèï ìåòîäà îñíîâàí íà ñïîñîáíîñòè ìåòàáîëè÷åñêè àêòèâíûõ êëåòîê ïðåâðàùàòü âîäîðàñòâîðèìûé ÌÒÒ
(3-[4,5-äèìåòèëòèàçîë-2-èë]-2,5-äèôåíèë-òåòðàçîëèé áðîìèä) â îêðàøåííûé íåðàñòâîðèìûé â
âîäå ôîðìàçàí. Ðåàêöèþ ïðîâîäèëè â 96-ëóíî÷íûõ ïëàíøåòàõ. Îêîëî 300 òûñ. êëåòîê èíêóáèðîâàëè 18 ÷ â 200 ìêë ñðåäû êàê îïèñàíî âûøå.
Ïëàíøåòû öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 200 g 5 ìèí,
íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü óäàëÿëè. Ê îñàäêó êëåòîê äîáàâëÿëè 90 ìêë ñâåæåé ñðåäû èíêóáàöèè è
10 ìêë ðàñòâîðà ÌÒÒ (èñõîäíàÿ êîíöåíòðàöèÿ
5ìã/ìë â PBS). Ïîñëå èíêóáàöèè â òå÷åíèå 1,5 ÷
ïðè 37 °Ñ, îáðàçîâàâøèéñÿ ôîðìàçàí îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 400 g â òå÷åíèå 10 ìèí
è îòìûâàëè â àíàëîãè÷íûõ óñëîâèÿõ 200 ìêë
PBS. Îñàäêè ïîäñóøèâàëè â òå÷åíèå íî÷è â òåìíîòå, äîáàâëÿëè 150 ìêë äèìåòèëñóëüôîêñèäà è
îïðåäåëÿëè ïîãëîùåíèå ïðè 570 íì. Çà 100%
ïðèíèìàëè êîëè÷åñòâî ôîðìàçàíà, îáðàçîâàâøåãîñÿ â àëèêâîòå ñâåæåâûäåëåííûõ èíòàêòíûõ òèìîöèòîâ.
Ýêñòðàêöèþ ôðàãìåíòèðîâàííîé ÄÍÊ ïðîâîäèëè ñîãëàñíî ìåòîäó, îïèñàííîìó â ðàáîòå [10],
ñ ìîäèôèêàöèÿìè. Îêîëî 2 ìëí. êëåòîê èíêóáèðîâàëè â 1 ìë ñðåäû êàê îïèñàíî âûøå, êëåòêè
îñàæäàëè è ïðîìûâàëè 1 ìë PBS. Ê îñàäêó êëåòîê äîáàâëÿëè 300 ìêë 20 ìÌ Tris-HCl-áóôåðà,
ðÍ 8,0, ñîäåðæàùåãî 10 ìÌ ÝÄÒÀ è 0,2%-é òðèòîí Õ-100. Ïîñëå ýêñòðàêöèè â òå÷åíèå 5 ìèí
ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå ïðîáû öåíòðèôóãèðîâàëè 15 ìèí ïðè 12 000 g è â íàäîñàäî÷íîé
æèäêîñòè ïðîâîäèëè êà÷åñòâåííóþ èäåíòèôèêàöèþ ìåæíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ ñ ïîìîùüþ ýëåêòðîôîðåçà â 1%-ûõ ãåëÿõ àãàðîçû
ñîãëàñíî ïðîöåäóðå, îïèñàííîé â ðàáîòå [11].
ÄÍÊ èç ýêñòðàêòà êëåòîê òðèòîíîì Õ-100 îñàæäàëè ýòàíîëîì, èíêóáèðîâàëè ïðè 37 °Ñ 2 ÷àñ ñ
0,5 ìã/ìë ÐÍÊ-àçû À, ñâîáîäíîé îò ÄÍÊ-àç, à
çàòåì åùå 2 ÷àñ ñ 100 ìêã/ìë ïðîòåèíàçû Ê. Ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîå ðàçäåëåíèå ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ
ïðîâîäèëè â 40 ìÌ áóôåðå Tris – óêñóñíàÿ êèñëîòà, ðÍ 8,0, ñîäåðæàùåì 1 ìÌ ÝÄÒÀ, ïðè íàïðÿæåíèè ýëåêòðè÷åñêîãî ïîëÿ 5 Â/ñì.
Òåñò íà íåêðîòè÷åñêóþ ãèáåëü òèìîöèòîâ.
Âûõîä èç êëåòîê â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó öèòîçîëüíîé ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû îöåíèâàëè ñîãëàñíî ïðîöåäóðå, îïèñàííîé â ðàáîòå [12], ñ ìîäèôèêàöèÿìè. Ðåàêöèþ ïðîâîäèëè â 96-ëóíî÷íûõ
ïëàíøåòàõ. Îêîëî 500 òûñ. êëåòîê èíêóáèðîâàëè
18 ÷àñ â 200 ìêë ñðåäû êàê îïèñàíî âûøå, êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì è íàäîñàäî÷íóþ êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó ñîáèðàëè. Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü ñîäåðæàëà 20 ìêë íàäîñàäî÷íîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäû è 60 ìêë 0,4 Ì ãèäðàçèí ñóëüôàò-1 Ì ãëèöèí áóôåðà, ðÍ 9,9, ñîäåðæàùåãî
100 ìÌ ëàêòàò íàòðèÿ è 10 ìÌ NAD+. Ïðîáû
èíêóáèðîâàëè 10 ìèí ïðè 37 °Ñ, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè 20 ìêë 50%-ãî ÒÕÓ (âåñ/îáúåì) è 25 ìêë
0,1%-ãî ðàñòâîðà 2,4-äèíèòðîôåíèëãèäðàçèíà â
2 Ì HCl. Ïëàíøåòû âûäåðæèâàëè 1 ÷àñ ïðè 37 °Ñ
äëÿ îáðàçîâàíèÿ ôåíèëãèäðàçîíà è 10 ìèí ïðè
êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè
120 ìêë 2 Ì NaOH. Àáñîðáöèþ îïðåäåëÿëè ïðè
äëèíå âîëíû 450 íì ïðîòèâ êîíòðîëüíîé ïðîáû,
ñîäåðæàùåé 20 ìêë ÷èñòîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäû. Çà 100% ïðèíèìàëè îáùóþ ëàêòàòäåãèäðîãåíàçíóþ àêòèâíîñòü â àëèêâîòå èíòàêòíûõ òèìîöèòîâ, ñîëþáèëèçèðîâàííîé â 200 ìêë 0,2%-ãî
òðèòîíà Õ-100.
Àíàëèç äåñòàáèëèçàöèè ìåìáðàí ëèçîñîì.
Âûõîä èç êëåòîê êèñëîé ôîñôàòàçû îïðåäåëÿëè
ïî ìåòîäó, îïèñàííîìó â ðàáîòå [13], àäàïòèðîâàííîìó íàìè äëÿ ïðîâåäåíèÿ â 96-ëóíî÷íûõ
ïëàíøåòàõ. Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü ñîäåðæàëà 50 ìêë
íàäîñàäî÷íîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäû è 25 ìêë 0,1 Ì
àöåòàò íàòðèÿ-óêñóñíàÿ êèñëîòà áóôåðà, ðÍ 5,0.
Ïîñëå ïðåèíêóáàöèè â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 37 °Ñ
ê ïðîáàì äîáàâëÿëè 25 ìêë 32 ìÌ ðàñòâîðà 4-íèòðîôåíèë-ôîñôàòà â ðåàêöèîííîì áóôåðå (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ ñóáñòðàòà â ðåàêöèîííîé ñìåñè 8 ìÌ) è èíêóáèðîâàëè 1 ÷àñ ïðè 37 °Ñ. Îáðàçîâàâøèéñÿ ï-íèòðîôåíîë âèçóàëèçèðîâàëè äîáàâëåíèåì 100 ìêë Tris-HCl-áóôåðà (ðÍ 8,5), ñîäåðæàùåãî 0,4 Ì K2HPO4. Àáñîðáöèþ îïðåäåëÿëè ïðè äëèíå âîëíû 420 íì ïðîòèâ êîíòðîëüíîé
ïðîáû, ñîäåðæàùåé 50 ìêë ÷èñòîé êóëüòóðàëüíîé ñðåäû. Çà 100% ïðèíèìàëè îáùóþ àêòèâ-
78
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ã. Â. ÏÅÒÐÎÂÀ, Ã. Â. ÄÎÍ×ÅÍÊÎ
íîñòü êèñëîé ôîñôàòàçû â àëèêâîòå èíòàêòíûõ
òèìîöèòîâ, ñîëþáèëèçèðîâàííîé â 200 ìêë 0,2%
òðèòîíà Õ-100.
Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ïîëíîòû âûõîäà êèñëîé
ôîñôàòàçû, ê îñàäêó êëåòîê ïîñëå óäàëåíèÿ êóëüòóðàëüíîé ñðåäû äîáàâëÿëè 100 ìêë 20 ìÌ HEPESNaOH-áóôåðà (ðÍ 7,5), ñîäåðæàùåãî 250 ìÌ ñàõàðîçó, 10 ìÌ KCl, 1,5 ìÌ MgCl2, 1 ìÌ ÝÄÒÀ
è 1 ìÌ ÝÃÒÀ. Ïîñëå èíêóáàöèè 30 ìèí íà ëåäÿíîé áàíå è èíòåíñèâíîãî âñòðÿõèâàíèÿ â òå÷åíèå 15 ñ íà ïðèáîðå Vortex, ïðîáû öåíòðèôóãèðîâàëè 15 ìèí ïðè 12 000 g è â íàäîñàäî÷íîé
æèäêîñòè îïðåäåëÿëè àêòèâíîñòü êèñëîé ôîñôàòàçû êàê îïèñàíî âûøå.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Ðàíåå íàìè áûëî ïîêàçàíî, ÷òî α-òîêîôåðîë, α-òîêîôåðèëàöåòàò è òîêîôåðèëõèíîí ñ íàòèâíîé áîêîâîé öåïüþ (Ñ16) â êîíöåíòðàöèÿõ
100 ìêÌ íå îêàçûâàþò âëèÿíèÿ íà âûæèâàåìîñòü
òèìîöèòîâ êðûñû ïðè èíêóáàöèè â òå÷åíèå 18 ÷àñ
[14]. Èññëåäîâàíèå âûæèâàåìîñòè òèìîöèòîâ â
çàâèñèìîñòè îò êîíöåíòðàöèè êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ àíàëîãîâ âèòàìèíà Å ïîêàçàëî, ÷òî â êîíöåíòðàöèÿõ 10 è 20 ìêÌ óêàçàííûå ñîåäèíåíèÿ
íå ýôôåêòèâíû, â òî âðåìÿ êàê ïðè óâåëè÷åíèè
êîíöåíòðàöèé äî 100 ìêÌ íàáëþäàåòñÿ äîçîçàâèñèìîå óâåëè÷åíèå ãèáåëè êëåòîê. Êðèâûå äåéñòâèÿ àíàëîãîâ èìåëè ñõîäíûé õàðàêòåð, îäíàêî
íàèáîëåå òîêñè÷íûì îêàçàëñÿ ÒÔ-Ñ6, ýôôåêò
êîòîðîãî áûë âûðàæåí ïðè êîíöåíòðàöèè 50 ìêÌ
(ðèñ. 1).
Îáíàðóæåííàÿ íàìè ñïîñîáíîñòü êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ α-òîêîôåðîëà â ýêâèìîëÿðíûõ α-òîêîôåðîëó êîíöåíòðàöèÿõ èíãèáèðîâàòü âûæèâàåìîñòü ïåðâè÷íîé êóëüòóðû òèìîöèòîâ îáóñëîâèëà íåîáõîäèìîñòü èññëåäîâàíèÿ
õàðàêòåðà ãèáåëè êëåòîê. Èçâåñòíî, ÷òî ãèáåëü
êëåòîê ìîæåò ïðîèñõîäèòü ïî äâóì àëüòåðíàòèâíûì ïóòÿì – àïîïòîçà èëè íåêðîçà, êîòîðûå â
çíà÷èòåëüíîé ìåðå ðàçëè÷àþòñÿ ïî ìîðôîëîãè÷åñêèì è áèîõèìè÷åñêèì ïðèçíàêàì. Òàê, îäíèì
èç îñíîâíûõ ïðèçíàêîâ àïîïòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê ñ÷èòàåòñÿ ìåæíóêëåîñîìíàÿ ôðàãìåíòàöèÿ
ÄÍÊ õðîìàòèíà, â ñëó÷àå æå ãèáåëè êëåòîê ïî
ïóòè íåêðîçà ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ ëèáî íå íàáëþäàåòñÿ âîâñå, ëèáî îáðàçóþùèåñÿ ôðàãìåíòû
ÄÍÊ èìåþò íåîïðåäåëåííûå ðàçìåðû, êîòîðûå
ïðè ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîì ðàçäåëåíèè äàþò
ñïëîøíóþ ïîëîñó [15].
Êàê âèäíî èç ðèñ. 2, ÒÔ-Ñ6 â êîíöåíòðàöèÿõ 10 è 20 ìêÌ íå èçìåíÿåò êîíòðîëüíûé óðîâåíü (ñïîíòàííûé àïîïòîç [9]) ìåæíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ õðîìàòèíà, à ïðè óâåëè÷åíèè êîíöåíòðàöèè íàáëþäàåòñÿ óìåíüøåíèå
ñòåïåíè ìåæíóêëåîñîìíîé äåãðàäàöèè ÄÍÊ, ÷òî,
íàðÿäó ñî ñíèæåíèåì âûæèâàåìîñòè êëåòîê
(ðèñ. 1), ñâèäåòåëüñòâóåò î ðàçâèòèè â áîëüøåé
ìåðå íåêðîòè÷åñêèõ, ÷åì àïîïòè÷åñêèõ ïðîöåññîâ. Áîëåå òîãî, êàê ïîêàçàíî íàìè ðàíåå, èñ÷åçíîâåíèå àïîïòè÷åñêîé ëåñòíèöû ïîä äåéñòâèåì
ÒÀö-Ñ6 íàáëþäàåòñÿ äàæå íà ôîíå äåéñòâèÿ äåêñàìåòàçîíà – ìîùíîãî èíäóêòîðà àïîïòè÷åñêîé
ãèáåëè òèìîöèòîâ, âûçûâàþùåãî áîëåå 70% ôðàã-
Выживаемость клеток, %
100
α-Токоферилацетат-С6
α-Токоферол-С6
Токоферилхинон-С6
80
60
40
20
0
0
10
20
50
100
Концентрация, мкМ
Ðèñ. 1. Çàâèñèìîñòü âûæèâàåìîñòè (% îò èíòàêòíûõ êëåòîê) òèìîöèòîâ êðûñû îò êîíöåíòðàöèè
êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ âèòàìèíà Å (ÌÒÒ-òåñò), M ± m, n = 7–8.
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
79
ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ
1
2
3
4
5
Ðèñ. 2. Ýëåêòðîôîðåãðàììà ìåæíóêëåîñîìíûõ
ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ õðîìàòèíà òèìîöèòîâ êðûñû,
îáðàçóþùèõñÿ ïðè äåéñòâèè α-òîêîôåðîëà-Ñ6 â
ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ: 1 – êîíòðîëü (ñïîíòàííûé àïîïòîç), 2–5 – äîáàâëåí α-òîêîôåðîë-Ñ6
â êîíöåíòðàöèÿõ ñîîòâåòñòâåííî 10, 20, 50 è
100 ìêÌ. Ïðåäñòàâëåíà òèïè÷íàÿ êàðòèíà ðàñïðåäåëåíèÿ äëÿ òðåõ íåçàâèñèìûõ ýêñïåðèìåíòîâ.
α-Токоферилацетат-С6
α-Токоферол-С6
Токоферилхинон-С6
80
Выход лактатдегидрогеназы, %
ìåíòàöèè ÄÍÊ [9]. Õàðàêòåð ðàñïðåäåëåíèÿ ìåæíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ â ñëó÷àå èñïîëüçîâàíèÿ ÒÀö-Ñ6 è ÒÕ-Ñ6 áûë àíàëîãè÷åí (äàííûå íå ïðåäñòàâëåíû).
Èçâåñòíî, ÷òî õàðàêòåðíûìè ðàçëè÷èÿìè
àïîïòè÷åñêîé è íåêðîòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê ÿâëÿþòñÿ òàêæå êîíå÷íûå ýòàïû äàííûõ ïðîöåññîâ.  ñëó÷àå àïîïòîçà çàâåðøàþùèì ýòàïîì ÿâëÿåòñÿ îáðàçîâàíèå òàê íàçûâàåìûõ àïîïòè÷åñêèõ òåëåö – âàêóîëåïîäîáíûõ îáðàçîâàíèé ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû, â êîòîðûå çàêëþ÷åíî ñîäåðæèìîå êëåòêè. Ïðè ýòîì âíóòðèêëåòî÷íîå ñîäåðæèìîå íå èçëèâàåòñÿ â ìåæêëåòî÷íîå ïðîñòðàíñòâî. Ïðè íåêðîçå íàáëþäàåòñÿ ïîâûøåíèå ïðîíèöàåìîñòè è, â êîíå÷íîì èòîãå, ðàçðûâ ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû, â ðåçóëüòàòå ÷åãî öèòîçîëüíûå ôåðìåíòû âûõîäÿò èç êëåòêè â îêðóæàþùóþ ñðåäó [16].
Íà ðèñ. 3 ïðåäñòàâëåí âûõîä (% îò îáùåãî
ñîäåðæàíèÿ â àëèêâîòå èíòàêòíûõ êëåòîê) â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó öèòîçîëüíîé ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû – ôåðìåíòà, íàèáîëåå ÷àñòî èñïîëüçóåìîãî
êàê òåñò íà íåêðîòè÷åñêóþ ãèáåëü. Çàâèñèìîñòü
âûõîäà èç êëåòîê ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû ïîä äåéñòâèåì êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ àíàëîãîâ âèòàìèíà Å
îáðàòíî ïðîïîðöèîíàëüíà âûæèâàåìîñòè êëåòîê,
÷òî, íàðÿäó ñ îòñóòñòâèåì ìåæíóêëåîñîìíîé äåãðàäàöèè ÄÍÊ õðîìàòèíà (ðèñ. 2), ñâèäåòåëüñòâóåò
îá èíäóêöèè èññëåäóåìûìè ñîåäèíåíèÿìè èìåííî
íåêðîòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê. Êàê è ïðè èññëåäîâàíèè âûæèâàåìîñòè êëåòîê, äåéñòâèå êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ìåòàáîëèòîâ α-òîêîôåðîëà â äàí-
70
60
50
40
30
20
0
10 20
50
100
Концентрация, мкМ
Ðèñ. 3. Çàâèñèìîñòü âûõîäà èç òèìîöèòîâ êðûñû öèòîçîëüíîé ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû (% îò îáùåãî
ñîäåðæàíèÿ â àëèêâîòå èíòàêòíûõ êëåòîê) îò êîíöåíòðàöèè êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ âèòàìèíà Å, M ± m, n = 5–6.
80
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ã. Â. ÏÅÒÐÎÂÀ, Ã. Â. ÄÎÍ×ÅÍÊÎ
íîì ñëó÷àå ñõîäíî, à íàèìåíüøèì ýôôåêòîì îáëàäàåò ÒÀö-Ñ6.
Ñóùåñòâóþò äàííûå ëèòåðàòóðû î òîì, ÷òî
â ìîäåëüíûõ ñèñòåìàõ ëèïèäíûõ ìåìáðàí àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà íàòèâíîãî α-òîêîôåðîëà è
åãî êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ ñõîäíû,
îäíàêî èìåþòñÿ çíà÷èòåëüíûå ðàçëè÷èÿ â ñòåïåíè ïðîíèêíîâåíèÿ äàííûõ ñîåäèíåíèé âî âíóòðü
ëèïèäíûõ âåçèêóë. Äëèííàÿ ãèäðîôîáíàÿ áîêîâàÿ öåïü â ìîëåêóëå íàòèâíîãî α-òîêîôåðîëà îïðåäåëÿåò åãî “çàÿêîðåâàíèå” â ìåìáðàíå, â òî
âðåìÿ êàê óêîðî÷åíèå áîêîâîé öåïè îáåñïå÷èâàåò áîëåå ñâîáîäíîå ïðîíèêíîâåíèå ÷åðåç ëèïèäíûé áèñëîé [17]. Èçâåñòíî òàêæå, ÷òî áëàãîäàðÿ
àìôèôèëüíîñòè ìîëåêóëû, α-òîêîôåðîë ïðè âûñîêèõ êîíöåíòðàöèÿõ ìîæåò ïðîÿâëÿòü ñâîéñòâà
äåòåðãåíòà, â ðåçóëüòàòå ÷åãî ñïîñîáåí äåñòàáèëèçèðîâàòü ìåìáðàííûé áèñëîé [18].  ñâÿçè ñ
ýòèì ìû ïðåäïîëîæèëè, ÷òî âûñîêàÿ ñòåïåíü
ïðîíèöàåìîñòè ÷åðåç êëåòî÷íóþ ìåìáðàíó êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ α-òîêîôåðîëà ïîçâîëÿåò ñîçäàòü âíóòðè êëåòêè èõ êîíöåíòðàöèþ,
äîñòàòî÷íóþ äëÿ äåñòàáèëèçàöèè ìåìáðàí ñóáêëåòî÷íûõ ñòðóêòóð.
 ïîñëåäíèå ãîäû â ëèòåðàòóðå øèðîêî îáñóæäàþòñÿ äàííûå î òîì, ÷òî, íàðÿäó ñ ìèòîõîíäðèÿìè è ÿäðîì – ñòðóêòóðàìè, ïðèíèìàþùèìè
íåïîñðåäñòâåííîå ó÷àñòèå â íåêðîòè÷åñêîé è àïîïòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê, àêòèâíóþ ðîëü â äàííûõ ïðîöåññàõ èãðàþò òàêæå ëèçîñîìû. Ïîâûøåíèå ïðîíèöàåìîñòè ëèçîñîìíîé ìåìáðàíû è
âûõîä â öèòîçîëü êëåòêè ëèçîñîìíûõ ãèäðîëè-
α-Токоферилацетат-С6
α-Токоферол-С6
Токоферилхинон-С6
40
Выход кислой фосфатазы, %
òè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ îáóñëîâëèâàåò ãèáåëü êëåòîê, à ñòåïåíü óâåëè÷åíèÿ ïðîíèöàåìîñòè ëèçîñîìíîé ìåìáðàíû è èíòåíñèâíîñòü âûõîäà ôåðìåíòîâ ìîãóò îïðåäåëÿòü “âûáîð” ìåæäó àïîïòîçîì è íåêðîçîì [19]. Êàê ñëåäóåò èç ðèñ. 4,
êîðîòêîöåïî÷å÷íûå ïðîèçâîäíûå α-òîêîôåðîëà
âûçûâàþò ïîÿâëåíèå â èíêóáàöèîííîé ñðåäå êèñëîé ôîñôàòàçû – îäíîãî èç îñíîâíûõ ìàðêåðîâ
ëèçîñîì. Õàðàêòåð âûõîäà èç êëåòîê ôåðìåíòà
ïðÿìî ïðîïîðöèîíàëåí âûõîäó ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû è îáðàòíî – âûæèâàåìîñòè êëåòîê. Íàèáîëüøèì ýôôåêòîì â êîíöåíòðàöèè 50 ìêÌ îáëàäàåò ÒÔ-Ñ6, íàèìåíüøèì – ÒÀö-Ñ6. Ïîñêîëüêó âûõîä êèñëîé ôîñôàòàçû èç êëåòîê ÿâëÿåòñÿ
âòîðè÷íûì ïî îòíîøåíèþ ê åå âûõîäó èç ëèçîñîì â öèòîçîëü, äëÿ êîððåêòíîé îöåíêè êîëè÷åñòâà ñâîáîäíîãî ôåðìåíòà áûëî ïðîâåäåíî èññëåäîâàíèå ïîëíîòû åãî âûõîäà èç êëåòîê. Îñòàòî÷íàÿ àêòèâíîñòü ñâîáîäíîãî ôåðìåíòà â îñàäêå
êëåòîê áûëà îäèíàêîâîé äëÿ êîíòðîëüíîé è îïûòíûõ ïðîá ïðè âñåõ êîíöåíòðàöèÿõ èññëåäóåìûõ
ïðîèçâîäíûõ è êîëåáàëàñü â ïðåäåëàõ 8–10% îò
îáùåãî ñîäåðæàíèÿ êèñëîé ôîñôàòàçû â èíòàêòíûõ êëåòêàõ. Ñóììèðîâàíèå îòíîñèòåëüíîé àêòèâíîñòè âûøåäøåãî èç êëåòîê ôåðìåíòà è åãî
îñòàòî÷íîé àêòèâíîñòè â êëåòêàõ íå èçìåíÿëî
õàðàêòåð êðèâûõ, ïðåäñòàâëåííûõ íà ðèñ. 4. Ïî
íàøåìó ìíåíèþ, ïîÿâëåíèå â êóëüòóðàëüíîé ñðåäå
êèñëîé ôîñôàòàçû ñâèäåòåëüñòâóåò î äåñòàáèëèçàöèè èññëåäóåìûìè ñîåäèíåíèÿìè ëèçîñîìíîé
ìåìáðàíû, ÷òî, î÷åâèäíî, è îáóñëîâëèâàåò èõ
öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò.
35
30
25
20
15
0
10
20
50
100
Концентрация, мкМ
Ðèñ. 4. Çàâèñèìîñòü âûõîäà èç òèìîöèòîâ êðûñû êèñëîé ôîñôàòàçû (% îò îáùåãî ñîäåðæàíèÿ â
àëèêâîòå èíòàêòíûõ êëåòîê) îò êîíöåíòðàöèè êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ âèòàìèíà Å, M ± m,
n = 5–6.
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
81
ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ
Ñõîäñòâî õàðàêòåðà êðèâûõ âëèÿíèÿ êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ àíàëîãîâ íà âñå èññëåäîâàííûå
ïîêàçàòåëè óêàçûâàåò íà òî, ÷òî èõ öèòîòîêñè÷íîñòü îïðåäåëÿåòñÿ, ïðåæäå âñåãî, íàëè÷èåì óêîðî÷åííîé áîêîâîé ôèòèëüíîé öåïè, ïîâûøàþùåé ñòåïåíü ïðîíèöàåìîñòè ÷åðåç öèòîïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó, ïîñêîëüêó α-òîêîôåðîë,
α-òîêîôåðèëàöåòàò è òîêîôåðèëõèíîí ñ íàòèâíîé áîêîâîé öåïüþ â êîíöåíòðàöèÿõ 100 ìêÌ
íå îêàçûâàþò âëèÿíèÿ íà âûæèâàåìîñòü òèìîöèòîâ êðûñû [14]. Îäíàêî íàëè÷èå îïðåäåëåííûõ ðàçëè÷èé â ñòåïåíè ýôôåêòîâ ñâèäåòåëüñòâóåò
â ïîëüçó äîïîëíèòåëüíîé ðîëè õèìè÷åñêîé ñòðóêòóðû õðîìàíîâîãî ÿäðà êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ àíàëîãîâ. Òàê, ñïîñîáíîñòü α-òîêîôåðîëà è, âåðîÿòíî ÒÔ-Ñ6, â âûñîêèõ êîíöåíòðàöèÿõ ïðîÿâëÿòü
ïðîîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà [18], âûçûâàÿ îêñèäàòèâíûé ñòðåññ, ìîæåò âíîñèòü äîïîëíèòåëüíûé
ê ëèçîñîìîäåñòàáèëèçèðóþùåìó ýôôåêòó âêëàä
â öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå ÒÔ-Ñ6. Ýêðàíèðîâàíèå ÎÍ-ãðóïïû õðîìàíîâîãî ÿäðà ýôèðíîé ñâÿçüþ â ñëó÷àå ÒÀö-Ñ6 ïðåäîòâðàùàåò ïðîòåêàíèå
íåñïåöèôè÷åñêèõ îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíûõ ðåàêöèé, ÷òî ìîæåò îïðåäåëÿòü åãî íàèìåíüøóþ öèòîòîêñè÷íîñòü.
Íåîáõîäèìî îòìåòèòü, ÷òî õîòÿ êîíöåíòðàöèÿ 100 ìêÌ ÿâëÿåòñÿ ôèçèîëîãè÷åñêîé äëÿ
α-òîêîôåðîëà [20], îäíàêî â ñëó÷àå åãî êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ìåòàáîëèòîâ îíà áåçóñëîâíî äîëæíà
ðàññìàòðèâàòüñÿ êàê íàãðóçî÷íàÿ.  íàñòîÿùåå
âðåìÿ íå ñóùåñòâóåò äàííûõ î êîíöåíòðàöèè
Ñ6-ìåòàáîëèòîâ â êëåòêå. Ýêñêðåöèÿ ñ ìî÷îé êîíå÷íîãî ïðîäóêòà ìåòàáîëèçìà α-òîêîôåðîëà
(α-ÑÅÍÑ, Ñ2-ìåòàáîëèò ) ó ÷åëîâåêà ñîñòàâëÿåò
îêîëî 0,3 ìã â ñóòêè [21]. Ïðè èíêóáàöèè êóëüòóðû êëåòîê HepG2 ñ 50 ìêÌ α-òîêîôåðîëà êîíöåíòðàöèÿ α-ÑÅÍÑ â êëåòêàõ íàõîäèòñÿ â ïðåäåëàõ
0,1 íìîëü/ìã áåëêà [22 ]. Îäíàêî, ïîñêîëüêó êîðîòêîöåïî÷å÷íûå àíàëîãè α-òîêîôåðîëà âûçûâàþò ãèáåëü êóëüòóð ðàêîâûõ êëåòîê [8], ýòî îáñòîÿòåëüñòâî, íà íàø âçãëÿä, íå ìåøàåò ðàññìàòðèâàòü äàííûå ñîåäèíåíèÿ êàê ïîòåíöèàëüíûå
ïðîòèâîîïóõîëåâûå àãåíòû, îñîáåííî â ñëó÷àå ôåíîìåíà ëåêàðñòâåííîé ðåçèñòåíòíîñòè, êîãäà ðàêîâûå êëåòêè óñòîé÷èâû ê äåéñòâèþ àãåíòîâ,
âûçûâàþùèõ àïîïòîç. Îòìåòèì òàêæå, ÷òî òîêîôåðèë-ñóêöèíàò, ïðîàïîïòè÷åñêîå è ïðîòèâîîïóõîëåâîå äåéñòâèå êîòîðîãî èíòåíñèâíî èññëåäóåòñÿ â ïîñëåäíèå ãîäû [5], âîîáùå íå ÿâëÿåòñÿ
ôèçèîëîãè÷åñêèì ñîåäèíåíèåì è äîëæåí ðàññìàòðèâàòüñÿ êàê êñåíîáèîòèê.
Òàêèì îáðàçîì, ïî íàøåìó ìíåíèþ, ñîâîêóïíîñòü ïðåäñòàâëåííûõ äàííûõ ñâèäåòåëüñòâóåò
â ïîëüçó ïðåäëîæåííîãî íàìè âîçìîæíîãî ìåõàíèçìà öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ ïðîèçâîäíûõ α-òîêîôåðîëà â êóëüòóðå
êëåòîê, à èìåííî – èõ ïîâûøåííàÿ ïðîíèöàåìîñòü ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó ïîçâîëÿåò
ñîçäàòü âíóòðè êëåòêè êîíöåíòðàöèþ, äîñòàòî÷íóþ äëÿ äåòåðãåíòïîäîáíîé äåñòàáèëèçàöèè ìåìáðàí ëèçîñîì, ÷òî ïðèâîäèò ê âûõîäó â öèòîçîëü
êëåòêè ëèçîñîìíûõ ôåðìåíòîâ è ãèáåëè êëåòêè
ïî ïóòè íåêðîçà. Ïîäîáíûé ìåõàíèçì öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ ïîñòóëèðóåòñÿ è äëÿ ïðèðîäíîãî êîìïîíåíòà áèîëîãè÷åñêèõ ìåìáðàí è âòîðè÷íîãî ìåññåíäæåðà – ñôèíãîçèíà. ßâëÿÿñü â
íèçêèõ êîíöåíòðàöèÿõ èíäóêòîðîì àïîïòîçà, ïðè
óâåëè÷åíèè êîíöåíòðàöèé âûøå 20 ìêã/ìë ñôèíãîçèí âûçûâàåò íåêðîòè÷åñêóþ ãèáåëü êëåòîê çà
ñ÷åò äåòåðãåíòïîäîáíîé ñîëþáèëèçàöèè ëèçîñîìíîé ìåìáðàíû [23]. Ïîäîáíàÿ äåñòàáèëèçàöèÿ
ìåìáðàíû ëèçîñîì ïðåäïîëàãàåòñÿ è äëÿ ïðîàïîïòè÷åñêîãî äåéñòâèÿ òîêîôåðèë-ñóêöèíàòà [24].
Âïîëíå âîçìîæíî, ÷òî ìåõàíèçì ïîäîáíîãî ðîäà
ÿâëÿåòñÿ óíèâåðñàëüíûì äëÿ öèòîòîêñè÷åñêîãî
äåéñòâèÿ â óñëîâèÿõ êóëüòóð êëåòîê ãèäðîôîáíûõ ñîåäèíåíèé, êîòîðûå îáëàäàþò äåòåðãåíòïîäîáíûìè ñâîéñòâàìè è ñïîñîáíû äîñòàòî÷íî
ëåãêî ïðîíèêàòü ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó êëåòêè.
CYTOTOXIC EFFECT OF VITAMIN E
SHORT-CHAIN DERIVATIVES ON RAT
THYMOCYTES
G. V. Petrova, G. V. Donchenko
Palladin Institute of Biochemistry, National Añademy
of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: [email protected]
Summary
It is established, that α-tocopherol, α-tocopheryl acetate and tocopheryl quinone with carbon lateral chains shortened to 6 atoms inhibited the viability of primary culture rats thymocytes in a dosedependent manner. Absence of the DNA internucleosomal degradation side by side with cytosolic lactatedehydrogenase outlet from the cells testifies to the
benefit of necrotic way of thymocytes destruction.
The outlet from cells of acid phosphatase, lysosomal
marker enzyme, testifies to destabilization of lysosomal membranes by the researched compounds. The
possible mechanism of cytotoxication of vitamin E
short-chain derivatives in cell cultures is offered,
namely: their high permeability through a plasmatic
membrane allows to create inside the cells a concentration, sufficient for detergent-like rupture of the
lysosomal membranes, that results in the entering of
lysosomal enzymes in cytosol and destruction of cells
by necrosis.
K e y w o r d s: vitamin E short-chain derivatives, apoptosis, necrosis, thymocytes, lysosomes.
.
82
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ã. Â. ÏÅÒÐÎÂÀ, Ã. Â. ÄÎÍ×ÅÍÊÎ
1. Emerson O. H., Emerson G. A., Mohammed A. et
al. // J. Biol. Chem. 1937. 122. Ð. 99–107.
2. Hensley K., Benaksas E. J., Bolli R. et al. //
Free Radic. Biol. Med. 2004. 36, N 1. Ð. 1–15.
3. Ïåòðîâà Ã. Â., Êàïðàëîâ À. À., Äîí÷åíêî Ã. Â.
// Óêð. áiîõiì. æóðí. 2003. 75, ¹ 6. Ñ. 25–
34.
4. Kogure K., Hama S., Kisaki M. et al. // Biochim.
Biophys. Acta. 2004. 1672, N 2. P. 93–99.
5. Prasad K. N., Kumar B., Yan X. D. et al. // J.
Am. Coll. Nutr. 2003. 22, N 2. P. 108–117.
6. McIntyre B. S., Briski K. P., Tirmenstein M. A.
et al. // Lipids. 2000. 35, N 2. P. 171–180.
7. Birringer M., Drogan D., Brigelius-Flohe R. //
Free Radical Biol.and Med. 2001. 31, N 2.
P. 226–232.
8. Äîí÷åíêî Ã. Â., Õîëîäîâà Þ. Ä., Êóçüìåíêî È. Â.
è äð. // Óêð. áiîõiì. æóðí. 1998. 70, ¹ 2.
Ñ. 37–45.
9. Ïåòðîâà Ã. Â., Êàïðàëîâ À. À., Äîí÷åíêî Ã. Â.
// Òàì ñàìî. 2003. 75, ¹ 1. Ñ. 78–84.
10. Herrmann M., Lorenz H. M., Voll R. et al. //
Nucleic Acids Res. 1994. 22. P. 5506–5507.
11. McConkey D. J. // J. Biol. Chem. 1996. 271,
N 37. P. 22398–22406.
12. Chen A., Jones T. W., Brown P. C. et al. //
Ibid. 1990. 265, N 35. P. 21603–21611.
13. Áàððåò À. Äæ., Õèò Ì.Ô. / Ëèçîñîìû. Ìåòîäû èññëåäîâàíèÿ. Ïîä ðåä . Äæ. Äèíãëà. Ì.:
Ìèð. 1980. Ñ. 25–156.
14. Ïåòðîâà Ã. Â., Äîí÷åíêî Ã. Â. // Óêð. áiîõiì.
æóðí. 2005. 77, ¹ 1. Ñ. 68–73.
15. Nicotera P., Melino G. // Oncogene. 2004. 23.
P. 2757–2765.
16. Fiers W., Beyaert R., Declercq W. et al. // Ibid.
1999. 18. P. 7719–7730.
17. Niki E., Kawakami A., Saito M. et al. // J.
Biol.Chem. 1985. 260, N 4. P. 2191–2196.
18. Wang, X., Quinn P. J. // Prog. Lipid Res. 1999.
38, N 4. P. 309–336.
19. Guicciardi M. E., Leist M., Gores G. J. //
Oncogene. 2004. 23. P. 2881–2890.
20. Ïàëüìèíà Í. Ï., Ìàëüöåâà Å. Ë., Êóðíàêîâà Í. Â. è äð. // Áèîõèìèÿ. 1994. 59, ¹ 2.
Ñ. 193–200.
21. Schuelke M., Elsner A., Finckh B. et al. // J.
Lipid Res. 2000. 41. P. 1543–1551.
22. Birringer M., Pfluger P., Kluth D. et al. // J.
Nutr. 2002. 132. P. 3113–3118.
23. Kagedal K., Zhao M., Svensson I. et al. //
Biochem. J. 2001. 359, N 2. P. 335–343.
24. Neuzil J., Zhao M., Ostermann G. et al. // Ibid.
2002. 362, N 3. P. 709–715.
Ïîëó÷åíî 11.02.2005
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
83