1 001146 2 Настоящее изобретение относится в целом

1
Настоящее изобретение относится в целом
к фармацевтическим композициям, содержащим
пептиды, которые обладают ангиостатическими
свойствами, и более конкретно, к фармацевтическим композициям триптофансодержащих
дипептидов и способам их применения.
Неоваскуляризация, образование новых
сосудов, происходит в раннем эмбриогенезе,
при заживлении ран, восстановлении тканей и,
возможно, в ходе нормального функционирования сосудистой системы.
Процессы, вовлеченные в неоваскуляризацию, включают активацию эндотелиальных клеток и перицитов; деградацию базальной мембраны; миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и перицитов; oбразование просвета нового сосуда; появление перицитов вокруг новых сосудов; образование новой базальной мембраны; образование капиллярной петли;
сочетание инволюции с дифференцировкой новых сосудов; образование сети капилляров и,
наконец, формирование сети более крупных
сосудов.
Известно, что отдельные цитокины, включая интерлейкин-2 (IL-2), трансформирующий
ростовой фактор бета (TGF-бета), интерферон
альфа (IFN-альфа) и тромбоцитарный фактор 4
(PF-4) подавляют неоваскуляризацию. Однако
клниническое применение цитокинов оказалось
проблематичным из-за токсичности некоторых
из этих соединений.
Имеется ряд патологических состояний, в
которых ангиогенез играет прямую роль или же
участвует в развитии последствий первичного
заболевания. К ним относятся, например, неоваскуляризация в опухолях; образование гемангиом; неоваскуляризация, связанная с различными
заболеваниями печени; ангиогенная дисфункция, обусловленная избытком гормонов; неоваскулярные последствия диабета; неоваскулярные последствия гипертонии; неоваскуляризация, происходящая после инсульта; неоваскуляризация после травмы головы; неоваскуляризация при хронической инфекции печени; рестеноз в результате ангиопластики; неоваскуляризация после тепловой или холодовой травмы.
При том, что ангиогенез несомненно требуется для поддержания здоровой сосудистой
системы, практическая медицина не может не
оценить доступность нетоксичных способов
временного подавления неоваскуляризации, т.е.
индукции временного ангиостаза.
Краткое описание изобретения
Известно, что L-Glu-L-Тrр стимулирует
образование иммунных клеток и нормализует
их численные соотношения при различных иммунодефицитных состояниях. (См., например,
WO 89/06134, WO 92/17191 и WO 93/08815).
Однако было показано, что этот дипептид обладает также ангиостатической активностью, независимой от его эффектов при иммунодефицитах. Результаты исследований in vitro показы-
001146
2
вают, что небольшие количества дипептида LGlu-L-Trp ингибируют неоваскуляризацию хориоаллантоисных мембран куриных эмбрионов.
Исследования на животных показали, что L-GluL-Trp подавляет неоваскуляризацию опухоли
легких Льюиса при внутрикожном введении
мышам C57BL/6 и подавляет рост Саркомы 180
у мышей Свисс-Уэбстер.
Соответственно, настоящее изобретение
относится к способам лечения человека, страдающего от заболевания, в патогенезе которого
существенную роль играет неоваскуляризация,
включающим введение фармацевтического препарата, содержащего дипептид R'-Glu-Trp-R" и
фармацевтически приемлемый носитель, в количестве, эффективно подавляющем неоваскуляризацию. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения заявлено применение
дипептида R'-Glu-Trp-R" с целью получения
медикамента, предназначенного для лечения
индивидуума, страдающего от патологического
состояния, в развитии которого существенную
роль играет неоваскуляризация.
В частности, согласно настоящему изобретению, заявлены способы лечения больных,
страдающих от следующих патологических состояний, в развитие которых вовлечена неоваскуляризация: гемангиом; васкуляризированных
злокачественных и доброкачественных опухолей, включая опухоли мозговых оболочек, интрацеребральные опухоли, саркомы, остеосаркомы, опухоли мягких тканей пищевода и трахеи; неоваскуляризации печени, вызванной определенными веществами, включая вторичную
неоваскуляризацию после употребления лекарств, алкоголя и наркотиков; ангиогенной
дисфункции, связанной с избытком гормонов,
например, эстрогена; неоваскулярных последствий диабета, таких как центральная серозная
хориоретинопатия; неоваскулярных последствий гипертонии; неоваскуляризации, происходящей после инсульта; неоваскуляризации после травмы головы; неоваскуляризации при
хронической инфекции печени (например, хроническом гепатите); рестеноза в результате ангиопластики; неоваскуляризации после тепловой или холодовой травмы, например, ожога
или обморожения. Дипептид проявляет активность при введении как пациентам со здоровой
иммунной системой, так и пациентам с различными иммунными нарушениями.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению, заявлены фармацевтические препараты Glu-Тrр,
включающие дипептид R'-Glu-Trp-R" и фармацевтически приемлемый носитель. Под дипептидом R'-Glu-Trp-R" понимается дипептид LGlu-L-Trp, его производные и аналоги.
Производные дипептида R'-Glu-Trp-R"
включают такие производные, в которых дипептид модифицирован ковалентным присоединением радикалов R' и/или R" различной природы.
3
К ним относятся, например, фармацевтически
приемлемые соли дипептида, амиды, имиды,
эфиры, ангидриды, сложные эфиры, метил- или
этилалкильные эфиры, алкил, арил или смешанные алкил/арил производные при том, что их
молекулярный вес составляет менее 5000 Да или
менее 1000 Да, мультимерные или циклические
варианты дипептида и пептиды, состоящие менее чем из 20 аминокислот или менее чем из 10
аминокислот и включающие glu-trp в свою аминокислотную последовательность. Примерами
могут служить HEW, EWEW, GEW, EWKHG,
EWKKHG, EW-NH-NH-GHK-NH2, Ac-L-Glu-LTrp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, But-EW, RFEWY,
RKEW, KEWY, KEW и pEW.
К аналогам дипептида R'-Glu-Trp-R" относятся те соединения, у которых L-аминокислоты
заменены D-аминокислотами, например, такие
как L-Glu-D-Trp, D-Glu-L-Тrр или D-Glu-D-Тrр,
аналоги триптофана, такие как 5-гидрокситриптамин, 5-гидроксииндолуксусная кислота, и
пирроловые аналоги, у которых азот в пирроловом кольце заменен углеродом.
Наиболее предпочтительным R'-Glu-TrpR" дипептидом является L-Glu-Trp-L. Дипептид
L-Glu-L-Trp также взаимозаменяемо обозначается как "EW" или "EW-дипептид" с употреблением однобуквенного кода для обозначения
первой аминокислоты на амино-конце и последней аминокислоты на карбокси-конце.
Термин "неоваскуляризация" обозначает
образование новых сосудов. Процессы, вовлеченные в неоваскуляризацию, включают активацию эндотелиальных клеток и перицитов;
деградацию базальной мембраны; миграцию и
пролиферацию (т.е. клеточное деление) эндотелиальных клеток и перицитов; образование просвета нового сосуда; появление перицитов вокруг новых сосудов; образование новой базальной мембраны; образование капиллярной петли;
сочетание инволюции с дифференцировкой новых сосудов; образование сети капилляров и,
наконец, формирование более крупных сосудов.
Процесс пролиферации эндотелиальных клеток,
например, в зачатке сосуда, называется ангиогенезом и соотносится с неоваскуляризацией
как с субпроцессом. Репрезентативные клинические проявления заболеваний классифицированы и кодифицированы (см., например, Международную классификацию заболеваний, ICD9-CM, Washington, D.C. 1989). Лабораторными
показателями неоваскуляризации служат данные, полученные на основе ангиограмм, САТсканограмм и сонограмм, так же, как и в результате визуального обследования при эндоскопических и/или капилляроскопических процедурах.
Термины "ангиостаз", "ангиостатический"
и "подавление неоваскуляризации" обозначают
ту величину или степень неоваскуляризации в
ткани, на которую она понизилась после соот-
001146
4
ветствующего воздействия по сравнению с состоянием до воздействия.
Ангиостаз диагностируют с помощью перечисленных выше клинических и лабораторных показателей. При ангиостазе может происходить подавление одного или более субпроцессов, вовлеченных в неоваскуляризацию, например, пролиферации или миграции эндотелиальных или гладкомышечных клеток сосудов.
Термин "патологическое состояние с участием неоваскуляризации" относится к патологическому состоянию, компонентом которого
является неоваскуляризация или риск ее развития. К таким состояниям относятся (без ограничений указанными) патологии, при которых
неоваскуляризация является первичной патологией, например, гемангиомы; патологии, при
которых неоваскуляризация не является первичной патологией, но вносит в нее существенный вклад, например, неоваскуляризация опухолей; патологии, при которых неоваскуляризация является следствием первичного заболевания, например, центральная серозная ретинопатия при диабете.
Термин "индивидуум" относится к млекопитающим, включая человека и других приматов, домашним и сельскохозяйственным животным, пушным зверям, собакам, кошкам, грызунам, птицам, лошадям, коровам, свиньям, рыбам
и другим животным.
Термин "иммунодефицитный" относится к
индивидууму, имеющему уменьшенное количество одного или более типов иммунных клеток,
таких как NK-клетки, Т4 или Т8 Т-лимфоциты,
В-лимфоциты или фагоциты, при определении
стандартными диагностическими методами. К
иммунодефицитным также относятся индивидуумы со сниженной функцией иммунных клеток, что оценивается по таким стандартным
функциональным тестам, как продукция иммуноглобулинов, хемотаксис, реакция смешанных
лейкоцитов или тест на задержанную гиперчувствительность. Иммунодефицитные индивидуумы часто подвержены необычным или неожиданным оппортунистическим инфекциям.
"Полипептид" означает упорядоченную
последовательность аминокислот длиной от 16
аминокислот до нескольких сот аминокислот,
например, белок.
Термин "ненормальный" относится к какому-либо лабораторному показателю неоваскуляризации, который выходит за пределы
значений, характерных для здоровых индивидуумов.
Термин "нормализованный" относится к
изменениям лабораторных или клинических
показателей неоваскуляризации, которые после
лечения возвращаются в пределы значений, характерные для здоровых индивидуумов. Индивидуум без выявленных дефектов сосудов, а
также без известных нарушений систем коагу-
5
ляции и фибринолиза считается "здоровым индивидуумом".
Термины "модулятор" и "модулирующий"
относятся к агенту и процессу снижения неоваскуляризации или ангиогенеза у здорового индивидуума или у индивидуума, подвергающегося риску какого-либо заболевания.
Под лечением с помощью R'-Glu-Trp-R"
понимается способ доставки индивидууму фармацевтического препарата R'-Glu-Trp-R" с целью индукции снижения скорости или степени
неоваскуляризации или ангиогенеза.
В одном из предпочтительных вариантов
осуществления изобретения фармацевтический
препарат R'-Glu-Trp-R" вводят раковому больному в таком количестве и в такие сроки, которые необходимы для снижения одного или нескольких клинических или лабораторных показателей неоваскуляризации или ангиогенеза, что
приводит к улучшению клинического состояния
пациента. Подобный способ снижает неоваскуляризацию опухоли, уменьшает ее снабжение
кровью и, поэтому, подавляет рост опухоли.
Согласно предпочтительному варианту
осуществления заявленного изобретения, схема
лечения предусматривает введение индивидууму дозы от 0,5 мкг до 1 мг на кг веса тела ежедневно в течение периода от 1-го до 30-ти дней.
Предпочтительно ежедневно вводить единичную дозу R'-Glu-Trp-R" фармацевтического
препарата внутримышечно или интраназально.
Препарат готовят в виде стерильного раствора
для инъекций, раствора для ингаляций или раствора для орошения слизистых оболочек, содержащего от 0,001% до 0,01% R'-Glu-Trp-R"
фармацевтического препарата.
Альтернативно, фармацевтический препарат R'-Glu-Trp-R" может быть введен, предпочтительно в единичной дозе, например, в таблетки, суппозитории, капсулы, глазные пленки, а
также в пасты и мази, например, в зубную пасту, кожную мазь или крем на водной основе.
Наиболее предпочтительной разовой дозировкой фармацевтического препарата R'-Glu-Trp-R"
является доза в 0,01 мг.
Заявленные согласно настоящему изобретению способы находят все более широкое профилактическое и терапевтическое применение
при патофизиологических состояниях человека
и домашних животных. Они могут применяться
для поддержания культур эндотелиальных клеток и сосудистых тканевых культур in vitro, что
имеет место при аутологичной и аллогенной
трансплантации. Заявленные способы предусматривают поддержание культур эндотелиальных клеток и сосудистых тканевых культур в
культуральной среде, содержащей соединение
R'-Glu-Trp-R". Такой способ поддержания имеет
преимущества для сохранения сосудистых тканей и снижает воспалительные изменения, обусловленные травмой тканей при хирургическом
удалении и хранении тканевой культуры.
001146
6
При профилактической схеме применения
заявленные согласно настоящему изобретению
соединения вводят восприимчивому больному
или, что то же самое, больному с риском развития неоваскуляризации, например, для предотвращения неоваскуляризации после хирургического удаления опухоли и снижения риска ее
вторичного роста. Понятие "профилактически
эффективная доза" относится к такому количеству препарата, которое достаточно для получения ангиостатического эффекта в некотором
локусе ткани. При этом данное количество зависит от состояния здоровья пациента и его веса,
но, в целом, укладывается в тот интервал доз,
который применяется для терапии. Профилактическое введение может быть особенно желательно для пациентов, у которых неоваскуляризация или ангиогенез могут развиться как осложнение основного заболевания, например, в
случае диабетической ретинопатии.
В объем изобретения включены терапевтические схемы, согласно которым R'-Glu-TrpR" фармацевтический препарат вводят сам по
себе или в комбинации со вторым фармацевтическим агентом, т.е. проводят "сочетанную терапию". Примером такой терапии может служить применение R'-Glu-Trp-R" композиции
вместе с одним или более антибиотиком, противовоспалительным агентом или химиотерапевтическими соединениями. Заявленные композиции могут вводиться как в сочетании со вторыми лечебными средствами, так и раздельно, т.е.
в различное время или в различных шприцах
или таблетках. Часто при комбинированной терапии R'-Glu-Trp-R" вводят вместе с противовоспалительными агентами, антигистаминными
препаратами или химиотерапевтическими соединениями. Сочетаемые с R'-Glu-Trp-R" терапевтические препараты могут включать, например, противовоспалительные агенты, хорошо
известные из уровня техники.
Иллюстративная сочетанная терапия на
основе R'-Glu-Trp-R" может предусматривать и
введение вазоактивного препарата в качестве
второго агента. К таким вазоактивным препаратам относятся ингибиторы ангиотензин конвертирующего фермента (АСЕ), открыватели кальциевых каналов (РСО) и подобные им препараты.
Иллюстративная сочетанная терапия опухолей при помощи R'-Glu-Trp-R" предусматривает введение химиотерапевтического препарата в качестве второго агента. Лечение R'-GluTrp-R" композициями может быть эффективным
для снижения нежелательного побочного эффекта терапии кортикостероидами, например,
неоваскуляризации. Репрезентативные химиотерапевтические агенты хорошо известны из
уровня техники.
Опытные практикующие специалисты
подберут временной график и дозировку препарата, соответствующие клиническим симптомам
7
пациента. Подобные знания накапливаются десятилетиями и обобщаются в периодической
литературе и медицинских учебниках. Выбор
определенного времени начала терапии на основе заявленных способов (сочетанная терапия
или введение единственного агента) полностью
находятся в компетенции врача.
Эмпирическая терапия - это терапия, направленная против наиболее общих или вероятных причинных агентов и основанная на исторической, демографической и эпидемиологической информации. Эмпирическая терапия часто
предусматривает применение множественных
терапевтических агентов, связанных с широким
кругом терапевтических возможностей. Когда
становятся доступны данные лабораторных анализов, выбор терапевтических средств может
стать более конкретным применительно к данному заболеванию. Лечение клинических синдромов очень часто начинается эмпирически.
Новый терапевтический метод должен быть
проверен в отношении определенного клинического синдрома.
При разработке фармацевтических препаратов доклинические испытания какого-либо
терапевтического метода позволяют оценить
эффекты данной терапии применительно к ряду
заболеваний, представляющих интерес. Результаты (иногда неоднозначные) различных исследований тщательно взвешивают для определения положительных сторон и нежелательных
последствий конкретного терапевтического
подхода, что дает медицинские знания о степени риска, сопряженного с данным заболеванием.
Очевидно, что не все пациенты с определенным синдромом будут вылечены при использовании какого-либо одного терапевтического подхода, но, определенно, могут существовать группы больных, для которых такая терапия даст положительный и предпочтительный
результат. Примеры клинических синдромов,
при которых определенные группы больных
могут получить положительный эффект от применения заявленных терапевтических способов,
описаны в нескольких последующих разделах.
Заявленные согласно данному изобретению фармацевтические композиции предназначены для парентерального, поверхностного,
подкожного, внутримышечного, внутриоболочечного, орального, интраназального, интраперитонеального или местного (например, в составе кожного крема) применения с целью профилактики и/или терапии. Предпочтительно
вводить заявленные в настоящем изобретении
композиции парентерально, внутримышечно
или интраназально. Заявленные R'-Glu-Trp-R"
композиции обладают тем преимуществом, что
желаемые эффекты достигаются при очень низких дозах и без наблюдаемой токсичности. Так,
для терапии в острых случаях может потребоваться быстрое повышение концентрации R'-
001146
8
Glu-Trp-R" в ткани, что достижимо, например,
болюсным внутривенным введением или вливанием. В других случаях, напротив, может оказаться желательной доставка R'-Glu-Trp-R" в
течение продолжительного периода времени.
Заявленные композиции, содержащие R'Glu-Trp-R", могут быть приготовлены таким
образом, чтобы достигалось их попадание в
кровоток. Подобные композиции включают васкулярные модуляторы, индуцирующие изменения на клеточном уровне, которые, в свою очередь, вызывают такие изменения клеточных
процессов, которые более не зависят от присутствия композиции. Отмечено, что генерируемые
пептидом эффекты могут быть весьма продолжительными, длиться недели и месяцы, несмотря на относительно быструю деградацию пептида (5 мин). При том, что заявленные R'-Glu-TrpR" соединения водорастворимы в тех низких
концентрациях, в которых они обычно используются, предпочтительно применять их в виде
кислых или щелочных солей, образованных
фармацевтически приемлемыми агентами, например, уксусной, лимонной, малеиновой, янтарной кислотами, натрием, калием, аммонием
или цинком. Легкорастворимые соли заявленных R'-Glu-Trp-R" композиций могут превращаться в жидкостях организма в малорастворимые соли, что достигается, например, модификацией фармацевтически приемлемой малорастворимой солью, например, танниновой или
пальмовой кислоты, путем ковалентного связывания более крупным носителем или заключением в капсулу, обеспечивающую продолжительное высвобождение препарата, и т.д.
Заявленные R'-Glu-Тrр-R" фармацевтические препараты могут использоваться как свободные пептиды или в форме водорастворимых
фармацевтически приемлемых солей, таких как
соли натрия, калия, аммония или цинка. Понятно, что заявленные дипептиды могут вводиться
вместе с другими активными ингредиентами,
которые будут вносить независимый вклад в
активность препарата. Фармацевтически приемлемые соли могут быть легко получены из R'Glu-Trp-R" дипептида (или его агониста) обычными методами.
Так, например, подобные соли можно получить обработкой R'-Glu-Trp-R" дипептида
водным раствором нужного фармацевтически
приемлемого гидроксида металла или другого
основания металла с последующим упариванием полученного раствора досуха, предпочтительно при пониженном давлении в атмосфере
азота. Альтернативно, раствор R'-Glu-Trp-R"
дипептида можно смешать с алкоксидом нужного металла и затем упарить полученный раствор. Фармацевтически приемлемые гидроксиды, основания и алкоксиды включают (но не
ограничиваются перечисленными) такие, в которых катионы представляют собой натрий,
калий, аммоний, кальций и магний. К другим
9
фармацевтически приемлемым солям относится
гидрохлорид, гидробромид, сульфат, бисульфат,
ацетат, оксалат, валарат, олеат, лаурат, борат,
бензоат, лактат, фосфат, тосулат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат и подобные им.
Для парентерального введения, согласно
настоящему изобретению, заявлены фармацевтические препараты, которые представляют собой раствор R'-Glu-Trp-R" дипептида или его
полимерных, мультимерных или циклических
форм или их производных, растворенных в
фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно водном. Могут использоваться
различные водные носители, например вода,
забуференная вода, 0,4% физраствор, 0,3% глицин и другие подобные носители, содержащие
белки и/или гликопротеины, для увеличения
стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин и сходные с ними соединения.
Данные композиции могут быть простерилизованы обычными хорошо известными способами.
Полученные водные растворы могут быть расфасованы для непосредственного использования
или профильтрованы в асептических условиях и
лиофилизированы. Лиофилизованные препараты перед введением смешивают со стерильным
водным раствором. Композиции могут содержать дополнительные фармацевтически приемлемые вещества, необходимые для поддержания
их определенного физиологического состояния,
например, соединения, доводящие рН, сохраняющие буферную емкость или осмотическое
давление, скажем, гидроацетат натрия, лактат
натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид
кальция и т.д. Для увеличения срока хранения и
продления срока фармакокинетической полужизни препарата может оказаться желательной
стабилизация R'-Glu-Trp-R" дипептидов, аналогов, производных, агонистов. Увеличение срока
хранения достигается добавлением таких нейтральных агентов как а) гидрофобные агенты
(например, глицерин); б) сахаров (например,
сахарозы, маннозы, сорбитола, рамнозы, ксилозы); в) сложных углеводов (например, лактозы);
и/или г) бактериостатических агентов. Срок
фармакокинетической полужизни пептидов модифицируют за счет соединения их с пептидами-носителями, полипептидами или углеводородами химическим путем (например, присоединением боковой цепи по N- или Стерминальным остаткам) или заменяя одну аминокислоту на другую аминокислоту (см. выше).
Срок фармакокинетической полужизни и фармакодинамика могут быть также модифицированы
а) инкапсулированием (например, в липосомы);
б) изменением степени гидратации (например, изменением степени и типа гликозилирования пептида); и
в) изменением электростатического заряда
и гидрофобности пептида.
001146
10
Заявленные согласно настоящему изобретению композиции, содержащие дипептид R'Glu-Trp-R", могут применяться в форме, приемлемой для парентерального введения (например,
внутривенного, подкожного, внутримышечного). Данные препараты могут подвергаться
обычным фармацевтическим процедурам, таким
как стерилизация, могут содержать адъюванты,
например, стабилизаторы, увлажняющие агенты, консерванты и т.п.
Содержащие дипептид R'-Glu-Trp-R" композиции обычно биологически активны в дозе
от 0,5 мкг/кг до 1 мг/кг, предпочтительно от 1
до 50 мкг/кг. Концентрация R'-Glu-Trp-R" дипептидов в фармацевтических композициях может варьировать, например, от 0,001 до 15-20
вес.% и определяться прежде всего объемом
жидкости, вязкостью и т.п. в соответствии с
конкретными целями лечения и способом введения пациенту. При внутримышечном применении в виде раствора для инъекций активный
ингредиент присутствует в количестве, необходимом для эффективного подавления неоваскуляризации, например, от 0,001 до 0,01 вес.% R'Glu-Trp-R". При применении в форме таблетки,
капсулы или суппозитория желательно, чтобы
активный ингредиент присутствовал в количестве около 0,1 мг R'-Glu-Trp-R" на таблетку,
суппозиторий или капсулу. В этом случае капсула, суппозиторий или таблетка может содержать и другие приемлемые разбавители и носители, такие как наполнители, крахмал, глюкоза
и т.д. Фармацевтически приемлемым носителем
для инъекционной формы может служить любой фармацевтически приемлемый растворитель, такой как 0,9% водный хлорид натрия,
дистиллированная вода, раствор новокаина, раствор Рингера, раствор глюкозы и др. В препаратах для поверхностного применения R'-Glu-TrpR" дипептиды обычно входят в состав смягчающих средств на основе мочевины, мазей на
основе нефти и др. в концентрациях от 0,1 до
10,000 частей на миллион, предпочтительно от 1
до 1000 частей на миллион и еще более предпочтительно от 10 до 100 частей на миллион.
Способы получения соединений, предназначенных для парентерального, орального или наружного применения, подробно описаны, например, в руководстве Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company,
Easton, PA (1985).
Для введения заявленных R'-Glu-Trp-R"
композиций
предпочтительными
являются
внутримышечный и интраназальный способы.
Предпочтительная дозировка заявленных
композиций для внутримышечного введения
составляет от 50 до 100 мкг R'-Glu-Trp-R" на
дозу для взрослых (от 300 до 1000 мкг на весь
курс лечения); для детей до 1 года около 10 мкг
на дозу, для детей 1-3 лет от 10 до 20 мкг на
дозу; для детей 4-6 лет от 20 до 30 мкг на дозу,
для детей 7-14 лет около 50 мкг на дозу. Все
11
указанные дозировки приемлемы для лечения на
протяжении 3-10 дней, в зависимости от потребностей конкретного пациента. При необходимости лечение может быть повторено, обычно через 1-6 месяцев.
В одном из предпочтительных вариантов
осуществления изобретения фармацевтический
препарат R'-Glu-Trp-R" в дозах от 10 мкг/кг до 1
мг/кг вводят пациенту ежедневно в течение 6-10
дней, но по назначению лечащего врача курс
может быть продлен до 30 дней. Согласно одному из предпочтительных курсов терапии, R'Glu-Trp-R" вводят внутримышечно ежедневно в
дозе 1-100 мкг/кг в течение 5-7 дней, за которыми следует перерыв на 1-6 месяцев, а затем повторяют аналогичный курс лечения.
Содержащие R'-Glu-Trp-R" композиции
могут вводиться сами по себе или вместе с фармацевтически приемлемыми носителями как в
единичной, так и в множественных дозах. Фармацевтически приемлемые носители включают
инертные твердые разбавители или наполнители, стерильные водные растворы и различные
нетоксичные органические растворители. Фармацевтические композиции могут включать R'Glu-Trp-R" дипептид в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или антибиотиком. Заявленные комбинации терапевтических
агентов вводят в различных дозировках в виде
таблеток, пластинок, сиропов, растворов для
инъекций и т.д. Комбинация терапевтических
агентов может так же включать R'-Glu-Trp-R"
дипептид, например, L-Glu-L-Trp, в одной и той
же лекарственной форме. Фармацевтические
носители могут при необходимости содержать
дополнительные компоненты, такие как отдушки, вкусовые добавки, связующие вещества,
разбавители и т.д.
Так, для орального применения таблетки
могут содержать различные наполнители, такие
как цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат
кальция, в сочетании с такими разрыхлителями,
как крахмал, предпочтительно картофельный
или тапиоковый, альгининовая кислота, и некоторые сложные силикаты вместе с такими связующими агентами, как поливинилпирролидон,
сахароза, желатин или гуммиарабик. Для таблетирования часто используют и такие смазывающие агенты, как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. Аналогичные твердые
композиции могут использоваться как наполнители для желатиновых капсул. Предпочтительными материалами для этих целей служат лактоза, или молочный сахар, и высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Когда водные суспензии предназначены для перорального введения,
входящий в ее состав активный ингредиент, R'Glu-Trp-R" дипептид, может быть смешан с различными подсластителями или вкусовыми добавками, пищевыми красителями. При необходимости в состав указанных препаратов могут
входить эмульгаторы или суспендирующие
001146
12
агенты, а также растворители: вода, этанол,
пропиленгликоль, глицерин или их комбинации.
Для парентерального введения могут применяться растворы R'-Glu-Trp-R" в кунжутном
или арахисовом масле или в водном пропиленгликоле, а также стерильные растворы фармацевтически приемлемых солей металлов, упоминавшихся выше. Данные водные растворы
должны быть соответствующим образом забуферены, а жидкий растворитель должен быть
изотоничен, что достигается добавлением соли
или глюкозы. Подобные водные растворы особенно пригодны для внутривенных, внутримышечных, подкожных и внутрибрюшинных инъекций. Используемые водные растворы легко
получить стандартными методами, хорошо известными из уровня техники. Кроме того, возможно местное введение указанных соединений
(например, через катетер) с использованием
соответствующих растворов.
Под "терапевтически эффективной дозой"
понимают то количество препарата, которое
приводит к появлению терапевтического результата более чем у 50% индивидуумов, подвергшихся лечению. Лечение острых состояний
обычно продолжается 3-10 дней. Лечение хронических состояний или профилактическое
применение продолжается те же сроки, но может быть повторено через 1-6 месяцев или позже. В некоторых случаях желательным является
введение композиций с перерывами в период от
2 до 20 дней, предпочтительно от 3 до 14 дней,
более предпочтительно курсом от 4 до 10 дней,
который повторяют, по меньшей мере, через 15
дней, предпочтительно через 20 дней или через
1-6 месяцев или позже.
Способ доставки R'-Glu-Trp-R" композиции определяется заболеванием и тем участком,
в котором желательно получить эффект.
При местном применении необходима доставка R'-Glu-Trp-R" композиций в конкретный
локус (например, иглой в определенный участок
ткани) или, например, наложением пропитанной
(импрегнированной) повязки на место опухоли
после ее хирургического удаления; известен и
ряд показаний для системного применения R'Glu-Trp-R" композиций. При таких показаниях
R'-Glu-Trp-R" композиции и подобные им могут
вводиться внутривенно, интраперитонеально,
внутримышечно, подкожно, интраназально и
внутрикожно; возможны также интрабронхиальное орошение (через распылитель), трансдермальное введение (например, с жирорастворимым носителем через кожный пластырь) или
гастроинтестинальное введение (например, с
капсулой или таблеткой).
В целом, кислые соли заявленных R'-GluTrp-R" композиций, например, L-Glu-L-Lys
композиции с фармацевтически приемлемыми
кислотами будут биологически эквивалентны
собственно заявленным R'-Glu-Trp-R" композициям.
13
Предпочтительные терапевтические композиции, объемы, способы введения и дозировки будут варьировать в зависимости от клинических показаний. Для внутримышечного введения инокулят обычно готовят из лиофилизированного пептида (или конъюгата пептида),
суспендируя пептид в физиологически приемлемом растворителе, таком как вода, физраствор
или фосфатный буферный раствор. Обязательно
будут иметь место вариации в дозировках в зависимости от состояния пациента и, в любом
случае, врач должен определить оптимальную
дозировку для индивидуального больного. Эффективное количество пептида на единичную
дозу зависит среди прочего от веса тела, физиологии и выбранного расписания инъекций. Единичная доза пептида означает вес пептида без
веса носителя (когда он используется). Эффективное лечение достижимо, когда концентрация
R'-Glu-Trp-R" дипептида, например, L-Glu-LLys, в некотором локусе ткани, т.е. в микроокружении клеток достигает от 10-5 до 10-9 М.
Опытный практик может использовать
клинические и лабораторные показатели для
оценки ответа больного на терапию и соответствующим образом корректировать дозировку.
Поскольку фармакокинетика и фармакодинамика R'-Glu-Trp-R" дипептидов, агонистов, антагонистов и им подобных соединений будут отличаться от больного к больному, наиболее предпочтительным способом достижения терапевтической концентрации в ткани является постепенное повышение дозировки с контролем клинических и лабораторных показателей. При подобной ступенчатой схеме терапии начальная
доза будет зависеть от способа введения. При
внутривенном введении дипептид R'-Glu-Trp-R"
с молекулярной массой от 200 до 400 Да вводят
в начальной дозе 0,5 мкг/кг, а затем дозу ступенчато повышают в 10 раз при каждом введении.
При применении в форме таблетки, капсулы или суппозитория желательно, чтобы активный ингредиент присутствовал в количестве
около 0,1 мг R'-Glu-Trp-R" на таблетку, суппозиторий или капсулу. В этом случае капсула,
суппозиторий или таблетка может содержать и
другие приемлемые разбавители и носители,
такие как наполнители, крахмал, глюкоза и т.д.
Обычно заявленный R'-Glu-Trp-R" дипептид синтезируют при использовании одного из
широко распространенных в настоящее время
автоматизированных методов. В целом, данные
методы предусматривают ступенчатый синтез
путем последовательного добавления аминокислот с получением все более крупных молекул.
Аминокислоты соединяют друг с другом
путем конденсации между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой аминокислоты с образованием пептидной
связи. Чтобы контролировать эти реакции необ-
001146
14
ходимо блокировать аминогруппу одной аминокислоты и карбоксильную группу другой. Блокирующие группы должны выбираться с учетом
того, что их удаление не оказывает существенного влияния на пептиды, например, при удалении путем рацемизации или гидролизом образовавшихся пептидных связей. Аминокислоты с
карбоксильными группами (например, Asp, Glu)
или гидроксильными группами (например, Ser,
гомосерин и тирозин) также нуждаются в блокировании перед конденсацией.
Из множества существующих методов
синтеза пептидов обычно предпочитают твердофазный синтез. Согласно данному способу,
аминокислоту связывают с частицей смолы и
синтезируют пептид, последовательно добавляя
защищенные аминокислоты к растущей цепи.
Обычно используют модификации метода, описанного Меррифилдом. При обычном твердофазном методе пептиды синтезируют, связывая
карбокситерминальную аминокислоту с органическим линкером (например, РАМ, 4-оксиметил
фенилацетамидометил), ковалентно прикрепленным к нерастворимым полистироловым частицам, сшитым между собой дивинилбензолом.
Блокирование t-Boc применяют для защиты
терминального амина, а гидроксильные и карбоксильные группы обычно блокируют Oбензильными группами.
Синтез проводят на автоматическом синтезаторе пептидов (Applied Biosystems, Foster City,
CA, Model 430-A). По завершении синтеза продукт может быть отделен от смолы, а также
удалены блокирующие группы гидрофторной
кислотой или трифтор метилсульфоновой кислотой в соответствии с известными методами
(Bergot,B.J. and S.N.McCurdy, Applied Biosystems Bulletin, 1987). В результате обычного синтеза можно получить 0,5 ммоль связанного со
смолой пептида. Выход после снятия с твердой
фазы и очистки обычно составляет от 60 до
70%. Например, производное активированного
эфира Glx, защищенного по аминогруппам и
боковым цепям, реагирует с защищенным по
боковым цепям Тrр, прикрепленным с помощью
С-концевого участка к твердой фазе. После удаления альфа-аминозащитной группы пептид
может быть снят с твердой фазы или же аналогичным образом добавлена другая аминокислота. Дополнительные аминокислоты добавляются
последовательно. Пептиды снимают с твердой
фазы сильной кислотой, которая обычно удаляет и защитные группы.
Пептиды могут быть затем очищены, лиофилизованы и сохранены для дальнейшего использования. Удобные методы синтеза пептидов
подробно описаны Stewart and Young, Solid
Phase Peptide Synthesis, 2d edition, Pierce Chemical Company, 1984; и Tam et al., J.Am.Chem.Soc.,
105:64642 (1983).
Очистку полученных пептидов проводят,
например, кристаллизацией пептида из органи-
15
ческого растворителя (метил-бутиловый эфир) с
последующим растворением в дистиллированной воде и диализом (если молекулярный вес
пептида выше 500), тонкослойной хроматографией, гель-хроматографией, лиофилизацией или
обратной HPLC (например, на колонке С18 с
0,1% трифторуксусной кислотой и ацетонитрилом в качестве растворителей), если молекулярный вес пептида ниже 500. Очищенный пептид
лиофилизируют и хранят в сухом виде до использования. Заявленный R'-Glu-Trp-R" фармацевтический препарат, т.е. очищенный дипептид L-Glu-L-Trp, представляет собой белый порошок (в лиофилизированной форме, в противном случае - это кристаллическое вещество),
растворимый в воде, в DMF, нерастворимый в
хлороформе и эфире. Альфа 22D = +12,6; С =
0,5 Н2О. Rf = 0,65 (бутанол : уксусная кислота :
вода = 3:1:1). UV (275 + (-5) нм). ЯМР (500
МГц) : 0,001 моль/л раствора пептида, Тrр (3.17;
3.37; 4.57; 7.16; 7.24; 7.71; 7.49); Glu (1.90; 1.96;
2.21; 3.72).
Обычно с защищенным L-триптофаном
реагирует активированный эфир глутаминовой
кислоты, защищенный по аминогруппе или боковой цепи. После удаления защитных групп и
соответствующей очистки, например, тонкослойной хроматографией или GL-хроматографией, пептид можно очистить лиофилизацией, гель-хроматографией и другими методами.
Несмотря на отсутствие достоверных знаний о механизме действия, предполагают, что
триптофансодержащие пептиды могут обратимо
связываться со специфическими клеточными
EW-рецепторами на эндотелиальных клетках.
Один из подобных рецепторов был определен
как убиквитарная "CD2"-детерминанта на клеточной поверхности, присутствующая также на
лимфоцитах, эндотелиальных клетках и отдельных эпителиальных клетках. Считается, что связывание дипептида EW с CD2 (и другими EWрецепторами) инициирует конформационные
изменения рецептора, которые в свою очередь
приводят к активации аденилатциклазы и увеличению количества внутриклеточного цАМФ.
Вероятно, что L-Glu-L-Тrр проявляет свое действие, подавляя клеточные механизмы, при помощи которых медиаторы воспаления (TNFальфа и IL-1) запускают активацию и пролиферацию клеток эндотелия и перицитов. Активация приводит к изменениям экспрессии на клеточной поверхности адгезинов, участвующих в
связывании клеток воспаления при васкулите, а
пролиферация вносит свой вклад в неоваскуляризацию. В подавлении посредством L-Glu-LTrp эндотелиальных эффектов, индуцированных
медиаторами воспаления, может участвовать
дефосфорилирование одной или более клеточных тирозинкиназ. Считается вероятным, что
подобная отрицательная регуляция может приводить к изменениям в синтезе и экспрессии на
клеточной поверхности эндотелиальных адгези-
001146
16
нов, селектинов и/или интегринов, например,
ELAM, VCAM и им подобных. Клеточные изменения, индуцированные триптофансодержащими дипептидами, могут привести к снижению способности клеток воспаления (например,
лимфоцитов, нейтрофилов и/или моноцитов)
локализоваться в местах васкулита.
Согласно рекомендациям IUPAC-IUB,
опубликованным в Arch. Biochem. Biophys.
115:1-12, 1966, использованы следующие символы для обозначения аминокислот: L, Leu,
лейцин; V, Val, валин; Y, Туr, тирозин; D, Asp,
аспарагиновая кислота; W, Тrр, триптофан; Р,
Pro, пролин; I, Ileu, изолейцин; G, Gly, глицин;
М, Met, метионин; Е, Glu, глутаминовая кислота; Т, Thr, треонин; К, Lys, лизин; N, Asn, аспарагин; R, Arg, аргинин; Q, Gln, глутамин; A, Ala,
аланин; С. Cys, цистеин; S, Ser, серин; F, Phe,
фенилаланин; Н, His, гистидин; С, Cys, цистеин;
S, Ser, серин.
Следующие примеры приведены для дальнейшего пояснения изобретения. Они ни в какой степени не ограничивают объем и сущность
изобретения.
Пример 1. Отсутствие мутагенности и токсичности у L-Glu-L-Trp: Фармакокинетика и
биораспределение.
Протокол А. Изучение острой токсичности.
При введении L-Glu-L-Trp в дозах, в 10000
раз превышающих предполагаемые терапевтические дозы, данный препарат оказался нетоксичным для мышей, морских свинок, цыплят и
собак, что оценивали по общему состоянию,
поведению, подвижности, показателям сердечной и дыхательной деятельности.
Протокол Б. Изучение хронической токсичности.
Ежедневное внутримышечное или внутривенное введение L-Glu-L-Trp в течение 28 дней
не вызывало каких-либо побочных эффектов.
Мониторинг состояния животных включал
оценку поведения, питания, веса, состояния
кожных покровов, слизистых оболочек, количества красных и белых клеток крови, показатели
сердечной и дыхательной деятельности, функциональные почечные и печеночные тесты. О
функции почек судили по диурезу после водной
нагрузки; в отдельных экспериментах собак и
крыс умерщвляли и исследовали через 10, 20, 30
и 60 дней.
Протокол В. Фармакокинетика и биораспределение: GLP-тест.
Крысам Спраг-Доули интраназально вводили меченный 14С L-Glu-L-Trp (110 мкг/кг).
Через 0,5, 2, 8 или 24 ч брали образцы крови и
тканей и определяли количество интактного LGlu-L-Trp при помощи HPLC. Образцы тканей
включали красные клетки крови, белые клетки
крови, печень, почки, сердце, легкие, тимус,
мозг, мышцы, кожу, жир, глаз, яичники, семенники, подчелюстные лимфатические узлы и же-
17
лудочно-кишечный тракт с содержимым. Введенный интраназально 14C-L-Glu-L-Trp быстро
поглощался
плазмой:
С
mах
0.349
mcg*eq.*hr/14g С. Интактного соединения не
было обнаружено в плазме через 30 мин (определение с чувствительностью в пределах 5-101
нг/мл), что свидетельствует о сроке полужизни
в крови менее 30 мин.
Срок полужизни в тканях был определен
как составляющий 18,7 ч.
Пример 2. Ингибиторные воздействия LGlu-L-Trp в тесте на ангиогенез в хорионаллантоисной мембране.
Восьмидневные куриные эмбрионы удаляли из яиц и помещали в стерильные чашки Петри. Диски из фильтровальной бумаги насыщали
различными исходными растворами L-Glu-LTrp (7,5 мкл) в 0,14М NaCl с тем, чтобы получить конечные концентрации, составляющие
0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100, 500 и 1000 мкг на
диск. Диски подсушивали на воздухе и затем
помещали на поверхность соответствующих
эмбрионов. Васкуляризацию эмбрионов оценивали через 48 ч инкубации при помощи ступенчатой шкалы, приведенной ниже в табл. 1.
Тестируемое
вещество
Физраствор
Гепарин
L-Glu-L-Тrр
ТАЕЕК
001146
18
Таблица 1
Оценка васкуляризации хорион-аллантоисных
оболочек куриного эмбриона
Степень
Процент
Описание
подавления
подавления
0
Нет видимых отличий от
0
отрицательного контроля
1
Слабое подавление
25
образования сосудов
2
Умеренное подавление
50
образования сосудов
3
Почти полное подавление
75
образования сосудов
4
Полное подавление
100
образования сосудов
В данном опыте физраствор служил отрицательным контролем, а гепарин (10 мкг/диск) отрицательным контролем. Пентапептид ТуrAla-Glu-Glu-Lys (ТАЕЕК) использовали в качестве специфического контроля (например, для
определения возможных неспецифических эффектов пептидов на неоваскуляризацию в интервале тестируемых концентраций). Для каждой тестируемой концентрации использовали 912 дисков и соответствующее число эмбрионов.
Для положительного и отрицательного контролей использовали 82 эмбриона в каждом случае.
Результаты исследований суммированы в
табл. 2.
Таблица 2
Результаты теста в хорион-аллантоисных мембранах куриных эмбрионов
Кол-во
Концентрация
Подавление неоваскуляризации
эмбрионов
мкг/диск
Степень подавления
Средний процент
Среднее ± СО*
82
0
0-0
0±0
0±0
82
10
1-4
3,26±0,73
81±18
10
1000
2-4
3,3±0,82
83±20
10
500
1-4
2,4±0,84
60±20
9
100
3-4
3,44±0,73
85±18
11
10
1-4
3,09±1,14
78±28
12
1
1-4
2,33±0,89
58±23
10
0.1
0-3
1,9±0,88
48±23
10
0,01
1-2
1,5±0,53
38±13
10
0,001
0-2
1,3±0,82
18±20
10
1000
0-2
0,7±0,82
18±20
10
500
0-1
0,3±0,48
9±13
9
100
0-2
0,67±0,87
18±23
11
10
0-1
0,18±0,40
5±10
12
1
0-1
0,33±0,49
8±10
10
0,1
0-0
0
0±0
10
0,01
0-0
0
0±0
10
0,001
0-0
0
0±0
СО* = стандартное отклонение
n = 10 для опыта и n = 80 для физраствора и гепарина.
Результаты, приведенные в табл. 2, показывают 30-88%-ное снижение васкуляризации в
эмбрионах, обработанных L-Glu-L-Trp в физрастворе в дозах 10 нг-1000 мкг. Уровень подавления, достигаемый при дозах 10-1000 мкг, был
сопоставим с таковым, получаемым при обработке гепарином (10 мкг). При том, что некото-
рый ожидаемый неспецифический эффект пентапептида ТАЕЕК на васкуляризацию эмбриона
наблюдался при высоких дозах (100-1000 мкг),
эффект был не столь выраженным, как в случае
L-Glu-L-Trp, и предполагаемый неспецифический эффект не наблюдался при низких дозах.
Совокупность приведенных результатов свиде-
19
тельствует о воздействии L-Glu-L-Trp на процесс образования сосудов в эмбриональных
тканях цыпленка.
Пример 3. Подавление неоваскуляризации
в карциноме Льюиса.
Клетки карциномы легких Льюиса (5 × 107)
при введении (0,1 мл) внутрикожно в обе задние
лапы мышей C57BL/6 (день 0) через 7 дней образуют видимые высоковаскуляризованные
опухолевые узелки. При эксцизии опухоли
можно микроскопически определить степень ее
васкуляризации путем подсчета крупных сосудов, отходящих от опухолевой массы. Независимое исследование было проведено на контрактной основе в сторонней научной организации.
В качестве положительного контроля применяли Цитоксан, а в качестве отрицательного физраствор. Положительный контроль, Цитоксан (200 мг/кг), вводили только в день 2. Опытные введения L-Glu-L-Trp проводили внутримышечно ежедневно, начиная с дня 1 после введения опухоли в течение 5 дней (т.е. до дня 6).
L-Glu-L-Trp вводили в дозах 125, 250, 500, 1000
и 2000 мкг/кг/доза. Отрицательный контроль,
физраствор, вводили интраперитонеально по
аналогичной пятидневной схеме. Каждая группа
животных для оценки опытного или контрольного агента состояла из 10 животных (20 опухолей). Полученные результаты суммированы в
табл. 3.
Таблица 3
Подавление неоваскуляризации в карциноме Льюиса
Группа
Доза,
Кол-во сосудов
Обработка
№
мкг/кг
(среднее ± СО)
1
нет
0
19±6
2
Цитоксан
200
9±5*
3
2000
17±7
4
1000
12±5*
5
500
L-Glu-L-Trp
9±4*
6
250
7±2*
7
125
6±3*
* Множественное парное сравнение СтьюентаНьмена-Кьюза; статистически отличается от группы 1
при р<0,05.
001146
20
Результаты, приведенные в табл. 3, показывают явное статистически достоверное подавление неоваскуляризации как результат обработки Цитоксаном или L-Glu-L-Trp. Малые
дозы L-Glu-L-Trp были более эффективны для
подавления ангиогенеза (группы 4-7), чем более
высокие дозы (группа 3). Обратная зависимость
"доза - ответ", т.е. более низкая активность высоких доз, совпадает с зависимостью для других
модификаторов биологического ответа (например, IFN-альфа или IL-12), наблюдавшейся в
том же тесте.
Все эксперименты хорошо переносились
животными, потери веса или гибели животных
не отмечалось.
Пример 4. Антиопухолевая активность LGlu-L-Trp: Саркома 180.
Неоваскуляризация необходима для опухолевого роста. Антиопухолевую активность LGlu-L-Trp оценивали в независимой исследовательской организации на контрактной основе.
Опухоли Саркомы 180 (АТСС CCL-8 CCRF S180 II) индуцировали введением 2 × 106 клеток/0,1 мл внутримышечно в правую и левую
задние лапы мышам Свисс-Уэбстер. Группы
состояли из 10 животных (20 опухолей). L-GluL-Trp вводили одной инъекцией 0,1 мл в дозах
10 мкг/кг, 75 мкг/кг, 250 мкг/кг или 1000 мкг/кг.
Размер опухолей оценивали хирургически, удаляя и взвешивая пораженные конечности, а затем сравнивали с весом нормальных ("неопухолевых") конечностей. Первая профилактическая
схема (PDR-1) состояла из 5 последовательных
ежедневных интраперитонеальных инъекций,
начиная с дня -5 и кончая днем -1. Вторая профилактическая схема (PDR-2) состояла из 5 последовательных ежедневных внутримышечных
инъекций в левый бок (место опухоли), начиная
с дня -5 и кончая днем -1. Клетки Саркомы 180
вводили внутримышечно в день 0. Отрицательным контролем служило введение 0,1 мл физраствора.
Таблица 4
Влияние лечения L-Glu-L-Тrр на размер опухолей Саркомы 180
Группа
Схема
Доза
Вес лап, мкг/кг
Cpeдний вес опухоли
Процент от веса конлечения
трольной опухоли
Лев.
Прав.
Лев.
Прав.
1А (норм.)
нет
0
0
0
1,2±0,1
1,2±0,2
1В (опухоль)
нет
0
2,5
2,3
0
0
3,7±0,6
3,5±0,7
2
PDR-1
10
3,0
2,9
120
126
4,2±0,9
4,1±0,7
3
PDR-1
75
3,0
3,0
120
130
4,2±0,8
4,2±0,8
4
PDR-1
250
2,3
1,9
92
83
3,5±1,0
3,1±0,6
5
PDR-1
1000
1,3
1,0
52
43
2,5±0,7
2,2±0,5
6
PDR-2
10
2,4
2,6
96
113
3,6±0,7
3,8±0,7
7
PDR-2
75
2,4
3,3
96
143
3,6±0,7
3,5±0,3
8
PDR-2
250
1,8
1,1
72
48
3,0±0,1
2,3±0,5
9
PDR-2
1000
1,2
1,3
48
57
2,4±0,5
2,5±0,5
(а) Средний вес опухоли = (средний вес обработанной лапы - средний вес лапы в контроле)
(б) Подавление = (вес обработанной опухоли/вес контрольной опухоли) × 100%.
21
Представленные в табл. 4 результаты показывают, что профилактическое интраперитонеальное или внутримышечное введение L-Glu-LТrр в дозах 250 мкг/кг и 1000 мкг/кг подавляет
последующий внутримышечный рост опухоли.
Примечательно, что удалось получить системный подавляющий эффект при местном
внутримышечном введении препарата, поcколько внутримышечные инъекции в левую
лапу подавляли рост опухоли на правой лапе
(например, группы 8 и 9). Полученные результаты совпадают с данными по подавлению неоваскуляризации, приведенными в примерах 2 и
3.
Согласно настоящему изобретению, заявлен по существу новый способ подавления неоваскуляризации. Притом, что в описании приведены конкретные примеры, они не ограничивают объем изобретения и приведены здесь исключительно с целью иллюстрации. Из текста
описания для специалиста в данной области
исследований понятны различные модификации
изобретения. Объем изобретения, таким образом, определяется не столько описанием, сколько представленной ниже формулой, охватывающей также эквивалентные варианты осуществления изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения индивидуума, страдающего от заболевания, в патогенезе которого существенную роль играет неоваскуляризация,
включающий введение фармацевтического препарата, содержащего дипептид R'-Glu-Trp-R"
или его фармацевтически приемлемую соль и
фармацевтически приемлемый носитель, в количестве, эффективно подавляющем неоваскуляризацию.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что
дипептид R'-Glu-Trp-R" представляет собой LGlu-L-Trp или фармацевтическую соль L-Glu-LTrp.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем,
что неоваскуляризация является результатом
гемангиомы.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем,
что неоваскуляризация является результатом
васкуляризованной злокачественной опухоли
или васкуляризованной доброкачественной
опухоли.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем,
что в патогенезе заболевания существенную
роль играет неоваскуляризация, развившаяся в
период выздоровления после инсульта; после
травмы головы; или тепловой или холодовой
травмы, рестеноз, развившийся в результате
ангиопластики.
6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем,
что в патогенезе заболевания существенную
роль играет неоваскуляризация печени, индуци-
001146
22
рованная определенными веществами; ангиогенная дисфункция, обусловленная избытком
гормонов; неоваскуляризация, развившаяся
вследствие диабета; в результате гипертонии
или хронической инфекции печени.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что индивидууму вводят препарат в
дозе от 0,5 мкг на кг веса тела до 1 мг на кг веса
тела.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что эффективное количество вводимого препарата составляет от 1 до 50 мкг на кг
веса тела.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что дозу вводят ежедневно в течение
периода, составляющего от 1 до 30 дней.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что фармацевтический препарат
вводят внутримышечно, трансдермально, локально, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, интраназально, внутрибронхиальным
орошением или гастроинтестинально.
11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что препарат вводят в виде раствора для инъекций.
12. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что препарат вводят в единичной дозе в форме таблетки, суппозитория, капсулы, глазной пленки, раствора для ингаляций
или орошения слизистых оболочек, капель в
нос, глазных капель, зубной пасты, мази или
крема на водной основе.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что
единичная доза препарата содержит 0,01 мг дипептида R'-Glu-Trp-R" или его фармацевтически
приемлемой соли.
14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что дополнительно включает
введение индивидууму вазоактивного вещества.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что
вазоактивное вещество представляет собой ингибитор ангиотензинпревращающего фермента
(АПФ) или открыватель кальциевых каналов
(ОКК).
16. Способ по любому из пп.4-14, отличающийся тем, что индивидууму, страдающему
от опухоли, дополнительно вводят химиотерапевтический препарат.
17. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что индивидуум не является иммунодефицитным.
18. Способ по п.4, отличающийся тем, что
опухоль представляет собой опухоль мозговых
оболочек, интрацеребральную опухоль, саркому, остеосаркому, опухоль мягких тканей пищевода, опухоль трахеи, опухоль легких Льюиса.
19. Способ по п.6, отличающийся тем, что
неоваскуляризация, развившаяся вследствие
диабета, представляет собой серозную хориоретинопатию.
23
001146
20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что индивидуум является млекопитающим.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что
млекопитающее является человеком.
22. Способ лечения индивидуума, страдающего от заболевания, в патогенезе которого
существенную роль играет неоваскуляризация,
включающий введение фармацевтического препарата, содержащего дипептид L-Glu-L-Тrр,
циклическую форму дипептида, линейный или
циклический полимер дипептида, содержащий
не более 20 аминокислот, аналог дипептида, у
которого азот в пирроловом кольце триптофана
замещен углеродом, или его фармацевтически
приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель, в количестве, эффективно подавляющем неоваскуляризацию.
23. Способ по любому из пп.1-22, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из солей натрия, калия, аммония или цинка.
24. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из гидрохлоридов, гидробромидов, сульфатов, бисульфатов, ацетатов, оксалатов, валератов, олеатов, лауратов, боратов, бензоатов, лактатов,
24
фосфатов, тозилатов, цитратов, малеатов, фумаратов, сукцинатов или тартратов.
25. Способ по любому из пп.2-24, отличающийся тем, что вводят натриевую соль LGlu-L-Trp.
26. Способ по любому из пп.2-25, отличающийся тем, что L-Glu-L-Trp вводят в виде
солевого раствора.
27. Способ по любому из пп.2-26, отличающийся тем, что натриевую соль L-Glu-L-Trp
вводят интраназально или внутрибронхиальным
орошением.
28. Способ лечения индивидуума, страдающего от заболевания, в патогенезе которого
существенную роль играет неоваскуляризация,
включающий введение фармацевтического препарата, содержащего дипептид R'-Glu-Trp-R"
или его аналог, у которого азот в пирроловом
кольце триптофана замещен углеродом, и фармацевтически приемлемый носитель, в количестве, эффективно подавляющем неоваскуляризацию.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что
дипептид R'-Glu-Trp-R" представляет собой LGlu-L-Тгр или его аналог, у которого азот в
пирроловом кольце триптофана замещен углеродом.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, Москва, ГСП 103621, М. Черкасский пер., 2/6