фрагментация днк лимфоцитов человека в динамике развития
advertisement
2011 ÖÈÒÎËÎÃÈß Ò î ì 53, ¹ 1 ÔÐÀÃÌÅÍÒÀÖÈß ÄÍÊ ËÈÌÔÎÖÈÒΠ×ÅËÎÂÅÊÀ  ÄÈÍÀÌÈÊÅ ÐÀÇÂÈÒÈß ÀÏÎÏÒÎÇÀ, ÈÍÄÓÖÈÐÎÂÀÍÍÎÃÎ ÂÎÇÄÅÉÑÒÂÈÅÌ ÓÔ-ÈÇËÓ×ÅÍÈß È ÀÊÒÈÂÍÛÕ ÔÎÐÌ ÊÈÑËÎÐÎÄÀ © Â. Ã. Àðòþõîâ,1 Ì. Ñ. Òðóáèöûíà, Ì. À. Íàêâàñèíà, Å. Â. Ñîëîâüåâà Êàôåäðà áèîôèçèêè è áèîòåõíîëîãèè Âîðîíåæñêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî óíèâåðñèòåòà; 1 ýëåêòðîííûé àäðåñ: avg@main.vsu.ru Â. Ã. Àðòþõîâ, Ì. Ñ. Òðóáèöûíà è äð. Óñòàíîâëåíî, ÷òî óëüòðàôèîëåòîâûé (ÓÔ) ñâåò (240—390 íì) â äîçàõ 151, 1510 è 3020 Äæ/ì2, àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà (ÀÔÊ) è ñèíãëåòíûé êèñëîðîä èíäóöèðóþò ôðàãìåíòàöèþ ÄÍÊ ëèìôîöèòàðíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà ÷åðåç 20 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ. Ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåòîäà ÄÍÊ-êîìåò âûÿâëåíî, ÷òî ïîâðåæäåíèÿ ÄÍÊ (îäíîíèòåâûå ðàçðûâû) îáíàðóæèâàþòñÿ ñðàçó ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ ëèìôîöèòîâ â äîçàõ 1510 è 3020 Äæ/ì2 èëè äîáàâëåíèÿ ïåðîêñèäà âîäîðîäà â êîíöåíòðàöèè 10–6 ìîëü/ë (êîìåòû òèïà Ñ1) è äîñòèãàþò ìàêñèìóìà ÷åðåç 6 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ íà êëåòêè ÓÔ-ñâåòà èëè ÀÔÊ (êîìåòû òèïîâ Ñ2 è Ñ3). Âûäâèíóòî ïðåäïîëîæåíèå î âåäóùåé ðîëè ð53-çàâèñèìîãî ïóòè â ðåàëèçàöèè àïîïòîçà ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà â óñëîâèÿõ âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-ñâåòà è ÀÔÊ. Ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà â äèíàìèêå ðàçâèòèÿ àïîïòîçà Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: ëèìôîöèòû, ÄÍÊ-êîìåòû, àïîïòîç, ÓÔ-ñâåò, àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà. èíäóêòîðàìè àïîïòîçà â êëåòêàõ ðàçëè÷íûõ òèïîâ, â òîì ÷èñëå èììóíîêîìïåòåíòíûõ (Servomaa, Rytomaa, 1990; Martin, Gotter, 1991; Ëîíñêàÿ è äð., 1997; Ìåíüùèêîâà, Çåíåêîâ, 1997; Ïëåòþøêèíà è äð., 2006). Îäíàêî äèíàìèêó ïðîöåññîâ àïîïòîçà, âûçâàííîãî ÓÔ-ñâåòîì â äîçàõ 151, 1510 è 3020 Äæ/ì2, ÀÔÊ è ñèíãëåòíîãî êèñëîðîäà íå èññëåäîâàëè.  íàñòîÿùåé ðàáîòå ïðè ïîìîùè ìåòîäîâ ÄÍÊ-êîìåò è ýëåêòðîôîðåçà â àãàðîçíîì ãåëå èññëåäîâàíû èçìåíåíèÿ ñòðóêòóðû ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè äîíîðîâ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-èçëó÷åíèÿ, ÀÔÊ è ñèíãëåòíîãî êèñëîðîäà.  îðãàíèçìå çäîðîâîãî ÷åëîâåêà êëåòî÷íûé ãîìåîñòàç îïðåäåëÿåòñÿ áàëàíñîì ìåæäó ãèáåëüþ è ïðîëèôåðàöèåé êëåòîê. Àïîïòîç — ïðîãðàììèðîâàííàÿ êëåòî÷íàÿ ãèáåëü, ýíåðãåòè÷åñêè çàâèñèìûé, ãåíåòè÷åñêè êîíòðîëèðóåìûé ïðîöåññ, êîòîðûé çàïóñêàåòñÿ ñïåöèôè÷åñêèìè ñèãíàëàìè è èçáàâëÿåò îðãàíèçì îò ïîâðåæäåííûõ èëè îñëàáëåííûõ êëåòîê (Âëàäèìèðñêàÿ, 2002). Æèçíåñïîñîáíîñòü êëåòîê çàâèñèò îò ñîîòíîøåíèÿ àêòèâàòîðîâ è èíãèáèòîðîâ àïîïòîçà.  ðîëè èíãèáèòîðîâ àïîïòîçà ìîãóò âûñòóïàòü ôàêòîðû ðîñòà, êëåòî÷íûé ìàòðèêñ è ïîëîâûå ñòåðîèäû. Ê àêòèâàòîðàì àïîïòîçà îòíîñÿòñÿ ãëþêîêîðòèêîèäû, íåêîòîðûå âèðóñû, àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà (ÀÔÊ), óëüòðàôèîëåòîâûé (ÓÔ) ñâåò, èîíèçèðóþùàÿ ðàäèàöèÿ, à òàêæå ãåíîòîêñè÷åñêèå è êàíöåðîãåííûå âåùåñòâà (Ñêóëà÷åâ, 2001). Êîíå÷íûì ýòàïîì ðåàëèçàöèè ïðîãðàììû àïîïòîçà ÿâëÿåòñÿ äåãðàäàöèÿ ÄÍÊ íà ôðàãìåíòû, êðàòíûå 180—200 ïàðàì íóêëåîòèäîâ (ï. í.), ÷òî ïðèâîäèò ê îáðàçîâàíèþ õàðàêòåðíîé êàðòèíû (ëåñåíêè) íà ýëåêòðîôîðåãðàììå êëåòî÷íûõ ÄÍÊ-ýêñòðàêòîâ. Îäíàêî ïîñëåäíÿÿ äàåò èíôîðìàöèþ, óñðåäíåííóþ ïî âñåé ïîïóëÿöèè èññëåäóåìûõ êëåòîê (Òðîíîâ, Ïåëåâèíà, 1996). Ñóùåñòâóåò ìåòîä, ïîçâîëÿþùèé íàáëþäàòü èçìåíåíèÿ â õðîìàòèíå êëåòêè íà ðàííèõ ýòàïàõ ðàçâèòèÿ àïîïòîçà, à òàêæå ðàçëè÷àòü êëåòêè, ïîãèáàþùèå ïî ìåõàíèçìó àïîïòîçà è íåêðîçà, — ìåòîä ÄÍÊ-êîìåò (Ostling, Johanson, 1984). Ýòî — ñïîñîá ðåãèñòðàöèè ïîâðåæäåíèé ãåíîìà èíäèâèäóàëüíîé êëåòêè, êîòîðûé â íàñòîÿùåå âðåìÿ ïðèìåíÿåòñÿ ïðè ïðîâåäåíèè ýïèäåìèîëîãè÷åñêèõ è ãåíîòîêñè÷åñêèõ îáñëåäîâàíèé, ïðè äèàãíîñòèêå, ëå÷åíèè è ïðîôèëàêòèêå çàáîëåâàíèé (Ñèðîòà, Êóçíåöîâà, 2008). Ê íàñòîÿùåìó âðåìåíè óñòàíîâëåíî, ÷òî ÓÔ-ñâåò, ÀÔÊ è ñèíãëåòíûé êèñëîðîä ÿâëÿþòñÿ ïîòåíöèàëüíûìè Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà Îáúåêòîì èññëåäîâàíèÿ ÿâèëèñü ëèìôîöèòû, ïîëó÷åííûå ïóòåì öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ãåïàðèíèçèðîâàííîé äîíîðñêîé êðîâè â ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîëë-óðîãðàôèíà (r = 1.077 ã/ñì3). Ñóñïåíçèþ êëåòîê èíêóáèðîâàëè â ñðåäå RPMI-1640 (Áèîëîò, Ðîññèÿ) ïðè 37 °Ñ â àòìîñôåðå 5 % ÑÎ2. Êëåòêè îáëó÷àëè ÓÔ-ñâåòîì ñâåðõó ñ ïîìîùüþ ðòóòíî-êâàðöåâîé ëàìïû òèïà ÄÐÒ-400 ïðè èõ íåïðåðûâíîì ïåðåìåøèâàíèè â òåðìîñòàòèðóåìîé ñòåêëÿííîé êþâåòå (ïðè 20 ± 1 °Ñ). Ðàññòîÿíèå îò îñè ëàìïû äî êþâåòû ñ êëåòêàìè ñîñòàâëÿëî 23 ñì. Îáëó÷åíèå ëèìôîöèòîâ (1 ìë, 2$106 êë./ìë) ïðîâîäèëè ÷åðåç ñâåòîôèëüòð ÓÔÑ-1 ñ ïîëîñîé ïðîïóñêàíèÿ 240—390 íì (ñî ñïåêòðàëüíûìè ëèíèÿìè 253.7, 265.2, 280, 296.7, 302.2, 312.6 è 365 íì). Èíòåíñèâíîñòü èçëó÷åíèÿ ëàìïû — 151 Äæ/ì2 çà 1 ìèí. Èñïîëüçîâàëè äîçû 151, 1510 è 3020 Äæ/ì2 ïðè âðåìåíè îáëó÷åíèÿ ñîîòâåòñòâåííî 1, 10 è 20 ìèí. Ïëîòíîñòü ýíåðãèè èçëó÷åíèÿ (îáëó÷åííîñòü), ñîçäàâàåìóþ ÓÔ-ëó61 62 Â. Ã. Àðòþõîâ, Ì. Ñ. Òðóáèöûíà è äð. ÷àìè, èçìåðÿëè ñ ïîìîùüþ óôèìåòðà, ñìîíòèðîâàííîãî íà êàôåäðå áèîôèçèêè Âîðîíåæñêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî óíèâåðñèòåòà.  êà÷åñòâå òåïëîâîãî ïðèåìíèêà ÓÔ-èçëó÷åíèÿ â óôèìåòðå ïðèìåíÿëè òåðìîáàòàðåþ, ñîáðàííóþ èç 50 íèõðîìîâî-êîíñòàíòàíîâûõ òåðìîïàð (Ðâà÷åâ, 1966). Èñïîëüçîâàëè ñèñòåìû ýêçîãåííîé ãåíåðàöèè ðàçíûõ ÀÔÊ è ñèíãëåòíîãî êèñëîðîäà (1Î2). Ãèäðîêñèëüíûå ðàäèêàëû (ÎÍ•) ãåíåðèðîâàëè ñ ïîìîùüþ ðåàêöèè Ôåíòîíà: ê 0.9 ìë ñóñïåíçèè ëèìôîöèòîâ (1—2 ìëí/ìë) ïðèáàâëÿëè 0.05 ìë ñâåæåïðèãîòîâëåííîãî ðàñòâîðà FeSO4 (5$10–5 ìîëü/ë) è èíêóáèðîâàëè 10 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Äàëåå äîáàâëÿëè 0.05 ìë 0.02%-íîãî H2O2 (Goldstein, Czapski, 1984). Äëÿ ãåíåðàöèè ñóïåðîêñèäíîãî àíèîí-ðàäèêàëà (O•– 2 ) â ëèìôîöèòàðíóþ ñóñïåíçèþ (1—2 ìëí/ìë) îáúåìîì 0.9 ìë âíîñèëè ïî 0.05 ìë ðàñòâîðîâ ðèáîôëàâèíà (1.3$10–4 ìîëü/ë) è ÒÅÌÅÄ (0.1 ìîëü/ë, ïðèãîòîâëåí íà ðàñòâîðå ÝÄÒÀ 0.002 ìîëü/ë). Îäíîâðåìåííî ñèñòåìó îáëó÷àëè â òå÷åíèå 1 ìèí ñâåòîì ëàìïû íàêàëèâàíèÿ (ìîùíîñòü 60 Âò ïðè ðàññòîÿíèè 10 ñì äî êþâåòû ñ êëåòêàìè) (×óìàêîâ, Îñèíñêàÿ, 1977). Äëÿ èçó÷åíèÿ âëèÿíèÿ H2O2 â ñóñïåíçèþ ëèìôîöèòîâ (1—2 ìëí/ìë) îáúåìîì 0.9 ìë ïðèáàâëÿëè 0.1 ìë H2O2 (10–5 ìîëü/ë; êîíöåíòðàöèþ îïðåäåëÿëè ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ñ èñïîëüçîâàíèåì êîýôôèöèåíòà ìîëÿðíîé ýêñòèíêöèè 43.6 ë$ìîëü–1$ñì–1 ïðè 240 íì). Äëÿ ãåíåðàöèè 1Î2 0.9 ìë ñóñïåíçèè ëèìôîöèòîâ (1—2 ìëí/ìë) îáëó÷àëè â ïðèñóòñòâèè ìåòèëåíîâîãî ãîëóáîãî (10–6 ìîëü/ë) êðàñíûì ñâåòîì ñ ïîìîùüþ óñòðîéñòâà «Óëîêñ», èçãîòîâëåííîãî ïî ëàçåðíîé òåõíîëîãèè íà îñíîâå òðåõêîìïîíåíòíîãî òâåðäîãî ðàñòâîðà ãàëëèÿ, ìûøüÿêà è àëþìèíèÿ (Âîðîíåæñêèé ôèëèàë Ãîñóäàðñòâåííîé íàó÷íî-ïðîèçâîäñòâåííîé ôèðìû Ìèêðîòåê): äëèíà âîëíû ìàêñèìóìà èçëó÷åíèÿ — 665 ± 15 íì, äèàïàçîí èçëó÷åíèÿ — 630—700 íì, âûõîäíàÿ èíòåíñèâíîñòü èçëó÷åíèÿ — 20 ìÂò/ñì2 (Ìèðîíîâ, 1996). Ðåçóëüòàòû àíàëèçà èçìåíåíèé ëþìèíîëçàâèñèìîé õåìèëþìèíåñöåíöèè ïîêàçàëè, ÷òî óðîâåíü îáðàçîâàíèÿ ÀÔÊ â èñïîëüçóåìûõ íàìè ñèñòåìàõ èõ ãåíåðàöèè áûë â ñðåäíåì â 3—4 ðàçà íèæå óðîâíÿ íåéòðîôèëîâ ïðè äûõàòåëüíîì âçðûâå. Èçâåñòíî, ÷òî âî âðåìÿ äûõàòåëüíîãî âçðûâà 107 íåéòðîôèëîâ îáðàçóþò 0.1 íìîëü/ìèí O•– 2 (Curnutte, Babior, 1974), 106 íåéòðîôèëîâ îáðàçóþò 3—5 íìîëü/ìèí Í2Î2 (Roos, 1980), 191 ± 22 íìîëü/÷ ÎÍ• (Neil et al., 1986) è 11.3 ± 4.9 íìîëü 1Î2/1.25$106 êëåòîê (Steinbeck et al., 1992). Âûäåëåíèå ÄÍÊ èç ëèìôîöèòîâ ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè ôåíîëüíîãî ìåòîäà (Äóäíèê è äð., 2001). Èçìåíåíèÿ ñòðóêòóðû ÄÍÊ àíàëèçèðîâàëè ñ ïîìîùüþ ýëåêòðîôîðåçà â àãàðîçíîì ãåëå (Äóäíèê è äð., 2001). Ðàçìåðû ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ ëèìôîöèòàðíûõ êëåòîê ïðè ïðîâåäåíèè ýëåêòðîôîðåçà â àãàðîçíîì ãåëå îïðåäåëÿëè ñ ïîìîùüþ MassRulertm ÄÍÊ-ìàðêåðà, êîòîðûé ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé íàáîð èç 9 ÄÍÊ-ôðàãìåíòîâ äëèíîé 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000 è 10 000 ï. í. Îá èíäóêöèè àïîïòîçà ëèìôîöèòîâ ñóäèëè ïî ìåòîäó ÄÍÊ-êîìåò. Èñïîëüçîâàëè ùåëî÷íóþ îáðàáîòêó ïðåïàðàòîâ ëèçèðîâàííûõ êëåòîê, êîòîðàÿ âûçûâàåò ðàñùåïëåíèå äóïëåêñà ÄÍÊ è ïîçâîëÿåò îòäåëüíûì íèòÿì íåçàâèñèìî ìèãðèðîâàòü â ýëåêòðè÷åñêîì ïîëå (Singh et al., 1988). Ñóòü ìåòîäà çàêëþ÷àåòñÿ â òîì, ÷òî ÄÍÊ åäèíè÷íûõ êëåòîê, èììîáèëèçîâàííûõ â àãàðîçå, ïîäâåðãàåòñÿ ýëåêòðîôîðåçó, ïðè ýòîì ôðàãìåíòèðîâàííàÿ ÄÍÊ âûõîäèò èç ÿäðà êëåòêè, îáðàçóÿ «õâîñò» êîìåòû. Ïîñëå îêðàñêè áðî- ìèñòûì ýòèäèåì ÄÍÊ-êîìåòû àíàëèçèðîâàëè ñ ïîìîùüþ ôëóîðåñöåíòíîãî ìèêðîñêîïà (Zeiss, ôèëüòð âîçáóæäåíèÿ 450—490, äèõðîííîå çåðêàëî FT 510, çàïèðàþùèé ôèëüòð LP 520, îáúåêòèâ 40%). Èçîáðàæåíèÿ ðåãèñòðèðîâàëè öèôðîâûì ôîòîàïïàðàòîì Samsung S760. Ñêàíèðîâàíèå êîìåò ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè ïðîãðàììû CometScoretm.  ðàáîòå èñïîëüçîâàëè ñëåäóþùèå ðåàêòèâû: ôèêîëë 400 (Dia-m, Øâåéöàðèÿ), óðîãðàôèí 76 % (Schering AG, Èñïàíèÿ), ÒÅÌÅÄ, ðèáîôëàâèí, ïåðîêñèä âîäîðîäà, ìåòèëåíîâûé ãîëóáîé è ñóëüôàò æåëåçà (Alfa Aesar, Ãåðìàíèÿ), MassRulertm ÄÍÊ-ìàðêåð è ëåãêîïëàâêóþ àãàðîçó (Fermentas, ÑØÀ) Îáðàáîòêó ðåçóëüòàòîâ ïðîâîäèëè ñ ïîìîùüþ ïàêåòà ñòàòèñòè÷åñêèõ ïðîãðàìì Statgraphics. Îïðåäåëÿëè ñðåäíåå çíà÷åíèå, ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå è äîâåðèòåëüíûé èíòåðâàë. Äîñòîâåðíîñòü ðàçëè÷èé êîíòðîëüíûõ è ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ðåçóëüòàòîâ îöåíèâàëè ïðè ïîìîùè t-êðèòåðèÿ Ñòüþäåíòà. Ðåçóëüòàòû Äëÿ âûÿâëåíèÿ âîçìîæíîãî ïðîöåññà ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ íà ëèìôîöèòû ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè äîíîðîâ ÓÔ-ñâåòà â äîçàõ 151, 1510 è 3020 Äæ/ì2 ìû âûäåëÿëè ÄÍÊ èç ëèìôîöèòîâ ïðè ïîìîùè ôåíîëüíîãî ìåòîäà è ïðîâîäèëè ýëåêòðîôîðåç ïîëó÷åííûõ ïðåïàðàòîâ ÄÍÊ èíòàêòíûõ êëåòîê è ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ. Èç àíàëèçà äàííûõ, ïðåäñòàâëåííûõ íà ðèñ. 1, ñëåäóåò, ÷òî íà äîðîæêå 1 (êîíòðîëü) âûÿâëÿåòñÿ îäíà ïîëîñà, õàðàê- Ðèñ. 1. Ýëåêòðîôîðåãðàììà ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà, îáëó÷åííûõ ÓÔ-ñâåòîì. Äîðîæêè: 1 — êîíòðîëü; 2—4 — äîçû îáëó÷åíèÿ ñîîòâåòñòâåííî 151, 1510 è 3020 Äæ/ì2; Ì — ìàðêåð ìîëåêóëÿðíûõ ìàññ, ï. í. Ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà â äèíàìèêå ðàçâèòèÿ àïîïòîçà 63 ðàçìåðîì > 300 ò. ï. í.), Ñ2 (ôðàãìåíòû 7 50 ò. ï. í.), Ñ3 (N %180 ï. í.), Ñ4 (äåãðàäàöèÿ ãåíîìà è ýêñêðåöèÿ íèçêîïîëèìåðîé ÄÍÊ èç êëåòêè) (Collins et al., 1995; Òðîíîâ è äð., 1998). Íà ðèñ. 3 è 4 ïðåäñòàâëåíû ìèêðîôîòîãðàôèè òèïîâ êîìåò, ôîðìèðóåìûõ ëèìôîöèòàìè ñðàçó è ÷åðåç 6 è 20 ÷ ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ èëè äåéñòâèÿ Í2Î2. Êîìåòû èíòàêòíûõ ëèìôîöèòîâ, èíêóáèðîâàííûõ â ñðåäå RPMI-1640 â òå÷åíèå 6 è 20 ÷, îòíîñÿòñÿ ê êëàññó Ñ0 (ðèñ. 3, à). Êîìåòû ëèìôîöèòîâ íåïîñðåäñòâåííî ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-ñâåòà â äîçå 151 Äæ/ì2 îòíîñÿòñÿ ê êëàññó Ñ1. Ñïóñòÿ 6 è 20 ÷ ïîñëå îáëó÷åíèÿ èììóíîöèòîâ îáíàðóæåíû êîìåòû êëàññà Ñ2, õàðàêòåðíûå äëÿ ïðåäàïîïòîòè÷åñêèõ êëåòîê (êîììèòèðîâàííûõ ê ãèáåëè) ñ ôðàãìåíòàìè ÄÍÊ 7 50 òûñ. ï. í. (ðèñ. 3, á). Ïîñëå âîçäåéñòâèÿ íà ëèìôîöèòû ÓÔ-ñâåòà â äîçå 1510 Äæ/ì2 íàáëþäàëè îáðàçîâàíèå êîìåò êëàññà Ñ1, à ÷åðåç 6 è 20 ÷ ïîñëå îáëó÷åíèÿ — êîìåò ñîîòâåòñòâåííî êëàññîâ Ñ2 è Ñ3 (ðèñ. 3, â). Êîìåòû êëàññà Ñ3 ñîîòâåòñòâóþò àïîïòîòè÷åñêèì ñ ìåæíóêëåîñîìíîé ôðàãìåíòàöèåé ÄÍÊ (N % 180 ï. í.). Ïîñëå îáëó÷åíèÿ ëèìôîöèòîâ â äîçå 3020 Äæ/ì2 áûëè îáíàðóæåíû êîìåòû êëàññà Ñ2, à ÷åðåç 6 è 20 ÷ ïîñëå îáëó÷åíèÿ — êîìåòû êëàññà Ñ3 (ðèñ. 3, ã). Ñïóñòÿ 20 ÷ ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ â óêàçàííîé äîçå âûÿâëÿëèñü êîìåòû êëàññà Ñ4. Íàëè÷èå â èññëåäóåìûõ îáðàçöàõ êîìåò êëàññà Ñ4 óêàçûâàåò íà ðåàëèçàöèþ ãèáåëè ÷àñòè ëèìôîöèòîâ ïî òèïó íåêðîçà. Ñðàçó ïîñëå äîáàâëåíèÿ ê ëèìôîöèòàì 10–6 ìîëü/ë Í2Î2 íàáëþäàëè îáðàçîâàíèå êîìåò êëàññà Ñ1, ñïóñòÿ 6 ÷ — êîìåò êëàññîâ Ñ2 è Ñ3, à ÷åðåç 20 ÷ — êîìåò Ðèñ. 2. Ýëåêòðîôîðåãðàììà ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ ïîñëå äåéñòâèÿ àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà. Äîðîæêè: 1 — êîíòðîëü; 2 — 10–6 ìîëü/ë Í2Î2; 3 — ñóïåðîêñèäíûé àíèîí-ðàäèêàë; 4 — ñèíãëåòíûé êèñëîðîä; 5 — ãèäðîêñèëüíûé ðàäèêàë; Ì — ìàðêåð ìîëåêóëÿðíûõ ìàññ, ï. í. òåðíàÿ äëÿ âûñîêîìîëåêóëÿðíîé ÄÍÊ èíòàêòíûõ êëåòîê. Ñïóñòÿ 20 ÷ ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ â âûøåóêàçàííûõ äîçàõ íà ýëåêòðîôîðåãðàììå îáíàðóæåíû ôðàãìåíòû ÄÍÊ (àïîïòîòè÷åñêàÿ ëåñòíèöà), ñîîòâåòñòâóþùèå ðàçìåðàì 6000, 5000 è ìåíåå 1500 ï. í. (ðèñ. 1, äîðîæêè 2—4). Ñëåäîâàòåëüíî, ÓÔ-ñâåò â èñïîëüçîâàííûõ äîçàõ èíäóöèðóåò àïîïòîòè÷åñêóþ ãèáåëü ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà. Ñïóñòÿ 20 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ íà ëèìôîöèòû O•– 2 , 1Î , OH • è Í Î ïðîèñõîäèò ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ, íà ÷òî 2 2 2 óêàçûâàåò ñîâîêóïíîñòü ïîëîñ íà ýëåêòðîôîðåãðàììå (ðèñ. 2). Ðàçìåðû ôðàãìåíòîâ âàðüèðóþò ñîîòâåòñòâåííî â ïðåäåëàõ 2500—5000, 1500—2500, 2000—4500 è 1500— 4000 ï. í. Òàêèì îáðàçîì, ÓÔ-ñâåò (240—390 íì) â äîçàõ 151, 1510 è 3020 Äæ/ì2, ÀÔÊ è ñèíãëåòíûé êèñëîðîä èíäóöèðóþò àïîïòîç ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà. Ôðàãìåíòû ÄÍÊ ïðè âîçäåéñòâèè íà ëèìôîöèòû ÀÔÊ è 1Î2 êðóïíåå ôðàãìåíòîâ, îáíàðóæåííûõ ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ êëåòîê â äîçàõ 151 è 1510 Äæ/ì2. Êàê è â ñëó÷àå ñ ðåçóëüòàòàìè ÓÔ-îáëó÷åíèÿ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ íà ëèìôîöèòû ÀÔÊ è 1Î , òàêæå ìîæíî ïðåäïîëîæèòü èíèöèàöèþ àïîïòîçà, ðå2 àëèçóþùåãîñÿ ñ ó÷àñòèåì òðàíñêðèïöèîííîãî ôàêòîðà ð53, ïðîàïîïòîçíîãî áåëêà Bax è ìèòîõîíäðèàëüíîãî àïîïòîòè÷åñêîãî ôàêòîðà AIF. Ïðè ïîìîùè ìåòîäà ÄÍÊ-êîìåò èññëåäîâàëè óðîâåíü ïîâðåæäåíèÿ ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-èçëó÷åíèÿ (151, 1510 è 3020 Äæ/ì2) è Í2Î2 (10–6 ìîëü/ë). Èçâåñòíî, ÷òî ÄÍÊ-êîìåòû êëàññèôèöèðóþò íà ïÿòü òèïîâ â çàâèñèìîñòè îò ñòåïåíè ïîâðåæäåíèé ÄÍÊ: Ñ0 (ÄÍÊ èíòàêòíûõ êëåòîê), Ñ1 (ôðàãìåíòû ÄÍÊ Ðèñ. 3. Ìèêðîôîòîãðàôèè ÄÍÊ-êîìåò ñðàçó ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ (0 ÷) è ÷åðåç 6 è 20 ÷ ïîñëå íåãî. à — èíòàêòíûå êëåòêè; á—ã — äîçû îáëó÷åíèÿ ñîîòâåòñòâåííî 151, 1510 è 3020 Äæ/ì2. 64 Â. Ã. Àðòþõîâ, Ì. Ñ. Òðóáèöûíà è äð. Ðèñ. 4. Ìèêðîôîòîãðàôèè ÄÍÊ-êîìåò êëåòîê ñðàçó ïîñëå äîáàâëåíèÿ 10–6 ìîëü/ë ïåðîêñèäà âîäîðîäà (0 ÷) è ÷åðåç 6 è 20 ÷ ïîñëå ýòîãî. à — èíòàêòíûå êëåòêè; á — ïîñëå äîáàâëåíèÿ Í2Î2; â — íåêðîòè÷åñêèå êëåòêè ÷åðåç 20 ÷ ïîñëå äîáàâëíèÿ Í2Î2. êëàññà Ñ3. Ïî íàøåìó ìíåíèþ, ïî ïðîøåñòâèè 20 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ íà ëèìôîöèòû Í2Î2 îáíàðóæèâàþòñÿ êîìåòû êëàññà Ñ4 (äåãðàäàöèÿ ãåíîìà è ýêñêðåöèÿ íèçêîïîëèìåðíîé ÄÍÊ èç êëåòêè) (ðèñ. 4). Óðîâåíü ïîâðåæäåíèé ÄÍÊ âûðàæàåòñÿ ðàçëè÷íûìè ïàðàìåòðàìè, âû÷èñëÿåìûìè ïðè àíàëèçå ìèêðîèçîáðàæåíèé íóêëåîèäîâ ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììíîãî îáåñïå÷åíèÿ. Ýòî äëèíà êîìåòû, âûñîòà, ïðîöåíòíîå ñîäåðæàíèå ÄÍÊ â ãîëîâå êîìåòû, ïðîöåíòíîå ñîäåðæàíèå ÄÍÊ â õâîñòå êîìåòû, ìîìåíò õâîñòà è îëèâüå-ìîìåíò (Ostling, Johanson, 1984; Singh et al., 1988; Olive et al., 1990). Ìû èçìåðÿëè òîëüêî äîëþ ÄÍÊ â õâîñòå êîìåòû (Ò, %), õàðàêòåðèçóþùóþ óðîâåíü ïîâðåæäåíèé â ÄÍÊ èññëåäóåìûõ êëåòîê, íàëè÷èå êîòîðûõ ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê ñèãíàë ê èíèöèàöèè àïîïòîçà (Hartmann et al., 2003). Íà ðèñ. 5 ïîêàçàíû èçìåíåíèÿ âåëè÷èíû Ò äëÿ ëèìôîöèòîâ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-ñâåòà (à) è Í2Î2 (á). Îáíàðóæåíî ïîâûøåíèå ïî îòíîøåíèþ ê êîíòðîëþ (ð < 0.05) óðîâíÿ ïîâðåæäåíèÿ ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ (âåëè÷èíû Ò) ñðàçó ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ â äîçàõ 1510 è 3020 Äæ/ì2 è ÷åðåç 6 è 20 ÷ ïîñëå îáëó÷åíèÿ â äîçàõ 151, 1510 è 3020 Äæ/ì2 (ðèñ. 5). Íàèáîëåå ñóùåñòâåííîå âîçðàñòàíèå ñòåïåíè ïîâðåæäåííîñòè ÄÍÊ çàðåãèñòðèðîâàíî ÷åðåç 6 ÷ ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ ëèìôîöèòîâ â äîçå 1510 Äæ/ì2. Óðîâåíü ïîâðåæäåííîñòè ÄÍÊ êëåòîê, îáëó÷åííûõ â äîçå 3020 Äæ/ì2, âûøå, ÷åì ó êîíòðîëüíûõ êëåòîê, íî ÷åðåç 6 è 20 ÷ ïîñëå îáëó÷åíèÿ îí òàêîé æå, êàê è ñðàçó ïîñëå îáëó÷åíèÿ. Ïîâûøåíèå ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì (Ð < 0.05) óðîâíÿ ïîâðåæäåííîñòè ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ, îáðàáîòàííûõ Í2Î2, çàðåãèñòðèðîâàíî ñðàçó è ÷åðåç 6 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ (ðèñ. 5, á). Íàèáîëüøèé îáúåì ïîâðåæäåíèé ÄÍÊ ïðèõîäèòñÿ íà âðåìÿ 6 ÷ ïîñëå îáðàáîòêè ëèìôîöèòîâ Í2Î2. Èòàê, ÷åðåç 20 ÷ ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ ëèìôîöèòîâ â äîçå 151 Äæ/ì2 â àãàðîçíîì ãåëå îáíàðóæèâàþòñÿ ôðàãìåíòû ÄÍÊ êëåòîê ðàçìåðàìè 6000 è <1500 ï. í. Ìåòîä ÄÍÊ-êîìåò ïîçâîëèë âûÿâèòü êîìåòû êëàññà Ñ2, õàðàêòåðíûå äëÿ ïðåäàïîïòîòè÷åñêèõ êëåòîê (ôðàãìåíòû 7 50 òûñ. ï. í.). Ïðè äîçå îáëó÷åíèÿ 1510 Äæ/ì2 ÷åðåç 20 ÷ îáðàçóþòñÿ ôðàãìåíòû ÄÍÊ ðàçìåðîì ìåíåå 1500 ï. í. è ÄÍÊ-êîìåòû êëàññà Ñ3, ÷òî óêàçûâàåò íà ìåæíóêëåîñîìíóþ ôðàãìåíòàöèþ ÄÍÊ, õàðàêòåðíóþ äëÿ Ðèñ. 5. Èçìåíåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÄÍÊ (Ò) â õâîñòå êîìåò ëèìôîöèòîâ ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ â ðàçíûõ äîçàõ (à) è äåéñòâèÿ 10–6 ìîëü/ë ïåðîêñèäà âîäîðîäà (á). Âåðòèêàëüíûå îòðåçêè — äîâåðèòåëüíûå èíòåðâàëû ñðåäíèõ çíà÷åíèé. Ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà â äèíàìèêå ðàçâèòèÿ àïîïòîçà ïîãèáàþùèõ êëåòîê. Ïðè äîçå îáëó÷åíèÿ 3020 Äæ/ì2 ÷åðåç 20 ÷ îáíàðóæåíû ôðàãìåíòû ÄÍÊ ðàçìåðîì ~5000 è >1500 ï. í., êîìåòû êëàññîâ Ñ3 è Ñ4.  ýòèõ æå óñëîâèÿõ ðàíåå ìû íàáëþäàëè èíàêòèâàöèþ êàñïàçû-3 (Àðòþõîâ è äð., 2009). Ïî-âèäèìîìó, ýòè ðåçóëüòàòû óêàçûâàþò íà âîçìîæíîñòü ðåàëèçàöèè ð53-çàâèñèìîãî ïóòè àïîïòîçà, ñîïðîâîæäàþùåãîñÿ âûõîäîì èç ìèòîõîíäðèé ôàêòîðà AIF è èíäóêöèåé êàñïàçîíåçàâèñèìîãî ïóòè ïðîãðàììèðîâàííîé êëåòî÷íîé ñìåðòè. Îáðàáîòêà ëèìôîöèòîâ Í2Î2 âûçûâàåò îáðàçîâàíèå ôðàãìåíòîâ ðàçìåðîì 1500—4000 ï. í. è ÄÍÊ-êîìåò êëàññîâ Ñ3 è Ñ4, ÷òî óêàçûâàåò íà ðåàëèçàöèþ ãèáåëè êëåòîê ïî òèïó àïîïòîçà, à ÷àñòè — ïî òèïó íåêðîçà.  èññëåäîâàííûõ îáðàçöàõ íàáëþäàëè îòäåëüíûå êîìåòû, òèïè÷íûå äëÿ íåêðîòè÷åñêèõ êëåòîê. Òàêèì îáðàçîì, ïðîöåññó îáðàçîâàíèÿ êîìåò êëàññà Ñ3, õàðàêòåðèçóþùåãîñÿ ìåæíóêëåîñîìíîé ôðàãìåíòàöèåé (N%180 ï. í.) â óñëîâèÿõ âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-ñâåòà è Í2Î2, ïðåäøåñòâóåò ôîðìèðîâàíèå êîìåò êëàññîâ Ñ1 è Ñ2 ñ îáðàçîâàíèåì ñîîòâåòñòâåííî âûñîêîìîëåêóëÿðíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ ðàçìåðîì > 300 òûñ. ï. í. è ôðàãìåíòîâ ðàçìåðîì 7 50 òûñ. ï. í. Äëÿ ÷àñòè êëåòîê ïîñëå èõ ÓÔ-îáëó÷åíèÿ â äîçå 3020 Äæ/ì2 è âîçäåéñòâèÿ Í2Î2 âîçìîæíà ãèáåëü ïî òèïó íåêðîçà. Îáñóæäåíèå Èçâåñòíî, ÷òî ÓÔ-èçëó÷åíèå èíäóöèðóåò àïîïòîç â ëèìôîèäíûõ êëåòêàõ (Servomaa, Rytomaa, 1990). Ïðè ÓÔ-îáëó÷åíèè â ïîãëîùåíèè ýíåðãèè â ïåðâóþ î÷åðåäü ïðèíèìàþò ó÷àñòèå êîìïîíåíòû ìåìáðàí ëèìôîöèòîâ. ÓÔ-ñâåò ìîæåò èíäóöèðîâàòü äåìàñêèðîâàíèå ñêðûòûõ (ïðåäñóùåñòâóþùèõ) ìîëåêóë CD95 íà ïîâåðõíîñòü ëèìôîèäíûõ êëåòîê íåçàâèñèìî îò àêòèâàöèè Fas-ëèãàíäà (Aragane et al., 1998) âñëåäñòâèå èíòåíñèôèêàöèè ïðîöåññîâ ïåðîêñèäíîãî ôîòîîêèñëåíèÿ ëèïèäîâ (ÏÔÎË), íàêîïëåíèÿ ÀÔÊ, èçìåíåíèÿ ñòðóêòóðíîãî ñîñòîÿíèÿ ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí êëåòîê, à òàêæå ñèíòåç íîâûõ ìîëåêóë Fas-ðåöåïòîðà. Ïðè ýòîì ïðîèñõîäÿò îáðàçîâàíèå òðèìåðîâ Fas-ðåöåïòîðîâ è äàëüíåéøåå ïðåîáðàçîâàíèå àïîïòîçíîãî ñèãíàëà ñ ó÷àñòèåì öèòîïëàçìàòè÷åñêèõ ôàêòîðîâ; êðîìå òîãî, ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-ñâåòà, ÀÔÊ è ñèíãëåòíîãî êèñëîðîäà â ñìåñè ëèìôîöèòîâ âîçìîæíà àêòèâàöèÿ Fas-L, èíäóöèðóþùàÿ àïîïòîç èììóííûõ êëåòîê (Caricchio et al., 1998). Íå èñêëþ÷åíà âåðîÿòíîñòü òîãî, ÷òî ÓÔ-ñâåò ñïîñîáåí àêòèâèðîâàòü ìåìáðàííûå êàñêàäû ïåðåäà÷è ñèãíàëà è îáåñïå÷èâàòü ïåðåäà÷ó ñèãíàëà íà Fas-ðåöåïòîð èçíóòðè êëåòêè. Òàê, ÓÔ-èçëó÷åíèå âûçûâàåò íàðóøåíèå ñòðóêòóðû ìèòîõîíäðèé è âûõîä èç íèõ àïîïòîãåííûõ ôàêòîðîâ (öèòîõðîìà ñ, AIF) (Murahashi et al., 2003). Îñòàåòñÿ íåÿñíûì, ïðîèñõîäèò ëè íàðóøåíèå ìèòîõîíäðèé íåïîñðåäñòâåííî ïîä âîçäåéñòâèåì ÓÔ-èçëó÷åíèÿ, ÷åðåç íåïîñðåäñòâåííîå ïîâðåæäåíèå ÄÍÊ èëè ÷åðåç àêòèâàöèþ ðåöåïòîðîâ ñìåðòè (Kulms, Schwarz, 2000). Îáðàçîâàíèå ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ íåîäèíàêîâîãî ðàçìåðà ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-ñâåòà è ÀÔÊ ìîæåò áûòü ñâÿçàíî ñ çàïóñêîì ðàçëè÷íûõ ïóòåé àïîïòîçà. Òàê, îáíàðóæåíèå ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ ïîñëå îáëó÷åíèÿ ëèìôîöèòîâ â äîçå 3020 Äæ/ì2 áîëåå êðóïíûõ, ÷åì ïðè îáëó÷åíèè äðóãèìè äîçàìè, ìîæíî îáúÿñíèòü ïåðåêëþ÷åíèåì êàñïàçíîãî ïóòè ïðîãðàììèðîâàííîé êëåòî÷íîé ñìåðòè íà êàñïàçîíåçàâèñèìûé ïóòü, îñóùåñòâëÿþùèéñÿ ñ ó÷àñòèåì ôàêòîðà AIF. Íà ýòî óêàçûâàþò èçìåíåíèÿ óðîâíÿ ôóíêöèîíàëü- 65 íîé àêòèâíîñòè ýôôåêòîðíîé êàñïàçû-3 ïîñëå âîçäåéñòâèÿ íà ëèìôîöèòû ÷åëîâåêà ÓÔ-ñâåòà â ðàçëè÷íûõ äîçàõ (Àðòþõîâ è äð., 2009). Âîçìîæíîñòü îñóùåñòâëåíèÿ àïîïòîçà ïî êàñïàçîíåçàâèñèìîìó ïóòè â ïðèñóòñòâèè èíãèáèòîðà êàñïàç (z VAD-fmk) â óñëîâèÿõ âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-ñâåòà ñðåäíåâîëíîâîãî äèàïàçîíà (lmax = 315 íì) áûëà ïîêàçàíà äëÿ Ò-êëåòîê ÷åëîâåêà ëèíèè Jurkat (Murahashi et al., 2003). Ñëåäóåò ïîä÷åðêíóòü, ÷òî óêàçàííàÿ ñïåêòðàëüíàÿ ëèíèÿ ïðèñóòñòâóåò â ñïåêòðå èçëó÷åíèÿ ïðèìåíÿåìîé íàìè ëàìïû òèïà ÄÐÒ-400. Èçâåñòíî, ÷òî ÓÔ-ñâåò âûçûâàåò ïîâðåæäåíèå ÿäåðíîé ÄÍÊ, êîòîðîå èíäóöèðóåò àïîïòîç ÷åðåç àêòèâàöèþ òðàíñêðèïöèîííîãî ôàêòîðà p53 (Ozawa et al., 1999). Èñïîëüçóåìûé íàìè èñòî÷íèê ÓÔ-èçëó÷åíèÿ ñîäåðæèò ñïåêòðàëüíûå ëèíèè 253.7 è 265.2 íì, êîòîðûå ìîãóò ïîãëîùàòüñÿ àçîòèñòûìè îñíîâàíèÿìè íóêëåèíîâûõ êèñëîò. Ìåòîäîì ÄÍÊ-êîìåò óñòàíîâëåíî, ÷òî ïîâðåæäåíèÿ ÄÍÊ (îäíîíèòåâûå ðàçðûâû) îáíàðóæèâàþòñÿ ñðàçó ïîñëå ÓÔ-îáëó÷åíèÿ ëèìôîöèòîâ â äîçàõ 1510 è 3020 Äæ/ì2 è äîáàâëåíèÿ Í2Î2 â êîíöåíòðàöèè 10–6 ìîëü/ë (êîìåòû Ñ1) è äîñòèãàþò ìàêñèìóìà ñïóñòÿ 6 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ óêàçàííûõ àãåíòîâ (êîìåòû Ñ2 è Ñ3). Âåðîÿòíî, íàêîïëåíèå îäíîíèòåâûõ ðàçðûâîâ ÄÍÊ ïðèâîäèò â èòîãå ê ôîðìèðîâàíèþ äâóõíèòåâûõ ðàçðûâîâ, ÿâëÿþùèõñÿ ñèãíàëîì ê çàïóñêó àïîïòîçà ëèìôîöèòàðíûõ êëåòîê. Áåëîê ð53 âëèÿåò è íà âíåøíèé, è íà ìèòîõîíäðèàëüíûé ïóòè èíäóêöèè àïîïòîçà (Gottlieb, Oren, 1998; Vousden, 2000; Vousden, Lu, 2002). Âëèÿÿ íà ìèòîõîíäðèàëüíûé ïóòü, ð53 ðåïðåññèðóåò òðàíñêðèïöèþ àíòèàïîïòîçíîãî áåëêà Bcl2 è àêòèâèðóåò òðàíñêðèïöèþ ïðîàïîïòîçíûõ áåëêîâ Bax (Miyashita, Reed, 1995), Noxa (Oda et al., 2000a), p53AIP1 (Oda et al., 2000b) è Puma (Nakano, Vousden, 2001; Yu et al., 2001). Êðîìå òîãî, ð53 àêòèâèðóåò òðàíñêðèïöèþ ãåíà APAF1 (Fortin et al., 2001; Moroni et al., 2001; Robles et al., 2001), ïîâûøàåò ÷óâñòâèòåëüíîñòü êëåòîê ê âíåøíèì ïðîàïîïòîçíûì ôàêòîðàì, ñòèìóëèðóÿ òðàíñêðèïöèþ ãåíîâ Fas (APO1) (Owen-Schaub et al., 1995) è KILLER/DR5 (Wu et al., 1997). Áåëîê ð53 àêòèâèðóåò òàêæå ìíîæåñòâî äðóãèõ áåëêîâ, ñâÿçàííûõ ñ èíäóêöèåé àïîïòîçà. Ê íèì îòíîñÿòñÿ Perp (Attardi et al., 2000), Pidd (Lin et al., 2000), Wip1 (Fiscella et al., 1997), Scotin (Bourdon et al., 2002), GML, STAG1, p53CABC1, p53RDL1 (Nakamura, 2004) è äð. Ñóùåñòâóåò òàêæå çíà÷èòåëüíàÿ ãðóïïà ð53-èíäóöèðóåìûõ ãåíîâ, ôóíêöèÿ êîòîðûõ ñâÿçàíà ñ èçìåíåíèåì ðåäîêñ-áàëàíñà êëåòêè. Ê íèì îòíîñÿòñÿ ãåíû PIG3, PIG8 (Polyak et al., 1997), FDXR (Hwang et al., 2001) è íåêîòîðûå äðóãèå. Ñîãëàñíî îäíîé èç ìîäåëåé (Polyak et al., 1997), ðåçêîå ïîâûøåíèå óðîâíÿ âíóòðèêëåòî÷íûõ êèñëîðîäíûõ ðàäèêàëîâ, ïðîèñõîäÿùåå ïðè èíäóêöèè äàííîé ãðóïïû ãåíîâ, ìîæåò ñïîñîáñòâîâàòü óñêîðåíèþ êëåòî÷íîé ñìåðòè. Òàêèì îáðàçîì, ìîæíî ïðåäïîëîæèòü ó÷àñòèå ð53-çàâèñèìîãî ïóòè â ðåàëèçàöèè àïîïòîçà ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà â óñëîâèÿõ âîçäåéñòâèÿ ÓÔ-ñâåòà è ÀÔÊ. Ñïèñîê ëèòåðàòóðû Àðòþõîâ Â. Ã., Íàêâàñèíà Ì. À., Òðóáèöûíà Ì. Ñ., Ïîïîâà Ò. Í., Èñêóñíûõ È. Þ. 2009. Ðåöåïòîðíûå êàñïàçîçàâèñèìûé è êàñïàçîíåçàâèñèìûé ïóòè àïîïòîçà ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà, èíäóöèðîâàííîãî ÓÔ-èçëó÷åíèåì. Ðàäèàöèîííàÿ áèîëîãèÿ. Ðàäèîýêîëîãèÿ. 49 (4) : 432—437. Âëàäèìèðñêàÿ Å. Á. 2002. Àïîïòîç è åãî ðîëü â ðåãóëÿöèè êëåòî÷íîãî ðàâíîâåñèÿ (ëåêöèÿ). Êëèíè÷åñêàÿ ëàáîðàòîðíàÿ äèàãíîñòèêà. 11 : 25—33. 66 Â. Ã. Àðòþõîâ, Ì. Ñ. Òðóáèöûíà è äð. Äóäíèê Ë. Á., Öþïêî À. Í., Õðåíîâ À. Â., Àëåñåíêî À. Â. 2001. Âëèÿíèå áèëèðóáèíà íà ïåðîêñèäíîå îêèñëåíèå ëèïèäîâ, àêòèâíîñòü ñôèíãîìèåëèíàçû è àïîïòîç, èíäóöèðîâàííûé ñôèíãîçèíîì è ÓÔ-îáëó÷åíèåì. Áèîõèìèÿ. 66 (9) : 1252—1262. Ëîíñêàÿ È. À., Àôàíàñüåâ Â. Í., Ïå÷àòíèêîâ Â. À. 1997. Èíäóêöèÿ è ïîäàâëåíèå àïîïòîçà â òèìîöèòàõ êðûñû óëüòðàôèîëåòîâûì îáëó÷åíèåì. Áèîôèçèêà. 42 (3) : 680—685. Ìåíüùèêîâà Å. Á., Çåíêîâ Í. Ê. 1997. Îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ ïðè âîñïàëåíèè. Óñïåõè ñîâðåì. áèîë. 117 (2) : 155—157. Ìèðîíîâ À. Ô. 1996. Ôîòîäèíàìè÷åñêàÿ òåðàïèÿ ðàêà — íîâûé ýôôåêòèâíûé ìåòîä äèàãíîñòèêè è ëå÷åíèÿ çëîêà÷åñòâåííûõ îïóõîëåé. Ñîðîñ. îáðàçîâàò. æóðí. 2 (8) : 32—40. Ïëåòþøêèíà Î. Þ., Ôåòèñîâà Å. Ê., Ëÿìçàåâ Ê. Ã., Èâàíîâà Î. Þ., Äîìíèíà Ë. Â., Âûñîêèõ Ì. Þ., Ïóñòîâèäêî À. Â., Àëåêñååâñêèé À. Â., Àëåêñååâñêèé Ä. À., Âàñèëüåâ Þ. Ì. 2006. Ïåðîêñèä âîäîðîäà, îáðàçóåìûé âíóòðè ìèòîõîíäðèé, ó÷àñòâóåò â ïåðåäà÷å àïîïòîçíîãî ñèãíàëà îò êëåòêè ê êëåòêå. Áèîõèìèÿ. 71 (1) : 75—84. Ðâà÷åâ Â. Ï. 1966. Ââåäåíèå â áèîôèçè÷åñêóþ ôîòîìåòðèþ. Ëüâîâ: ËÃÓ. 378 ñ. Ñèðîòà Í. Ï., Êóçíåöîâà Å. À. 2008. Óðîâåíü ñïîíòàííûõ ïîâðåæäåíèé ÄÍÊ â ëåéêîöèòàõ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ëþäåé ðàçíîãî âîçðàñòà. Áþë. ýêñïåðèì. áèîë. è ìåäèöèí. 145 (2) : 154—156. Ñêóëà÷åâ Â. Ï. 2001. ßâëåíèÿ çàïðîãðàììèðîâàííîé ñìåðòè. Ìèòîõîíäðèè, êëåòêè è îðãàíû: ðîëü àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà. Ñîðîñ. îáðàçîâàò. æóðí. 7 (6) : 4—10. Òðîíîâ Â. À., Ïåëåâèíà È. È. 1996. Ìåòîä ÄÍÊ-êîìåò èíäèâèäóàëüíûõ êëåòîê. Ïðèíöèï è ïðèìåíåíèå ìåòîäà. Öèòîëîãèÿ. 38 (4/5) : 631—641. Òðîíîâ Â. À., Òåðåùåíêî Ä. Ã., Êîíîïëÿííèêîâ Ì. À. 1998. Ìåõàíèçì ðàäèàöèîííîé ãèáåëè ëèìôîöèòîâ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ÷åëîâåêà, îöåíèâàåìîé ìåòîäîì ÄÍÊ-êîìåò. Áèîôèçèêà. 43 (1) : 115—124. ×óìàêîâ Â. Í., Îñèíñêàÿ Ë. Ô. 1977. Êîëè÷åñòâåííûé ìåòîä îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè öèíê-, ìåäüçàâèñèìîé ñóïåðîêñèääèñìóòàçû â áèîëîãè÷åñêîì ìàòåðèàëå. Âîïð. ìåä. õèìèè. 5 : 712—716. Aragane Y., Kulms D., Metze D., Wilkes G., Poppelmann B., Luger T. A., Schwarz T. 1998. Ultraviolet light induces apoptosis via direct activation of CD95 (Fas/APO—1) independently of its ligand CD95L. J. Cell Biol. 140 : 171—182. Attardi L. D., Reczek E. E., Cosmas C., Demicco E. G., McCurrach M. E., Lowe S. W., Jacks T. 2000. PERP, an apoptosis-associated target of p53, is a novel member of the PMP-22/gas3 family. Genes Develop. 14 : 704—718. Bourdon J. C., Renzing J., Robertson P. L., Fernandes K. N., Lane D. P. 2002. Scotin, a novel p53-inducible proapoptotic protein located in the ER and the nuclear membrane. J. Cell Biol. 158 : 235—246. Caricchio R., Reap E. A., Cohen P. L. 1998. Fas/Fas ligand interactions are involved in ultraviolet-B-induced human lymphocyte apoptosis. J. Immunol. 161 : 241—251. Collins A. R., Ma A. G., Duthie S. J. 1995. The kinetics of repair of oxidative DNA damage (strand breaks and oxidised pyrimidine) in human cells. Mutat. Res. 336 : 69—77. Curnutte J. T., Babior B. M. 1974. Biological defense mechanisms. The effect of bacteria and serum on superoxide production by granulocytes. J. Clin. Invest. 53 : 1662—1672. Fiscella M., Zhang H., Fan S., Sakaguchi K., Shen S., Mercer W. E., Vande Woude G. F., O’Connor P. M., Appella E. 1997. Wip1, a novel human protein phosphatase that is induced in response to ionizing radiation in a p53-dependent manner. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94 : 6048—6053. Fortin A., Cregan S. P., MacLaurin J. G., Kushwaha N., Hickman E. S., Thompson C. S., Hakim A., Albert P. R., Cecconi F., Helin K., Park D. S., Slack R. S. 2001. APAF1 is a key transcriptional target for p53 in the regulation of neuronal cell death. J. Cell Biol. 155 : 207—216. Goldstein S., Czapski G. 1984. Mannitol as an OH• scavenger in aqueous solutions and in biological systems. Int. J. Radiat. Biol. 46 : 725—729. Gottlieb T. M., Oren M. 1998. P53 and apoptosis. Semin. Cancer Biol. 8 : 359—368. Hartmann A., Agurell E., Beevers C., Brendler-Schwaab S., Burlinson B., Clay P., Collins A., Smith A., Speit G., Thybaud V., Tice R. R. 2003. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. Mutagenesis. 18 : 45—51. Hwang P. M., Bunz F., Yu J., Rago C., Chan T. A., Murphy M. P., Kelso G. F., Smith R. A., Kinzler K. W., Vogelstein B. 2001. Ferredoxin reductase affects p53-dependent, 5-fluorouracil-induced apoptosis in colorectal cancer cells. Nat. Med. 7 : 1111—1117. Kulms D., Schwarz T. 2000. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 16 : 195—201. Lin Y., Ma W., Benchimol S. 2000. Pidd, a new death-domain-containing protein, is induced by p53 and promotes apoptosis. Nat. Genet. 26 : 122—127. Martin S. J., Gotter T. G. 1991. Ultraviolet B irradiation of human leukaemia HL-60 cells in vitro induces apoptosis. Int. J. Radiat. Biol. 59 : 1001—1016. Miyashita T., Reed J. C. 1995. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell. 80 : 293—299. Moroni M. C., Hickman E. S., Lazzerini Denchi E., Caprara G., Colli E., Cecconi F., Muller H., Helin K. 2001. Apaf-1 is a transcriptional target for E2F and p53. Nat. Cell Biol. 3 : 552— 558. Murahashi H., Azuma H., Zamzami N., Furuya K., Ikebuchi K., Yamaguchi M., Yamada Y., Sato N., Fujihara M., Kroemer G., Ikeda H. 2003. Possible contribution of apoptosis-inducing factor (AIF) and reactive oxygen species (ROS) to UVB-induced caspase-independent cell death in the T cell line Jurkat. J. Leukocyte Biol. 73 : 399—406. Nakamura Y. 2004. Isolation of p53-target genes and their functional analysis. Cancer Sci. 95 : 7—11. Nakano K., Vousden K. H. 2001. Puma, a novel proapoptotic gene, is induced by p53. Mol. Cell. 7 : 683—694. Neil W. Boyce, Stephen R. Holdsworth. 1986. Hydroxyl radical mediation of immune renal injury by desferrioxamine. Kidney Int. 30: 813—817. Oda E., Ohki R., Murasawa H., Nemoto J., Shibue T., Yamashita T., Tokino T., Taniguchi T., Tanaka N. 2000a. Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. Science. 288 : 1053—1058. Oda K., Arakawa H., Tanaka T., Matsuda K., Tanikawa C., Mori T., Nishimori H., Tamai K., Tokino T., Nakamura Y., Taya Y. 2000b. p53AIP1, a potential mediator of p53-dependent apoptosis, and its regulation by Ser-46-phosphorylated p53. Cell. 102 : 849— 862. Olive P. L., Banath J. P., Durand R. E. 1990. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells mesured using the «comet» assay. Radiat. Res. 122 : 86—94. Ostling O., Johanson K. J. 1984. Microelectrophorettic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 : 291—298. Owen-Schaub L. B., Zhang W., Cusack J. C., Angelo L. S., Santee S. M., Fujiwara T., Roth J. A., Deisseroth A. B., Zhang W. W., Kruzel E., Radinsky R. 1995. Wild-type human p53 and a temperature-sensitive mutant induce Fas/APO-1 expression. Mol. Cell. Biol. 15 (6) : 3032—3040. Ozawa Â. M., Ferenczi K., Kikuchi T., Cardinale I., Austin L. M., Coven T. R., Burack L. H., Krueger J. G. 1999. 312-nanometer ultraviolet B light (narrow-band UVB) induces apoptosis of T cells within psoriatic lesions. Exp. Med. 189 : 711— 718. Polyak K., Xia Y., Zweier J. L., Kinzler K. W., Vogelstein B. 1997. A model for p53-induced apoptosis. Nature. 389 : 300— 305. Robles A. I., Bemmels N. A., Foraker A. B., Harris C. C. 2001. APAF-1 is a transcriptional target of p53 in DNA damage-induced apoptosis. Cancer Res. 61 : 6660—6664. Ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà â äèíàìèêå ðàçâèòèÿ àïîïòîçà Roos D. 1980. The metabolic response to phagocytosis. In: The cell biology of inflammation. Amsterdam: Elsevier. 2 : 337—385. Servomaa K., Rytomaa T. 1990. UV light and ionizing radiations cause programmed death of rat chlorleukemia cells by inducing retropositions of a mobile DNA element (L1Rn). Int. J. Radiat. Biol. 57 : 331—343. Singh N. P., McCoy M. T., Tice R. R., Schneider E. L. 1988. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 : 184—191. Steinbeck M. J., Khan A. U., Karnovsky M. J. 1992. Intracellular singlet oxygen generation by phagocytosing neutrophils in response to particles coated with a chemical trap. J. Biol. Chem. 267 : 13 425—13 433. 67 Vousden K. H. 2000. p53. Death star. Cell. 103 : 691—694. Vousden K. H., Lu X. 2002. Live or let die: the cell’s response to p53. Nat. Rev. Cancer. 2 : 594—604. Wu G. S., Burns T. F., McDonald E. R., 3rd, Jiang W., Meng R., Krantz I. D., Kao G., Gan D. D., Zhou J. Y., Muschel R., Hamilton S. R., Spinner N. B., Markowitz S., Wu G., el-Deiry W. S. 1997. KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene. Nat. Genet. 17 : 141—143. Yu J., Zhang L., Hwang P. M., Kinzler K. W., Vogelstein B. 2001. PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells. Mol. Cell. 7 : 673—682. Ïîñòóïèëà 30 VII 2009 FRAGMENTATION OF DNA LYMPHOCYTES THE HUMAN IN DYNAMICS OF DEVELOPMENT APOPTOSIS, INDUCED INFLUENCE OF UV-RADIATION AND REACTIVE OXYGEN SPECIES V. G. Artyukhov,1 M. S. Trubicina, M. A. Nakvasina, E. V. Solovjeva Voronezh State University; 1 e-mail: avg@main.vsu.ru It is established that UV-light (240—390 nm) in doses of 151, 1510 and 3020 J/m2 and reactive oxygen species and singlet oxygen induce DNA fragmentation lymphocytes cells of the human 20 h after influence. Using a method of DNA-comets it is revealed that DNA damages (single strand breaks) are found out right after UV-irradiations of lymphocytes in doses of 1510 and 3020 J/m2 and additions hydrogen peroxide in concentration of 10–6 mol/l (a comet of type C1) and reach a maximum through 6 h after influence on of cells UV-light and ROS (comets of types C2 and C3). Assumption about the leading part of a p53-dependent way in realization apoptosis human lymphocytes in the conditions of influence of UV-light and reactive oxygen species is put forward. K e y w o r d s: lymphocytes, DNA-comets, apoptosis, UV-light, reactive oxygen species.
