êàëüöèåâûé ãîìåîñòàç â òèìîöèòàõ ïðè àïîïòîçå. i. ïîâûøåíèå êîíöåíòðà

ÓÄÊ 577.342.45:612
ÊÀËÜÖÈÅÂÛÉ ÃÎÌÅÎÑÒÀÇ Â ÒÈÌÎÖÈÒÀÕ ÏÐÈ ÀÏÎÏÒÎÇÅ.
I. ÏÎÂÛØÅÍÈÅ ÊÎÍÖÅÍÒÐÀÖÈÈ ÖÈÒÎÇÎËÜÍÎÃÎ
Ñà2+ ÍÀ ÐÀÍÍÅÉ ÑÒÀÄÈÈ ÀÏÎÏÒÎÇÀ,
ÈÍÄÓÖÈÐÎÂÀÍÍÎÃÎ ÏÅÐÎÊÑÈÄÎÌ ÂÎÄÎÐÎÄÀ
Ä. Ì. ÃÐÅÁÈÍÛÊ, Ò. Â. ÊÎÂÀËÜ, Î. Ï. ÌÀÒÛØÅÂÑÊÀß
Êèåâñêèé íàöèîíàëüíûé óíèâåðñèòåò èìåíè Òàðàñà Øåâ÷åíêî, Óêðàèíà;
e-mail: grebinik@yahoo.com
Äîñë³äæóâàëè êîíöåíòðàö³þ â³ëüíîãî öèòîçîëüíîãî Ñà2+ ([Ca2+]i), âõ³ä 45Ñà2+ òà âì³ñò â³äíîâëåíîãî ãëóòàò³îíó (GSH) â ³çîëüîâàíèõ òèìîöèòàõ ï³ñëÿ ðåíòãåí³âñüêîãî îïðîì³íåííÿ â äîç³ 4,5 Ãð àáî çà
䳿 0,1ìÌ Í2Î2 â ïåð³îä, ÿêèé ïåðåäóº âèÿâëåí³é åëåêòðîôîðåòè÷íî ì³æíóêëåîñîìí³é ôðàãìåíòàö³¿ ÄÍÊ.
²ç âèêîðèñòàííÿì çîíäà ôóðà-2 âñòàíîâëåíî, ùî ð³âåíü öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â îïðîì³íåíèõ êë³òèíàõ íå
çì³íþºòüñÿ ïîð³âíÿíî ç êîíòðîëåì, à âì³ñò GSH íå çíèæóºòüñÿ.  îáðîáëåíèõ ïåðîêñèäîì âîäíþ
êë³òèíàõ âèÿâëåíî ïîñòóïîâå ï³äâèùåííÿ [Ca2+]i îäíî÷àñíî ç³ çíèæåííÿì âì³ñòó GSH. Âõ³ä 45Ñà2+ â
òèìîöèòè ï³ä 䳺þ àïîïòîãåííèõ ÷èííèê³â íå ïîñèëþºòüñÿ. Äîäàâàííÿ Í2Î2 äî êë³òèí, ïîïåðåäíüî
îáðîáëåíèõ òàïñèãàðã³íîì, òàêîæ ïðèçâîäèòü äî ïîäàëüøîãî çðîñòàííÿ [Ca2+]i ÿê ó ñòàíäàðòíîìó, òàê
³ â íîì³íàëüíî áåçêàëüö³ºâîìó ñåðåäîâèù³. Öèêëîñïîðèí À ïðèãí³÷óº Ñà2+-ìîá³ë³çóâàëüíèé åôåêò ïåðîêñèäó âîäíþ, àëå íå ïîïåðåäæຠéîãî ïîâí³ñòþ. Îáãîâîðþºòüñÿ ðîëü âíóòð³øíüîêë³òèííèõ äåïî â ïîðóøåíí³
êàëüö³ºâîãî ãîìåîñòàçó â òèìîöèòàõ çà óìîâ ìîäåëþâàííÿ îêèñíîãî ñòðåñó òà àïîïòîçó.
Ê ë þ ÷ î â ³ ñ ë î â à: êàëüö³é, àïîïòîç, ïåðîêñèä âîäíþ, ðåíòãåí³âñüêå îïðîì³íåííÿ, ì³òîõîíäð³¿, öèêëîñïîð³í À, òèìîöèòè.
Í
åñìîòðÿ íà òî, ÷òî â ïîñëåäíåå âðåìÿ èíòåíñèâíî èññëåäóþòñÿ ìåõàíèçìû àïîïòîçà, ïóòè êîíòðîëèðîâàíèÿ ýòîãî
ïðîöåññà îñòàþòñÿ íåäîñòàòî÷íî èçó÷åííûìè. Îò÷àñòè ýòî îáúÿñíÿåòñÿ òåì, ÷òî â êàñêàäàõ ðåàêöèé, çàïóñêàþùèõ ïðîãðàììó êëåòî÷íîé ãèáåëè,
ïîñòîÿííî âûÿâëÿþòñÿ íîâûå çâåíüÿ, ïîñëåäîâàòåëüíîñòü âêëþ÷åíèÿ êîòîðûõ çàâèñèò îò ïðèðîäû àïîïòîãåííîãî ñòèìóëà, òèïà è ôóíêöèîíàëüíîé àêòèâíîñòè êëåòîê. Ñîãëàñíî äàííûì
ðàáîò ïîñëåäíèõ ëåò, îäíèì èç ôàêòîðîâ êîíòðîëÿ êàê ðàííåãî, òàê è çàâåðøàþùåãîñÿ óïîðÿäî÷åííîé äåãðàäàöèåé ÄÍÊ ïîçäíåãî ýòàïà àïîïòîçà ÿâëÿåòñÿ ïîâûøåíèå êîíöåíòðàöèè ñâîáîäíîãî öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â êëåòêå ([Ca2+]i). Çàðåãèñòðèðîâàíî âîçðàñòàíèå [Ca2+]i â ëèìôîèäíûõ
êëåòêàõ è òèìîöèòàõ ïðè àïîïòîçå â îòâåò íà
îáðàáîòêó ãëþêîêîðòèêîèäàìè, àíòèòåëàìè ê ÑD3
[1–3], à òàêæå â êëåòêàõ ðàçëè÷íûõ òèïîâ ïðè
àïîïòîçå, âûçâàííîì òàïñèãàðãèíîì èëè êàëüöèåâûìè èîíîôîðàìè [4,5]. Ïîêàçàíî, ÷òî àïîïòîãåííûé ýôôåêò ìîæåò íàáëþäàòüñÿ â ñëó÷àå
îñâîáîæäåíèÿ Ñà2+ èç ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëóìà (ÝÏÐ), “eìêîñòíîãî” âõîäà êàòèîíà â
êëåòêó ÷åðåç Ñà2+-êàíàëû, àêòèâèðóåìûå îïóñòîøåíèåì ÝÏÐ, à òàêæå âûõîäà Ñà2+ èç ìèòîõîíäðèàëüíîãî ìàòðèêñà [6–8]. Î÷åâèäíî, ÷òî âàæíóþ ðîëü â èíèöèàöèè àïîïòîçà èãðàåò íå ñòîëüêî
ïîâûøåíèå îáùåãî óðîâíÿ Ñà2+ â öèòîçîëå, ñêîëü-
êî íàðóøåíèå åãî âíóòðèêëåòî÷íîé êîìïàðòìåíòàëèçàöèè âñëåäñòâèå äèñáàëàíñà Ñà2+-ïóëîâ ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëóìà è ìèòîõîíäðèé.
 ñâÿçè ñ ýòèì âàæíîå çíà÷åíèå ïðèîáðåòàåò îöåíêà êîíöåíòðàöèè öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â äèíàìèêå
àïîïòîçà, èíäóöèðîâàííîãî ðàçëè÷íûìè ôàêòîðàìè è èññëåäîâàíèå âîçìîæíûõ ïðè÷èííî-ñëåäñòâåííûõ ñâÿçåé ìåæäó ïðîÿâëåíèåì ìîðôîëîãè÷åñêèõ ïðèçíàêîâ àïîïòîçà è íàðóøåíèÿìè
êàëüöèåâîãî ãîìåîñòàçà â ñèñòåìå åãî ïîääåðæàíèÿ.
Äëÿ ýêñïåðèìåíòàëüíîãî ìîäåëèðîâàíèÿ
àïîïòîçà íàìè áûëà èñïîëüçîâàíà ñóñïåíçèÿ èçîëèðîâàííûõ òèìîöèòîâ, ïîäâåðæåííàÿ äåéñòâèþ
èîíèçèðóþùåé ðàäèàöèè êàê ôàêòîðà, îñíîâíîé
ìèøåíüþ êîòîðîãî ÿâëÿåòñÿ ÄÍÊ, ëèáî ïåðîêñèäà âîäîðîäà – óíèâåðñàëüíîãî èíäóêòîðà
îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà. Ñîãëàñíî äàííûì, ïîëó÷åííûì íàìè ñ èñïîëüçîâàíèåì ôëóîðåñöåíòíîé ìèêðîñêîïèè, íà ðàííåì ýòàïå èíêóáàöèè
òèìîöèòîâ ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ
(4,5 Ãð) èëè â ïðèñóòñòâèè Í2Î2 (0,1 ìÌ) â ñóñïåíçèè òèìîöèòîâ îáíàðóæèâàåòñÿ çíà÷èòåëüíîå
êîëè÷åñòâî àïîïòè÷åñêèõ êëåòîê ñ êîíäåíñèðîâàííûì è ôðàãìåíòèðîâàííûì õðîìàòèíîì [9].
Öåëüþ äàííîé ðàáîòû áûëî èçó÷èòü äèíàìèêó íàêîïëåíèÿ ïðîäóêòîâ ìåæíóêëåîñîìíîãî
ðàñùåïëåíèÿ ÄÍÊ, ïàðàëëåëüíî îöåíèòü óðîâåíü
öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â êëåòêàõ è ïðîàíàëèçèðîâàòü
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6
63
ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ
âîçìîæíûå ïðè÷èíû åãî èçìåíåíèÿ ïîñëå äåéñòâèÿ èññëåäóåìûõ àïîïòîãåííûõ ôàêòîðîâ.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Òèìîöèòû ïîëó÷àëè èç òèìóñà êðûñ ëèíèè
Âèñòàð ìàññîé òåëà 120–150 ã. Òèìóñ ïðîòèðàëè
÷åðåç íåéëîíîâîå ñèòî â áóôåð À, ñîäåðæàùèé
(ìÌ): Na2HPO4 × 12H2O – 3, KCl – 5, NaCl –
120, ãëþêîçà – 10, HEPES – 5, NaHCO3 – 4,
MgCl2 – 1 è CaCl2 – 1. Êîëè÷åñòâî æèçíåñïîñîáíûõ êëåòîê îïðåäåëÿëè â êàìåðå Ãîðÿåâà ñ
èñïîëüçîâàíèåì 0,2%-ãî òðèïàíîâîãî ñèíåãî.
Óñëîâèÿ ïîñòàíîâêè ýêñïåðèìåíòà: ñóñïåíçèþ êîíòðîëüíûõ òèìîöèòîâ èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå óêàçàííîãî âðåìåíè; â ñðåäó èíêóáàöèè
äîáàâëÿëè ïåðîêñèä âîäîðîäà äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 0,1ìÌ; ïåðåä èíêóáàöèåé êëåòî÷íóþ
ñóñïåíçèþ ïîäâåðãàëè îäíîðàçîâîìó ðåíòãåíîâñêîìó îáëó÷åíèþ íà óñòàíîâêå ÐÓÌ–17 ïðè ýêñïîçèöèîííîé äîçå – 11,61 × 10-2 Êë/êã (4,5 Ãð,
ìîùíîñòü äîçû – 0,24 Ãð/ìèí); ôèëüòðû 0,5 ìì
(Cu + Al), íàïðÿæåíèå 200 êÂ, ñèëà òîêà 10 ìÀ,
ôîêóñíîå ðàññòîÿíèå – 50 ñì.
Èíêóáàöèþ òèìîöèòîâ â êîíöåíòðàöèè (2–
4) × 106 êëåòîê/ìë ïðîâîäèëè â òåðìîñòàòå â ñðåäå RPMI-1640 ñ äîáàâëåíèåì 5%-é ýìáðèîíàëüíîé òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêè. Ïîñëå îñàæäåíèÿ (600 g,
10 ìèí) êëåòêè ïîìåùàëè â áóôåð À.
Êîíöåíòðàöèþ ñâîáîäíîãî öèòîçîëüíîãî
Ñà 2+ â òèìîöèòàõ îïðåäåëÿëè ñ ïîìîùüþ
ôóðà-2ÀÌ («Sigma», ÑØÀ). Êëåòî÷íóþ ñóñïåíçèþ (3 × 107 êëåòîê/ìë) íàãðóæàëè çîíäîì â òå÷åíèå 40 ìèí ïðè 25 °Ñ è îòìûâàëè îò èçáûòêà
çîíäà òðåõêðàòíûì öåíòðèôóãèðîâàíèåì (600 g,
10 ìèí) ñ ïîñëåäóþùèì ðåñóñïåíäèðîâàíèåì â
áóôåðå À äî êîíöåíòðàöèè 1 × 107 êëåòîê/ìë.
Ïðè èññëåäîâàíèè ýôôåêòîâ ðàçëè÷íûõ äîáàâîê
èíêóáàöèþ íàãðóæåííûõ çîíäîì òèìîöèòîâ ïðîâîäèëè íåïîñðåäñòâåííî â êþâåòå â ñòàíäàðòíîé
(áóôåð À) è íîìèíàëüíî áåçêàëüöèåâîé (íå ñîäåðæàùåé CaCl2) ñðåäå. Ñïåêòðû ôëóîðåñöåíöèè
ôóðà-2 ðåãèñòðèðîâàëè íà ñïåêòðîôëóîðèìåòðå
Shimadzu RF-510, λâîçáóæä. = 330 è 375 íì, λèçëó÷. =
= 505 íì. Êîíöåíòðàöèþ Ñà2+ â êëåòêàõ ([Ñà2+]i)
ðàññ÷èòûâàëè ñ èñïîëüçîâàíèåì äâóõëó÷åâîãî
ôëóîðåñöåíòíîãî ïàðàìåòðà R [10].
Äëÿ îöåíêè âõîäà Ñà2+ òèìîöèòû (5 × 106
êëåòîê) èíêóáèðîâàëè ïðè 37 °Ñ â ñðåäå îáúåìîì
0,5 ìë, ñîäåðæàùåé áóôåð À è 1 ìêÊè 45ÑàÑl2
(«Amersham», Âåëèêàÿ Áðèòàíèÿ). Ðåàêöèþ îñòàíàâëèâàëè áûñòðîé ôèëüòðàöèåé ïðîá ÷åðåç
ôèëüòðû “Millipore” (0,45 ìêì), êîòîðûå òðèæäû ïðîìûâàëè 3 ìë îõëàæäåííîãî ðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî 150 ìM KÑl, 5 ìÌ ÑîÑl2 × 6Í2Î,
10 ìÌ ÍÅÐÅS, ðÍ 7,4. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ àäñîðáöèè êàëüöèÿ ñóñïåíçèþ êëåòîê íàíîñèëè íà
64
ôèëüòðû ñðàçó æå ïîñëå äîáàâëåíèÿ ìåòêè. Ðàäèîàêòèâíîñòü ïðîá èçìåðÿëè íà æèäêîñöèíòèëëÿöèîííîì ñ÷åò÷èêå Delta (ÑØÀ).
Ñòðóêòóðíîå ñîñòîÿíèå ÄÍÊ îöåíèâàëè ñ
ïîìîùüþ ýëåêòðîôîðåçà â 1,5%-ì àãàðîçíîì ãåëå,
ñîäåðæàùåì áðîìèä ýòèäèÿ (0,5 ìêã/ìë), â òðèñàöåòàòíîì áóôåðå (pH = 8,3), íà ïðîòÿæåíèè 5 ÷
ïðè íàïðÿæåíèè 5 Â/ñì.
Äëÿ ýêñòðàêöèè ÄÍÊ ê òèìîöèòàì äîáàâëÿëè ëèçèðóþùèé áóôåð, ñîäåðæàùèé 10 ìÌ
òðèñ – HCl (pH = 7,4), 10 ìÌ ÝÄÒÀ, òðèòîí
X-100 (0,5%), ñìåñü èíêóáèðîâàëè 10 ìèí ïðè
+4 °Ñ. Ýêñòðàêöèþ ÄÍÊ èç äåïðîòåèíèçîâàííûõ ïðîòåèíêèíàçîé Ê («Sigma», ÑØÀ) ïðîá ïðîâîäèëè ïðè –20 °Ñ ñìåñüþ 3 Ì àöåòàòà íàòðèÿ
(ðÍ 5,2) : ýòàíîë (1 : 20) è öåíòðèôóãèðîâàíèåì
(13 000 g, 10 ìèí).
Êîëè÷åñòâî âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà
(GSH) îöåíèâàëè ôëóîðåñöåíòíûì ìåòîäîì ñ
ïðèìåíåíèåì îðòîôòàëåâîãî àëüäåãèäà [11]. Äëÿ
îïðåäåëåíèÿ èñïîëüçîâàëè ñóïåðíàòàíò êëåòî÷íîãî ýêñòðàêòà, ïîëó÷åííûé ïîñëå ðàçðóøåíèÿ
òèìîöèòîâ (2 × 107 êëåòîê/ìë) â ñðåäå, ñîäåðæàùåé 1,5 ìë 0,1 Ì ÍÑÎ2Í, è öåíòðèôóãèðîâàíèÿ
(10 000 g, 15 ìèí). Ôëóîðåñöåíöèþ ïðîá èçìåðÿëè ïðè λâîçáóæä. = 350 íì, λèçëó÷. = 420 íì íà
ñïåêòðîôëóîðèìåòðå Shimadzu RF-510 (ßïîíèÿ).
Ñòàòèñòè÷åñêóþ îáðàáîòêó ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ ïðîâîäèëè îáùåïðèíÿòûìè ìåòîäàìè
ñ èñïîëüçîâàíèåì t-êðèòåðèÿ Ñòüþäåíòà.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Ðåçóëüòàòû ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîãî àíàëèçà
ñòðóêòóðíîãî ñîñòîÿíèÿ ÄÍÊ, âûäåëåííîé èç
òèìîöèòîâ ÷åðåç 1 è 3 ÷ ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî
îáëó÷åíèÿ â äîçå 4,5 Ãð èëè äåéñòâèÿ 0,1 ìÌ
Í2Î2, ïðåäñòàâëåíû íà ðèñ. 1. Íà ïðîòÿæåíèè
èíêóáàöèè êîíòðîëüíûõ òèìîöèòîâ âûñîêîïîëèìåðíîå ñîñòîÿíèå ÄÍÊ ñîõðàíÿåòñÿ, òîãäà êàê â
îáëó÷åííûõ è ïîäâåðæåííûõ äåéñòâèþ ïåðîêñèäà êëåòêàõ ïðîèñõîäèò ðàñùåïëåíèå ÄÍÊ. Òàê,
óæå ÷åðåç 1 ÷ âîçëå ëèíèè ñòàðòà îòìå÷àåòñÿ íàêîïëåíèå ïðîäóêòîâ êðóïíîìàñøòàáíîé ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ, âûçâàííîé íåóïîðÿäî÷åííûìè ðàçðûâàìè ìîëåêóëû. ×åðåç 3 ÷ íà ýëåêòðîôîðåãðàììàõ îáíàðóæèâàþòñÿ ïðîäóêòû ìåæíóêëåîñîìíîé äåãðàäàöèè ÄÍÊ – îëèãîíóêëåîñîìíûå
ôðàãìåíòû ÄÍÊ, êðàòíûå 200 ï.î. Õîòÿ äèíàìèêà ïîâðåæäåíèÿ ñòðóêòóðû ÄÍÊ â êëåòêàõ ïîñëå
äåéñòâèÿ èññëåäóåìûõ ôàêòîðîâ ïîäîáíà, êîëè÷åñòâåííàÿ îöåíêà ïîêàçàëà, ÷òî îáùåå ñîäåðæàíèå íàêîïëåííûõ â òå÷åíèå 3 ÷ âûñîêîïîëèìåðíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ âûøå â òèìîöèòàõ, ïîäâåðãøèõñÿ äåéñòâèþ ïåðîêñèäà âîäîðîäà, à îëèãîíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ – â îáëó÷åííûõ
êëåòêàõ [12].
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6
Ä. Ì. ÃÐÅÁÈÍÛÊ, Ò. Â. ÊÎÂÀËÜ, Î. Ï. ÌÀÒÛØÅÂÑÊÀß
2
3
4
5
Ðèñ. 1. Ýëåêòðîôîðåãðàììà ÄÍÊ, âûäåëåííîé èç
êîíòðîëüíûõ òèìîöèòîâ (1) è èíêóáèðîâàííûõ â
òå÷åíèå 1 ÷ (2,3) è 3 ÷ (4,5) ïîñëå äîáàâëåíèÿ
0,1 ìÌ ïåðîêñèäà âîäîðîäà (2,4) èëè îáëó÷åíèÿ â
äîçå 4,5 Ãð (3,5).
Ýòè ðåçóëüòàòû ñîãëàñóþòñÿ ñ ëèòåðàòóðíûìè
äàííûìè, ñîãëàñíî êîòîðûì ïðîöåññ ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ ïðè îáëó÷åíèè òèìîöèòîâ in vitro õàðàêòåðèçóåòñÿ íàëè÷èåì íåçàâèñÿùåãî îò äîçû è
ìîùíîñòè ðàäèàöèîííîãî âîçäåéñòâèÿ ëàã-ïåðèîäà è ëèíåéíûì íàðàñòàíèåì êîëè÷åñòâà ïðîäóêòîâ ìåæíóêëåîñîìíîé äåãðàäàöèè ÄÍÊ â äèàïàçîíå äîç 0,5–6 Ãð [13].  ñëó÷àå îáðàáîòêè êëåòîê ðàçíîãî òèïà ïåðîêñèäîì âîäîðîäà â êîíöåíòðàöèÿõ íèæå 1 ìÌ ìåæíóêëåîñîìíàÿ ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ ïîäòâåðæäåíà ýëåêòðîôîðåòè÷åñêè è
ìåòîäîì ìå÷åíèÿ in situ ðàñùåïëåííûõ êîíöîâ
ìîëåêóëû [1, 14].
Ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå ïîçâîëèëè îöåíèòü äëèòåëüíîñòü ïåðèîäà, êîòîðûé ïðåäøåñòâóåò
ìåæíóêëåîñîìíîìó ðàñùåïëåíèþ ÄÍÊ – íåîáðàòèìîé ñòàäèè àïîïòîçà òèìîöèòîâ, èíäóöèðîâàííîãî èîíèçèðóþùåé ðàäèàöèåé èëè ïåðîêñèäîì âîäîðîäà. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî èìåííî â ýòîò
“ïðåàïîïòè÷åñêèé” ïåðèîä ïðîèñõîäèò àêòèâàöèÿ êîíòðîëèðóþùèõ àïîïòîç êàñêàäîâ, â òîì
÷èñëå è ôîðìèðîâàíèå êàëüöèåâîãî ñèãíàëà [1,3].
Ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ êîíöåíòðàöèè ñâîáîäíîãî öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â òèìîöèòàõ, êîòîðîå
ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ôëóîðåñöåíòíòíîãî çîíäà ôóðà-2, ïðèâåäåíû íà ðèñ. 2. Âåëè÷èíà
[Ca2+]i â êîíòðîëüíûõ òèìîöèòàõ ñîñòàâëÿåò
104 ± 9 íÌ è íå èçìåíÿåòñÿ íà ïðîòÿæåíèè èíISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6
êóáàöèè êëåòîê â êîíòðîëå.
Íàìè íå áûëî âûÿâëåíî èçìåíåíèé â êîíöåíòðàöèè öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â òèìîöèòàõ ïîñëå
äåéñòâèÿ ðåíòãåíîâñêîãî èçëó÷åíèÿ (ðèñ. 2, 1). Â
òèìîöèòàõ, èíêóáèðîâàííûõ â ïðèñóòñòâèè Í2Î2,
íàáëþäàåòñÿ áûñòðîå ïîâûøåíèå óðîâíÿ Ñà2+ â
öèòîçîëå – óæå ÷åðåç 30 ìèí îí âîçðàñòàåò â 2,7
ðàçà, à â ïåðèîä 2–3 ÷ äîñòèãàåò ìàêñèìàëüíîé
âåëè÷èíû, ïðåâûøàþùåé êîíòðîëüíóþ â 5 ðàç
(ðèñ. 2, 2). ×åðåç 5 ÷ íàáëþäàåòñÿ åå ñíèæåíèå.
Ñëåäóåò ó÷èòûâàòü, ÷òî ìîíèòîðèíã [Ca2+]i íà
óðîâíå ñóñïåíçèè êëåòîê ïîçâîëÿåò îöåíèòü ïîâûøåíèå åãî ñîäåðæàíèÿ â ñðåäíåì, êîòîðîå ÿâëÿåòñÿ áîëåå íèçêèì ïî ñðàâíåíèþ ñ òàêîâûì â
öèòîçîëå îòäåëüíîé êëåòêè. Ïîýòîìó îáíàðóæåííîå âîçðàñòàíèå [Ca2+]i óêàçûâàåò íà çíà÷èòåëüíîå ðàííåå íàðóøåíèå êàëüöèåâîãî ãîìåîñòàçà â
òèìîöèòàõ, îáðàáîòàííûõ H2O2.
Ïðè÷èíîé óâåëè÷åíèÿ [Ca2+]i ìîæåò áûòü
ëèáî óñèëåííûé âõîä êàòèîíà ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó êëåòîê (ïîâûøåíèå ñïåöèôè÷åñêîé è íåñïåöèôè÷åñêîé ïðîíèöàåìîñòè), ëèáî
åãî âûáðîñ èç âíóòðèêëåòî÷íûõ äåïî. Êàê ïîêàçàíî íàìè ðàíåå, äîáàâëåíèå â ñðåäó èíêóáàöèè
áëîêàòîðà êàëüöèåâûõ êàíàëîâ âåðàïàìèëà íå
âëèÿåò íà âåëè÷èíó ïîâûøåíèÿ [Ca2+]i, íàáëþäàåìîãî ÷åðåç 0,5 è 1 ÷ ïîñëå äåéñòâèÿ H2O2 [15].
Ýòî ïîçâîëÿåò ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ñïåöèôè÷åñêàÿ ïðîíèöàåìîñòü êàëüöèåâûõ êàíàëîâ ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû òèìîöèòîâ â ýòîò ïåðèîä âðåìåíè íå èçìåíÿåòñÿ.
Êàê èíòåãðàëüíûé ïîêàçàòåëü òðàíñìåìáðàííîãî ïåðåìåùåíèÿ èîíîâ Ñà ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó îöåíèâàëè ïàññèâíûé âõîä 45Ñà2+
â òèìîöèòû. Ñîãëàñíî ïîëó÷åííûì äàííûì
(ðèñ. 3), ÷åðåç 15 ìèí ïîñëå äåéñòâèÿ êàê îáëó-
700
600
500
[Ca2+]i, нМ
1
400
22
300
200
1
1
100
0
0
1
2
3
4
5
Время, ч
Ðèñ. 2. Äèíàìèêà èçìåíåíèÿ êîíöåíòðàöèè ñâîáîäíîãî Ñà2+ â öèòîçîëå òèìîöèòîâ ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ (1) èëè äîáàâëåíèÿ H2O2 (2).
65
ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ
÷åíèÿ, òàê è ïåðîêñèäà âîäîðîäà, óðîâåíü 45Ñà2+,
ïîñòóïèâøåãî â êëåòêè çà 1 ìèí, äîñòîâåðíî íå
èçìåíÿåòñÿ. ×åðåç 30 ìèí èíêóáàöèè êëåòîê â
ïðèñóòñòâèè Í2Î2 ïîêàçàòåëü ñíèæàåòñÿ íà 47%.
Òàêîå åãî óìåíüøåíèå, ñêîðåå âñåãî, ñâÿçàíî ñ
àêòèâàöèåé Ñà2+-ÀÒÐ-àçû ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû òèìîöèòîâ â óñëîâèÿõ ïîâûøåíèÿ óðîâíÿ
Ñà2+ â öèòîçîëå, ò.ê. ïîêàçàíî, ÷òî â Ò-ëèìôîöèòàõ àêòèâíîñòü Na+/Ñà2+ îáìåííèêà íå ôèêñèðóåòñÿ, à ñêîðîñòü îòêà÷èâàíèÿ êàòèîíà Ñà2+-ÀÒÐàçîé çíà÷èòåëüíî óâåëè÷èâàåòñÿ ïðè âîçðàñòàíèè
[Ca2+]i [16].
 ñîâîêóïíîñòè ýòè ðåçóëüòàòû ïîçâîëÿþò
çàêëþ÷èòü, ÷òî íà ðàííåì ýòàïå ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ ñèñòåìà ïîääåðæàíèÿ êàëüöèåâîãî ãîìåîñòàçà â òèìîöèòàõ íå íàðóøàåòñÿ, òîãäà êàê ïîñëå äåéñòâèÿ ïåðîêñèäà âîäîðîäà ïðîèñõîäèò ïîâûøåíèå [Ca2+]i âñëåäñòâèå íåêîíòðîëèðóåìîãî ïîñòóïëåíèÿ êàòèîíà â öèòîçîëü èç
âíóòðèêëåòî÷íûõ äåïî. Ïðè÷èíîé ýòîãî ìîæåò
áûòü äèñêîîðäèíàöèÿ ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ÝÏÐ
è ìèòîõîíäðèé â óñëîâèÿõ îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà
è ñíèæåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé çàùèòû âíóòðèêëåòî÷íûõ ìåìáðàííûõ ñòðóêòóð. Ïîñêîëüêó îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ ñ÷èòàåòñÿ âàæíûì êîìïîíåíòîì ïðîãðàììû àïîïòîçà, èíäóöèðîâàííîãî êàê
ïåðîêñèäîì âîäîðîäà, òàê è èîíèçèðóþùåé ðàäèàöèåé, ìû îöåíèëè ñîñòîÿíèå àíòèîêñèäàíòíîé ñèñòåìû â òèìîöèòàõ ïî òàêîìó ïîêàçàòåëþ,
êàê ñîäåðæàíèå âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà.
Ñîäåðæàíèå GSH â êîíòðîëüíûõ êëåòêàõ
ñîñòàâèëî 0, 8 ± 0,05 ìêã/107 êëåòîê è äîñòîâåðíî íå ñíèæàåòñÿ â ïåðèîä äî 3-õ ÷àñîâ èíêóáàöèè. Ïîñëå îáðàáîòêè òèìîöèòîâ íàáëþäàþòñÿ
ñóùåñòâåííûå îòëè÷èÿ â èçìåíåíèè óðîâíÿ GSH,
çàâèñÿùèå îò ïðèðîäû àïîïòîãåííîãî ôàêòîðà
(ðèñ. 4). Òàê, ÷åðåç 15 ìèí ïîñëå îáëó÷åíèÿ óðîâåíü GSH â êëåòêàõ áûë ñóùåñòâåííî ïîâûøåí,
÷åðåç 1 ÷ ïîêàçàòåëü âîçâðàùàåòñÿ ê êîíòðîëüíîìó çíà÷åíèþ è ñíèæàåòñÿ íà 24% ÷åðåç 3 ÷. Òàêèì
îáðàçîì, åñëè â îáëó÷åííûõ òèìîöèòàõ è ïðîèñõîäèò ñìåùåíèå â öèêëå ãëóòàòèîíà â íàïðàâëåíèè óâåëè÷åíèÿ ñîäåðæàíèÿ îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà, òî â ïåðèîä, îòäàëåííûé îò ìîìåíòà ðàäèàöèîííîãî âîçäåéñòâèÿ.  êëåòêàõ, îáðàáîòàííûõ ïåðîêñèäîì âîäîðîäà, ñîäåðæàíèå GSH áûñòðî ñíèæàåòñÿ – íà 28% îò êîíòðîëÿ ÷åðåç 30 ìèí
è íà 48% ÷åðåç 1 ÷, óäåðæèâàÿñü íà ýòîì óðîâíå
äî 3 ÷.
Ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå ñîãëàñóþòñÿ ñ òåì,
÷òî ïåðîêñèä âîäîðîäà, êîòîðûé ñàì ïî ñåáå íå
ÿâëÿåòñÿ ñèëüíûì îêèñëèòåëåì, áûñòðî ïðîíèêàåò ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó âíóòðü êëåòêè, ãäå ìîãóò íàêàïëèâàòüñÿ ïðîäóêòû åãî ïðåâðàùåíèÿ, â ÷àñòíîñòè, íàèáîëåå ðåàêöèîííî-àêòèâíûé ãèäðîêñèëüíûé ðàäèêàë.  çíà÷èòåëüíîé
ìåðå ïîâðåæäàþùåìó äåéñòâèþ ïåðîêñèäà ïîäâåðæåíû ìèòîõîíäðèè, â êîòîðûõ îòñóòñòâóåò êàòàëàçà è âîññòàíîâëåíèå Í2Î2 îñóùåñòâëÿåòñÿ ãëóòàòèîíïåðîêñèäàçîé [7,17]. Îáðàçîâàâøèéñÿ â
êëåòêàõ îêèñëåííûé ãëóòàòèîí ìîæåò áûòü âîññòàíîâëåí äî GSH ãëóòàòèîíðåäóêòàçîé, íî ïðè
ýòîì ïîòðåáëÿåòñÿ âîññòàíîâëåííûé NADPH, ïîýòîìó ïðè äëèòåëüíîì âîçäåéñòâèè ïåðîêñèäà ìîæåò ïðîèñõîäèòü îêèñëåíèå SH-ãðóïï ñòðóêòóðíûõ è ðåãóëÿòîðíûõ áåëêîâ, èñòîùåíèå ïóëîâ
NADPH è NADÍ, íàðóøåíèå Ñà-àêêóìóëèðóþùåé ñïîñîáíîñòè ÝÏÐ è ìèòîõîíäðèé.
1
2
3
800
*
600
400
45
СаСl2, имп/мин
1000
200
0
15 мин
min
30 мин
min
Время инкубации
Ðèñ. 3. Âõîä Ñà2+ â òèìîöèòû â êîíòðîëå (1), ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ (2) èëè äîáàâëåíèÿ Í2Î2
(3). *p ≤ 0,05 îòíîñèòåëüíî êîíòðîëÿ.
66
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6
Ä. Ì. ÃÐÅÁÈÍÛÊ, Ò. Â. ÊÎÂÀËÜ, Î. Ï. ÌÀÒÛØÅÂÑÊÀß
160
GSH, % от контроля
140
120
100
KK
80
11
60
22
40
20
0
0
1
2
3
Время,
Время, чч
Ðèñ. 4. Äèíàìèêà èçìåíåíèÿ ñîäåðæàíèÿ âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà â òèìîöèòàõ ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ (1) èëè äîáàâëåíèÿ H2O2 (2).
×òîáû îöåíèòü âîçìîæíóþ ðîëü îñíîâíûõ
âíóòðèêëåòî÷íûõ äåïî â ïîâûøåíèè [Ca2+]i ïîñëå äåéñòâèÿ Í2Î2, ìû èññëåäîâàëè, âëèÿåò ëè
ïåðîêñèä âîäîðîäà íà óðîâåíü êàòèîíà â öèòîçîëå òèìîöèòîâ â óñëîâèÿõ ïðåäâàðèòåëüíîãî îïóñòîøåíèÿ êàëüöèåâûõ çàïàñîâ ÝÏÐ. Äëÿ ýòîãî
èñïîëüçîâàëè èíãèáèòîð Ñà2+-ÀÒÐ-àçû ÝÏÐ òàïñèãàðãèí, êîòîðûé â êîíöåíòðàöèÿõ 100–500 íÌ
âûçûâàåò áûñòðîå ïîâûøåíèå [Ca2+]i, â òèìîöèòàõ âñëåäñòâèå îïóñòîøåíèÿ êàëüöèåâûõ çàïàñîâ
ÝÏÐ è âõîäà Ñà2+ ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó áåç ãåíåðàöèè èíîçèòîëôîñôàòîâ [4,8]. Ýêñïåðèìåíòû ïðîâîäèëè, èñïîëüçóÿ ïðåäâàðèòåëüíî íàãðóæåííûå çîíäîì òèìîöèòû, äîáàâëÿÿ òàïñèãàðãèí è ïåðîêñèä íåïîñðåäñòâåííî â èññëåäóåìóþ ïðîáó.
Íà ðèñ. 5, À ïðåäñòàâëåíû äàííûå, ïîëó÷åííûå ïðè èíêóáàöèè êëåòîê â ñðåäå, ñîäåðæàùåé 1 ìÌ ÑàÑl2.  ýòîì ñëó÷àå äîáàâëåíèå â
ïðîáó 300 íÌ òàïñèãàðãèíà ïðèâîäèò ê áûñòðîìó ïîâûøåíèþ (â ïÿòü ðàç) óðîâíÿ öèòîçîëüíîãî Ñà2+, êîòîðîå óäåðæèâàåòñÿ â òå÷åíèå 30 ìèí
âñëåäñòâèå âõîäà êàòèîíà ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ
ìåìáðàíó. Ïîñëå äîáàâëåíèÿ íà 15-é ìèíóòå Í2Î2
íàáëþäàåòñÿ äàëüíåéøåå, áîëåå çàìåäëåííîå ïîâûøåíèå [Ca2+]i, äîñòèãàþùåå óðîâíÿ áîëåå
1 ìêÌ.
Ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòîâ, ïðîâåäåííûõ â
íîìèíàëüíî áåçêàëüöèåâîé ñðåäå ïðåäñòàâëåíû
íà ðèñ. 5, Á. Â õîäå ïðåäâàðèòåëüíîé 10-ìèíóòíîé èíêóáàöèè êëåòîê â íîìèíàëüíî áåçêàëüöèåâîé ñðåäå â öèòîçîëå òèìîöèòîâ óñòàíàâëèâàëàñü
ðàâíîâåñíàÿ êîíöåíòðàöèÿ 62 ± 7 íÌ. Äîáàâëåíèå òàïñèãàðãèíà ïðèâîäèò ê îïóñòîøåíèþ ÝÏÐ
è ïîâûøåíèþ [Ca2+]i äî 96 ± 8 íÌ, êîòîðîå óäåðæèâàåòñÿ â òå÷åíèå 5 ìèí, ïîñëå ÷åãî óðîâåíü
êàòèîíà ïîñòåïåííî ñíèæàåòñÿ.  ñëó÷àå äîáàâëåíèÿ Í2Î2 òàêæå íàáëþäàåòñÿ äàëüíåéøåå âîçðàñòàíèå óðîâíÿ öèòîçîëüíîãî Ñà2+ ñ âûõîäîì
íà ïëàòî ÷åðåç 20 ìèí.
Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ñâèäåòåëüñòâóþò, ÷òî
èñòî÷íèêîì âûÿâëåííîãî íà ðàííèõ ýòàïàõ àïîïòîçà ïîñòóïëåíèÿ Ca2+ â öèòîçîëü ìîæåò áûòü íå
òîëüêî ÝÏÐ, íî è äðóãèå âíóòðèêëåòî÷íûå äåïî.
Åñëè ðîëü òàêîâûõ âûïîëíÿþò ìèòîõîíäðèè, òî
îñâîáîæäåíèå Ñà2+ ïîä äåéñòâèåì òàêîãî îêèñëèòåëÿ, êàê Í2Î2, ìîæåò ïðîèñõîäèòü è áåç êàëüöèåâîé ïåðåãðóçêè.
Äëÿ ïðîâåðêè ïðåäïîëîæåíèÿ îá ó÷àñòèè
ìèòîõîíäðèé â íàðóøåíèè êàëüöèåâîãî ãîìåîñòàçà íàìè áûëè èñïîëüçîâàíû ðóòåíèåâûé êðàñíûé (RuR, èíãèáèòîð ìèòîõîíäðèàëüíîãî Ñà2+óíèïîðòåðà) è öèêëîñïîðèí À (CsA, áëîêàòîð íåñåëåêòèâíîé ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû, ÍÌÏ),
êîòîðûå âíîñèëè â èíêóáèðóåìóþ ïðîáó ñ íàãðóæåííûìè çîíäîì ôóðà-2 òèìîöèòàìè îäíîâðåìåííî ñ Í2Î2. Äîáàâëåíèå RuR â ñðåäó èíêóáàöèè ïðèâîäèò ê ñíèæåíèþ óðîâíÿ êàòèîíà
(ðèñ. 6).  ïðèñóòñòâèè CsA Ñà2+-ìîáèëèçèðóþùèé ýôôåêò H2O2 íå ïðîÿâëÿåòñÿ â íà÷àëüíûé
ïåðèîä èíêóáàöèè è çíà÷èòåëüíî ñíèæàåòñÿ ïðè
åå ïðîäîëæåíèè, îäíàêî íå ïðåäîòâðàùàåòñÿ ïîëíîñòüþ.
Äëÿ îáúÿñíåíèÿ ýòèõ ðåçóëüòàòîâ ñëåäóåò
ó÷èòûâàòü ðàçíîîáðàçèå âîçìîæíûõ ïóòåé ìîáèëèçàöèè Ñà2+ ïðè äåéñòâèè Í2Î2, ìîäåëèðóþùåì îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ. Òàê, óñèëåíèå ïðîöåññîâ ëèïîïåðîêñèäàöèè â òàêèõ óñëîâèÿõ ìîæåò îêàçûâàòü ðàçîáùàþùèé ýôôåêò è ïðèâîäèòü ê ñíèæåíèþ ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà ìèòîõîíäðèé, îáðàùåíèþ Ñà2+- óíèïîðòåðà è ÷àñòè÷íîìó âûõîäó êàòèîíà èç ìèòîõîíäðèàëüíîãî
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6
67
ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ
А
1200
+ Н2 О 2
Н2 О 2
100
800
TG
- Н 2О 2
80
i
600
- Н2 О 2
400
200
0
+ Н2О2
Н2 О2
TG
120
2+2+
[Ca
[Ca ]i], ,нМ
нМ
2+
[Ca
]i,] нМ
[
i,
1000
Б
140
60
40
20
0
5
10
15
20
25
Время, мин
30
0
35
0
5
10
15
20
25
Время, мин
30
35
Ðèñ. 5. Äèíàìèêà ïîâûøåíèÿ [Ca2+]i â òèìîöèòàõ ïðè èíêóáàöèè â ñòàíäàðòíîé (À) è íîìèíàëüíî
áåçêàëüöèåâîé (Á) ñðåäå ïîñëå äîáàâëåíèÿ 320 íÌ òàïñèãàðãèíà (TG) è Í2Î2.
ìàòðèêñà [18]. Áëîêèðîâàíèå Ñà2+- óíèïîðòåðà
ïðåäîòâðàùàåò òàêîé âûõîä, ÷òî è íàáëþäàåòñÿ â
ïðèñóòñòâèè RuR â ïðîáå. Òîò ôàêò, ÷òî ýôôåêò
CsA ïðîÿâëÿåòñÿ äîñòàòî÷íî áûñòðî, íî ïîâûøåíèå [Ca2+]i ïðåäîòâðàùàåòñÿ íå ïîëíîñòüþ, óêàçûâàåò íå òîëüêî íà ðàííåå îáðàçîâàíèå ïîðû â
ìèòîõîíäðèÿõ, îáðàáîòàííûõ Í2Î2 òèìîöèòîâ, íî
è íà ó÷àñòèå äðóãèõ âíóòðèêëåòî÷íûõ îðãàíåëë â
ïîääåðæàíèè âûñîêîãî óðîâíÿ êàòèîíà â öèòîçîëå. Îòêðûòèå ÍÌÏ â ÷àñòè ìèòîõîíäðèé ïðåäñòàâëÿåòñÿ âïîëíå âåðîÿòíûì â óñëîâèÿõ ëîêàëüíîãî ïîâûøåíèÿ óðîâíÿ Ñà2+, çíà÷èòåëüíîãî
îêèñëåíèÿ êëåòî÷íîãî ãëóòàòèîíà è ìåìáðàííûõ
äèòèîëîâ â ìèòîõîíäðèÿõ, à òàêæå ñíèæåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ýíäîãåííûõ ïèðèäèíîâûõ íóêëåîòèäîâ. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî îêèñëåíèå êàðäèîëèïè-
íà, óäåðæèâàþùåãî öèòîõðîì Ñ íà âíåøíåé ñòîðîíå âíóòðåííåé ìåìáðàíû ìèòîõîíäðèé, ñîïðîâîæäàåòñÿ âûõîäîì öèòîõðîìà Ñ â öèòîçîëü è
åãî ñâÿçûâàíèåì ñ ðåöåïòîðàìè ê èíîçèòîëòðèôîñôàòó ÝÏÐ, ÷òî äåëàåò èõ íå÷óâñòâèòåëüíûìè
ê àóòîèíãèáèðîâàíèþ ïîâûøåííûìè êîíöåíòðàöèÿìè Ñà2+, â ðåçóëüòàòå ÷åãî èç ÝÏÐ òàêæå
îñâîáîæäàåòñÿ êàëüöèé [7].
Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ïîçâîëÿþò ñäåëàòü
íåñêîëüêî îáùèõ âûâîäîâ. Õàðàêòåðíàÿ äëÿ àïîïòîçà ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ íàáëþäàåòñÿ â òèìîöèòàõ â îòâåò íà äåéñòâèå êàê èîíèçèðóþùåé ðàäèàöèè, òàê è îáðàáîòêè êëåòîê ïåðîêñèäîì âîäîðîäà, îäíàêî ðàííåå ïîâûøåíèå óðîâíÿ [Ca2+]i
âñëåäñòâèå íàðóøåíèÿ âíóòðèêëåòî÷íîé êîìïàðòìåíòàëèçàöèè Ñà2+ íàáëþäàåòñÿ ëèøü ïîñëå äåé-
[Ca2+]i, (в % от контроля)
700
600
1
500
2
400
3
300
200
100
0
0
10
20
30
40
50
60
Время, мин
Ðèñ. 6. Äèíàìèêà ïîâûøåíèÿ [Ca2+]i â òèìîöèòàõ ïðè èíêóáàöèè â ïðèñóòñòâèè Í2Î2 áåç èíãèáèòîðîâ
(1), ïðè äîáàâëåíèè 5 ìêÌ ðóòåíèåâîãî êðàñíîãî (2) èëè 5 ìêÌ öèêëîñïîðèíà À (3).
68
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6
Ä. Ì. ÃÐÅÁÈÍÛÊ, Ò. Â. ÊÎÂÀËÜ, Î. Ï. ÌÀÒÛØÅÂÑÊÀß
ñòâèÿ H2O2. Õîòÿ îáà èññëåäóåìûõ àïîïòîãåííûõ
ôàêòîðà äåéñòâóþò ïî âíóòðèêëåòî÷íîìó ñèãíàëüíîìó ìåõàíèçìó, åãî èíèöèàöèÿ è óñèëåíèå ìîæåò ïðîèñõîäèòü ñ âîâëå÷åíèåì ðàçëè÷íûõ âíóòðèêëåòî÷íûõ êîìïàðòìåíòîâ è ðàçëè÷íûìè ïóòÿìè – êàê ñ ó÷àñòèåì ôàêòîðîâ, îñâîáîæäàþùèõñÿ èç ìèòîõîíäðèé è êàñêàäà èñïîëíèòåëüíûõ êàñïàç, òàê è ÷åðåç ôîðìèðîâàíèå ïðîòåîñîìíûõ êîìïëåêñîâ, àêòèâàöèè ãðàíçèìîâ, êàòåïñèíîâ è äð. , ÷òî òðåáóåò áîëåå ãëóáîêîãî èçó÷åíèÿ.
CALCIUM HOMEOSTASIS DURING
THYMOCYTE APOPTOSIS. I. INCREASE
IN CYTOSOLIC Ñà2+ CONCENTRATION
AT THE EARLY STAGE OF APOPTOSIS
INDUCED BY HYDROGEN PEROXIDE
D. M. Grebinyk, T. V. Koval,
O. P. Matyshevska
Kyiv Taras Shevchenko National University, Ukraine;
å-mail: grebinik@yahoo.com
Summary
The concentration of free cytosolic Ca 2+
([Ca ]i), 45Ca2+ entry and the level of reduced glutathione (GSH) after x-irradiation in a dose of 4.5 Gy
or 0.1 mM H2O2-treatment were investigated in isolated rat thymocytes during the period preceding electrophoretically detected DNA intranucleosomal fragmentation.
Using fura-2 it was shown that the level of
[Ca2+]i in X-irradiated thymocytes was not changed
as compared with the control, while the GSH content was increased. The gradual increase in [Ca2+]i
along with GSH level falling was detected in the
H2O2-treated cells. 45Ca2+ entry in the cells exposed
to apoptogenic stimuli was not enhanced.
After addition of H2O2 to the cells previously
treated with thapsigargin further [Ca2+]i increase in
both normal and nominally calcium-free medium
was detected. Cyclosporine A inhibited Ca2+-mobilizing effect of H2O2, but did not prevent it completely. The role of intracellular calcium depots in
calcium homeostasis disturbance during oxidative stress
and apoptosis is discussed.
2+
1. Orrenius S., Zhivotovsky B., Nicotera P. // Nature
Reviews. 2003. 4. P. 552–565.
2. Berridge M. J., Bootman M. D., Roderick H. L.
// Nature Reviews. 2003. 4. P. 517–529.
3. McConkey D. J., Orrenius S. // Stem Cells. –
1996. –14. – P. 619-631.
4. Bustamante J., Di Libero E., Fernandez-Cobo M.
// Free Rad. Biol. and Med. 2004. 37, N 9.
P. 1490–1498.
5. Rodriguez-Tarduchy G., Collins M., Lopez-Rivas A.
// EMBO J. 1990. 9. P. 2997–3002.
6. Pinton P., Ferrari D., Rapizzi E., et al. // EMBO
J. 2001. 20. P. 2690–2701.
7. Brookes P. S., Yoon Y., Robotham J. I. et al. //
Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2004. 287. P. 817–
833.
8. Zhu L. P., Yu X. D., Ling S. et al. // Cell
Calcium. 2000. 28, N 2. P. 107–117.
9. Ãðèíþê ². ²., Êîðí³é÷óê Ã. Ì., Êàïðàëîâ Î. Î.,
Ìàòèøåâñüêà Î. Ï. // Óêð. á³îõ³ì. æóðí. 2004.
76, ¹ 5. Ñ. 69–74.
10. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R. Y. // J.
Biol. Chem. – 1985. 260,N 6. P. 3440-3450.
11. Hissin P. J., Hilf R. // Anal. Biochem. 1976.
74. P. 214–227.
12. Êîâàëü Ò. Â., Êàïðàëîâ Î. Î., Ìàòèøåâñüêà Î. Ï., Êó÷åðåíêî Ì. ª. // Äîï. ÍÀÍ Óêðà¿íè. 2004. ¹ 7. Ñ. 166–171.
13. Umansky S. R., Korol’ B. A., Nelipovich P. A. //
Biochem. Biophys. Acta. 1981. 27, N 665 (1).
P. 9–17.
14. Lelli J. L., Becks L. L., Dabrowska M. I., Hinhaw D. B. // Free Rad. Biol. and Med. 1998.
25, N 6. P. 694–702.
15. Ãðåá³íèê Ä. Ì., Àðòåìåíêî O. Þ., Ñåìåíîâ Þ. Â., Çèìà Â. Ë., Ìàòèøåâñüêà Î. Ï. //
³ñí. Êè¿â. íàö. óí-òó. Á³îëîã³ÿ. 2003. 38.
Ñ. 16–18.
16. Donnadieu E., Bismuth G., Trautmann A. // JBC.
1992. 267, N 36. P. 25864–25872.
17. Crompton M. // Biochem. J. – 1999. – 341. –
P. 233-249.
18. Montero M., Alonso M. T., Albillos A. et al. //
Mol. Biol. Cell. 2001. 12. P. 63–71.
Ïîëó÷åíî 19.11.2004
K e y w o r d s: calcium, apoptosis, hydrogen
peroxide, X-irradiation, mitochondria, cyclosporine A,
thymocytes.
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6
69