Извлечение биофлавоноида-кверцетина из растительного

ÓÄÊ 542.06.542.61.542.46.808.542.97.542.93
ÈÇÂËÅ×ÅÍÈÅ ÁÈÎÔËÀÂÎÍÎÈÄÀ — ÊÂÅÐÖÅÒÈÍÀ
ÈÇ ÐÀÑÒÈÒÅËÜÍÎÃÎ ÑÛÐÜß Â ÑÐÅÄÅ ÑÓÁÊÐÈÒÈ×ÅÑÊÎÉ
ÂÎÄÛ
À. Â. Ëåêàðü, 2 Ñ. Í. Áîðèñåíêî*, 1 Å. Â. Ìàêñèìåíêî,
Ð. Í. Áîðèñåíêî, 2Å. Â. Âåòðîâà, 1 Í. È. Áîðèñåíêî, 2 Â. È. Ìèíêèí
1
2
1
Ýêîëîãî-àíàëèòè÷åñêèé öåíòð Þæíîãî ôåäåðàëüíîãî óíèâåðñèòåòà, ã. Ðîñòîâ-íà-Äîíó,
Ðîññèÿ
2
Íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò ôèçè÷åñêîé è îðãàíè÷åñêîé õèìèè Þæíîãî
ôåäåðàëüíîãî óíèâåðñèòåòà, ã. Ðîñòîâ-íà-Äîíó, Ðîññèÿ
*Å-mail: boni@i poc.rsu.ru
Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 22.07.2007 ã.
Ðàçðàáîòàíà ìåòîäèêà ýêñòðàêöèè êâåðöåòèíà èç ðàñòèòåëüíîãî ñûðüÿ â ñðåäå
ñóáêðèòè÷åñêîé âîäû. Ìåòîäèêà ÿâëÿåòñÿ ýêîëîãè÷åñêè ÷èñòîé è áîëåå ýôôåêòèâíà ïî ñðàâíåíèþ ñ òðàäèöèîííûìè ìåòîäèêàìè ýêñòðàêöèè ïîëÿðíûìè îðãàíè÷åñêèìè ðàñòâîðèòåëÿìè (íàïðèìåð, ìåòàíîëîì) â íåïðåðûâíîì ðåæèìå.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: ñóáêðèòè÷åñêàÿ âîäà, êâåðöåòèí, ýêñòðàêöèÿ.
ÂÂÅÄÅÍÈÅ
Øèðîòà òåðàïåâòè÷åñêîãî äåéñòâèÿ, ïðèñóùàÿ êàê èíäèâèäóàëüíûì âåùåñòâàì
èç ãðóïïû ôëàâîíîèäîâ, òàê è èõ ñìåñÿì, îáóñëîâèëà ñîçäàíèå áîëüøîãî ÷èñëà
ëåêàðñòâåííûõ ôîðì íà èõ îñíîâå [1]. Îíè îêàçûâàþò àíòèîêñèäàíòíîå è êàïèëëÿðîóêðåïëÿþùåå äåéñòâèå, à òàêæå âõîäÿò â ãðóïïó âèòàìèíà Ð [2].
Âàæíîé çàäà÷åé ïðîèçâîäñòâà ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ íà îñíîâå áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ âåùåñòâ èç ðàñòèòåëüíîãî ñûðüÿ ÿâëÿåòñÿ ïîèñê íîâûõ ñïîñîáîâ
èõ èçâëå÷åíèÿ, íå çàãðÿçíÿþùèõ îêðóæàþùóþ ñðåäó. Îäíèì èç òàêèõ ýêîëîãè÷åñêè áåçîïàñíûõ ñïîñîáîâ ìîæåò áûòü ýêñòðàêöèÿ â ñðåäå ñóáêðèòè÷åñêîé âîäû.
Ïðåèìóùåñòâî ñóáêðèòè÷åñêîé âîäû çàêëþ÷àåòñÿ â òîì, ÷òî ïðè ïîâûøåííûõ
òåìïåðàòóðàõ (100 ÷ 374 °Ñ) è äàâëåíèè äî 218 àòì çíà÷èòåëüíî óìåíüøàþòñÿ
òàêèå âàæíûå õàðàêòåðèñòèêè, êàê êîíñòàíòà äèýëåêòðè÷åñêîé ïðîíèöàåìîñòè,
ïîâåðõíîñòíîå íàòÿæåíèå, âÿçêîñòü. Âîäà ïðè òàêèõ óñëîâèÿõ âåäåò ñåáÿ ïîäîáíî
ïîëÿðíîìó îðãàíè÷åñêîìó ðàñòâîðèòåëþ.
Öåëüþ íàñòîÿùåé ðàáîòû ÿâèëàñü ðàçðàáîòêà ýêîëîãè÷åñêè ÷èñòîãî ñïîñîáà
âûäåëåíèÿ ôëàâîíîèäîâ èç ðàñòèòåëüíîãî ñûðüÿ íà ïðèìåðå êâåðöåòèíà è ñðàâíåíèå åãî ñ òðàäèöèîííûì ìåòîäîì èçâëå÷åíèÿ.
ÝÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜÍÀß ×ÀÑÒÜ
 êà÷åñòâå ñûðüÿ èñïîëüçîâàëè ãîðåö ïåðå÷íûé, ñïîðûø (Polygonum hydropiper L.). Äëÿ àíàëèçà ýêñòðàêòîâ, ïîëó÷àåìûõ èç ðàñòèòåëüíîãî ìàòåðèàëà, áûë
ðàçðàáîòàí ìåòîä êà÷åñòâåííîãî è êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ êâåðöåòèíà ñ ïîìîùüþ âûñîêîýôôåêòèâíîé æèäêîñòíîé õðîìàòîãðàôèè (ÂÝÆÕ). Èññëåäîâàíèå
ïðîâîäèëè íà æèäêîñòíîì õðîìàòîãðàôå ôèðìû Thermo Separation Products ñ êîëîí«Ñâåðõêðèòè÷åñêèå Ôëþèäû: Òåîðèÿ è Ïðàêòèêà». Òîì 3. ¹ 2. 2008
33
À. Â. Ëåêàðü, Ñ. Í. Áîðèñåíêî, Å. Â. Ìàêñèìåíêî,
Ð. Í. Áîðèñåíêî, Å. Â. Âåòðîâà, Í. È. Áîðèñåíêî, Â. È. Ìèíêèí
êîé, çàïîëíåííîé ñîðáåíòîì Spherisorb
ODS-2 ñ ïðèâèòîé ôàçîé Ñ-18 äëÿ îáðàùåííî-ôàçîâîé õðîìàòîãðàôèè, ðàçìåðîì
250 × 2,1 ìì. Ó÷èòûâàÿ ëèòåðàòóðíûå
äàííûå [3] è ñîáñòâåííûå èññëåäîâàíèÿ,
áûëè ïîäîáðàíû îïòèìàëüíûå óñëîâèÿ
õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ðàçäåëåí è ÿ
ïîëó÷àåìîé â ýêñïåðèìåíòå ñìåñè ôëàâîíîèäîâ: ñêîðîñòü ýëþåíòà 0,4 ìë/ìèí;
òåìïåðàòóðà êîëîíêè 35 °Ñ; ÓÔ-äåòåêÐèñ. 1. Ñõåìà óñòàíîâêè äëÿ ýêñòðàêöèè òîð, λ = 353 íì; ñîñòàâ ïîäâèæíîé ôàçû:
0,01 Ì ñåðíîé êèñëîòû, àöåòîíèòðèëà, ìåáèîôëàâîíîèäîâ ñóáêðèòè÷åñêîé âîäîé:
1 — åìêîñòü äëÿ âîäû; 2 — íàñîñ (Eldex Labs, inc. òàíîëà, óêñóñíîé êèñëîòû â îáúåìíîì
Menlo Park, CA); 3 — òåðìîñòàò; 4 —ñïèðàëü òåðìî- ñîîòíîøåíèè 73 : 18 : 4 : 5; îáúåì ââîäèñòàòà; 5 — êàðòðèäæ; 6 — ðåñòðèêòîð (îãðàíè÷è- ìîé ïðîáû 20,00 ìêë. Âðåìÿ õðîìàòîãòåëü äàâëåíèÿ); 7 — åìêîñòü äëÿ ñáîðà ýêñòðàêòà
ðàôè÷åñêîãî àíàëèçà 20 ìèí.
Êâåðöåòèí èäåíòèôèöèðîâàëè, èñïîëüçóÿ èíôîðìàöèþ î âðåìåíè åãî óäåðæèâàíèÿ ïðè àíàëèçå ñòàíäàðòíîãî ðàñòâîðà. Êîëè÷åñòâåííîå îïðåäåëåíèå ïðîâîäèëè ïî
ìåòîäó âíåøíåãî ñòàíäàðòà (àáñîëþòíîé êàëèáðîâêè) ïî ñòàíäàðòíûì ðàñòâîðàì
ðàçëè÷íîé êîíöåíòðàöèè. Îòíîñèòåëüíàÿ îøèáêà îïðåäåëåíèÿ íå ïðåâûøàåò 4,5 %.
Ýêñòðàêöèþ ñóáêðèòè÷åñêîé âîäîé ïðîâîäèëè ñ ïîìîùüþ èçãîòîâëåííîé íàìè
óñòàíîâêè, ñõåìà êîòîðîé ïðåäñòàâëåíà íà ðèñ. 1.
 êàðòðèäæ ïîìåñòèëè 0,6 ã ïðåäâàðèòåëüíî î÷èùåííîãî ãåêñàíîì ðå÷íîãî
ïåñêà äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ çàñîðåíèÿ ôèëüòðà â êîììóíèêàöèÿõ ñèñòåìû è 0,3 ã
âûñóøåííîãî íà âîçäóõå èçìåëü÷åííîãî ðàñòèòåëüíîãî ñûðüÿ. Ýêñòðàêöèþ ïðîâîäèëè ïåðåãðåòîé (ñóáêðèòè÷åñêîé) âîäîé ïðè òåìïåðàòóðå äî 250 °Ñ è äàâëåíèè 120 àòì â òå÷åíèå 30 ìèí. Âîäíûé ýêñòðàêò îáðàáàòûâàëè õëîðîôîðìîì äëÿ
óäàëåíèÿ áàëëàñòíûõ âåùåñòâ, ïîñëåäîâàòåëüíî ýêñòðàãèðîâàëè ýòèëîâûì ýôèðîì 3 ðàçà ïî 5 ìë è ýòèëàöåòàòîì 3 ðàçà ïî 5 ìë.
Äëÿ îöåíêè ýôôåêòèâíîñòè ýêñòðàêöèè ñóáêðèòè÷åñêîé âîäîé áûëî ïðîâåäåíî ñðàâíåíèå ñ ðåçóëüòàòàìè òðàäèöèîííîé ýêñòðàêöèè ôëàâîíîèäîâ ìåòàíîëîì:
0,3 ã âîçäóøíî-ñóõîãî èçìåëü÷åííîãî ðàñòèòåëüíîãî ñûðüÿ ýêñòðàãèðîâàëè 5 ðàç
ïî 5 ìë 80 %-íûì ìåòàíîëîì â öåíòðèôóãå ïðè 5000 îá/ñ â òå÷åíèå 20 ìèí.
Âîäíî-ñïèðòîâûå ýêñòðàêòû îáúåäèíÿëè, óïàðèâàëè äî 1/3 îò ïåðâîíà÷àëüíîãî
îáúåìà. Äëÿ î÷èñòêè îò õëîðîôèëëà è ñìîëèñòûõ âåùåñòâ ýêñòðàêò ïðîìûâàëè
õëîðîôîðìîì [4—6]. Äëÿ âûäåëåíèÿ ñóììû ôëàâîíîèäîâ èç ìåòàíîëüíîé âûòÿæêè î÷èùåííûé îñòàòîê ïîñëåäîâàòåëüíî îáðàáàòûâàëè ýòèëîâûì ýôèðîì 3 ðàçà
ïî 5 ìë äëÿ èçâëå÷åíèÿ àãëèêîíîâ, çàòåì ýòèëàöåòàòîì 3 ðàçà ïî 5 ìë — â ýòîì
ñëó÷àå èçâëåêàþòñÿ â îñíîâíîì ìîíîçèäû è áèîçèäû.
Îáà ýêñòðàêòà ñóøèëè íàä áåçâîäíûì ñóëüôàòîì íàòðèÿ â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ,
óïàðèëè äîñóõà íà ðîòîðíîì èñïàðèòåëå ïðè òåìïåðàòóðå 40 °Ñ è ðàñòâîðèëè â
1 ìë ìåòàíîëà äëÿ ïðîâåäåíèÿ õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî àíàëèçà ìåòîäîì ÂÝÆÕ. Õðîìàòîãðàììà ýêñòðàêòà, ïîëó÷åííîãî â ñðåäå ñóáêðèòè÷åñêîé âîäû, äåìîíñòðèðóåò
íàëè÷èå ïèêà êâåðöåòèíà ñ âðåìåíåì óäåðæàíèÿ 9,176 ìèí.
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ È ÈÕ ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ
Ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòîâ ïðåäñòàâëåíû â òàáëèöå 1. Èç ïðèâåäåííûõ äàííûõ âèäíî, ÷òî ýêñòðàêöèÿ ñóáêðèòè÷åñêîé âîäîé ïîçâîëÿåò èçâëå÷ü êâåðöåòèíà
34
«Ñâåðõêðèòè÷åñêèå Ôëþèäû: Òåîðèÿ è Ïðàêòèêà». Òîì 3. ¹ 2. 2008
Èçâëå÷åíèå áèîôëàâîíîèäà — êâåðöåòèíà
èç ðàñòèòåëüíîãî ñûðüÿ â ñðåäå ñóáêðèòè÷åñêîé âîäû
Òàáëèöà 1
Ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ ôëàâîíîèäîâ è êâåðöåòèíà â ýêñòðàêòàõ
ãîðöà ïåðå÷íîãî
Ñóììàðíîå êîëè÷åñòâî
ôëàâîíîèäîâ ïî äàííûì
ÂÝÆÕ (ïî ïëîùàäÿì
ïèêîâ, mB*108)
Ýêñòðàãåíò
Êîëè÷åñòâî
êâåðöåòèíà,
ìêã/ã
Äîëÿ èçâëå÷åíèÿ
êâåðöåòèíà îòíîñèòåëüíî
ñïîñîáà II
Ìåòàíîë
5,8
43,1
1,0
Ñóáêðèòè÷åñêàÿ
âîäà
4,8
328,0
7,6
Òàáëèöà 2
Ðåçóëüòàòû ýêñòðàêöèè êâåðöåòèíà ñóáêðèòè÷åñêîé âîäîé
ïðè ðàçëè÷íûõ òåìïåðàòóðàõ
¹
Òåìïåðàòóðà, °Ñ
Êîëè÷åñòâî êâåðöåòèíà, ìêã/ã
1
äî 100
44,0
2
100 ÷ 150
61,3
3
150 ÷ 250
222,7
â 7,6 ðàç áîëüøå ïî ñðàâíåíèþ ñ òðàäèöèîííûì ñïîñîáîì. Â òî æå âðåìÿ ñëåäóåò
îòìåòèòü, ÷òî îáùàÿ ñóììà ôëàâîíîèäîâ, èçâëåêàåìûõ ñ èñïîëüçîâàíèåì ïåðåãðåòîé âîäû, íåñêîëüêî íèæå, ÷åì ïðè òðàäèöèîííîé ìåòàíîëüíîé ýêñòðàêöèè.
Äëÿ èçó÷åíèÿ ïðè÷èí äàííîãî ÿâëåíèÿ ýêñòðàêöèÿ ñóáêðèòè÷åñêîé âîäîé
áûëà îñóùåñòâëåíà â íåñêîëüêèõ òåìïåðàòóðíûõ èíòåðâàëàõ. Äàííûå, ïðèâåäåííûå
â òàáëèöå 2, ïîêàçûâàþò, ÷òî ïðè ýêñòðàêöèè äî 100 °Ñ êâåðöåòèíà îáðàçóåòñÿ
ñòîëüêî æå, ñêîëüêî èçâëåêàåòñÿ ìåòàíîëüíîé ýêñòðàêöèåé. Ïðè íàãðåâàíèè îò
100 °Ñ äî 250 °Ñ ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ñóáêðèòè÷åñêàÿ âîäà ñïîñîáñòâóåò
âûñâîáîæäåíèþ ñâÿçàííîãî êâåðöåòèíà. Âîçìîæíî, ýòî ïðîèñõîäèò â ðåçóëüòàòå
÷àñòè÷íîãî ãèäðîëèçà ïðèñóòñòâóþùèõ â ðàñòèòåëüíîé ìàòðèöå ãëèêîçèäîâ (íàïðèìåð, ðóòèíà), ÷òî êîñâåííî ïîäòâåðæäàåòñÿ, â ñâîþ î÷åðåäü, óìåíüøåíèåì ñóììû ôëàâîíîèäîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ òðàäèöèîííîé ýêñòðàêöèåé (òàáëèöà 1).
ÂÛÂÎÄÛ
Èòàê, â õîäå ïðîâåäåííîãî èññëåäîâàíèÿ:
— ïðåäëîæåíà ýêîëîãè÷åñêè áåçîïàñíàÿ ìåòîäèêà èçâëå÷åíèÿ ôåíîëüíûõ ñîåäèíåíèé èç ðàñòèòåëüíîãî ñûðüÿ áåç èñïîëüçîâàíèÿ îðãàíè÷åñêèõ ðàñòâîðèòåëåé;
— ðàçðàáîòàí ìåòîä êà÷åñòâåííîãî è êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ êâåðöåòèíà â ðàñòèòåëüíîì ñûðüå ñ èñïîëüçîâàíèåì ÂÝÆÕ;
— ïîêàçàíî, ÷òî ýêñòðàêöèÿ â ñðåäå ñóáêðèòè÷åñêîé âîäû ïîçâîëÿåò èçâëåêàòü
êâåðöåòèíà èç ãîðöà ïåðå÷íîãî â 7 ðàç áîëüøå ïî ñðàâíåíèþ ñ òðàäèöèîííûì
ìåòîäîì.
Ðàáîòà âûïîëíÿëàñü íà áàçå Íàó÷íî-îáðàçîâàòåëüíîãî ýêîëîãî-àíàëèòè÷åñêîãî
öåíòðà þãà Ðîññèè ÞÔÓ ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Þæíîãî ôåäåðàëüíîãî
óíèâåðñèòåòà (ãðàíò ¹ 05/6-87), ôîíäà CRDF ïî ðîññèéñêî-àìåðèêàíñêîé ïðîãðàì«Ñâåðõêðèòè÷åñêèå Ôëþèäû: Òåîðèÿ è Ïðàêòèêà». Òîì 3. ¹ 2. 2008
35
À. Â. Ëåêàðü, Ñ. Í. Áîðèñåíêî, Å. Â. Ìàêñèìåíêî,
Ð. Í. Áîðèñåíêî, Å. Â. Âåòðîâà, Í. È. Áîðèñåíêî, Â. È. Ìèíêèí
ìå «Ôóíäàìåíòàëüíûå èññëåäîâàíèÿ è âûñøåå îáðàçîâàíèå» (ãðàíòû BP1M04/REC004 è Y3-C-04-02) è ïðîãðàììû «Ðàçâèòèå íàó÷íîãî ïîòåíöèàëà âûñøåé øêîëû»
Ìèíîáðàçîâàíèÿ è íàóêè ÐÔ (ïðîåêòû ÐÍÏ.2.1.1.4939 è ÐÍÏ.2.2.2.3.5690).
ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ
1. Áëàæåé À., Øóòûé Ë. Ôåíîëüíûå ñîåäèíåíèÿ ðàñòèòåëüíîãî ïðîèñõîæäåíèÿ / Ïåð. ñî
ñëîâàöêîãî ê.õ.í. À.Ï. Ñåðãååâà. Ì.: Ìèð, 1977.
2. Notar M, Leskovsek H. Fresenius J. Analytical Chemistry. 1997. Vol. 358. P. 623—629.
3. Âûñîêîýôôåêòèâíàÿ æèäêîñòíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ â áèîõèìèè / Ïåð. ñ àíãë. Ïîä ðåä.
À. Õåíøåí è äð. Ì.: Ìèð, 1988. 634 ñ.
4. Äæóìûðêî Ñ.Ô. Õèìèÿ ïðèðîäíûõ ñîåäèíåíèé. 1985. ¹ 4. C. 565.
5. Çàêèðîâà Á.Ì., Îìóðêàìçèíîâà Â.Á., Åðæàíîâà Ì.Ñ. Õèìèÿ ïðèðîäíûõ ñîåäèíåíèé. 1982.
¹ 6. C. 781—782.
6. Õóøáàêòîâà Ç.À., Ôàéçèåâà Ñ.Õ., Ñûðîâ Â.Í., Þëäàøåâ Ì.Ï., Áàòåðîâ Ý.Õ., Ìàìîíõîíîâ À.Ó. Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. 2001. T. 35. ¹ 3. C. 35—38.
BIOFLAVONOID-QUERCETIN EXTRACTION FROM PLANT RAW
MATERIALS IN SUB-CRITICAL WATER MEDIUM
1
A. V. Lekar, 2 S.N. Borisenko, 1 E.V. Maksimenko, 2R. N. Borisenko,
2
E.V. Vetrova, 1 N.I. Borisenko, 2 V.I. Minkin
Ecological and Analytic Center of Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russia
Institute of Physical and Organic Chemistry of Southern Federal University, Rostov-on-Don,
Russia
1
2
The method of quercetin extraction from plant raw materials in sub-critical water
medium is developed. It is more efficient than conventional extraction by polar organic
solvents (e.g. methanol) and does not require the use of environmentally non-friendly
solvents.
K e y w o r d s: sub-critical water, quercetin, extraction.
«Ñâåðõêðèòè÷åñêèå Ôëþèäû: Òåîðèÿ è Ïðàêòèêà». Òîì 3. ¹ 2. 2008