Антимикробная активность пробиотика на основе бацилл

УДК 619:614.48 (07)
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОБИОТИКА НА ОСНОВЕ БАЦИЛЛ
*Шайбель
А.Я., **Минх Ш., ***Грязнева Т.Н., ***Руденко А.Н.
*ООО
«Пробиотик-Плюс», Москва
VITAL UG, Tűbingen, Deutschland
***ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной
медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»
**MAGNAT
Пробиотик ОЛИН на основе культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus
licheniformis ВКПМ 10135 обладает антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов и является эффективным лечебно-профилактическим средством при кишечных инфекциях человека и
животных.
Ключевые слова: бациллы, микробиоценоз, кишечные инфекции, бактерицидное
действие, антимикробная активность.
В ряду важнейших достижений современной биологии одно из главных мест занимает фундаментальное познание многих сторон взаимодействия организма человека и
животных с населяющей их полости микрофлорой, создание и широкое внедрение в
медицинскую и ветеринарную практику биопрепаратов из живых микробных культур –
пробиотиков [1, 2].
Применение в медицине и ветеринарии препаратов на основе лакто- и бифидобактерий показало их профилактическую эффективность при дисбактериозах [3, 4].
В последние годы установлено, что в микробиоценозе пищеварительного тракта
человека и животных чрезвычайно важны и некоторые экзогенные бактерии, например,
рода Bacillus, такие как Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis [5].
Эти бактерии характеризуются рядом преимуществ перед лакто- и бифидобактериями, которые позволяют считать их перспективными в качестве основы пробиотиков
с лечебным действием [6].
Во-первых, эти виды бацилл широко распространены в природе; являются безвредными для человека и животных; характеризуются высокой ферментативной активностью, что способствует регулированию и стимулированию пищеварения; индуцируют
продукцию интерферона, оказывая противовирусное действие; являются устойчивыми
к литическим и пищеварительным ферментам, ко многим антибиотикам; синтезируют
различные бактериоцины, что обуславливает их антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Во-вторых, бациллы технологичны в производстве, в приготовлении биологически
активных добавок, лечебной пищи, комбикормов и кормовых добавок, устойчивы к широкому диапазону температур, экологически безопасны, препараты на их основе отличаются длительным сроком хранения.
Созданный совместными усилиями ученых Германии и России пробиотик ОЛИН,
на основе культур штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ
10135, обладает бактерицидным действием в отношении эшерихий, сальмонелл, протеев, клебсиелл, цитробактеров, энтеробактеров, стафилококков, стрептококков, клостридий, псевдомонад, кандид, кокцидий (эймерий) и др., является эффективным лечебно-профилактическим средством при дисбактериозах и кишечных инфекциях человека и животных, в т.ч. птиц.
Это связано, в первую очередь, с тем, что бактерии-компоненты ОЛИН обладают
2
фенотипической гетерогенностью - защищают от патогенной микрофлоры все участки
пищеварительного тракта, утилизируют ксилозу и пропионат, обладают протеолитической, амилолитической, аргининдигидролазной и антагонистической активностью, обладают антибиотикорезистентностью к различным препаратам и др. (табл. 1).
Таблица 1. Фенотипическая гетерогенность культур штаммов
B. subtilis ВКПМ 10172 и B. licheniformis ВКПМ 10135
Фенотипический признак
Рост в анаэробных условиях
Утилизация ксилозы
Аргининдигидролазная активность
Утилизация пропионата
Протеолитическая активность, ед/мкл
Амилолитическая активность, ед/мкл
Концентрация гомогенных белков в культуральной жидкости (разведение 1:2), мкг/мл
Концентрация гомогенных белков в ультразвуковом дезинтеграте (разведение 1:5), мкг/мл
Зоны угнетения роста тест-штаммов, мм:
Salmonella paratyphi 2606
Salmonella stenly 5266
Staphylococcus aureus 1479
Shigella sonnei 659
Pseudomonas aeruginosa 32
Proteus vulgaris 491
Klebsiella pneumoniae 5055
Citrobacter freundii 381
Candida albicans 690
Campilobacter jejuni 418
Антибиотикочувствительность бацилл (диаметр зон
торможения роста культуры), мм:
Амикацин
Гентамицин
Канамицин
Тобрамицин
Цефоперазон
Тетрациклин
Нистатин
Рифампицин
B. subtilis
ВКПМ
10172
+
25
36
2500,0
B. licheniformis ВКПМ
10135
+
+
+
16
17
2000,0
1200,0
1500,0
18±2
16±1
22±3
13±1
7±1
25±2
16±3
22±2
18±4
20±4
16±2
12±2
26±2
16±2
12±1
20±2
10±1
18±2
25±2
22±2
0
4±0,2
0
0
5±0,3
8±0,3
0
12±0,3
10±0,2
8±0,1
10±0,1
6±0,1
10±0,2
0
4±0,3
0
На слизистой оболочке кишечника бациллы-компоненты пробиотика ОЛИН образуют защитную биопленку (рис. 1).
Рис. 1. Биопленка из бацилл-компонентов ОЛИН на слизистой кишечника
3
При электронной микроскопии препаратов, приготовленных из 24-часовых смешанных культур тест-штаммов патогенных микроорганизмов и бактерий-компонентов
пробиотика ОЛИН, было выявлено бактерицидное действие препарата, характеризующееся разрушением золотистого стафилококка, эшерихий, сальмонелл, клебсиелл и
кандид, выделенных от больных животных.
Причем, высокий уровень антагонистической активности проявляли оба штамма
бацилл-компонентов пробиотика ОЛИН (рис. 2).
а)
в)
б)
г)
д)
Рис. 2. Бактерицидное действие бацилл-компонентов пробиотика ОЛИН
в отношении: а) S.aureus, б) C.albicans, в) S.paratyphi г) E.coli, д) K.pneumoniae
Для определения влияния пробиотика ОЛИН на рост и размножение основных
представителей полезной микрофлоры пищеварительного тракта животных – лакто- и
бифидобактерий, эти микроорганизмы раздельно засевали сплошным газоном на плотные питательные среды и в центр чашки Петри на поверхность питательной среды
наносили каплю суспензии ОЛИН. Через 24 ч после культивирования при температуре
370С посевы просматривались в косо проходящем свете.
Рис. 3. Зона вторичного роста бифидобактерий (а) и лактобактерий (б)
в присутствии ОЛИН (в центре),свидетельствующая о синергидном действии
препарата
4
Было установлено, что вокруг зоны роста бацилл-компонентов пробиотика ОЛИН
наблюдается вторичный рост лактобактерий и бифидобактерий в виде валика, представляющего собой слившиеся колонии, что свидетельствует о стимуляции размножения полезной кишечной микрофлоры пробиотиком ОЛИН.
Для определения влияния биологически активных веществ, продуцируемых бациллами-компонентами пробиотика ОЛИН, на энтеропатогенные бактерии было проведено культивирование изучаемых бацилл в мясо-пептонном бульоне в смеси с эшерихиями - непатогенной (E.coli 1257) и энтеротоксигенной (E.coli К88).
Для этого в пробирку вносили суточные бульонные культуры Bacillus subtilis ВКПМ
10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 в соотношении 1:1 с концентрацией микробных клеток 108 в 1 мл суспензии. Затем вносили суточную бульонную культуру непатогенной или энтеротоксигенной E.coli в той же концентрации.
В контрольных пробах выращивали чистые культуры бацилл и эшерихий.
Через 2 часа культивирования при 37°С были приготовлены нативные микропрепараты для изучения в электронном микроскопе высокого класса разрешения «J 100В».
Ранее нами было установлено, что бациллы-компоненты ОЛИН продуцируют
ферменты и бактериоцины, губительно действующие на патогенные энтеробактерии,
продуцирующие энтеротоксины. Продукты метаболизма бацилл-компонентов пробиотика ОЛИН (ферменты и бактериоцины) образуют сложные комплексы с токсинами энтеропатогенных эшерихий, которые содержат в своем составе углеводы, белки, липополи- и мукополисахариды. Данный комплекс адсорбируется на поверхности энтеротоксигенных бактерий, т.к. обладает сродством к поверхности клеточной стенки патогенных микроорганизмов. Бактериоцины бацилл-компонентов ОЛИН упаковываются
внутрь нано- и липосом, образованных ферментами бацилл и токсинами патогенных
эшерихий. После адсорбции наноструктурированного комплекса на поверхности энтеропатогенной E.coli, бактериоцины бацилл проникают внутрь патогенных эшерихий и
лизируют их. Кроме того, данный комплекс препятствует пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ в патогенные микроорганизмы и вызывает их
гибель (рис. 4).
Рис. 4. Образование наноструктурированного комплекса из ферментов
и бактериоцинов бацилл-компонентов пробиотика ОЛИН и энтеротоксинов
патогенной E.coli и его адсорбция на поверхности эшерихий
На рис. 4 четко виден комплекс из ферментов и бактериоцинов бациллкомпонентов пробиотика ОЛИН и энтеротоксинов патогенной E.coli, представляющий
собой нано-липосомальные структуры, адсорбирующиеся на поверхности клеточной
стенки энтеротоксигенной E.сoli.
Через 1 час воздействия пробиотиком ОЛИН на энтеротоксигенные эшерихии, они
лизировались.
В контрольной пробе, при отсутствии бацилл пробиотика ОЛИН, энтеротоксигенные E.сoli бурно размножались и вырабатывали энтеротоксины.
В связи с тем, что полезные бактерии пищеварительного тракта не вырабатывают
энтеротоксины, они не подпадают под антагонистическое действие пробиотика ОЛИН.
5
Следовательно, образование комплекса из ферментов и бактериоцинов бациллкомпонентов пробиотика ОЛИН и токсинов патогенных микроорганизмов обуславливает
механизм избирательного антимикробного действия пробиотика ОЛИН.
При этом, пробиотик ОЛИН негативно воздействует только на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, не вызывая гибели или угнетения роста полезной микрофлоры человека и животных (лакто- и бифидобактерий, непатогенной кишечной палочки и др.).
Лечебно-профилактическая эффективность применения пробиотика ОЛИН при
дисбактериозах человека составила 100%, при кишечных инфекциях молодняка разных
видов животных, в т.ч. птиц и рыб – 95%, сохранность - 100%.
На основании проведенных исследований было установлено, что антимикробная
активность пробиотика ОЛИН при различных патологиях организма человека и животных обусловлена разносторонним действием препарата (табл. 2).
Таблица 2. Лечебно-профилактическое действие пробиотика ОЛИН
Действие
Подавление роста патогенных и условнопатогенных микроорганизмов
Нормализация пищеварения
Антиаллергическое
действие
Стимуляция неспецифической резистентности макроорганизма
Антитоксическое действие
Восстановление эндогенной микрофлоры, коррекция микробиоценоза
Синтез заменимых и
незаменимых аминокислот и витаминов
Выведение тяжелых
металлов и радионуклидов
Противоопухолевая
активность
Процессы, обеспечивающие действие
Синтез веществ, обладающих антибиотическими свойствами (антибиотики, лизоцим, пептиды с антибиотическими свойствами и др.), снижение рН среды, высокая конкурентная способность в процессе размножения.
Синтез пектолитических, амилолитических, протеолитических ферментов, липазы.
Расщепление аллергенов на биологически инертные
субъединицы.
Стимуляция лимфоцитов, макрофагов, индукция эндогенного α-и γ-интерферона, увеличение содержания гаммаглобулиновой фракции крови.
Дезинтеграция высокомолекулярных белков, способность
связывать токсины патогенных бактерий и грибов.
Филогенетическая общность представителей нормальной
симбионтной микрофлоры.
Экзоцеллюлярная продукция треонина, глутаминовой
кислоты, аланина, валина, тирозина, гистидина, орнитина и
др.
Способность к повышенной сорбции тяжелых металлов
и радионуклидов в сочетании с их быстрой элиминацией.
Стимуляция естественных киллерных клеток и Тлимфоцитов, стимуляция макрофагов.
Таким образом, нами были определены основные направления использования
пробиотика ОЛИН в медицине и ветеринарии:
1. Профилактика и лечение диарейного синдрома.
2. Профилактика инфекционных кишечных заболеваний.
3. Восстановление кишечного биоценоза после антибиотикотерапии.
4. Лечение гинекологических заболеваний.
5. Использование в реабилитационный период при вирусных и бактерийных инфекциях.
6. Восполнение дефицита нормальной кишечной микрофлоры.
7. Восполнение дефицита аминокислот, витаминов, ферментов, перевариваемого протеина.
8. Участие в пищеварении.
9. Профилактика метрит-мастит-агалактийного синдрома.
6
10. Повышение резистентности слизистых оболочек к инвазии простейшими и
гельминтами.
11. Повышение активности колострального иммунитета.
12. Профилактика аутоиммунных патологий у новорожденных.
13. Профилактика патологий печени пищевой, кормовой и лекарственной этиологии.
14. Иммуно-, ферменто-, гормонокоррекция.
15. Стимуляция выработки антител при вакцинации.
16. Стимуляция молочной продуктивности у животных, повышение качества молока и молочных продуктов.
17. Повышение жизнеспособности потомства, снижение риска рождения мертворожденных.
18. Экономия корма.
Использованная литература
1. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической
функцией //Журн.микробиол.- 2004.- № 1.- С. 84-92.
2. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические
свойства и защитные функции // Журн. микробиол. -1999.-№ 6.- С. 102-105.
3. Данилевская Н.В., Кудинкин Р.С. Влияние пробиотика Лактобифадол на продуктивность поросят мясных пород на подсосе и доращивании // Ветеринария и кормление. – 2005. – № 3. – С. 16-17.
4. Субботин В.В., Сидоров М.А. Профилактика желудочно-кишечных болезней новорожденных животных с симптомокомплексом диареи // Ветеринария. – 2001. – № 4. –
С. 3-7.
5. Грязнева Т.Н. Технология производства пробиотика Биод-5 и его применение в
ветеринарии / Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Сб. науч. ст. –
Покров: ВНИИВВиМ. – 2003. – С. 609-614.
6. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов // Антибиотики и химиотерапия. – 1998. – № 2. – С. 20-23.
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF PROBIOTIK ON THE BASIS OF BACILLI
*
Shaibel A.Ya. **Minch Sh. *** Gryazneva T.N., ***Rudenko A.N.
*Company
with limited from by responsibility «Probiotic-plus», Moscow
**MAGNAT VITAL UG, Tűbingen Deutschland
*** Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology of the name
K.I.Skryabina
Probiotik OLIN on the basis of cultures of the Bacillus subtilis VKPM 10172 and Bacillus
licheniformis VKPM 10135 cultures possesses antagonistic activity in regard to the wide spectrum of bacteria pathogenic and conditional-pathogenic and mushrooms and is an effective
medical and prophylactic tool at the intestinal infections of man and animals.
Keywords: bacilli, mikrobiotsenoz, intestinal infections, bactericidal action, antimicrobial
activity.