Грязнева Т.Н. – зав. кафедрой микробиологии, доктор биологических наук, профессор, Смирнова Е.А. – доцент кафедры биотехнологии, кандидат биологических наук ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ НАНОСТРУКТУРИРОВАННОГО БИОКОМПЛЕКСА, ОБУСЛАВЛИВАЮЩЕГО АНТАГОНИСТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ БАЦИЛЛ-КОМПОНЕНТОВ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ «ОЛИН» В статье приводятся экспериментально подтвержденные данные о том, что в процессе культивирования B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 – бактерийкомпонентов пробиотической кормовой добавки «ОЛИН», в смеси с энтеротоксигенными микроорганизмами образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов, который адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ в клетки, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели. Создание биопрепаратов на основе живых, антагонистически активных бактерий (пробиотики, синбиотики, симбиотики), как альтернативы антибиотикам, является актуальной задачей и для медицины и для ветеринарии. Общеизвестен тот факт, что широкое применение антибиотиков способствует появлению антибиотикорезистентных штаммов бактерий и микроскопических грибов, распространению микозов и микотоксикозов, развитию у людей и животных дисбактериозов, иммунодепрессий и т.д. [1, 2]. На сегодняшний день отказаться от антибиотиков невозможно, но в ряде случаев, например, при желудочно-кишечных болезнях, вызванных энтеропатогенными бактериями, антибиотики с успехом заменяются пробиотическими препаратами и пробиотическими кормовыми добавками на основе бацилл – B.subtillis и B.licheniformis (КД-5, Биоспорин, Биод-5, ОЛИН, Белолин и др.). Однако, несмотря на обилие отечественных и зарубежных публикаций о положительных свойствах пробиотиков, механизм их действия изучен недостаточно [3, 4, 5, 6, 7]. Для определения влияния биологически активных веществ, продуцируемых B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 (компоненты пробиотической кормовой добавки «ОЛИН»), на энтеропатогенные бактерии нами было проведено культивирование изучаемых бацилл в мясо-пептонном бульоне в смеси с эшерихиями - непатогенной (E.coli 1257) и энтеротоксигенной (E.coli К88). Для этого в пробирку вносили суточные бульонные культуры B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в соотношении 1:1 с концентрацией 108 м.кл./мл. Затем вносили суточную бульонную культуру непатогенной или энтеротоксигенной E.coli в той же концентрации. В контрольных пробах выращивали чистые культуры бацилл и эшерихий. Через 2 часа культивирования при 37°С были приготовлены нативные микропрепараты для изучения в электронном микроскопе высокого класса разрешения «J 100В» [8, 9]. 2 Ранее нами было установлено, что B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 продуцируют ферменты и бактериоцины, губительно действующие на патогенные энтеробактерии, а E.сoli К88 вырабатывает энтеротоксины (рис. 1). Рис. 1. Метаболиты, образующиеся в процессе культивирования B.subtilis ВКПМ 10172, B.licheniformis ВКПМ 10135 и энтеротоксигенной E.coli К88 Мы предположили, что продукты метаболизма бацилл (ферменты и бактериоцины) образуют комплексы с энтеротоксинами энтеропатогенной E.сoli (рис. 2). Рис. 2. Образование комплекса бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов, вырабатываемых B.subtilis ВКПМ 10172, B.licheniformis ВКПМ 10135 и энтеротоксигенной E.coli К88, при совместном культивировании 3 Условно данный комплекс мы обозначили как «КФБЭ». Для исследования химической природы комплекса КФБЭ использовали метод биохимической деградации с помощью таких веществ, как лизоцим, холинэстераза, пептидазы (трипсин, папаин, протеиназа К). Для этого из мясо-пептонного бульона, в котором в течение 2 часов культувировали бациллы и энтеропатогенные эшерихии, удаляли методом центрифугирования биомассу клеток. Полученную культуральную жидкость, содержащую комплекс КФБЭ, анализировали следующими методами: 1. Метод перйодатного окисления. 2. Лизоцимный метод. 3. Холинэстеразный метод. 4. Пептидазный метод. В результате проведенной биохимической деградации было установлено, что комплекс КФБЭ имеет сложную химическую структуру и содержит в своем составе углеводы, липополисахариды, мукополисахариды и белки. По нашему мнению, данный комплекс адсорбируется на поверхности энтеротоксигенных бактерий, т.к. обладает сродством к поверхности клеточной стенки патогенных микроорганизмов. Бактериоцины B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 упаковываются внутрь нано- и липосом, образованных ферментами бацилл и токсинами патогенных эшерихий (рис. 3). Рис. 3. Взаимодействие комплекса КФБЭ с клеточной стенкой энтеротоксигенной E.coli К88 После адсорбции наноструктурированного комплекса на поверхности энтеропатогенной E.coli, бактериоцины B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 проникают внутрь патогенных эшерихий и лизируют их. Кроме того, комплекс КФБЭ препятствует пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ в патогенные микроорганизмы. Полученные электронные фотографии подтверждают нашу гипотезу (рис. 4). 4 Рис. 4. Адсорбция комплекса КФБЭ на поверхности энтеротоксигенной E.coli К88 (Х26000) 5 На электронных фотографиях видно, что комплекс КФБЭ представляет собой нанолипосомальные структуры, адсорбирующиеся на поверхности клеточной стенки энтеротоксигенной E.сoli. В контрольной пробе, в отсутствие бацилл энтеротоксигенные E.сoli К88 размножались и вырабатывали энтеротоксины (рис. 5). а б Рис. 5. Энтеротоксигенные (а) и непатогенные (б) эшерихии в контрольной пробе (Х26000) При культивировании непатогенной E.coli 1257 в смешанной культуре с бациллами комплекс КФБЭ не образовывался, развитие эшерихий не подавлялось, лизиса бактерий не наблюдалось (рис.6). Рис. 6. Непатогенные E.coli 1257 и бациллы в опытной пробе (Х26000) Заключение. Из результатов проведенного опыта можно сделать вывод, что в процессе культивирования B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в смеси с энтеротоксигенными микроорганизмами образуется нано-липосомальный комплекс 6 бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов (КФБЭ), представляющий собой смесь пептидогликанов и липополисахаридов. Комплекс КФБЭ адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели. Следовательно, комплекс КФБЭ обуславливает антагонистическую активность бацилл-компонентов пробиотической кормовой добавки «ОЛИН». Литература 1. Ковалев В.Ф. Некоторые проблемы применения антибиотиков в животноводстве и ветеринарии /Ковалев В.Ф. //Антибиотики и медбиотехнология.-1999.- № 10.- С. 725729. 2. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры /Каширская Н.Ю. //Русский медицинский журнал. – 2000. - № 13-14. – С. 3842. 3. Бакулина Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г. // Биотехнология. – 2001. - № 2. – С. 48-56. 4. Джупина С.И. Факторные инфекционные болезни животных /Джупина С.И. //Ветеринария.- 2001.- № 3.- С. 6. 5. Мазанкова Л.Н. Перспективы применения споровых пробиотиков при заболеваниях желудочно-кишечного тракта у детей /Мазанкова Л.Н., Курохтина И.С. // Педиатрия. – 2002. - № 4. – С. 56-61. 6. Жданов П.И. Опыт и перспективы применения нового пробиотика «Споробактерин» в животноводстве и ветеринарной практике /Жданов П.И., Мешков В.М., Лепский А.И. //Юбилейн. сб.тр.ученых Оренбург.гос.аграр.ун-та.- Оренбург: ОГАУ.- 2000. - С. 4-7. 7. Грязнева Т.Н. Оценка эффективности пробиотика «БИОД-5» при желудочнокишечных болезнях новорожденных телят /Грязнева Т.Н., Тихонов И.В., Васильев П.Г. // Ветеринарная медицина.- - 2002.- № 2.- С. 22-23. 8. Грязнева Т.Н. Элекронно-микроскопическое исследование колоний патогенных микроорганизмов и роль лактобактерий в процессе антагонизма /Грязнева Т.Н. //Достижения ветеринарной науки – производству: Сб. науч. ст. - Чебоксары: Изд. Чувашского СХИ.- 1994.- С. 23-26. 9. Грязнева Т.Н. Электронная микроскопия биологических объектов /Грязнева Т.Н., Меньшикова З.Н., Тихонов И.В., Мельницкая Т.И. //Учебно-методическое пособие.- М.: МГАВМиБ. - 2003.- 109 с.