Расширенная аннотация проекта. соглашением)

Расширенная аннотация проекта.
1. Полное наименование проекта (в соответствии с госконтрактом или
соглашением) Молекулярные механизмы регуляции фосфорного и азотного
метаболизма бацилл
2. Наименование программы: Федеральная целевая программа «Научные и
научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы».
3. Наименование мероприятия Программы
1.3.1 «Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами
наук» мероприятия 1.3 «Проведение научных исследований молодыми
учеными - кандидатами наук и целевыми аспирантами в научнообразовательных центрах» направления 1 «Стимулирование закрепления
молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий» федеральной
целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России» на 2009-2013 годы,
4. Научный руководитель
Ульянова Вера Владимировна, к.б.н., н.с. кафедры микробиологии
5. Ответственный исполнитель
Каюмов Айрат Рашитович, к.б.н., доцент кафедры генетики
6. Описание ожидаемых (полученных) результатов с указанием конкретных
планируемых характеристик и параметров объектов исследования или
разработки (1-2 страницы).
Проведена систематизация современных знаний о молекулярных механизмах регуляции
активности генов в клетках бацилл, проанализированы экспериментальные данные о
системе контроля фосфорного и азотного обмена в клетках бацилл по данным открытых
источников информации. Показано, что в экспрессии генов у бактерий основную роль
играют репрессоры и активаторы транскрипции, компоненты двухкомпонентных систем
трансдукции сигнала. Основными белками регуляторами азотного обмена у бацилл
являются белки TnrA, GlnK, GlnR и глутаминсинтетаза. Специфическим ответом бацилл
на недостаток фосфора в окружающей среде служит экспрессия генов Pho регулона. PHO
регулон B.subtilis насчитывает 37 генов и контролируется на уровне транскрипции
двухкомпонентной системой PhoP-PhoR.
Исследована активности фактора TnrA в мутантах по белкам GlnK и AmtB при
различной доступности азота (избыток-недостаток-отсутствие) на основе активности
бэтта-галактозидазы, находящейся под контролем TnrA-регулируемого nrg-промотора.
Показано что в отстутствие белка AmtB происходит 8-кратное увеличение активности
фактора транскрипции, сравнимо с конститутивным уровнем транскрипции. Инактивация
белка GlnK не влияет на активность фактора транскрипции. При этом связывание фактора
TnrA с частично ингибированной глутаминсинтетазой способно доолнительно подавить
ее ферментативную активность. При повышении доступного азота происходит
диссоциация белка TnrA из комплекса GlnK-TnrA и связывание с глутаминсинтетазой.
В работе показано, что уровень АТФ определяет клеточную локализацию фактора
транскрипции TnrA. 2 мМ АТФ приводит к диссоциации белка TnrA из мембраны в
цитоплазму, при 8 мМ АТФ локализация становится полностью цитоплазматической.
Также, после внесения АТФ до концентраций 4 и 8 мМ и последующей инкубации
происходит расщепление фактора транскрипции TnrA в клеточных экстрактах. Это
свидетельствует о том, что диссоциация этого белка в цитоплазму приводит к его
дальнейшему протеолитическому расщеплению. Получены штаммы B.subtilis GP249
pDG148-glnK и B.subtilis GP249 pDG148-glnK94. С их помощью показано, что белок GlnK
в клетках B.subtilis регулирует активность транспорта аммония белком AmtB в ответ на
внутриклеточный уровень АТФ. Также в случае белка GlnK94 диссоциации фактора TnrA
в цитоплазму при добавлении АТФ не происходило, и локализация оставалась всегда
мембранной. Эти данные подтверждают, что концентрация АТФ определяет локализацию
белка GlnK и следовательно фактора транскрипции TnrA внутри клетки. В полученных
штаммах наблюдается высокая концентрация рекомбинатного белка GlnK, что не
позволяет достоверно оценить роль белка GlnK в процессе протеолиза фактора TnrA. Для
решения этой проблемы необходимо получить хромосомную точечную мутацию гена
glnK.
Показано, что регуляторные белки фосфорного обмена гомологичные PhoP, PhoR, SigB
B.subtilis закодированы во всех секвенированных в настоящее время геномах бацилл, а их
гены расположены в сходных генетических контекстах. Высокая степень сходства
первичных структур, дивергентное происхождения генов при видообразовании,
подтвержденное в том числе проведенным филогенетическим анализом, в совокупности
позволяют сделать вывод о структурной и функциональной гомологии систем фосфорного
обмена бацилл. PhoP и PhoR белки были успешно экспрессированы в рекомбинантной
системе на основе штамма кишечной палочки и плазмиды, обеспечивающей продукцию
белков при добавлении индуктора. Оптимальными условиями биосинтеза PhoP и PhoR
белков стали выращивание бактерий при 30°С, индукция синтеза 0,5 мМ ИПТГ в течение
3 часов. Проведенная металл хелатная аффинная хроматография на никель сефарозе с
элюцией связавшихся с носителем белков в градиенте 0,5 М имидазола в фосфатном
буфере и последующей гель-фильтрацией позволили получить гомогенные препараты
PhoP и PhoR белков. Показано, что PhoP белок, фосфорилированный родственной
гистидин киназой PhoR в присутствии АТФ, эффективно связывается с промоторами
генов стрессового белка ykoL B.subtilis и рибонуклеаз B.pumilus и B.altitudinis. Однако и
нефосфорилированная форма белка PhoP образует комплекс с указанными ДНК
мишенями. Белок PhoP не обладал способностью специфически взаимодействовать с
промотором гена рибонуклеазы B.circulans.
7. Библиографическое описание публикации по проекту и гиперссылки на
публикации на персональных страницах.
1. Федорова К.П., Тарасов Н.В., Халитова А.В., Ильинская О.Н., Барабанщиков Б.И.,
Каюмов А.Р. Влияние белков AmtB, GlnK и глутаминсинтетазы на активность
фактора транскрипции TnrA в клетках Bacillus subtilis // Цитология. -2012, Т.54,
№12. С.898-901.
2. Дудкина Е.В., Ульянова В.В., Шах Махмуд Р., Гальцова А.К., Вершинина В.И.,
Ильинская О.Н. Получение новой секретируемой рибонуклеазы Bacillus sp. на
основе рекомбинантного штамма Bacillus megaterium // Естественные и
технические науки (подана в печать)
3. Акименко А.С., Шах Махмуд Р., Ульянова В.В., Вершинина В.И. Фосфатрегулируемая внеклеточная рибонуклеаза Bacillus coagulans. Сборник тезисов
всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и
биологии», Пущино – 2012, С. 95.
4. Шах Махмуд Р., Ульянова В. В. Участие бактериальных нуклеаз в азотном обмене
клеток // VII молодежная школа-конференция с международным участием
«Актуальные аспекты современной микробиологии»: сб. тезисов. – Москва, 2011. –
С. 49-52.
http://kpfu.ru/main?p_id=21707&p_lang=&p_type=12
http://kpfu.ru/main?p_id=26491&p_lang=&p_type=12