влияние пероксида водорода на способность нейтрофилов

2007
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 49, ¹ 10
ÂËÈßÍÈÅ ÏÅÐÎÊÑÈÄÀ ÂÎÄÎÐÎÄÀ ÍÀ ÑÏÎÑÎÁÍÎÑÒÜ ÍÅÉÒÐÎÔÈËÎÂ
ÃÅÍÅÐÈÐÎÂÀÒÜ ÀÊÒÈÂÍÛÅ ÔÎÐÌÛ ÊÈÑËÎÐÎÄÀ È ÕËÎÐÀ
È ÑÅÊÐÅÒÈÐÎÂÀÒÜ ÌÈÅËÎÏÅÐÎÊÑÈÄÀÇÓ IN VITRO
Å. È. Êîâàëåíêî,1 Ã. Í. Ñåìåíêîâà, Ñ. Í. ×åðåíêåâè÷
Å. È. Êîâàëåíêî, Ã. Í. Ñåìåíêîâà, Ñ. Í. ×åðåíêåâè÷
Âëèÿíèå Í2Î2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊ
Êàôåäðà áèîôèçèêè ôèçè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà Áåëîðóññêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî óíèâåðñèòåòà, Ìèíñê;
1ýëåêòðîííûé àäðåñ: kavalenka@bsu.by
 ðàáîòå èçó÷åíî âëèÿíèå ïåðîêñèäà âîäîðîäà (Í2Î2) â êîíöåíòðàöèè 10–8—10–2 ìîëü/ë íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ îáðàçîâûâàòü àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà è õëîðà (ÀÔÊÕ) è ñåêðåòèðîâàòü ìèåëîïåðîêñèäàçó (ÌÏÎ), à òàêæå èññëåäîâàíî ïîâðåæäàþùåå äåéñòâèå Í2Î2 íà íåéòðîôèëû. Îáíàðóæåíî, ÷òî
Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 2æ10–3—2æ10–2 ìîëü/ë ïðèâîäèò ê íàðóøåíèþ áàðüåðíûõ ñâîéñòâ ìåìáðàí íåéòðîôèëîâ è âûñâîáîæäåíèþ ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû. Èíêóáèðîâàíèå íåéòðîôèëîâ ñ äîáàâëåíèåì
10–4—10–7 ìîëü/ë Í2Î2 ñîïðîâîæäàåòñÿ ïîâûøåíèåì ñïîñîáíîñòè êëåòîê ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ ïðè ôàãîöèòîçå è ñíèæåíèåì ñïîñîáíîñòè ñåêðåòèðîâàòü ÌÏÎ è ÀÔÊÕ âî âíåêëåòî÷íóþ ñðåäó â õîäå àäãåçèè.
Ìåõàíèçìû äåéñòâèÿ Í2Î2 ñîïðÿæåíû ñ ìåòàáîëèçìîì àðàõèäîíîâîé êèñëîòû. Èíãèáèðîâàíèå 5-ëèïîêñèãåíàçíîãî èëè öèêëîîêñèãåíàçíîãî ïóòè ìåòàáîëèçìà âûçûâàåò óñèëåíèå öèòîäåñòðóêòèâíîãî äåéñòâèÿ Í2Î2. Áëîêèðîâàíèå 5-ëèïîêñèãåíàçû ïðèâîäèò ê îòìåíå âëèÿíèÿ Í2Î2 íà ñåêðåöèþ ÌÏÎ è óñèëåíèþ åãî âëèÿíèÿ íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ ïðè ôàãîöèòîçå. Ïîëó÷åííûå äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò î âûñîêîé óñòîé÷èâîñòè íåéòðîôèëîâ êðîâè ê äåñòðóêòèâíîìó äåéñòâèþ Í2Î2 è
ïîäòâåðæäàþò ðåãóëÿòîðíóþ ðîëü ïåðîêñèäà âîäîðîäà â îòíîøåíèè ôóíêöèîíàëüíûõ ñâîéñòâ íåéòðîôèëîâ.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: íåéòðîôèëû, ïåðîêñèä âîäîðîäà, àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà è õëîðà, ìèåëîïåðîêñèäàçà, ëàêòàòäåãèäðîãåíàçà, öèêëîîêñèãåíàçà, 5-ëèïîêñèãåíàçà.
Ï ð è í ÿ ò û å ñ î ê ð à ù å í è ÿ: ÀÊ — àðàõèäîíîâàÿ êèñëîòà, ÀÔÊÕ — àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà è
õëîðà, ËÄÃ — ëàêòàòäåãèäðîãåíàçà, ËÇÕË — ëþìèíîëçàâèñèìàÿ õåìèëþìèíåñöåíèÿ, 5-ËÎ — 5-ëèïîêñèãåíàçà, ÌÏÎ — ìèåëîïåðîêñèäàçà, ÏÕ — ïåðîêñèäàçà õðåíà, ÑÁÑÐ — ñáàëàíñèðîâàííûé áóôåðíûé
ñîëåâîé ðàñòâîð, îòí. åä. — îòíîñèòåëüíûå åäèíèöû, ÕË — õåìèëþìèíåñöåíöèÿ, ÖÎ — öèêëîîêñèãåíàçà.
Íåéòðîôèëû ïðèíèìàþò ó÷àñòèå â èììóííûõ ðåàêöèÿõ ïðè èíôèöèðîâàíèè îðãàíèçìà (Aratani, 2006; Brown et
al., 2006), àëëåðãè÷åñêèõ è àóòîèììóííûõ çàáîëåâàíèÿõ
(Holgate et al., 2006; Ramos et al., 2006), èøåìèè è àòåðîñêëåðîçå (Cave et al., 2006), îæîãîâîé è ìåõàíè÷åñêîé òðàâìàõ (Ravage et al., 1998; Rose et al., 2000), ñòðåññå âî âðåìÿ
èçáûòî÷íûõ ôèçè÷åñêèõ èëè ïñèõè÷åñêèõ íàãðóçîê (Saxton et al., 2003; Wang, 2004; Kumae et al., 2006). Àêòèâèðîâàííûå íåéòðîôèëû ñïîñîáíû îñóùåñòâëÿòü âíóòðèêëåòî÷íîå ðàçðóøåíèå áèîëîãè÷åñêîãî ìàòåðèàëà, çàõâàòûâàåìîãî â ïðîöåññå ôàãîöèòîçà, è ñåêðåòèðîâàòü âî
âíåêëåòî÷íóþ ñðåäó âûñîêî- è íèçêîìîëåêóëÿðíûå âåùåñòâà, îáëàäàþùèå èììóíîìîäóëèðóþùèì ëèáî òîêñè÷íûì äåéñòâèåì (Knaapen et al., 2006; Nathan, 2006). Ñåãìåíòîÿäåðíûå íåéòðîôèëû îáëàäàþò íàèáîëüøåé èç âñåõ
êëåòîê îðãàíèçìà ñïîñîáíîñòüþ ãåíåðèðîâàòü àêòèâíûå
ôîðìû êèñëîðîäà è õëîðà (ÀÔÊÕ) áëàãîäàðÿ âûñîêîìó
ñîäåðæàíèþ â íèõ ÍÀÄÔÍ-îêñèäàçû è ìèåëîïåðîêñèäàçû (ÌÏÎ) (Arnhold, 2004).
Ïåðîêñèä âîäîðîäà (Í2Î2), îáðàçóþùèéñÿ ïðè äèñìóòàöèè ãåíåðèðóåìûõ ÍÀÄÔÍ-îêñèäàçîé ñóïåðîêñèäíûõ
ðàäèêàëîâ, äèôôóçèîííûì îáðàçîì ðàñïðîñòðàíÿåòñÿ ïî
ðàçëè÷íûì êëåòî÷íûì êîìïàðòìåíòàì è âî âíåêëåòî÷íîé
ñðåäå è ìîæåò ðåãóëèðîâàòü ôóíêöèîíèðîâàíèå íåéòðîôèëîâ ïî ïàðàêðèííûì è àóòîêðèííûì ìåõàíèçìàì (Knaapen et al., 2006; Nathan, 2006).  íàñòîÿùåå âðåìÿ èìåþòñÿ äîêàçàòåëüñòâà êàê öèòîëèòè÷åñêîãî, òàê è ðåãóëÿòîðíîãî äåéñòâèÿ Í2Î2 íà ðÿä òèïîâ êëåòîê, â òîì ÷èñëå
íåôàãîöèòàðíîé ïðèðîäû (Schreck et al., 1991; Ãàìàëåé,
Êëþáèí, 1996; Hancock et al., 2001; Droge, 2002; Êóëàãîâà
è äð., 2006; Knaapen et al., 2006). Äëÿ ôàãîöèòîâ ïîêàçàíî,
÷òî ýêçîãåííûé Í2Î2 äîçîçàâèñèìûì îáðàçîì èíäóöèðóåò
õåìîòàêñèñ è ãèïåðïîëÿðèçàöèþ ìåìáðàíû (Klyubin et al.,
1996; Gamaley et al., 1997), óñèëèâàåò fÌLÐ-èíäóöèðîâàííûé ðåñïèðàòîðíûé âçðûâ è ôàãîöèòàðíóþ àêòèâíîñòü
êëåòîê (Winn et al., 1991; Gamaley et al., 1994), ïðèâîäèò ê
ñíèæåíèþ LPS-èíäóöèðîâàííîé ñåêðåöèè TNF-a (Strassheim et al., 2004).
 íàøåé ðàáîòå èññëåäîâàíî âëèÿíèå Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–8—10–2 ìîëü/ë íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ñåêðåòèðîâàòü ÌÏÎ è ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ ïðè àäãåçèè è ôàãîöèòîçå, à òàêæå íà óðîâåíü âíóòðèêëåòî÷íîé àêòèâíîñòè
ÌÏÎ. Êðîìå òîãî, èçó÷åíî äåñòðóêòèâíîå âîçäåéñòâèå
Í2Î2 íà íåéòðîôèëû.
839
840
Å. È. Êîâàëåíêî, Ã. Í. Ñåìåíêîâà, Ñ. Í. ×åðåíêåâè÷
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
Ð å à ê ò è â û: äåêñòðàí-500, ôèêîëë-400, 30%-íûé ðàñòâîð Í2Î2, ïåðîêñèäàçà õðåíà (ÏÕ), ëþìèíîë, àñïèðèí è
Òðèòîí Õ-100 (Sigma, ÑØÀ); óðîãðàôèí (Schering AG,
Ãåðìàíèÿ); MK-886 (Calbiochem, ÑØÀ); ãåïàðèí è ëàòåêñ
(Áåëìåäïðåïàðàòû, Áåëàðóñü); NaCl, KC1, NaH2P04æH2Î,
MgSÎæ7H2Î, CaCl2, NaHCO3, ãëþêîçà è íàáîðû äëÿ îïðåäåëåíèÿ ëàêòàòäåãèäðîãåíàçû (ËÄÃ) (Àíàëèç-X, Áåëàðóñü). Èç ôèêîëëà-400 è óðîãðàôèíà ãîòîâèëè ðàñòâîð
ôèêîëë-óðîãðàôèíà ïëîòíîñòüþ 1.077 ã/ñì3. Ñáàëàíñèðîâàííûé áóôåðíûé ñîëåâîé ðàñòâîð (ÑÁÑÐ) Ýðëà ñîáñòâåííîãî ïðèãîòîâëåíèÿ âêëþ÷àë â ñåáÿ (â ììîëü/ë):
116.2 — NaCl, 5.4 — KC1, 0.9 — NaH2P04æH2Î, 0.8 —
MgSÎ4æ7H2Î, 1.8 — CaCl2, 26.2 — NaHCÎ3, 5.6 — ãëþêîçà.
 û ä å ë å í è å í å é ò ð î ô è ë î â èç ïåðèôåðè÷åñêîé
êðîâè çäîðîâûõ ëþäåé ïðîâîäèëè ïî îïèñàííîìó ìåòîäó
(Áåéóì, 1980). Êðîâü, êîíñåðâèðîâàííóþ ñ ãåïàðèíîì, ïåðåìåøèâàëè èç ðàñ÷åòà 5 : 1 ñ 7%-íûì ðàñòâîðîì äåêñòðàíà-500 â 0.15 ìîëü/ë NaCl è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå
60 ìèí ïðè 37 °Ñ äëÿ ñåäèìåíòàöèè ýðèòðîöèòîâ. Â ïðîáèðêè íàëèâàëè ïî 3 ìë ôèêîëë-óðîãðàôèíà, íà êîòîðûé
îñòîðîæíî íàñëàèâàëè ïî 9 ìë ïëàçìû, îáîãàùåííîé ëåéêîöèòàìè, è öåíòðèôóãèðîâàëè â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè
400 g äëÿ ðàçäåëåíèÿ ëåéêîöèòîâ ïî ïëîòíîñòè. Ïîñëå
öåíòðèôóãèðîâàíèÿ íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü è ñëîé ìîíîíóêëåàðîâ óäàëÿëè, ê îñàäêó, ñîäåðæàùåìó ôðàêöèþ
ãðàíóëîöèòîâ, äîáàâëÿëè 1 ìë ëåäÿíîé äèñòèëëèðîâàííîé
Í2Î, ïåðåìåøèâàëè â òå÷åíèå 20 ñ äëÿ ãèïîòîíè÷åñêîãî
ëèçèñà îñòàâøèõñÿ ýðèòðîöèòîâ, ïîñëå ÷åãî âîññòàíàâëèâàëè îñìîòè÷íîñòü ðàñòâîðà äîáàâëåíèåì 1 ìë 0.3 ìîëü/ë
NaCl. Çàòåì êëåòêè äâàæäû îòìûâàëè â 0.15 ìîëü/ë NaCl,
öåíòðèôóãèðóÿ â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 400 g. Ïîëó÷åííóþ
ôðàêöèþ êëåòîê ñóñïåíäèðîâàëè â ÑÁÑÐ Ýðëà ïðè ðÍ 7.2.
 ïîëó÷åííîé ôðàêöèè êëåòîê ñîäåðæàíèå íåéòðîôèëîâ
ñîñòàâëÿëî íå ìåíåå 96 %.
Ïîâðåæäåíèå íåéòðîôèëîâ ïðè äåéñòâèè
Í 2 Î 2 èññëåäîâàëè ïî âûñâîáîæäåíèþ èç êëåòîê â èíêóáàöèîííóþ ñðåäó öèòîçîëüíîãî ôåðìåíòà ËÄÃ. Íåéòðîôèëû (2æ106 êëåòîê/ìë), ñóñïåíäèðîâàííûå â ÑÁÑÐ Ýðëà,
ïîìåùàëè â ñòåêëÿííûå ïðîáèðêè, äîáàâëÿëè Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–7—10–2 ìîëü/ë è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 30
èëè 60 ìèí ïðè 37 °Ñ. Çàòåì êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òå÷åíèå 7 ìèí ïðè 400 g, íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü ñîáèðàëè.  îáðàçöàõ âíåêëåòî÷íîé æèäêîñòè îïðåäåëÿëè àêòèâíîñòü ËÄà ñ ïîìîùüþ ñïåöèàëüíîãî íàáîðà
ðåàêòèâîâ è ñïåêòðîôîòîìåòðà PV 1251Ñ (Solar, Áåëàðóñü)
êèíåòè÷åñêèì ìåòîäîì (Àðòþõîâ, Íàêâàñèíà, 2000). Ìåòîä îñíîâàí íà ôåðìåíòàòèâíîé ðåàêöèè âçàèìîäåéñòâèÿ
ïèðóâàòà è ÍÀÄÍ ñ îáðàçîâàíèåì ëàêòàòà è ÍÀÄ+. Óìåíüøåíèå êîíöåíòðàöèè ÍÀÄÍ â îáðàçöàõ çà 1 ìèí, äåòåêòèðóåìîå ïî èçìåíåíèþ îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè îáðàçöîâ
ïðè äëèíå âîëíû 340 íì (DD), ïðîïîðöèîíàëüíî àêòèâíîñòè
ËÄà (A) : A = DDæ8600 [ìêìîëüæìèí–1æë–1]. Ïîëó÷åííûå
çíà÷åíèÿ âûðàæàëè â ïðîöåíòàõ îò îáùåé àêòèâíîñòè
ËÄÃ íåéòðîôèëîâ (À0), êîòîðóþ îöåíèâàëè ïîñëå îáðàáîòêè êëåòîê 0.1%-íûì ðàñòâîðîì Òðèòîíà Õ-100. Âûñâîáîæäåíèå ËÄÃ (Àîòí., %) îïðåäåëÿëè ïî ôîðìóëå Àîòí. =
= Àæ100 % / À0.
à å í å ð à ö è ÿ í å é ò ð î ô è ë à ì è À Ô Ê Õ. Ê ñóñïåíçèè íåéòðîôèëîâ (2æ106 êëåòîê/ìë) äîáàâëÿëè Í2Î2, èíãèáèòîðû âíóòðèêëåòî÷íûõ ñèãíàëüíûõ ïóòåé è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òå÷åíèå 7 ìèí ïðè 400 g, îñâîáîæäàëè îò
èíêóáàöèîííîé ñðåäû è ðåñóñïåíäèðîâàëè â ÑÁÑÐ Ýðëà.
 ïîëó÷åííûõ îáðàçöàõ îïðåäåëÿëè ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ ïðè ñòèìóëÿöèè. Êëåòêè ïîìåùàëè â ñòåêëÿííóþ êþâåòó, äîáàâëÿëè ëþìèíîë
(5æ10–5 ìîëü/ë) è èññëåäîâàëè ïàðàìåòðû ëþìèíîëçàâèñèìîé õåìèëþìèíåñöåíöèè (ËÇÕË), îáóñëîâëåííîé ãåíåðàöèåé ÀÔÊÕ â õîäå àäãåçèè êëåòîê íà ñòåêëî. ×åðåç
10 ìèí â îáðàçöû òàêæå âíîñèëè ëàòåêñ è îïðåäåëÿëè ïàðàìåòðû ËÇÕË, îáóñëîâëåííîé îáðàçîâàíèåì ÀÔÊÕ â
õîäå ôàãîöèòîçà ëàòåêñà íåéòðîôèëàìè. Ñ ïîìîùüþ
êîìïüþòåðèçèðîâàííîãî èçìåðèòåëüíîãî êîìïëåêñà, âêëþ÷àþùåãî â ñåáÿ áèîõåìèëþìèíîìåòð ÁÕË-1 (Áåëãîñóíèâåðñèòåò, Áåëàðóñü) è ñèñòåìó ðåãèñòðàöèè è îáðàáîòêè
ñèãíàëîâ Unichrom («Íîâûå àíàëèòè÷åñêèå ñèñòåìû», Áåëàðóñü), ðåãèñòðèðîâàëè êèíåòè÷åñêèå çàâèñèìîñòè èíòåíñèâíîñòè ËÇÕË. Èíòåãðàëüíóþ èíòåíñèâíîñòü õåìèëþìèíåñöåíöèè (ÕË) êëåòîê âû÷èñëÿëè êàê ïëîùàäü ïîä
êèíåòè÷åñêîé êðèâîé, ïîëó÷åííîé çà 10 ìèí èçìåðåíèÿ.
Ð à ç ë î æ å í è å Í 2 Î 2 â ð à ç ë è ÷ í û õ î á ð à ç ö à õ.
 îáðàçöû, ñîäåðæàùèå íåéòðîôèëû (2æ106 êëåòîê/ìë), èëè
îáëîìêè íåéòðîôèëîâ, ðàçðóøåííûõ â òðåõ öèêëàõ çàìîðàæèâàíèÿ ïðè –18 °Ñ è îòòàèâàíèÿ ïðè 37 °Ñ, èëè ÑÁÑÐ
Ýðëà (êîíòðîëü), âíîñèëè Í2Î2 è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå
0—30 ìèí. Ïîñëå èíêóáèðîâàíèÿ îáðàçöû öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 800 g â òå÷åíèå 2 ìèí, ñóïåðíàòàíòû ñîáèðàëè è
îïðåäåëÿëè â íèõ îñòàòî÷íîå êîëè÷åñòâî Í2Î2 õåìèëþìèíåñöåíòíûì ìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî â îáðàçöû äîáàâëÿëè ÏÕ
(1.1 íã/ìë) è ëþìèíîë (5æ10–5 ìîëü/ë), èçìåðÿëè èíòåãðàëüíóþ èíòåíñèâíîñòü ÕË çà 4 ìèí è îöåíèâàëè êîíöåíòðàöèþ Í2Î2 â îáðàçöàõ ñ ïîìîùüþ êàëèáðîâî÷íîãî
ãðàôèêà. Êàëèáðîâî÷íàÿ êðèâàÿ ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé çàâèñèìîñòü èíòåãðàëüíîé èíòåíñèâíîñòè ÕË, îáóñëîâëåííîé
ðåàêöèåé âçàèìîäåéñòâèÿ ëþìèíîëà (5æ10–5 ìîëü/ë) ñ
Í2Î2 â ÑÁÑÐ Ýðëà, êàòàëèçèðóåìîé ÏÕ (1.1 íã/ìë), îò
êîíöåíòðàöèè Í2Î2.
 ë è ÿ í è å Í 2Î 2 í à à ê ò è â í î ñ ò ü Ì Ï Î í å é ò ð î ô è ë î â. 1. Íåéòðîôèëû (2æ106 êëåòîê/ìë) èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè 37 °Ñ, áåç äîáàâëåíèÿ (êîíòðîëü) èëè ñ äîáàâëåíèåì Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–8—
10–3 ìîëü/ë, íå èíäóöèðóþùåé äåñòðóêöèþ íåéòðîôèëîâ.
Çàòåì êëåòêè ðàçðóøàëè â òðåõ öèêëàõ çàìîðàæèâàíèÿ
ïðè –18 °Ñ è îòòàèâàíèÿ ïðè 37 °Ñ. Îáùóþ àêòèâíîñòü
ÌÏÎ â êëåòêàõ îöåíèâàëè ïî èíòåãðàëüíîé èíòåíñèâíîñòè ÕË, îáóñëîâëåííîé êàòàëèçèðóåìîé ÌÏÎ ðåàêöèåé
îêèñëåíèÿ ëþìèíîëà (5æ10–5 ìîëü/ë) H2O2 (10–5 ìîëü/ë)
(Dahlgren et al., 1993; Haqqani et al., 1999). Çíà÷åíèå ïàðàìåòðà, õàðàêòåðèçóþùåãî àêòèâíîñòü ÌÏÎ, âûðàæàëè â
îòí. åä.
2. Íåéòðîôèëû ñíà÷àëà ðàçðóøàëè, ïðîâîäÿ òðè öèêëà çàìîðàæèâàíèÿ è îòòàèâàíèÿ. Çàòåì ïîëó÷åííûå îáðàçöû îáëîìêîâ êëåòîê èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 30 ìèí ñ äîáàâëåíèåì Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–8—10–3 ìîëü/ë èëè áåç
äîáàâëåíèÿ Í2Î2. Ïî îêîí÷àíèè èíêóáèðîâàíèÿ îöåíèâàëè îáùóþ àêòèâíîñòü ÌÏÎ îáðàçöîâ, êàê îïèñàíî âûøå.
Ñåêðåòîðíàÿ äåãðàíóëÿöèÿ àçóðîôèëüí û õ ã ð à í ó ë í å é ò ð î ô è ë î â. Ñóñïåíçèè íåéòðîôèëîâ
(2æ106 êëåòîê/ìë) ïîìåùàëè â ñòåêëÿííûå öèëèíäðè÷åñêèå êþâåòû è èíêóáèðîâàëè ñ äîáàâëåíèåì Í2Î2 è èíãèáèòîðîâ â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè 37 °Ñ. Íåéòðîôèëû ïðè àäãåçèè íà äíî êþâåò àêòèâèðîâàëèñü è ñåêðåòèðîâàëè ñîäåðæèìîå ãðàíóë âî âíåêëåòî÷íóþ ñðåäó. Ïî îêîí÷àíèè
èíêóáèðîâàíèÿ íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü ñîáèðàëè è öåíòðèôóãèðîâàëè â òå÷åíèå 7 ìèí ïðè 400 g äëÿ îñàæäåíèÿ
íåïðèêðåïèâøèõñÿ êëåòîê.  ïîëó÷åííûõ îáðàçöàõ âíåêëåòî÷íîé æèäêîñòè îïðåäåëÿëè àêòèâíîñòü ÌÏÎ, ñåêðå-
Âëèÿíèå Í2Î2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊ
841
òèðîâàííîé êëåòêàìè, ïî èíòåíñèâíîñòè XJI, èíäóöèðîâàííîé äîáàâëåíèåì ëþìèíîëà (5æ10–5 ìîëü/ë) è H2O2
(1æ10–5 ìîëü/ë). Ïîëó÷åííûå çíà÷åíèÿ âûðàæàëè â % îò
îáùåé àêòèâíîñòè ÌÏÎ íåéòðîôèëîâ.
Ñòàòèñòè÷åñêóþ îáðàáîòêó ðåçóëüòàòîâ
ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðîãðàììû Statistica 6.0. Íà
ðèñóíêàõ ïðåäñòàâëåíû ñðåäíèå çíà÷åíèÿ âåëè÷èí è èõ
ñòàíäàðòíûå îòêëîíåíèÿ, óêàçàíû óðîâíè çíà÷èìîñòè ðàçëè÷èé (P). Ðàçëè÷èÿ ñ÷èòàëè äîñòîâåðíûìè ïðè P ≤ 0.05.
Ðåçóëüòàòû
Ï î â ð å æ ä à þ ù å å ä å é ñ ò â è å Í 2 Î 2 í à í å é ò ð îô è ë û è ó ò è ë è ç à ö è ÿ Í 2 Î 2 ê ë å ò ê à ì è. Äëÿ òîãî
÷òîáû îïðåäåëèòü ñïîñîáíîñòü Í2Î2 âûçûâàòü ïîâðåæäåíèå íåéòðîôèëîâ, ìû îöåíèëè âûõîä âî âíåêëåòî÷íóþ ñðåäó
öèòîçîëüíîãî áåëêà ËÄÃ ïðè äîáàâëåíèè ýêçîãåííîãî Í2Î2 â
ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Íà ðèñ. 1 ïîêàçàíû çíà÷åíèÿ ïàðàìåòðà Aîòí., õàðàêòåðèçóþùåãî âûñâîáîæäåíèå ËÄà èç íåéòðîôèëîâ ÷åðåç 30 è 60 ìèí ïîñëå âíåñåíèÿ Í2Î2 â ñóñïåíçèþ
êëåòîê. Í2Î2 âíîñèëè èëè îäíîêðàòíî, èëè äåñÿòèêðàòíî ñ
èíòåðâàëîì 1 ìèí. Êàê âèäíî íà ðèñ. 1, Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–7—10–3 ìîëü/ë íå ïðèâîäèò ê äåñòðóêöèè êëåòîê. Â
ðåçóëüòàòå îäíîêðàòíîãî äîáàâëåíèÿ 10–2 ìîëü/ë Í2Î2 âûñâîáîæäåíèå ËÄÃ èç íåéòðîôèëîâ ïîâûøàåòñÿ ïî ñðàâíåíèþ
ñ êîíòðîëåì â 2 ðàçà ñïóñòÿ 30 ìèí èíêóáèðîâàíèÿ è â
3 ðàçà ñïóñòÿ 60 ìèí èíêóáèðîâàíèÿ (P < 0.01). Ïðè äåñÿòèêðàòíîì âíåñåíèè Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–3 ìîëü/ë ñ
èíòåðâàëîì 1 ìèí âûñâîáîæäåíèå ËÄà íå óâåëè÷èâàåòñÿ.
Ýòî ñâèäåòåëüñòâóåò î òîì, ÷òî íåéòðîôèëû áûñòðî óòèëèçèðóþò Í2Î2, ïðåïÿòñòâóÿ åãî íàêîïëåíèþ äî óðîâíÿ
êîíå÷íûõ çíà÷åíèé 10–2 ìîëü/ë, ïðè êîòîðûõ íàáëþäàåòñÿ
ïîâðåæäåíèå êëåòîê.
Ñ öåëüþ îïðåäåëåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè óòèëèçàöèè
Í2Î2 íåéòðîôèëàìè â èíêóáàöèîííóþ ñðåäó äîáàâëÿëè
10–2 ìîëü/ë Í2Î2, èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 2—30 ìèí ïðè
37 °Ñ, çàòåì êëåòêè îñàæäàëè, à íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü
Ðèñ. 1. Âûñâîáîæäåíèå ËÄÃ èç íåéòðîôèëîâ, èíäóöèðîâàííîå
äîáàâëåíèåì H2O2 â êîíöåíòðàöèè 10–7—10–2 ìîëü/ë.
Áåëûå ñòîëáèêè — îäíîêðàòíîå âíåñåíèå H2O2 è èíêóáèðîâàíèå â òå÷åíèå 30 ìèí, ñåðûå — îäíîêðàòíîå âíåñåíèå H2O2 è èíêóáèðîâàíèå â òå÷åíèå 60 ìèí, ÷åðíûå — äåñÿòèêðàòíîå âíåñåíèå H2O2 ñ èíòåðâàëàìè
1 ìèí è ïîñëåäóþùåå èíêóáèðîâàíèå â òå÷åíèå 30 ìèí; Ê — êîíòðîëü
(áåç äîáàâëåíèÿ H2O2). Çâåçäî÷êè — P < 0.01. Çäåñü è íà ðèñ. 2—7 âåðòèêàëüíûìè îòðåçêàìè ïîêàçàíî ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå ñðåäíèõ
âåëè÷èí.
ñîáèðàëè.  ïîëó÷åííûõ îáðàçöàõ îöåíèâàëè êîíöåíòðàöèþ Í2Î2, àíàëèçèðóÿ ïàðàìåòðû ÕË ïðè êàòàëèçèðóåìîì
ÏÕ îêèñëåíèè ëþìèíîëà Í2Î2. Â êîíòðîëüíîì ýêñïåðèìåíòå îöåíèâàëè èçìåíåíèå êîíöåíòðàöèè Í2Î2 â ÑÁÑÐ
Ýðëà ïðè èíêóáèðîâàíèè. Íà ðèñ. 2 ïîêàçàíà çàâèñèìîñòü
èíòåãðàëüíîé èíòåíñèâíîñòè ÕË îáðàçöîâ âíåêëåòî÷íîé
æèäêîñòè íåéòðîôèëîâ (êðèâàÿ 1) è ÑÁÑÐ Ýðëà (êðèâàÿ 2)
îò âðåìåíè èíêóáèðîâàíèÿ, ïðîøåäøåãî ñ ìîìåíòà âíåñåíèÿ Í2Î2. Íà ðèñ. 2 âèäíî, ÷òî çíà÷åíèÿ èññëåäóåìîãî ïàðàìåòðà äëÿ îáðàçöîâ âíåêëåòî÷íîé æèäêîñòè, ñîîòâåòñòâóþùèå âðåìåíè èíêóáèðîâàíèÿ 6 ìèí, íèæå, ÷åì â êîíò-
Ðèñ. 2. Èçìåíåíèå èíòåãðàëüíîé èíòåíñèâíîñòè ÕË (SI) âíåêëåòî÷íîé æèäêîñòè íåéòðîôèëîâ, îáóñëîâëåííîå èçìåíåíèåì êîíöåíòðàöèè H2O2 â îáðàçöàõ, ïðè èçìåíåíèè âðåìåíè èíêóáèðîâàíèÿ, ïðîøåäøåãî ñ ìîìåíòà âíåñåíèÿ 10–2 ìîëü/ë H2O2.
Ïî îñè îðäèíàò — SI îáðàçöîâ ïðè äîáàâëåíèè â íèõ 5æ10–5 ìîëü/ë ëþìèíîëà è 1.1 íã/ìë ïåðîêñèäàçû õðåíà. 1 — îáðàçöû âíåêëåòî÷íîé æèäêîñòè
íåéòðîôèëîâ, 2 — êîíòðîëü (ðàñòâîð Ýðëà).
842
Å. È. Êîâàëåíêî, Ã. Í. Ñåìåíêîâà, Ñ. Í. ×åðåíêåâè÷
Ðèñ. 3. Êîíöåíòðàöèîííàÿ çàâèñèìîñòü, ïîçâîëÿþùàÿ îïðåäåëèòü ñîäåðæàíèå H2O2 â îáðàçöàõ.
Ïî îñè îðäèíàò — èíòåãðàëüíàÿ èíòåíñèâíîñòü ÕË (SI) â ñèñòåìå «ëþìèíîë (5æ10–5 ìîëü/ë) à ÏÕ (1.1 íã/ìë) à H2O2».
ðîëå, íà 60—75 %, à ïðè âðåìåíè èíêóáèðîâàíèÿ 10—
30 ìèí íèæå íà 98—100 %, ÷òî ñâèäåòåëüñòâóåò î çíà÷èòåëüíîì óìåíüøåíèè êîíöåíòðàöèè Í2Î2 âî âíåêëåòî÷íîé æèäêîñòè. Ïðèâåäåííàÿ íà ðèñ. 3 êðèâàÿ ïîçâîëÿåò
îöåíèòü êîíöåíòðàöèþ Í2Î2 è õàðàêòåðèçóåò çàâèñèìîñòü
èíòåãðàëüíîé èíòåíñèâíîñòè ÕË îò êîíöåíòðàöèè Í2Î2 â
ñèñòåìå «ëþìèíîë (5æ10–5 ìîëü/ë) à ÏÕ (1.1 íã/ìë) à
+ ÑÁÑÐ Ýðëà à Í2Î2» áåç èíêóáèðîâàíèÿ. Ñîïîñòàâëåíèå äàííûõ, ïðåäñòàâëåííûõ íà ðèñ. 2 è 3, ïîçâîëÿåò çàêëþ÷èòü, ÷òî ÷åðåç 10 ìèí ïîñëå äîáàâëåíèÿ 10–2 ìîëü/ë
H2O2 â ñóñïåíçèþ íåéòðîôèëîâ âî âíåêëåòî÷íîé ñðåäå
îñòàåòñÿ íå áîëåå 10–6—10–7 ìîëü/ë Í2Î2 (ýòî óðîâåíü Í2Î2,
ïðè êîòîðîì ïîâðåæäåíèå êëåòîê íå èíèöèèðóåòñÿ). Îäíàêî,
êàê ñëåäóåò èç äàííûõ ðèñ. 1, ÷åðåç 60 ìèí ïîñëå âíåñåíèÿ
10–2 ìîëü/ë Í2Î2 âûñâîáîæäåíèå ËÄà èç íåéòðîôèëîâ çíà÷èòåëüíî âûøå, ÷åì ÷åðåç 30 ìèí. Ñëåäîâàòåëüíî, ïðîöåññû Í2Î2-èíäóöèðîâàííîãî ïîâðåæäåíèÿ íåéòðîôèëîâ ïðîäîëæàþò ðàçâèâàòüñÿ è ïîñëå óòèëèçàöèè êëåòêàìè Í2Î2.
Íà ðèñ. 2 ìîæíî çàìåòèòü, ÷òî èíòåãðàëüíàÿ èíòåíñèâíîñòü ÕË âíåêëåòî÷íîé æèäêîñòè íåéòðîôèëîâ (êðèâàÿ 1) ïðè âðåìåíè èíêóáèðîâàíèÿ 2—4 ìèí ïîñëå äîáàâëåíèÿ Í2Î2 âûøå êîíòðîëüíûõ çíà÷åíèé (êðèâàÿ 2). Ïðè÷èíîé ýòîãî ìîæåò áûòü ïîâûøåíèå ïåðîêñèäàçíîé
àêòèâíîñòè âî âíåêëåòî÷íîé ñðåäå çà ñ÷åò ÌÏÎ, ñåêðåòèðóåìîé íåéòðîôèëàìè (Kavalenka et al., 2003).
Ðåãóëÿöèÿ ôóíêöèîíèðîâàíèÿ êëåòîê è èõ ãèáåëè ìîæåò îñóùåñòâëÿòüñÿ ñ ó÷àñòèåì ôåðìåíòîâ ìåòàáîëèçìà
àðàõèäîíîâîé êèñëîòû (ÀÊ) (Chang, Wang, 2001). Íà
ðèñ. 4 ïîêàçàíî âëèÿíèå ÌÊ-886 (0.5 ìêìîëü/ë), áëîêèðóþùåãî 5-ëèïîêñèãåíàçíûé (5-ËÎ) ïóòü ïðåâðàùåíèÿ ÀÊ,
è àñïèðèíà (1 ììîëü/ë), èíãèáèðóþùåãî îáðàçîâàíèå
öèêëîîêñèãåíàçîé (ÖÎ) ïðîñòàãëàíäèíîâ, íà âûñâîáîæäåíèå ËÄÃ èç íåéòðîôèëîâ. Îêàçàëîñü, ÷òî èíãèáèðîâàíèå ÖÎ èëè 5-ËÎ ìåòàáîëèçìà ÀÊ ïðèâîäèò ê óñèëåíèþ Í2Î2-èíäóöèðîâàííîãî ïîâðåæäåíèÿ íåéòðîôèëîâ
(ðèñ. 4). Èíäóöèðîâàííîå Í2Î2 (2 ììîëü/ë, 60 ìèí) âûñâîáîæäåíèå ËÄÃ â ïðèñóòñòâèè àñïèðèíà íà 79 ä 34 %, à â
ïðèñóòñòâèè ÌÊ-886 — íà 66 ä 24 % âûøå, ÷åì â îòñóòñòâèå èíãèáèòîðîâ. Ïðè èíêóáèðîâàíèè íåéòðîôèëîâ â
òå÷åíèå 210 ìèí ïîñëå äîáàâëåíèÿ Í2Î2 âûñâîáîæäåíèå
ËÄÃ ïîâûøàåòñÿ íà 162 ä 55 %, à â ïðèñóòñòâèè
ÌÊ-886 — íà 112 ä 45 % ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì
(â îòñóòñòâèå èíãèáèòîðîâ). Òàêèì îáðàçîì, äåñòðóêòèâíîå äåéñòâèå Í2Î2 íà íåéòðîôèëû óñèëèâàåòñÿ ïðè èíãèáèðîâàíèè ìåòàáîëèçìà ÀÊ ïî ÖÎ- è 5-ËÎ-ïóòÿì.
 ë è ÿ í è å Í 2Î 2 í à ñ ï î ñ î á í î ñ ò ü í å é ò ð î ô è ë î â
ã å í å ð è ð î â à ò ü À Ô Ê Õ. Íà ðèñ. 5 ïîêàçàíû çíà÷åíèÿ
èíòåãðàëüíîé èíòåíñèâíîñòè ËÇÕË, îáóñëîâëåííîé ãåíåðàöèåé íåéòðîôèëàìè ÀÔÊÕ â ïðîöåññå èõ àäãåçèè ê
ñòåêëó è â õîäå ôàãîöèòîçà ëàòåêñà ïîñëå ïðåèíêóáèðîâàíèÿ
êëåòîê ñ äîáàâëåíèåì 10–8—10–3 ìîëü/ë Í2Î2. Óñòàíîâëåíî,
÷òî ó íåéòðîôèëîâ â ðåçóëüòàòå ýêñïîçèöèè ê Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–6—10–5 ìîëü/ë ñïîñîáíîñòü ãåíåðèðîâàòü
ÀÔÊÕ ïðè àäãåçèè ñíèæàåòñÿ (P < 0.05), à ïðè ôàãîöèòîçå ëàòåêñà ïîâûøàåòñÿ (P < 0.01) (ðèñ. 5, à). Òàêîãî æå
òèïà ýôôåêòû, íî ìåíüøåé èíòåíñèâíîñòè íàáëþäàþòñÿ
ïðè âíåñåíèè â ñðåäó èíêóáèðîâàíèÿ 10–7 èëè 10–4 ìîëü/ë
Í2Î2. Ñ èñïîëüçîâàíèåì ÌÊ-886 è àñïèðèíà ïîêàçàíî,
÷òî âëèÿíèå Í2Î2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ çàâèñèò îò àêòèâíîñòè 5-ËÎ, íî íå îò èíãèáèðîâàíèÿ ÖÎ-ïóòè ìåòàáîëèçìà ÀÊ (ðèñ. 5, á, â). Òàêèì îáðàçîì, Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–7—10–4 ìîëü/ë îêàçûâàåò
ìîäóëèðóþùåå âëèÿíèå íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ ïðè àäãåçèè è ôàãîöèòîçå ëàòåêñà ïî
ìåõàíèçìó, çàâèñèìîìó îò 5-ËÎ-ïóòè ìåòàáîëèçìà ÀÊ.
 ë è ÿ í è å Í 2Î 2 í à à ê ò è â í î ñ ò ü Ì Ï Î í å é ò ð î ôèëîâ è ñåêðåöèþ ÌÏÎ âî âíåêëåòî÷íóþ ñðåä ó. Íà ðèñ. 6 ïðèâåäåíû çíà÷åíèÿ ïàðàìåòðà, õàðàêòåðèçóþùåãî àêòèâíîñòü ÌÏÎ â îáðàçöàõ íåéòðîôèëîâ è èõ
îáëîìêîâ, ïðîèíêóáèðîâàííûõ â òå÷åíèå 30 ìèí ïîñëå
äîáàâëåíèÿ 10–3—10–7 ìîëü/ë Í2Î2. Êàê îáñóæäàëîñü âûøå,
Í2Î2 áûñòðî ðàçëàãàåòñÿ êëåòêàìè — ÷åðåç 30 ìèí ïîñëå
äîáàâëåíèÿ 10–2 ìîëü/ë â èíêóáàöèîííîé ñðåäå îñòàåòñÿ
íå áîëåå 10–7—10–6 ìîëü/ë Í2Î2 (ñì. ðèñ. 2, 3); àíàëîãè÷íûé ðåçóëüòàò ïîëó÷åí ïðè èññëåäîâàíèè óòèëèçàöèè
Ðèñ. 4. Âëèÿíèå èíãèáèòîðîâ ìåòàáîëèçìà ÀÊ íà âûñâîáîæäåíèå ËÄà èç íåéòðîôèëîâ, èíäóöèðîâàííîå H2O2, ïðè èíêóáèðîâàíèè êëåòîê â òå÷åíèå 60 è 210 ìèí ïîñëå âíåñåíèÿ H2O2.
Ñåðûå ñòîëáèêè — àñïèðèí (10–3 ìîëü/ë), ÷åðíûå — MK-886
R
— âûñâîáîæäåíèå ËÄÃ
(0.5æ10–6 ìîëü/ë), áåëûå — áåç èíãèáèòîðîâ; A îòí.
S
— âûñâîáîèç íåéòðîôèëîâ ïðè äîáàâëåíèè 2æ10–3 ìîëü/ë H2O2, A îòí.
æäåíèå ËÄà èç íåéòðîôèëîâ áåç äîáàâëåíèÿ H2O2. Çâåçäî÷êè — Ð < 0.01.
Âëèÿíèå Í2Î2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊ
843
Ðèñ. 5. Âëèÿíèå H2O2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ ïðè àäãåçèè (÷åðíûå ñòîëáèêè) è ïðè äåéñòâèè ëàòåêñà
(áåëûå ñòîëáèêè).
à — èíòåãðàëüíàÿ èíòåíñèâíîñòü ÕË (S I) íåéòðîôèëîâ, èíêóáèðîâàííûõ â òå÷åíèå 30 ìèí ñ äîáàâëåíèåì H2O2 â ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ; Ê — êîíòðîëü (áåç äîáàâëåíèÿ H2O2); îäíà çâåçäî÷êà — P < 0.05, äâå çâåçäî÷êè — Ð < 0.01. á, â — èçìåíåíèå ñïîñîáíîñòè íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ,
èíäóöèðîâàííîå äîáàâëåíèåì 10–6 ìîëü/ë H2O2, â îòñóòñòâèå (Ê) è â ïðèñóòñòâèè èíãèáèòîðîâ ìåòàáîëèçìà ÀÊ.
Í2Î2 â ñðåäå, ñîäåðæàùåé îáëîìêè íåéòðîôèëîâ (äàííûå
íå ïîêàçàíû). Äëÿ îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè ÌÏÎ ìåòîäîì
ÕË â ïðîáû âíîñèëè Í2O2 â êîíöåíòðàöèè 10–5 ìîëü/ë, êîòîðàÿ íà 1—2 ïîðÿäêà ïðåâûøàåò êîíöåíòðàöèþ Í2Î2 â
îáðàçöàõ, èíêóáèðîâàííûõ ñ íèì. Íà ðèñ. 6 âèäíî, ÷òî àêòèâíîñòü ÌÏÎ íåéòðîôèëîâ ïîñëå èíêóáèðîâàíèÿ ñ äîáàâëåíèåì 10–7—10–3 ìîëü/ë Í2Î2 ïîâûøàåòñÿ ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì, ïðè÷åì íàèáîëåå çíà÷èòåëüíî ïðè 10–7 è 10–3 ìîëü/ë
Í2Î2. Àêòèâíîñòü ÌÏÎ îáëîìêîâ íåéòðîôèëîâ çíà÷èòåëüíî óâåëè÷èâàåòñÿ ïðè èíêóáèðîâàíèè ñ äîáàâëåíèåì
Í2O2 â êîíöåíòðàöèè 10–4—10–3, íî íå 10–7—10–5 ìîëü/ë.
Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ Í2Î2 íà ñåêðåöèþ ÌÏÎ âî âíåêëåòî÷íóþ ñðåäó ïîçâîëèëî âûÿâèòü, ÷òî Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–7—10–4 ìîëü/ë ñíèæàåò ñåêðåöèþ ÌÏÎ íåéòðîôèëàìè, ïðè÷åì â äèàïàçîíå êîíöåíòðàöèé 10–7—10–5 ìîëü/ë
âåëè÷èíà ýôôåêòà âîçðàñòàåò ñ óâåëè÷åíèåì êîíöåíòðàöèè Í2Î2 (ðèñ. 7). Ñ èñïîëüçîâàíèåì ÌÊ-886 è àñïèðèíà
óñòàíîâëåíî, ÷òî èíãèáèòîðíûé ýôôåêò Í2Î2 íà ñåêðåöèþ ÌÏÎ óñòðàíÿåòñÿ ïðè ïðåäîòâðàùåíèè ìåòàáîëèçìà
ÀÊ ïî 5-ËÎ-ïóòè, íî íå ïî ÖÎ-ïóòè.
Îáñóæäåíèå
 äàííîé ðàáîòå ìû èññëåäîâàëè âëèÿíèå ýêçîãåííîãî Í2Î2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü
ÀÔÊÕ. Îáíàðóæåíî, ÷òî èíêóáèðîâàíèå íåéòðîôèëîâ ñ
Ðèñ. 6. Âëèÿíèå H2O2 íà àêòèâíîñòü ÌÏÎ íåéòðîôèëîâ è èõ
îáëîìêîâ.
Ïî îñè îðäèíàò — èíòåãðàëüíàÿ èíòåíñèâíîñòü ÕË (SI) â ñèñòåìå «ëþìèíîë (5æ10–5 ìîëü/ë) à H2O2 (10–5 ìîëü/ë) à ÌÏÎ îáðàçöîâ». Îáðàçöû
íåéòðîôèëîâ (1) è èõ îáëîìêîâ (2) èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 30 ìèí ïîñëå
âíåñåíèÿ 10–8—10–3 ìîëü/ë H2O2; Ê — êîíòðîëü (áåç äîáàâëåíèÿ H2O2 â
ñðåäó); îäíà çâåçäî÷êà — Ð < 0.05, äâå çâåçäî÷êè — Ð < 0.01.
844
Å. È. Êîâàëåíêî, Ã. Í. Ñåìåíêîâà, Ñ. Í. ×åðåíêåâè÷
Ðèñ. 7. Ñåêðåöèÿ íåéòðîôèëàìè ÌÏÎ, èíäóöèðîâàííàÿ â ïðîöåññå àäãåçèè êëåòîê ê ñòåêëó äîáàâëåíèåì 10–8—10–3 ìîëü/ë
H2O2.
Îäíà çâåçäî÷êà — Ð < 0.05, äâå çâåçäî÷êè — Ð < 0.01, òðè çâåçäî÷êè —
Ð < 0.001; Ê — êîíòðîëü.
äîáàâëåíèåì 10–4—10–7 ìîëü/ë Í2Î2 ñîïðîâîæäàåòñÿ ïîâûøåíèåì ñïîñîáíîñòè ýòèõ êëåòîê ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ
ïðè äåéñòâèè ëàòåêñà è ñíèæåíèåì âûõîäà ÀÔÊÕ ïðè àäãåçèè íåéòðîôèëîâ ê ñòåêëó. Ìàêñèìàëüíûå ýôôåêòû âûÿâëåíû ïðè êîíöåíòðàöèè Í2Î2 10–6—10–5 ìîëü/ë. Êàê ïîêàçàíî â ðàáîòàõ äðóãèõ àâòîðîâ, ïðè òàêèõ æå êîíöåíòðàöèÿõ Í2Î2 èíäóöèðóåò õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ è
êðàòêîâðåìåííîå ïîâûøåíèå â íèõ âíóòðèêëåòî÷íîé êîíöåíòðàöèè Ñà2à (Klyubin et al., 1996), óñèëèâàåò ðåñïèðàòîðíûé âçðûâ, èíäóöèðîâàííûé fMLP è îïñîíèçèðîâàííûì çèìîçàíîì (Winn et al., 1991). Òàêèì îáðàçîì, íàøè
íàáëþäåíèÿ ïîäòâåðæäàþò âûâîäû äðóãèõ èññëåäîâàòåëåé î ñïîñîáíîñòè ýêçîãåííîãî Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè
10–6—10–5 ìîëü/ë ìîäóëèðîâàòü àêòèâíîñòü íåéòðîôèëîâ
è óñèëèâàòü ãåíåðàöèþ èìè ÀÔÊÕ ïðè ôàãîöèòîçå.
Îñíîâíûå ñèñòåìû ãåíåðàöèè ÀÔÊÕ â íåéòðîôèëàõ — ýòî ÍÀÄÔÍ-îêñèäàçíûé êîìïëåêñ, âîññòàíàâëèâàþùèé Î2 äî O2$–, è ÌÏÎ, îêèñëÿþùàÿ ñóáñòðàòû ñ èñïîëüçîâàíèåì Í2Î2 è Î2$– è ãåíåðèðóþùàÿ ãèïîõëîðèò
(Albrecht, Jungi, 1993; Arnhold, 2004; Ximenes et al., 2005;
Aratani, 2006). Íåéòðîôèëû ñïîñîáíû ãåíåðèðîâàòü
ÀÔÊÕ âî âíåêëåòî÷íîé ñðåäå è âíóòðè ôàãîëèçîñîì, ïðè
ýòîì ëîêàëèçàöèÿ, ïðîäîëæèòåëüíîñòü è ìåõàíèçì ôîðìèðîâàíèÿ ÀÔÊÕ çàâèñÿò îò âèäà ñòèìóëèðóþùåãî âîçäåéñòâèÿ (Albrecht, Jungi, 1993; Kavalenka et al., 2003). Íàïðèìåð, îáðàçîâàíèå ÀÔÊÕ ïðè àäãåçèè èëè äåéñòâèè
ðàñòâîðèìûõ ñòèìóëîâ ïðîèñõîäèò â îñíîâíîì ó âíåøíåé
ïîâåðõíîñòè íåéòðîôèëîâ, à ïðè ôàãîöèòîçå ìèêðîîðãàíèçìîâ èëè ÷àñòèö — âíóòðè êëåòîê (Granfeldt, Dahlgren,
2001; Kavalenka et al., 2003). H2O2, îáðàçóþùèéñÿ ïðè äèñìóòàöèè Î2$–, äèôôóíäèðóåò ïî âñåé êëåòêå è ïðîíèêàåò
âî âñå êëåòî÷íûå êîìïàðòìåíòû (Ohno, Gallin, 1985), îäíàêî äëÿ àêòèâàöèè ÌÏÎ, äåïîíèðîâàííîé â àçóðîôèëüíûõ ãðàíóëàõ, íåîáõîäèìî åå âûñâîáîæäåíèå èç ãðàíóë â
îáëàñòü ôîðìèðîâàíèÿ Î2$– è Í2Î2, ò. å. âî âíåêëåòî÷íóþ
ñðåäó, ëèáî âíóòðü ôàãîëèçîñîì (Albrecht, Jungi, 1993).
Ðàíåå ìû îáíàðóæèëè, ÷òî ïðîöåññû ãåíåðàöèè
ÀÔÊÕ ïðè äåéñòâèè ëàòåêñà èëè ïðè àäãåçèè ìîãóò êîíêóðèðîâàòü äðóã ñ äðóãîì, ïîñêîëüêó ôîðìèðîâàíèå ôàãîëèçîñîì ïðè ïîãëîùåíèè ÷àñòèö âëå÷åò çà ñîáîé ïîäàâëåíèå ñåêðåöèè ñîäåðæèìîãî àçóðîôèëüíûõ ãðàíóë âî
âíåêëåòî÷íóþ ñðåäó (Kavalenka et al., 2003). Çäåñü ìû ïîêàçàëè, ÷òî ïðè àäãåçèè íåéòðîôèëîâ ñ äîáàâëåíèåì â èíêóáàöèîííóþ ñðåäó H2O2 (10–4—10–7 ìîëü/ë) ñåêðåöèÿ
ÌÏÎ çíà÷èòåëüíî ñíèæàåòñÿ. Ýòî, ïî-âèäèìîìó, è ÿâëÿåòñÿ ïðè÷èíîé ñíèæåíèÿ ãåíåðàöèè ÀÔÊÕ ïðè àäãåçèè
(âî âíåêëåòî÷íîé ñðåäå) è ïîâûøåíèÿ ïðè ôàãîöèòîçå ëàòåêñà (âíóòðè êëåòêè), òåì áîëåå ÷òî ýêçîãåííûé Í2Î2 â
òàêèõ æå êîíöåíòðàöèÿõ âûçûâàë è óâåëè÷åíèå âíóòðèêëåòî÷íîé àêòèâíîñòè ÌÏÎ íåéòðîôèëîâ. Ïåðåìåùåíèå
ãðàíóë â öèòîïëàçìå ïðîèñõîäèò ñ ó÷àñòèåì ìèêðîôèëàìåíòîâ, è àãåíòû, ðàçðóøàþùèå ìèêðîôèëàìåíòû, íàïðèìåð öèòîõàëàçèí Â, èíãèáèðóþò âíóòðèôàãîñîìàëüíóþ
äåãðàíóëÿöèþ è óñèëèâàþò ñåêðåòîðíóþ äåãðàíóëÿöèþ.
Ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî Í2Î2 ñòèìóëèðóåò ñáîðêó ôèëàìåíòîâ. Ýòî ïðåäïîëîæåíèå ïîäòâåðæäàåòñÿ òàêæå òåì,
÷òî Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–6—10–5 ìîëü/ë èíäóöèðóåò
õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ (Klyubin et al., 1996), à äëÿ íàïðàâëåííîé ìèãðàöèè êëåòîê àêòèâàöèÿ ìèêðîôèëàìåíòîâ íåîáõîäèìà.
Ïîâûøåíèå ÌÏÎ àêòèâíîñòè íåéòðîôèëîâ ïðè äåéñòâèè Í2O2 â âûñîêîé êîíöåíòðàöèè (10–4—10–3 ìîëü/ë)
âûÿâëåíî íå òîëüêî â öåëüíûõ, íî è â ðàçðóøåííûõ êëåòêàõ, ñëåäîâàòåëüíî, íå çàâèñèò îò ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ñèñòåì âíóòðèêëåòî÷íîé ñèãíàëèçàöèè. Îáíàðóæåííûå ýôôåêòû íå ìîãóò áûòü ñâÿçàíû ñ íåïîñðåäñòâåííûì ó÷àñòèåì ââåäåííîãî â ñðåäó Í2Î2 â ðåàêöèÿõ, ïî êîòîðûì
îïðåäåëÿëàñü àêòèâíîñòü ÌÏÎ, ïîñêîëüêó çà 30 ìèí èíêóáèðîâàíèÿ íåéòðîôèëû (è öåëüíûå, è ðàçðóøåííûå)
ïðàêòè÷åñêè ïîëíîñòüþ óòèëèçèðîâàëè âíåñåííûé Í2Î2.
Ðåàêöèè, êàòàëèçèðóåìûå ÌÏÎ, äîñòàòî÷íî ñëîæíû, ðàçëè÷íûì îáðàçîì ïðîòåêàþò ïðè êèñëûõ è íåéòðàëüíûõ
çíà÷åíèÿõ ðÍ (Albrecht, Jungi, 1993; Vlasova et al., 2006),
èíãèáèðóþòñÿ êàòàëàçîé, ñóïåðîêñèääèñìóòàçîé è äðóãèìè àíòèîêñèäàíòàìè (Ximenes et al., 2005). ÌÏÎ ìîæåò
ðåàãèðîâàòü ñ ðàçëè÷íûìè ñóáñòðàòàìè, îäíè èç êîòîðûõ
êîíêóðåíòíûì îáðàçîì ìîãóò èíãèáèðîâàòü âçàèìîäåéñòâèå ÌÏÎ ñ äðóãèìè. Ìåõàíèçìû âëèÿíèÿ Í2Î2 â áîëüøèõ
êîíöåíòðàöèÿõ íà àêòèâíîñòü ÌÏÎ êëåòîê íàìè íå ðàñêðûòû, íî â ñèëó âûøåñêàçàííîãî ìîãóò âêëþ÷àòü â ñåáÿ:
ñíèæåíèå àêòèâíîñòè àíòèîêñèäàíòíûõ ôåðìåíòîâ â ðåçóëüòàòå èõ íåïîñðåäñòâåííîãî ïîâðåæäåíèÿ (Ìèðîøíè÷åíêî, 1992; Gille, Sigler, 1995; Phalen, 2006); èçìåíåíèå âåëè÷èíû ðÍ, âëèÿþùåé íà ìåõàíèçì ïðîÿâëåíèÿ àêòèâíîñòè
ÌÏÎ è ïîòðåáëåíèå åþ Í2Î2 (Kettle, Winterbourn, 1989;
Zuurbier et al., 1990; Vlasova et al., 2006); èçìåíåíèå êîíöåíòðàöèè ñóáñòðàòîâ, ñâÿçûâàþùèõñÿ ñ ÌÏÎ (Bolscher et
al., 1984; Thannickal, Fanburg, 2000), êîòîðîå ìîæåò ïðîèñõîäèòü è â öåëüíûõ, è â ðàçðóøåííûõ êëåòêàõ.
Ñìåùåíèå áàëàíñà îêñèäàíòîâ—ïðîîêñèäàíòîâ ïðè
äåéñòâèè 10–4—10–3 ìîëü/ë Í2Î2 â ñòîðîíó óñèëåíèÿ îêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ñëåäóåò ðàññìàòðèâàòü êàê îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ. Ïðèìå÷àòåëüíî, ÷òî âëèÿíèå Í2Î2 íà ïðîöåññû
äåãðàíóëÿöèè è ãåíåðàöèè íåéòðîôèëàìè ÀÔÊÕ â õîäå
àäãåçèè è ôàãîöèòîçà ïðè êîíöåíòðàöèè Í2Î2 10–4—10–3
ìîëü/ë ìåíåå âûðàæåíî, ÷åì ïðè êîíöåíòðàöèè 10–6—10–5
ìîëü/ë, ÷òî ìîæåò îòðàæàòü èçìåíåíèå ôóíêöèîíèðîâàíèÿ
íåéòðîôèëîâ â óñëîâèÿõ îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà. Áûëî
îáíàðóæåíî èíãèáèðóþùåå âëèÿíèå 10–4—10–3 ìîëü/ë
Âëèÿíèå Í2Î2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊ
Í2Î2 íà àêòèâíîñòü NF-k è ñåêðåöèþ TNF- a LPS-ñòèìóëèðîâàííûìè íåéòðîôèëàìè, ÷òî ñâÿçàíî ñ àêòèâàöèåé òèðîçèíêèíàç ERK1/2, ð38, JNK è ÐÊ ïðè ýòèõ êîíöåíòðàöèÿõ Í2Î2 (íî íå áîëåå íèçêèõ) (Strassheim et al., 2004).
Ïðåäñòàâëÿåò èíòåðåñ âûÿâëåíèå ñèãíàëüíûõ ïóòåé,
âîâëå÷åííûõ â òðàíñäóêöèþ ñèãíàëà ïðè äåéñòâèè íèçêèõ
êîíöåíòðàöèé Í2Î2. Âàæíóþ ðîëü â ðåãóëÿöèè ãåíåðàöèè
ÀÔÊÕ, äåãðàíóëÿöèè, àäãåçèè, õåìîòàêñèñà è àïîïòîçà
íåéòðîôèëîâ èãðàþò ôåðìåíòû ìåòàáîëèçìà àðàõèäîíîâîé êèñëîòû (ÀÊ), òàêèå êàê ôîñôîëèïàçà À2, 5-ËÎ è ÖÎ
(Radmark, 2000; Chang, Wang, 2001; Kavalenka et al., 2003).
Ïîêàçàíà ñâÿçü ðåãóëÿòîðíîãî äåéñòâèÿ Í2Î2 íà ìîíîöèòû
ñ ìåòàáîëèçìîì ÀÊ (Krjukov et al., 2006). Ìû îïðåäåëèëè
âëèÿíèå èíãèáèòîðîâ ìåòàáîëèçìà ÀÊ (ÌÊ-886 è àñïèðèíà) íà ýôôåêòû, âûçûâàåìûå 10–6 ìîëü/ë Í2Î2. Îêàçàëîñü,
÷òî áëîêèðîâàíèå 5-ËÎ-ïóòè (íî íå ÖÎ-ïóòè) ìåòàáîëèçìà ÀÊ ïðèâîäèò ê ñíèæåíèþ ýôôåêòèâíîñòè âëèÿíèÿ 10–6
ìîëü/ë Í2Î2 íà ãåíåðàöèþ ÀÔÊÕ è ñåêðåöèþ ÌÏÎ ïðè
àäãåçèè è ê óñèëåíèþ âëèÿíèÿ Í2Î2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊÕ ïðè ôàãîöèòîçå ëàòåêñà.
Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî â îòñóòñòâèå ýêçîãåííîãî Í2Î2 èíãèáèòîð MK-886 âûçûâàë ñíèæåíèå ïðîäóêöèè ÀÔÊÕ è
ñåêðåöèè ÌÏÎ ïðè àäãåçèè è ïîâûøåíèå âûõîäà ÀÔÊÕ
ïðè äåéñòâèè ëàòåêñà (äàííûå íå ïîêàçàíû). Ïîëó÷åííûå
ðåçóëüòàòû ñâèäåòåëüñòâóþò îá óìåíüøåíèè âëèÿíèÿ
5-ËÎ íà ñåêðåöèþ ÀÔÊÕ è ÌÏÎ ïðè àäãåçèè è ïîâûøåíèè âëèÿíèÿ 5-ËÎ íà ãåíåðàöèþ ÀÔÊÕ ïðè ôàãîöèòîçå
ëàòåêñà â ðåçóëüòàòå âîçäåéñòâèÿ ýêçîãåííîãî Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–6— 10–5 ìîëü/ë.
Àêòèâíîñòü 5-ËÎ ðåãóëèðóåòñÿ ìíîæåñòâåííûìè ïóòÿìè è çàâèñèò îò FLAP, èíãèáèòîðîâ ñóëüôãèäðèëüíûõ ãðóïï
è íàëè÷èÿ ïåðîêñèäîâ ëèïèäîâ. Êðîìå òîãî, ïðè àêòèâàöèè
íåéòðîôèëîâ íàáëþäàåòñÿ ðåãóëèðóåìîå ïåðåìåùåíèå
FLAP ê ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíå èëè ÿäðó êëåòêè (Rouzer, Samuelsson, 1986; Riendeau et al., 1989). 5-ËÎ îñóùåñòâëÿåò òðàíñôîðìàöèþ ÀÊ â ëåéêîòðèåíû, àêòèâèðóþùèå
íåéòðîôèëû ïî àóòîêðèííîìó è ïàðàêðèííîìó ìåõàíèçìàì. Ëåéêîòðèåí Â4 ñòèìóëèðóåò ïðîöåññû äåñòðóêöèè
ôàãîöèòèðîâàííûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ â íåéòðîôèëàõ: ïðè
«âûêëþ÷åíèè» ãåíà 5-ËÎ íåéòðîôèëû îêàçûâàþòñÿ äåôåêòíûìè â ñïîñîáíîñòè óáèâàòü çàõâà÷åííûå ïàòîãåíû
(Mancuso et al., 2001). Êîíöåíòðàöèÿ ëåéêîòðèåíîâ êîíòðîëèðóåòñÿ ñ ó÷àñòèåì ÌÏÎ, êîòîðàÿ îñóùåñòâëÿåò èõ äåãðàäàöèþ ñ èñïîëüçîâàíèåì Í2Î2 (Henderson, Klebanoff,
1983). Òàêèì îáðàçîì, ìåæäó àêòèâíîñòüþ ÌÏÎ è 5-ËÎ
èìååòñÿ âçàèìîñâÿçü, è ýêçîãåííûé Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè
10–6—10–5 ìîëü/ë îêàçûâàåò âëèÿíèå íà âçàèìîäåéñòâèå
5-ËÎ- è ÌÏÎ-ìåòàáîëè÷åñêèõ ïóòåé. Ïðè ïîâûøåíèè àêòèâíîñòè ÌÏÎ, èíäóöèðîâàííîì Í2Î2, äåãðàäàöèÿ ëåéêîòðèåíîâ ìîæåò óñêîðèòüñÿ, ÷òî ïðèâåäåò â êîíå÷íîì èòîãå
ê ñíèæåíèþ ëåéêîòðèåí-çàâèñèìîé àêòèâàöèè íåéòðîôèëîâ.
Ïîâûøåíèå àêòèâíîñòè ÌÏÎ íåéòðîôèëîâ âîçìîæíî âñëåäñòâèå óâåëè÷åíèÿ êîíöåíòðàöèè âîññòàíîâèòåëåé, ïðåïÿòñòâóþùèõ íàêîïëåíèþ íåàêòèâíîé ôîðìû ÌÏÎ — ñîåäèíåíèÿ II (Bolscher et al., 1984; Thannickal, Fanburg, 2000).
H2O2 â âûñîêèõ êîíöåíòðàöèÿõ èíäóöèðóåò ïîâðåæäåíèå
êëåòî÷íûõ ìåìáðàí è ïðèâîäèò ê ãèáåëè êëåòîê. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî ýòî äåéñòâèå íå ïðÿìîå, à îïîñðåäîâàííîå, ïîñêîëüêó Í2O2 õàðàêòåðèçóåòñÿ íèçêèì îêèñëèòåëüíûì ïîòåíöèàëîì (Ãàìàëåé, Êëþáèí, 1996). Ìåõàíèçìû ïîâðåæäåíèÿ
íåéòðîôèëîâ Í2Î2 ñðåäè ïðî÷èõ ìîãóò âêëþ÷àòü â ñåáÿ íåêîíòðîëèðóåìóþ ãèïåðàêòèâàöèþ êëåòîê, ãåíåðàöèþ èçáûòî÷íîãî êîëè÷åñòâà ÀÔÊÕ, óñèëåíèå îêèñëèòåëüíûõ ïðîöåññîâ, íàêîïëåíèå ëèïèäíûõ ãèäðîïåðåêèñåé è äðóãèõ òîêñè÷íûõ ïðîäóêòîâ (Ãàìàëåé, Êëþáèí, 1996; Moldovan, Moldovan,
845
2004), â òîì ÷èñëå ñ ó÷àñòèåì ÌÏÎ. Ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå
ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî â ðåçóëüòàòå äåéñòâèÿ ýêçîãåííîãî Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–3—10–2 ìîëü/ë ïðîèñõîäèò íàðóøåíèå áàðüåðíûõ ñâîéñòâ ìåìáðàí íåéòðîôèëîâ è íàáëþäàåòñÿ
âûñâîáîæäåíèå âî âíåêëåòî÷íóþ ñðåäó öèòîçîëüíûõ áåëêîâ
(ËÄÃ). Ñ óâåëè÷åíèåì âðåìåíè èíêóáèðîâàíèÿ íåéòðîôèëîâ
ïîñëå âíåñåíèÿ Í2Î2 äåñòðóêòèâíûé ýôôåêò çíà÷èòåëüíî
âîçðàñòàåò. Íèæíÿÿ êîíöåíòðàöèîííàÿ ãðàíèöà òîêñè÷åñêîãî
äåéñòâèÿ Í2Î2, îïðåäåëåííàÿ ïî òåñòó ñ íèòðîñèíèì òåòðàçîëèåì, ñîñòàâëÿëà 10–4 ìîëü/ë (Klyubin et al., 1996), îäíàêî â
ýòîì ñëó÷àå êëåòêè ïîäâåðãàëèñü áîëåå äëèòåëüíîìó, ÷åì â
íàøåì ñëó÷àå, âîçäåéñòâèþ. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ïî âûñâîáîæäåíèþ ËÄÃ, êàê è ïî ïîãëîùåíèþ íèòðîñèíåãî
òåòðàçîëèÿ, ìîæíî ñóäèòü ëèøü î íåêðîòè÷åñêîì ïîâðåæäåíèè êëåòîê, íî íåâîçìîæíî îöåíèòü àïîïòîòè÷åñêèå èçìåíåíèÿ, êîòîðûå, âîçìîæíî, èìåþò ìåñòî ïðè áîëåå íèçêèõ êîíöåíòðàöèÿõ H2Î2 (10–4 è 10–3 ìîëü/ë) è ìåíåå äëèòåëüíîì èíêóáèðîâàíèè. Èíãèáèòîðíûé àíàëèç ïîêàçàë,
÷òî äåñòðóêòèâíîå äåéñòâèå Í2Î2 çàâèñèò îò ìåòàáîëèçìà
ëèïèäîâ è óñèëèâàåòñÿ ïðè èíãèáèðîâàíèè 5-ËÎ è ÖÎ
ìåòàáîëèçìà ÀÊ. Ýòî ñâèäåòåëüñòâóåò î òîì, ÷òî èìåííî ÀÊ,
âûñâîáîæäàåìàÿ èç ôîñôîëèïèäîâ ìåìáðàí ôîñôîëèïàçîé
À2, à íå åå ìåòàáîëèòû, îáðàçóåìûå ïî ËÎ- èëè ÖÎ-ïóòè,
ñïîñîáñòâóåò äåñòðóêöèè ìåìáðàí íåéòðîôèëîâ.
Òàêèì îáðàçîì, ïîëó÷åííûå äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò
î âûñîêîé ñòåïåíè óñòîé÷èâîñòè íåéòðîôèëîâ êðîâè ê äåñòðóêòèâíîìó äåéñòâèþ H2O2, ïîäòâåðæäàþò ðåãóëÿòîðíóþ ðîëü Í2Î2 â îòíîøåíèè ôóíêöèîíàëüíûõ ñâîéñòâ íåéòðîôèëîâ, à òàêæå äîêàçûâàþò ñâÿçü äåéñòâèÿ Í2Î2 íà
íåéòðîôèëû ñ ìåòàáîëèçìîì ÀÊ â ýòèõ êëåòêàõ.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Áåëîðóññêîãî ðåñïóáëèêàíñêîãî ôîíäà ôóíäàìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé (ïðîåêò Á03M-137).
Cïèñîê ëèòåðàòóðû
Àðòþõîâ Â. Ã., Íàêâàñèíà Ì. À. 2000. Áèîëîãè÷åñêèå ìåìáðàíû: ñòðóêòóðíàÿ îðãàíèçàöèÿ, ôóíêöèè, ìîäèôèêàöèÿ ôèçèêî-õèìè÷åñêèìè àãåíòàìè. Âîðîíåæ: Èçä-âî ÂÃÓ. 296 ñ.
Áåéóì À. 1980. Âûäåëåíèå ëèìôîöèòîâ, ãðàíóëîöèòîâ è
ìàêðîôàãîâ. Â êí.: Ëèìôîöèòû: âûäåëåíèå, ôðàêöèîíèðîâàíèå
è õàðàêòåðèñòèêà. Ì.: Ìåäèöèíà. 9—36.
Ãàìàëåé È. À., Êëþáèí È. Â. 1996. Ïåðåêèñü âîäîðîäà êàê
ñèãíàëüíàÿ ìîëåêóëà. Öèòîëîãèÿ. 38 (12) : 1233—1247.
Êóëàãîâà Ò. À., Ñåìåíêîâà Ã. Í., Êâà÷åâà Ç. Á., ×åðåíêåâè÷ Ñ. Í. 2006. Ðåãóëÿöèÿ ìîðôîëîãè÷åñêèõ è ôóíêöèîíàëüíûõ ñâîéñòâ àñòðîãëèàëüíûõ êëåòîê ïåðîêñèäîì âîäîðîäà. Öèòîëîãèÿ. 48 (11) : 900—905.
Ìèðîøíè÷åíêî Î. Ñ. 1992. Áèîãåíåç, ôèçèîëîãè÷åñêàÿ
ðîëü è ñâîéñòâà êàòàëàçû. Áèîïîëèìåðû è êëåòêà. 8 (6) :
3—25.
Albrecht D., Jungi T. W. 1993. Luminol-enhanced chemiluminescence induced in peripheral blood-derived human phagocytes
obligatory requirement of myeloperoxidase exocytosis by monocytes. J. Leukocyte Biol. 54 : 300—306.
Aratani Y. 2006. Role of myeloperoxidase in the host defense
against fungal infection. Nippon. Ishinkin. Gakkai Zasshi. 47 :
195—199.
Arnhold J. 2004. Review: properties, functions, and secretion
of human myeloperoxidase. Biochemistry. (Moskow). 69 : 4—9.
Bolscher B. G. J. M., Zoutberg G. R., Cuperus R. A., Wever R.
1984. Vitamin Ñ stimulates the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Biochim. Biophys. acta. 784 : 189—191.
Brown K .A., Brain S. D., Pearson J. D., Edgeworth J. D., Lewis S. M., Treacher D. F. 2006. Neutrophils in development of
multiple organ failure in sepsis. Lancet. 368 : 157—169.
846
Å. È. Êîâàëåíêî, Ã. Í. Ñåìåíêîâà, Ñ. Í. ×åðåíêåâè÷
Cave A. C., Brewer A. C., Narayanapanicker A., Ray R., Grieve D. J., Walker S., Shah A. M. 2006. NADPH oxidases in cardiovascular health and disease. Antioxid. Redox. Signal. 8 : 691—728.
Chang L. C., Wang J. P. 2001. Signal transduction pathways
for activation of extracellular signal-regulated kinase by arachidonic acid in rat neutrophils. J. Leukocyte Biol. 69 : 659—665.
Dahlgren C., Follin P., Lundqvist H., Sjolin C. 1993. Quantitative slot-blot chemiluminescence assay for determination of myeloperoxidase from human granulocytes. Anal. Biochem. 214 : 284—
288.
Droge W. 2002. Free radicals in the physiological control of
cell function. Physiol. Rev. 82 : 47—95.
Gamaley I. A., Kirpichnikova K. M., Klyubin I. V. 1994. Activation of murine macrophages by hydrogen peroxide. Cell Sygnal.
6 : 949—957.
Gamaley I. A., Kirpichnikova K. M., Klyubin I. V. 1997. Superoxide release is involved in membrane potential changes in mouse
peritoneal macrophages. Free Rad. Biol. Med. 24 : 168—174.
Gille G., Sigler K. 1995. Oxidative stress and living cells. Folia
Microbiol. 40 : 131—152.
Granfeldt D., Dahlgren C. 2001. An intact cytoskeleton is required for prolonged respiratory burst activity during neutrophil
phagocytosis. Inflammation. 25 : 165—169.
Hancock J. Ò., Desikan R., Neill S. J. 2001. Role of reactive
oxygen species in cell signalling pathways. Biochem. Soc. Trans.
29 : 345—350.
Haqqani A. S., Sandhu J. K., Birnboim H. C. 1999. A myeloperoxidase-specific assay based upon bromide-dependent chemiluminescence of luminol. Anal. Biochem. 273 : 126—132.
Henderson W. R., Klebanoff S. J. 1983. Leukotriene production
and inactivation by normal, chronic granulomatous disease and myeloperoxidase-deficient neutrophils. J. Biol. Chem. 258 : 13 522—
13 527.
Holgate S. T., Holloway J., Wilson S., Howarth P. H., Haitchi H. M., Babu S., Davies D. E. 2006. Understanding the pathophysiology of severe asthma to generate new therapeutic opportunities.
J. Allergy Clin. Immunol. 117 : 496—506.
Kavalenka A. I., Semenkova G. N., Cherenkevich S. N., Smirnova E. N., Gerein V. 2003. Systems of reactive oxygen species generation in human neutrophils: chemiluminescent analysis. Clin.
Lab. 49 : 566.
Kettle A. J., Winterbourn C. C. 1989. Influence of superoxide
on myeloperoxidase kinetics measured with a hydrogen peroxide
electrode. Biochem. J. 263 : 823—828.
Klyubin I. V., Kirpichnikova K. M., Gamaley I. A. 1996. Hydrogen peroxide-induced chemotaxis of mouse peritoneal neutrophils. Eur. J. Cell Biol. 70 : 347—351.
Knaapen A. M., Gungor N., Schins R. P., Borm P. J., van Schooten F. J. 2006. Neutrophils and respiratory tract DNA damage and
mutagenesis: a review. Mutagenesis. 21 : 225—236.
Krjukov A. A., Semenkova G. N., Cherenkevich S. N., Gerein V.
2006. Activation of redox-systems of monocytes by hydrogen peroxide. Biofactors. 26 : 283—292.
Kumae Ò., Kogure H., Nishimuta M., Kodama N., Yoshitake Y.
2006. Effects of a 21 day metabolic study on serum opsonic activity
in female college students, assessed by a chemiluminescence technique. Luminescence. 21 : 256—261.
Mancuso P., Nana-Sinkam P., Peters-Golden M. 2001. Leukotriene B4 augments neutrophil phagocytosis of klebsiella pneumoniae. Infection. Immunity. 69 : 2011—2016.
Moldovan N., Moldovan N. I. 2004. Oxygen free radicals and
redox biology of organelles. Histochem. Cell Biol. 122 : 395—412.
Nathan C. 2006. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6 : 173—182.
Ohno Y., Gallin J. I. 1985. Diffusion of extracellular hydrogen
peroxide into intracellular ñompartments of human neutrophils.
Studies utilizing the inactivation of myeloperoxidase by hydrogen
peroxide and azide. J. Biol. Chem. 260 : 8438—8446.
Phalen T. J., Weirather K., Deming P. B., Anathy V.,
Howe A. K., van der Vliet A., Jonsson T. J., Poole L. B., Heintz N. H. 2006. Oxidation state governs structural transitions in peroxiredoxin II that correlate with cell cycle arrest and recovery.
J. Cell Biol. 175 : 779—789.
Radmark O. 2000. The molecular biology and regulation
of 5-lipoxygenase. Amer. J. Respir. Crit. Care Med. 161 : S11—
S15.
Ramos C. D., Fernandes K. S., Canetti C., Teixeira M. M., Silva J. S., Cunha F. Q. 2006. Neutrophil recruitment in immunized
mice depends on MIP-2 inducing the sequential release of
ÌIP-alpha, TNF-alpha and LTB(4). Eur. J. Immunol. 36 : 2025—
2034.
Ravage Z. B., Gomez H. F., Czermak B. J., Watkins S. A., Till
G. O. 1998. Mediators of microvascular injury in dermal burn wounds. Inflammation. 22 : 619—629.
Riendeau D., Denis D., Choo L. Y., Nathaniel D. J. 1989. Stimulation of 5-lipoxygenase activity under conditions which promote lipid peroxidation. Biochem. J. 263 : 565—572.
Rose S., Illerhaus M., Wiercinski A., Mutschler W., Marzi I.
2000. Altered calcium regulation and function of human neutrophils during multiple trauma. Shock. 13 : 92—99.
Rouzer C. A., Samuelsson B. 1986. The importance of hydroperoxide activation for the detection and assay of mammalian 5-lipoxygenase. FEBS Lett. 204 : 293—296.
Saxton J. M., Claxton D., Winter E., Pockley A. G. 2003. Peripheral blood leucocyte functional responses to acute eccentric exercise in humans are influenced by systemic stress, but not by exercise-induced muscle damage. Clin. Sci. 104 : 69—77.
Schreck R., Rieber P., Baeuerle P. A. 1991. Reactive oxygen
intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-cappaB transcription factor and HIV-1. EMBO J. 10 :
2247—2258.
Strassheim D., Asehnoune K., Park J.-S., Kim J.-Y., He Q., Richter D., Mitra S., Arcaroli J., Kuhn K., Abraham E. 2004. Modulation of bone marrow-derived neutrophil signaling by H2O2: disparate effects on kinases, NF-kB, and cytokine expression Amer. J.
Physiol. Cell. Physiol. 286 : C683—C692.
Thannickal V. J., Fanburg B. L. 2000. Reactive oxygen species
in cell signaling. Amer. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279 :
L1005—L1028.
Vlasova I. I., Arnhold J., Osipov A.N., Panasenko O. M. 2006.
pH-dependent regulation of myeloperoxidase activity. Biokhimiya.
71 : 825—837.
Wang J. S. 2004. Strenuous, acute exercise suppresses polymorphonuclear leukocyte respiratory burst under adherence to surface-adherent platelets in men. Thromb. Haemost. 92 : 1076—
1085.
Winn J. S., Guille J., Gebicki J. M., Day R. O. 1991. Hydrogen
peroxide modulation of the respiratory burst of human neutrophils.
Biochem. Pharmacol. 41 : 31—36.
Ximenes V. F., Silva S. O., Rodrigues M. R., Catalani L. H.,
Maghzal G. J., Kettle A. J., Campa A. 2005. Superoxide-dependent
oxidation of melatonin by myeloperoxidase. J. Biol. Chem. 280 :
38 l60—38 l69.
Zuurbier K. W. M., Bakkenist A. R. J., Wever R., Muijsers A. O.
1990. The chlorinating activity of human myeloperoxidase: high
initial activity at neutral pH value and activation by electron donors. Biochim. biophys. acta. 1037 : 140—146.
Ïîñòóïèëà 19 XII 2006
Âëèÿíèå Í2Î2 íà ñïîñîáíîñòü íåéòðîôèëîâ ãåíåðèðîâàòü ÀÔÊ
THE INFLUENCE OF HYDROGEN PEROXIDE ON ABILITY OF NEUTROPHILS
TO GENERATE THE REACTIVE OXYGEN AND CHLORINE SPECIES
AND SECRETE MYELOPEROXIDASE IN VITRO
E. I. Kovalenko,1 G. N. Semenkova, S. N. Cherenkevich
Biophysics Department of Physical Faculty of Belarusian State University, Minsk;
1e-mail: kavalenka@bsu.by
The influence of H2O2 at concentrations of 10–8—10–2 mol/l on neutrophil ability to generate the reactive
oxygen and chlorine species (ROCS) and secrete myeloperoxidase (MPO) was studied, and H2O2 injurious effect on neutrophils was also investigated in this work. It was revealed that H2O2 at concentrations of
2æ10–3—2æ10–2 mol/l induced disturbance of the neutrophil membrane barrier properties and lactate dehydrogenase release. The incubation of the neutrophils with the addition of 10–4—10–7 mol/1 H2O2 led to an increase
in the cell ability to generate ROCS during phagocytosis and decreased neutrophil ability to secrete MPO and
ROCS in extracellular medium during adhesion. The mechanisms of H2O2 effect are coupled with arachidonic
acid metabolism. Inhibition of metabolic pathways of 5-lipoxygenase or cyclooxygenase increased the destructive effect of H2O2 on the cells. Five-lipoxygenase way prohibition led to cancellation of H2O2 influence on MPO
and ROCS secretion and to enhancement of H2O2 effect on neutrophil ability to generate ROCS during phagocytosis. The data obtained testify to the high neutrophil resistance to destructive effect of H2O2 and confirm the
regulatory role of H2O2 with respect to the neutrophil functions.
K e y w o r d s: neutrophils, hydrogen peroxide, reactive oxygen and chlorine species, myeloperoxidase,
5-lipoxygenase, cyclooxygenase, lactate dehydrogenase.
847